CN116271982B - 一种血液高丰度蛋白免疫亲和柱的再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种血液高丰度蛋白免疫亲和柱的再生方法，针对使用过并吸附了血液高丰度蛋白的免疫亲和柱，先采用含有尿素的甘氨酸‑盐酸溶液洗脱3次，再采用含有氯化钠的甘氨酸‑盐酸溶液洗脱3次，再经中和溶液调节pH至中性，经平衡溶液使免疫亲和柱保持稳定状态，并在保存溶液中可以长期保存。该方法操作简单，所用试剂低毒环保，再生后的免疫亲和柱可重复使用20次以上，显著减少了实验成本。
Description
技术领域
本发明属于免疫亲和柱技术领域，涉及一种血液高丰度蛋白免疫亲和柱的再生方法。
背景技术
人体血液中蛋白质多达20000余种，对血液中蛋白质含量变化的检测可以反映出机体的健康状态以及疾病或药物暴露对机体的影响。但是，血液中的蛋白质浓度差异很大，变化范围达10个数量级，其中包括白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、载脂蛋白在内的14种高丰度蛋白占血液中蛋白总量的95％以上，而且大多数与疾病状态相关的蛋白生物标志物在血液中的含量很低，大部分仅处于ng/mL和pg/mL的水平，检测信号容易被高丰度蛋白掩盖。为了增加血液中低丰度蛋白的检出率，在蛋白质组学研究中通常采用免疫亲和柱去除血液样本中的高丰度蛋白。
免疫亲和柱通过偶联多种高丰度蛋白抗体的固定化配基与目标高丰度蛋白的免疫结合作用，将目标高丰度蛋白进行去除，一次可去除血液样本中95％以上的高丰度蛋白，并且去除过程具有高度的专一性和选择性，能够保留绝大多数的低丰度蛋白。
但是目前商品化的免疫亲和柱价格昂贵，以Thermo Scientific品牌的Top14Abundant Protein Depletion Midi Spin Columns(货号A36371)为例，单根的采购成本高达700元以上，并且免疫亲和柱为一次性使用，导致大批量样品处理成本过高，极大地限制了蛋白质组学研究工作的开展。
因此急需找到一种能使商品化血液高丰度蛋白免疫亲和柱再生，可以重复使用的方法，从而降低实验成本。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种血液高丰度蛋白免疫亲和柱的再生方法，针对使用过并吸附了血液高丰度蛋白的免疫亲和柱，先采用含有尿素的甘氨酸-盐酸溶液洗脱3次，再采用含有氯化钠的甘氨酸-盐酸溶液洗脱3次，再经中和溶液中和pH，经平衡溶液使免疫亲和柱保持稳定状态，并在保存溶液中可以长期保存。该方法操作简单，所用试剂低毒环保，再生后的免疫亲和柱可重复使用20次以上，显著减少了实验成本。
一方面，本发明提供了一种血液高丰度蛋白免疫亲和柱的再生方法，所述方法主要先采用含有尿素的甘氨酸-盐酸溶液洗脱，再采用含有氯化钠的甘氨酸-盐酸溶液进行洗脱。
本发明所述的血液高丰度蛋白为：人血清白蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白E、免疫球蛋白G、免疫球蛋白G(轻链)、免疫球蛋白M、α-1-酸性糖蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-2-巨球蛋白、载脂蛋白A1、纤维蛋白原、触珠蛋白和转铁蛋白共计14种蛋白。
用于去除血液中这14种高丰度蛋白的免疫亲和柱，为Thermo Scientific品牌的Top14Abundant Protein Depletion Midi Spin Columns(货号A36371)，通过柱体中树脂填料上键合的高度特异性的固定化抗体去除血液样本中对应的高丰度蛋白，也就是说免疫亲和柱中键合有这14种蛋白的抗体，能够特异性吸附血液中的这14种蛋白。
本发明提供的使血液高丰度蛋白免疫亲和柱再生的洗脱方法，是采用两步较温和的酸性洗脱，第一步为采用含有尿素的甘氨酸-盐酸溶液洗脱，尿素可以使蛋白变性，使蛋白从抗体上解离下来，从而增加洗脱液的洗脱能力；第二步为采用含有氯化钠的甘氨酸-盐酸溶液洗脱，氯化钠可以改变溶液的离子强度，降低抗原-抗体的结合作用，也可以提高洗脱效率。
相比于单独采用含有尿素的甘氨酸-盐酸溶液，或单独采用含有氯化钠的甘氨酸-盐酸溶液进行洗脱，依次采用含有尿素的甘氨酸-盐酸溶液和含有氯化钠的甘氨酸-盐酸溶液进行洗脱，能更显著提高洗脱能力，帮助免疫亲和柱恢复再生，从而实现免疫亲和柱可重复使用20次以上。
发明人也尝试过使用其他洗脱液，希望能使免疫亲和柱再生，但研究证明，难以找到更加合适的方法。比如采用碱洗脱，虽然第一次的洗脱效果也不错，但是多次再生后获得的免疫亲和柱，使用的效果大打折扣，其原因可能是碱洗脱会破坏树脂中键合的固定化抗体，从而影响抗体与高丰度蛋白的结合能力，难以实现免疫亲和柱的重复使用。而采用含有尿素的甘氨酸-盐酸溶液和含有氯化钠的甘氨酸-盐酸溶液进行洗脱，对免疫亲和柱中键合的固定化抗体不会产生明显影响，能够实现高达20次以上的重复使用，大幅降低成本，效果显著。
由于人体内高丰度蛋白质量占总蛋白质量的95％以上，免疫亲和柱使用时需要保证高丰度蛋白的脱除率大于97％，因此免疫亲和柱每次使用时的总蛋白脱除率应高于92％，才能不影响后续的实验结果，否则会减少低丰度蛋白的鉴定量。因此本发明所述的免疫亲和柱再生，是指再生后的免疫亲和柱，对血液中的高丰度蛋白的脱除率大于97％，也就相当于对血液样本的总蛋白脱除率高于92％。
进一步地，先采用含有尿素的甘氨酸-盐酸溶液洗脱3次，再采用含有氯化钠的甘氨酸-盐酸溶液进行洗脱3次。
先采用含有尿素的甘氨酸-盐酸溶液洗脱3次，再采用含有氯化钠的甘氨酸-盐酸溶液进行洗脱3次，能使免疫亲和柱中的高丰度蛋白洗脱率能达到97％以上。
进一步地，所述含有尿素的甘氨酸-盐酸溶液，甘氨酸的浓度为0.1-1.0M，尿素的浓度为0.5-4.0M，pH为2.0-3.5。
进一步地，所述含有氯化钠的甘氨酸-盐酸溶液，甘氨酸的浓度为0.1-1.0M，氯化钠的浓度为10-1000mM，pH为2.0-3.0。
进一步地，含有尿素的甘氨酸-盐酸溶液的加入体积为柱容量的60～90％，含有氯化钠的甘氨酸-盐酸溶液的加入体积为柱容量的60～90％。
洗脱液加入体积太小，在免疫亲和柱旋转孵育的时候，其中的树脂填料容易聚集在一起，不能完全分离；洗脱液加入体积太大，对填料的分散也不利，旋转孵育时，溶液在柱管内无法充分流动，导致填料需要更长的时间进行分散。60～90％的柱容量，更优选为80％柱容量，能使树脂填料充分分散，又能在加入溶液后保证填料快速混匀。
进一步地，所述血液高丰度蛋白免疫亲和柱的再生方法包括以下步骤：
(1)先采用含有尿素的甘氨酸-盐酸溶液洗脱3次，再采用含有氯化钠的甘氨酸-盐酸溶液进行洗脱3次；
(2)弃去洗脱液，加入中和溶液调节pH至中性，所述中和溶液为Tris-HCl溶液；
(3)弃去中和溶液，加入平衡溶液；
(4)弃去平衡溶液，加入保存溶液。
进一步地，步骤(2)所述Tris-HCl溶液浓度为0.1-1.0M，pH为7.5-8.5；加入中和溶液后，可弃去，再重新加入中和溶液，重复2次。
由于步骤(1)采用的都是酸性洗脱，为了减少酸性环境对填料上键合抗体活性的影响，洗脱后的免疫亲和柱需要快速恢复到中性pH，因此需要立即加入中和溶液，洗去残留的酸性洗脱液，并将pH调节至中性。
进一步地，步骤(3)所述平衡溶液为PBS溶液，浓度为5-50mM，pH为7.0-8.0；加入平衡溶液后，可弃去，再重新加入平衡溶液，重复2次。
由于免疫亲和柱需要长期保存在含有Proclin300的PBS溶液中，因此在pH调节至中性后，可以采用PBS溶液进行洗涤，除去残留的Tris-HCl溶液。
进一步地，步骤(4)所述保存溶液为含有Proclin300的PBS溶液，其中PBS的浓度为5-50mM，Proclin300的体积百分含量为0.01-0.05％，pH为7.0-8.0。
ProClin300是一种具有广谱抗菌活性的防腐剂，当体积百分含量达到0.02％的条件下，能在比较长的时间内抑制细菌、真菌和酵母菌等微生物的生长,同时它又能保持体系中抗体的活性，可替代叠氮化钠等剧毒的生物防腐剂。
另一方面，本发明提供了一组洗脱液用于制备使血液高丰度蛋白免疫亲和柱再生的试剂的用途，所述洗脱液包括含有尿素的甘氨酸-盐酸溶液和含有氯化钠的甘氨酸-盐酸溶液。
本发明的有益效果为：
(1)独创了一种血液高丰度蛋白免疫亲和柱的再生方法，建立了一套标准化的再生流程；
(2)再生后的免疫亲和柱可重复使用20次以上；
(3)方法操作简单，所用试剂低毒环保；
(4)显著减少了实验成本。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例作进一步详细描述，需要指出的是，以下实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用，本发明的实施例中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均能够以任何方式组合。
实施例1：本发明提供的血液高丰度蛋白免疫亲和柱的使用后再生方法
本实施例使用的免疫亲和柱为Thermo Scientific品牌的Top14 AbundantProtein Depletion Midi Spin Columns(货号A36371)，柱容量为2.5mL，通过柱体中树脂填料上键合的高度特异性的固定化抗体去除血液样本中对应的高丰度蛋白。
本实施例先使用免疫亲和柱去除血液中的高丰度蛋白，再经本发明提供的方法使免疫亲和柱再生。
1、免疫亲和柱的使用
使用免疫亲和柱的操作步骤如下：
(1)首先将免疫亲和柱从4℃取出，平衡至室温。
(2)打开柱底部截留端，拧松瓶盖，室温下1000×g离心2分钟，弃去柱内的保存液。
(3)封闭柱底部截留端，取下瓶盖，先加入2mL 10mM PBS溶液，pH控制在7.0-8.0，然后往柱中加入血液样本，血样体积不得超过100uL(本实施例中血样体积为100uL)。
(4)拧紧瓶盖，将免疫亲和柱上下颠倒数次直至填料在溶液中完全分散，室温下以20rpm的转速旋转孵育30min。
(5)孵育结束后，打开柱底部截留端，拧松瓶盖，将免疫亲和柱放在15mL离心管中，室温下1000×g离心2分钟，收集洗脱液，即为高丰度蛋白去除后的样本，吸附的高丰度蛋白保留在免疫亲和柱中。
2、免疫亲和柱的再生
S1：将使用过的免疫亲和柱加入2mL洗脱液A，封闭柱底部截留端，拧紧瓶盖，上下颠倒混匀3次，使填料充分分散，室温下以20rpm的转速旋转孵育5min，弃去洗脱液，1000×g离心2分钟，重复3次。
洗脱液A为含有一定量尿素的甘氨酸-盐酸溶液，其中甘氨酸的浓度为0.5M，尿素的浓度为2.0M，溶液的pH为2.5。
S2：加入2mL洗脱液B，封闭柱底部截留端，拧紧瓶盖，上下颠倒混匀3次，使填料充分分散，室温下以20rpm的转速旋转孵育5min，1000×g离心2分钟，弃去洗脱液，重复3次。
洗脱液B为含有一定量氯化钠的甘氨酸-盐酸溶液，其中甘氨酸的浓度为0.1M，氯化钠的浓度为150mM，溶液的pH为2.5。
S3：加入2mL中和溶液，封闭柱底部截留端，拧紧瓶盖，上下颠倒混匀3次，使填料充分分散，室温下以20rpm的转速旋转孵育5min，1000×g离心2分钟，弃去洗脱液，重复2次。
中和溶液为Tris-HCl溶液，浓度为0.1M，溶液的pH为8.0。
S4：加入2mL平衡溶液，1000×g离心2分钟，弃去洗脱液，重复2次。
平衡溶液为PBS溶液，PBS的浓度为20mM，溶液的pH为7.4。
S5：加入2mL保存溶液,封闭柱底部截留端，拧紧瓶盖，4℃保存。
保存溶液为含有一定量ProClin300的PBS溶液，PBS的浓度为20mM，ProClin300的体积百分含量为0.02％，溶液的pH为7.4。
ProClin300是一种具有广谱抗菌活性的防腐剂，当体积百分含量达到0.02％的条件下，能在比较长的时间内抑制细菌、真菌和酵母菌等微生物的生长，同时它又能保持体系中抗体的活性，可替代叠氮化钠等剧毒的生物防腐剂。
经再生的免疫亲和柱可再次用于血液高丰度蛋白的脱除，并且可再次经该流程获得再生，共计可重复使用20次以上，大幅降低实验成本。
实施例2：不同洗脱方法对血液高丰度蛋白免疫亲和柱再生的影响
首先将100uL血样分别加入27根全新的免疫亲和柱中，按照实施例1描述的标准操作SOP进行免疫脱除后，其中使用后的免疫亲和柱上保留的蛋白量理论值为6600-6700ug，再均分成a～i共9种不同处理组进行再生。处理组a用洗脱液A连续洗脱6次；处理组b用洗脱液B连续洗脱6次；处理组c用洗脱液A先洗脱3次，再用洗脱液B洗脱3次；处理组d用含150mMNaCl的2M硫氰酸盐溶液洗脱6次；处理组e用含150mM NaCl的0.1M柠檬酸溶液洗脱6次；处理组f用含4M MgCl2的0.1M PBS溶液洗脱6次；处理组g用含5M LiCl的0.1M PBS溶液洗脱6次；处理组h用2.5％氨水溶液洗脱6次；处理组i用0.1M氢氧化钠溶液洗脱6次。每个处理组平行3次，通过BCA蛋白定量试剂盒，准确测定不同处理组中每次洗脱液的蛋白质量，结果如表1所示。
表1、不同洗脱方法的蛋白洗脱效果比较
由表1可以看出，采用不同的洗脱方式，经6次洗脱，洗脱的蛋白质量有明显不同，处理组c和处理组i的蛋白洗脱率最高，相比较使用后的免疫亲和柱上保留的蛋白量理论值为6600-6700ug，处理组c和处理组i的蛋白洗脱率都达到97％以上。因此优选采用处理组c和处理组i的洗脱试剂。但是针对免疫亲和柱的再生，蛋白洗脱率高并不一定就是好的再生方法。因为洗脱过程中，洗脱剂可能会对免疫亲和柱中的键合抗体活性产生影响，多次再生后的免疫亲和柱对血液中高丰度蛋白的脱除能力有可能会大打折扣，因此，还需要评估免疫亲和柱多次再生后的性能。由于人体内高丰度蛋白质量占总蛋白质量的95％以上，免疫亲和柱使用时需要保证高丰度蛋白的脱除率大于97％，因此免疫亲和柱每次使用时的总蛋白脱除率应高于92％，才能不影响后续的实验结果，否则会减少低丰度蛋白的鉴定量。
本实施例分别采用处理组c、处理组f和处理组i的洗脱溶剂对免疫亲和柱进行再生，每个处理组平行3次，并采用实施例1提供的方法使用免疫亲和柱进行血液样本的高丰度蛋白脱除，评估了不同处理组中再生次数对免疫亲和柱使用效果的影响。
首先将100uL血样分别加入9根全新的免疫亲和柱中，按照实施例1提供的标准操作SOP进行免疫脱除，通过BCA蛋白定量试剂盒，准确测定初次免疫脱除后样本的蛋白质量，计算免疫亲和柱初次使用时的蛋白脱除率。然后分别采用处理组c、处理组f和处理组i的洗脱溶剂对免疫亲和柱进行再生，每个处理组平行3根，然后继续将100uL相同的血样分别加入上述9根再生后的免疫亲和柱中，按照标准操作SOP进行免疫脱除，通过BCA蛋白定量试剂盒，准确测定免疫脱除后样本的蛋白质量，计算第1次再生后的免疫亲和柱的蛋白脱除率。按照上述步骤对免疫亲和柱连续再生5次，并计算每次再生后的免疫亲和柱的蛋白脱除率，结果如表2所示。
为了避免血样状态变化引起结果的误差，血样均事先分装保存在-80℃，保证每次使用的血样状态都是一致的。并且，每次血样都要和该次免疫脱除后的样本同时测定蛋白浓度，减少最终结果的误差。
表2、不同处理组对免疫亲和柱再生后性能的影响
由表2可以看出，处理组c再生的免疫亲和柱用于血液样本的高丰度蛋白脱除时，再生5次后的性能与第1次使用时几乎相差无异；而处理组f和处理组i再生1次后的免疫亲和柱，性能就出现了一定程度的下降，尤其是处理组i，再生2次后的蛋白脱除率已明显低于92％，无法再次恢复，原因可能是碱性溶液洗脱会影响免疫亲和柱中的键合抗体活性，减弱抗体与样本中目标蛋白的结合，从而降低免疫亲和柱对血液高丰度蛋白的吸附能力，导致有效使用次数减少。
实施例3：免疫亲和柱最大再生次数评估
本实施例采用实施例1提供的方法使用和洗脱处理免疫亲和柱，进一步评估了再生次数对免疫亲和柱使用效果的影响。
首先将100uL血样分别加入3根全新的免疫亲和柱中，按照标准操作SOP进行免疫脱除，通过BCA蛋白定量试剂盒，准确测定初次免疫脱除后样本的蛋白质量，计算免疫亲和柱初次使用时的蛋白脱除率。然后对免疫亲和柱进行再生，继续将100uL相同的血样分别加入上述3根再生后的免疫亲和柱中，按照标准操作SOP进行免疫脱除，通过BCA蛋白定量试剂盒，准确测定免疫脱除后样本的蛋白质量，计算第1次再生后的免疫亲和柱的蛋白脱除率。按照上述步骤对免疫亲和柱连续再生22次，并计算每次再生后的免疫亲和柱的蛋白脱除率，结果如表3所示。
为了避免血样状态变化引起结果的误差，血样均事先分装保存在-80℃，保证每次使用的血样状态都是一致的。并且，每次血样都要和该次免疫脱除后的样本同时测定蛋白浓度，减少最终结果的误差。
表3、再生次数对免疫亲和柱使用效果的影响
| 免疫亲和柱编号 | 1# | 2# | 3# |
| 初次使用 | 95.2％ | 94.8％ | 95.3％ |
| 第1次再生 | 94.9％ | 95.0％ | 94.9％ |
| 第2次再生 | 95.0％ | 94.7％ | 94.8％ |
| 第3次再生 | 94.9％ | 94.8％ | 94.5％ |
| 第4次再生 | 94.9％ | 94.8％ | 94.6％ |
| 第5次再生 | 94.8％ | 94.7％ | 94.6％ |
| 第6次再生 | 94.6％ | 94.5％ | 94.5％ |
| 第7次再生 | 94.7％ | 94.5％ | 94.4％ |
| 第8次再生 | 94.5％ | 94.4％ | 94.3％ |
| 第9次再生 | 94.3％ | 94.3％ | 94.1％ |
| 第10次再生 | 94.1％ | 94.0％ | 93.8％ |
| 第11次再生 | 93.9％ | 93.9％ | 93.8％ |
| 第12次再生 | 93.6％ | 93.7％ | 93.7％ |
| 第13次再生 | 93.2％ | 93.5％ | 93.4％ |
| 第14次再生 | 93.1％ | 93.2％ | 92.8％ |
| 第15次再生 | 92.9％ | 92.8％ | 92.5％ |
| 第16次再生 | 92.8％ | 92.7％ | 92.6％ |
| 第17次再生 | 92.8％ | 92.7％ | 92.5％ |
| 第18次再生 | 92.6％ | 92.5％ | 92.4％ |
| 第19次再生 | 92.5％ | 92.3％ | 92.1％ |
| 第20次再生 | 92.4％ | 92.2％ | 92.1％ |
| 第21次再生 | 92.1％ | 91.9％ | 91.8％ |
| 第22次再生 | 91.5％ | 91.5％ | 91.1％ |
由表3可知，免疫亲和柱前20次使用时可保持92％以上的蛋白脱除率，满足实验要求。从第21次开始，免疫亲和柱的蛋白脱除率随着使用次数的增加逐渐降低，可能是多次使用后柱中残留的蛋白产生干扰，抑制填料上键合的抗体与样本中目标蛋白的结合。因此，按照本专利所述的方法对免疫亲和柱进行再生，可重复使用20次以上。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种血液高丰度蛋白免疫亲和柱的再生方法，其特征在于，所述再生方法由以下步骤组成：
（1）将使用过的血液高丰度蛋白免疫亲和柱先加入2mL洗脱液A，封闭柱底部截留端，拧紧瓶盖，上下颠倒混匀3次，使填料充分分散，室温下以20rpm的转速旋转孵育5min，弃去洗脱液，1000×g离心2分钟，重复3次；
所述洗脱液A由尿素和甘氨酸-盐酸溶液组成，其中甘氨酸浓度为0.5M，尿素浓度为2.0M，pH为2.5；
（2）加入2mL洗脱液B，封闭柱底部截留端，拧紧瓶盖，上下颠倒混匀3次，使填料充分分散，室温下以20rpm的转速旋转孵育5min，1000×g离心2分钟，弃去洗脱液，重复3次；
所述洗脱液B由氯化钠和甘氨酸-盐酸溶液组成，其中甘氨酸浓度为0.1M，氯化钠浓度为150mM，pH为2.5；
（3）加入2mL中和溶液，封闭柱底部截留端，拧紧瓶盖，上下颠倒混匀3次，使填料充分分散，室温下以20rpm的转速旋转孵育5min，1000×g离心2分钟，弃去洗脱液，重复2次；
所述中和溶液为Tris-HCl溶液，浓度为0.1M，pH为8.0；
（4）加入2mL平衡溶液，1000×g离心2分钟，弃去洗脱液，重复2次；所述平衡溶液为PBS溶液，浓度为20mM，pH为7.4；
（5）加入2mL保存溶液，封闭柱底部截留，拧紧瓶盖，4℃保存；所述保存溶液为含有Proclin300的PBS溶液，其中PBS的浓度为20mM，Proclin300的体积百分含量为0.02%，pH为7.4；
所述使用过的血液高丰度蛋白免疫亲和柱是指使用血液高丰度蛋白免疫亲和柱去除血液中的高丰度蛋白，吸附的高丰度蛋白保留在血液高丰度蛋白免疫亲和柱中；
经所述再生方法获得的血液高丰度蛋白免疫亲和柱可再次用于血液高丰度蛋白的去除，可重复使用20次以上，且保持92%以上的蛋白脱除率。
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