CN114163520B - 一种血源性人IgM抗体纯化介质制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血源性人IgM抗体纯化介质制备方法，将一株能与人源IgM抗体特异性结合的二抗AT2910(anti‑μ链)通过CNBr偶联与琼脂糖介质偶联，获得IgM抗体纯化介质；本发明方法简单，易生产放大，方便大规模血清中生产人源IgM；本发明对人源IgM抗体的结构影响小，分离纯化得到的人源IgM抗体纯度高，特异性强，作为较好的免疫原使用；本发明可用于羊抗人IgM血清或兔抗人IgM血清的大规模制备，满足抗原供应。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种血源性人IgM抗体纯化介质制备方法。
背景技术
现有方法多采用PEG沉淀法或硫酸铵(SAS)沉淀法，此外再通过凝胶过滤层析技术(Gel filtration chromatography)、离子交换层析(Ion-exchange columnchromatography,IEC)。
现有方法较为复杂，步骤较多，分离纯化得到的人源IgM抗体纯度不高，作为最终产品或免疫原使用的话易对实验造成交差反应，且对人源IgM抗体的结构有一定的破坏，此外该方法得率不高，不利于大规模生产。
本发明方法简单，易生产放大，对人源IgM抗体的结构影响小，分离纯化得到的人源IgM抗体纯度高，作为较好的免疫原使用。
发明内容
本发明提供了一种血源性人IgM抗体纯化介质制备方法，以解决现有技术中的问题。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种血源性人IgM抗体纯化介质制备方法，将一株能与人源IgM抗体μ链特异性结合的二抗AT2910通过CNBr偶联与琼脂糖介质偶联，获得IgM抗体纯化介质。
进一步的，具体的制备方法，包括以下步骤：
S1、使用偶联缓冲液对AT2910蛋白进行透析置换缓冲液，按照体积比为1:40透析两次，A280测蛋白浓度；
S2、琼脂糖CNBr冻干粉(GE Health Care)﹕AT2910＝1ml﹕4mg(V/W)的比例称取相应质量的琼脂糖冻干粉，1g冻干粉对应3.5ml的成品琼脂糖凝胶柱体积；
S3、按照每g冻干粉对应20mL 1mM HCl将琼脂糖冻干粉重悬后，放置4℃活化2h；
S4、用1mM HCl将活化好的琼脂糖CNBr冲洗至少10分钟，再用去离子水冲洗将HCl完全置换，然后使用偶联缓冲液平衡；
S5、将平衡好的琼脂糖CNBr和透析好的AT2910蛋白按照所述步骤2的比例于4℃条件下在旋转混合仪上充分混合3h进行偶联；
S6、将偶联后的柱料填充到层析柱内，使用5倍柱体积的偶联缓冲液漂洗；
S7、将柱料转移到0.01M的Tris-HCl缓冲液中终止偶联反应2h；
S8、使用至少5倍柱料体积的0.1M醋酸钠或醋酸缓冲液和0.01M Tris-HCl缓冲液交替漂洗，至少循环3次；
S9、将最终获得的IgM抗体纯化介质保存在0.01M PBS，含0.02％NaN3(w/v)中，保存于4℃。
进一步的，所述偶联缓冲液包括0.1M NaHCO3和0.3M NaCl，所述偶联缓冲液pH＝7.4。
进一步的，所述Tris-HCl缓冲液的pH＝8.0。
进一步的，所述醋酸钠的pH＝4.0，所述醋酸缓冲液的pH＝4.0。
进一步的，所述PBS的pH＝7.4。
与人源IgM抗体特异性结合的二抗AT2910的重链可变区的CDR1，CDR2，CDR3的序列如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3所示。
与人源IgM抗体特异性结合的二抗AT2910的轻链可变区的CDR1，CDR2，CDR3的序列如SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法简单，易生产放大，方便大规模血清中生产人源IgM；
本发明对人源IgM抗体的结构影响小，分离纯化得到的人源IgM抗体纯度高，特异性强，作为较好的免疫原使用；
本发明可用于羊抗人IgM血清或兔抗人IgM血清的大规模制备，满足抗原供应。
实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例1
一种血源性人IgM抗体纯化介质制备方法，将一株能与人源IgM抗体μ链特异性结合的二抗AT2910通过CNBr偶联与琼脂糖介质偶联，获得IgM抗体纯化介质。
所述质制备方法，包括以下步骤：
S1、使用偶联缓冲液(0.1M NaHCO3+0.3M NaCl，pH＝7.4)对AT2910蛋白进行透析置换缓冲液，按照体积比为1:40透析两次，A280测蛋白浓度；
S2、琼脂糖CNBr冻干粉(GE Health Care)﹕AT2910＝1ml﹕4mg(V/W)的比例称取相应质量的琼脂糖冻干粉，1g冻干粉对应3.5ml的成品琼脂糖凝胶柱体积；
S3、按照每g冻干粉对应20mL 1mM HCl将琼脂糖冻干粉重悬后，放置4℃活化2h；
S4、用1mM HCl将活化好的琼脂糖CNBr冲洗至少10分钟，再用去离子水冲洗将HCl完全置换，然后使用偶联缓冲液平衡；
S5、将平衡好的琼脂糖CNBr和透析好的AT2910蛋白按照所述步骤2的比例于4℃条件下在旋转混合仪上充分混合3h进行偶联；
S6、将偶联后的柱料填充到层析柱内，使用5倍柱体积的偶联缓冲液漂洗；
S7、将柱料转移到0.01M的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中终止偶联反应2h；
S8、使用至少5倍柱料体积的0.1M醋酸钠或醋酸缓冲液(pH 4.0)和0.01M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)交替漂洗，至少循环3次；
S9、将最终获得的IgM抗体纯化介质保存在0.01M PBS(pH 7.4)，含0.02％NaN3(w/v)中，保存于4℃。
实施例2
AT2910为通过杂交瘤细胞融合技术获得的一株单克隆抗体，可以特异性结合人IgM-μ链，其轻重链CDR区核苷酸序列通过细胞株测序获得，AT2910的制备过程如下：
1、腹水处理：500mL AT2910腹水在25℃或室温条件下用10微米孔径慢速滤纸过滤去除油脂、沉淀杂蛋白、组织碎片等固体不容物；
2、柱平衡：使用柱体积为100mL的Protein G层析柱，用平衡缓冲液(0.02mM Tris+0.2M NaCl，pH＝7.4)平衡5倍柱体积，柱平衡好后将蛋白紫外检测仪显示值A280值调整为
0，作为基线；
3、上样：用1000mL体积的平衡缓冲液(0.02mM Tris+0.2M NaCl，pH＝7.4)稀释腹水，稀释后的腹水作为样品上样，使用蠕动泵在20-25℃条件下上样，流速为10mL/min；
4、平衡：上样完成后再用1000mL的平衡液(0.02mM Tris+0.2M NaCl，pH＝7.4)平衡Protein G柱，平衡至无蛋白流出，即蛋白紫外检测值A280显示值为0，流速为20mL/min；
5、解离：平衡完成后使用解离液(0.1M甘氨酸，pH＝3)进行解离，当蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时开始收集蛋白，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时停止收集蛋白，收集管中预先加入0.1倍收集体积的2M Tris(pH8.0)，流速为10mL/min；
6、平衡：解离完成后继续用解离液(0.1M甘氨酸，pH＝3)洗涤柱至无蛋白流出，再用去离子水平衡柱约5-10倍柱体积，最终用20％的乙醇保存ProteinG柱；
7、透析：合并收集蛋白组分，使用偶联缓冲液(0.1M NaHCO3+0.3M NaCl，pH＝7.4)对AT2910蛋白进行透析置换缓冲液，按照体积比为1:40透析两次，透析间隔不低于4小时。
与人源IgM抗体特异性结合的二抗AT2910的重链可变区的CDR1，CDR2，CDR3的序列如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3所示。
与人源IgM抗体特异性结合的二抗AT2910的轻链可变区的CDR1，CDR2，CDR3的序列如SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6所示。
重链CDR1的序列SEQID NO：1：FTYTMFMS；
重链CDR2的序列SEQID NO：2：VLNADSTRY；
重链CDR3的序列SEQID NO：3：SAVDTTY；
轻链CDR1的序列SEQID NO：4：SSRDWKY；
轻链CDR2的序列SEQID NO：5：SDNPLR；
轻链CDR3的序列SEQID NO：6：QGDTWTNS。
与人源IgM抗体特异性结合的二抗AT2910的核心序列：
H-chain：CDR1(-Phe-Thr-Tyr-Thr-Met-Phe-Met-Ser-)，
CDR2(-Val-Leu-Asn-Ala-Asp-Ser-Thr-Arg-Tyr-)，
CDR3(-Ser-Ala-Val-Asp-Thr-Thr-Tyr-)
L-chain：CDR1(-Ser-Ser-Arg-Asp-Trp-Lys-Tyr-)，CDR2(-Ser-Asp-Asn-Pro-Leu-Arg-)，
CDR3(-Gln-Gly-Asp-Thr-Trp-Thr-Asn-Ser-)
H-chain：CDR1(ttt-acc-tat-acc-atg-ttt-atg-agc)，
CDR2(gtg-ctg-aac-gcg-gat-agc-acc-cgt-tat)，
CDR3(agc-gcg-gtg-gat-acc-acc-tat)
L-chain：CDR1(agc-agc-cgt-gat-tgg-aaa-tat)，
CDR2(agc-gat-aac-ccg-ctg-cgt)，
CDR3(cag-ggc-gat-acc-tgg-acc-aac-agc)
对于抗体来说CDR序列为核心，除此之外其他序列不重要，但依然附完整序列：
>H-chain：
QVQLQESGPELVKPGASLSLTCIASFTYTMFMSIEWMRQFPGKSLEWIGNVLNADSTRYYNEKFKGKAKLTVKESASTVYLEFSRLTSDESAVYYCAIHSAVDTTYDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
>L-chain
DIVLTQSPASLAVSLGQRATRATISASQGSSRDWKYFMNWYQQKAGQPPKLLISDNPLRESGIPVRFSGRGSGTDFTINIHPVEEEDVATYYCQQGDTWTNSFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNucleotide sequence：
>H-chain：
caggtgcagctgcaggaaagcggcccggaactggtgaaaccgggcgcgagcctgagcctgacctgcattgcgagctttacctataccatgtttatgagcattgaatggatgcgtcagtttccgggcaaaagcctggaatggattggcaacgtgctgaacgcggatagcacccgttattataacgaaaaatttaaaggcaaagcgaaactgaccgtgaaagaaagcgcgagcaccgtgtatctggaatttagccgtctgaccagcgatgaaagcgcggtgtattattgcgcgattcatagcgcggtggataccacctatgattattggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagcgcgaaaaccaccccgccgagcgtgtatccgctggcgccgggcagcgcggcgcagaccaacagcatggtgaccctgggctgcctggtgaaaggctattttccggaaccggtgaccgtgacctggaacagcggcagcctgagcagcggcgtgcatacctttccggcggtgctgcagagcgatctgtataccctgagcagcagcgtgaccgtgccgagcagcacctggccgagcgaaaccgtgacctgcaacgtggcgcatccggcgagcagcaccaaagtggataaaaaaattgtgccgcgtgattgcggctgcaaaccgtgcatttgcaccgtgccggaagtgagcagcgtgtttatttttccgccgaaaccgaaagatgtgctgaccattaccctgaccccgaaagtgacctgcgtggtggtggatattagcaaagatgatccggaagtgcagtttagctggtttgtggatgatgtggaagtgcataccgcgcagacccagccgcgtgaagaacagtttaacagcacctttcgtagcgtgagcgaactgccgattatgcatcaggattggctgaacggcaaagaatttaaatgccgtgtgaacagcgcggcgtttccggcgccgattgaaaaaaccattagcaaaaccaaaggccgtccgaaagcgccgcaggtgtataccattccgccgccgaaagaacagatggcgaaagataaagtgagcctgacctgcatgattaccgatttttttccggaagatattaccgtggaatggcagtggaacggccagccggcggaaaactataaaaacacccagccgattatggataccgatggcagctattttgtgtatagcaaactgaacgtgcagaaaagcaactgggaagcgggcaacacctttacctgcagcgtgctgcatgaaggcctgcataaccatcataccgaaaaaagcctgagccatagcccgggcaaa
>L-chain：
Gatattgtgctgacccagagcccggcgagcctggcggtgagcctgggccagcgtgcgacccgtgcgaccattagcgcgagccagggcagcagccgtgattggaaatattttatgaactggtatcagcagaaagcgggccagccgccgaaactgctgattagcgataacccgctgcgtgaaagcggcattccggtgcgttttagcggccgtggcagcggcaccgattttaccattaacattcatccggtggaagaagaagatgtggcgacctattattgccagcagggcgatacctggaccaacagctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgtgcggatgcggcgccgaccgtgagcatttttccgccgagcagcgaacagctgaccagcggcggcgcgagcgtggtgtgctttctgaacaacttttatccgaaagatattaacgtgaaatggaaaattgatggcagcgaacgtcagaacggcgtgctgaacagctggaccgatcaggatagcaaagatagcacctatagcatgagcagcaccctgaccctgaccaaagatgaatatgaacgtcataacagctatacctgcgaagcgacccataaaaccagcaccagcccgattgtgaaaagctttaaccgt。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京京达生物技术有限公司
<120> 一种血源性人IgM抗体纯化介质制备方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Phe Thr Tyr Thr Met Phe Met Ser
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Val Leu Asn Ala Asp Ser Thr Arg Tyr
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ser Ala Val Asp Thr Thr Tyr
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ser Ser Arg Asp Trp Lys Tyr
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ser Asp Asn Pro Leu Arg
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gln Gly Asp Thr Trp Thr Asn Ser
1 5
Claims (3)
1.一种血源性人IgM抗体纯化介质制备方法，其特征在于，将与人源IgM抗体μ链特异性结合的二抗AT2910通过CNBr与琼脂糖介质偶联，获得IgM抗体纯化介质；
所述二抗AT2910的重链可变区的CDR1，CDR2，CDR3的序列分别如SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3所示；
轻链可变区的CDR1，CDR2，CDR3的序列分别如SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6所示。
2.根据权利要求1所述的一种血源性人IgM抗体纯化介质制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、使用偶联缓冲液对AT2910蛋白进行透析置换缓冲液，按照体积比为1:40透析两次，A280测蛋白浓度；
S2、琼脂糖CNBr冻干粉﹕AT2910＝1ml﹕4mg的比例称取相应质量的琼脂糖冻干粉，1g冻干粉对应3.5ml的成品琼脂糖凝胶柱体积；
S3、按照每g冻干粉对应20mL 1mM HCl将琼脂糖冻干粉重悬后，放置4℃活化2h；
S4、用1mM HCl将活化好的琼脂糖CNBr冲洗至少10分钟，再用去离子水冲洗将HCl完全置换，然后使用偶联缓冲液平衡；
S5、将平衡好的琼脂糖CNBr和透析好的AT2910蛋白按照所述步骤2的比例于4℃条件下在旋转混合仪上充分混合3h进行偶联；
S6、将偶联后的柱料填充到层析柱内，使用5倍柱体积的偶联缓冲液漂洗；
S7、将柱料转移到0.01M的Tris-HCl缓冲液中终止偶联反应2h；
S8、使用至少5倍柱料体积的0.1M醋酸钠或醋酸缓冲液和0.01M Tris-HCl缓冲液交替漂洗，至少循环3次；
S9、将最终获得的IgM抗体纯化介质保存在0.01M PBS，含0.02％NaN3(w/v)中，保存于4℃。
3.根据权利要求2所述的一种血源性人IgM抗体纯化介质制备方法，其特征在于，所述偶联缓冲液包括0.1M NaHCO3和0.3M NaCl，所述偶联缓冲液pH＝7.4。
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2021
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Also Published As
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