CN110237831A - 用于吸附胆红素的阴离子高分子微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于吸附胆红素的阴离子高分子微球及其制备方法，制备方法包括步骤：在载体材料中引入带有季铵盐的阴离子树脂，得到阴离子高分子微球；其中，载体材料选自树脂、葡聚糖凝胶微球、琼脂糖凝胶和丙烯酸凝胶微球中的一种或者多种；载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂的质量比为1：(0.48～0.62)。本发明提供的阴离子高分子微球无毒、无害，对于直接胆红素和间接胆红素的吸附效果好，对血浆中的其它成分吸附很少，能对胆红素高选择性的去除，并且具有良好的血液相容性；该阴离子高分子微球再生性能好，制备成本和使用成本低，具有很好的应用前景。

Description

用于吸附胆红素的阴离子高分子微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学材料技术领域，具体涉及一种用于吸附胆红素的阴离子高分子微球及其制备方法。
背景技术
胆红素是血液中红细胞的血红素代谢后的废弃物，主要由血红蛋白转化而来，一克血红蛋白能生成34mg胆红素。当红细胞衰老(红细胞生命周期120天)时，会经过脾脏加以破坏处理而产生胆红素，胆红素会经过肝脏作用并由胆管被排至十二指肠中，最后大部分随着粪便而排出体外。正常人每日生成胆红素250～350mg，其中80％～85％来自血液循环中衰老的红细胞，其余15％～20％来自骨髓和肝脏，称为旁路胆红素。胆红素对身体而言是废弃物，血清中胆红素过高时，透露出肝脏病变或胆管阻塞等异常信息，血清胆红素数值的高低代表着异常的严重程度。一般而言，直接胆红素在0.5mg/dl以下、总胆红素在1.3mg/dl以下属正常范围。胆红素是临床上判定黄疸的重要依据，亦是肝功能的重要指标。正常血清总胆红素浓度为1.7～17.1μmol/L，其中一分钟胆红素低于3.4μmol/L。当胆红素超过正常值时即为胆红素高，即高胆红素血症。当总胆红素在34μmol/L时，临床上即可发现黄疸；如血清总胆红素超过正常范围而肉眼看不出黄疸，则称为隐性黄疸，黄疸最常见于肝胆疾病，但其他系统疾病也可出现。高胆红素血症的病人，会发生胆汁性肝硬化，其它脏器也会被胆红素染黄而影响其功能，而且会引起其它综合症。
现在高胆红素血症治疗为血浆置换，但是血浆置换我国血浆严重不足，而且异体血浆存在感染风险，而且丢失营养物质多，患者预后不好。大量研究表明，利用血液净化吸附疗法可以有效地治疗高胆红素血症，此疗法的关键是胆红素吸附材料的性能。近20年来，胆红素吸附材料的研究主要集中在载体和功能基团两方面，依据载体的类型可分为合成树脂类吸附剂和多糖类吸附剂，依据功能基团的类型可分为广谱类吸附剂和亲和吸附剂。然而，目前已有的胆红素吸附材料，还存在吸附容量低、血液相容性差、价格昂贵等缺陷，因此，急需开发新型的胆红素吸附材料来克服现有的缺陷。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种用于吸附胆红素的阴离子高分子微球及其制备方法，该阴离子高分子微球无毒、无害，胆红素吸附效果好，能对胆红素高选择性的去除，并且具有良好的血液相容性；再生性能好，制备和使用成本低。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
本发明提供了一种用于吸附胆红素的阴离子高分子微球的制备方法，包括步骤：在载体材料中引入带有季铵盐的阴离子树脂，得到阴离子高分子微球；其中，载体材料选自树脂、葡聚糖凝胶微球、琼脂糖凝胶和丙烯酸凝胶微球中的一种或者多种；载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂的质量比为1：(0.48～0.62)。
优选地，带有季铵盐的阴离子树脂的制备方法包括步骤：将氯甲基化树脂用二氯甲烷溶胀，然后加入三正丁胺和无水乙醇，在氮气流中回流反应后冷却，过滤，收集固态物质；将固态物质进行洗涤，之后抽干，再进行真空干燥，得到带有季铵盐的阴离子树脂。
进一步优选地，带有季铵盐的阴离子树脂的制备方法中，氯甲基化树脂的质量和三正丁胺的摩尔数的比值是20g：(0.25～0.35)mol，氯甲基化树脂的质量和无水乙醇的体积的比值是20g：(90～110)mL。
进一步优选地，带有季铵盐的阴离子树脂的制备方法中，溶胀的时间是40～50min；回流反应的时间是6～7h；洗涤具体包括步骤：将固态物质用蒸馏水和1moL/L盐酸分别洗涤3次，再用蒸馏水洗涤至中性，最后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；真空干燥的温度是55～65℃，真空干燥的时间是9～10h。
优选地，在载体材料中引入带有季铵盐的阴离子树脂具体包括步骤：利用活化剂将载体材料进行活化反应，得到活化后载体材料，之后和带有季铵盐的阴离子树脂混合，将得到的混合物进行程序升温处理，再降温至常温；其中，活化剂是N，N’-羰基二咪唑溶液。
进一步优选地，N，N’-羰基二咪唑溶液的质量浓度为60～220g/L；载体材料在N，N’-羰基二咪唑溶液中的体积百分比为30％～50％，活化反应的温度为25～37℃，活化反应的时间为1～2小时。
进一步优选地，程序升温处理具体包括：以1.2～1.5℃/min的升温速率升温至89～95℃后保温0.5～1.5h，然后以0.2～0.3℃/min的升温速率继续升温至125～130℃，保温6～8h；程序升温处理过程中持续搅拌，搅拌的速率为100～120r/min；降温的速率为2.1～2.3℃/min。
进一步优选地，和带有季铵盐的阴离子树脂混合之前，还包括将活化后载体材料用双氨基试剂进行处理的步骤，具体包括：在丙酮中加入双氨基试剂，再加入活化后载体材料，之后进行反应，反应结束后依次用水和硼酸缓冲液清洗；其中，丙酮、双氨基试剂、活化后载体材料的体积比为1.0：(0.21～0.25)：(0.43～1.0)；双氨基试剂选自二氨基二丙基亚胺、己二胺、乙二胺中的一种或多种；反应的温度为25～37℃，反应的时间为2～4小时，反应过程在摇床中进行，摇床的转速为120～140r/min；硼酸缓冲液的摩尔浓度为0.10～0.14mol/L，硼酸缓冲液的pH值为8.2。
本发明还保护根据上述任一项方法制备得到的阴离子高分子微球。
本发明还保护根据上述任一项方法制备得到的阴离子高分子微球在吸附胆红素中的应用，包括直接胆红素和间接胆红素。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明提供的阴离子高分子微球无毒、无害，对于直接胆红素和间接胆红素的吸附效果好，能对胆红素高选择性的去除，对血浆中的其它成分吸附很少，并且具有良好的血液相容性；高胆红素血症患者病情的进一步加剧和反复发作率相对较低，并且不存在副作用和不良反应，从而提高高胆红素血症患者的生活质量；(2)本发明提供的阴离子高分子微球制备方法简单，生产成本低；再生性能好，使用成本低，从而降低高胆红素血症患者治疗成本，具有很好的应用前景。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
本发明提供一种用于吸附胆红素的阴离子高分子微球的制备方法，包括步骤：
S101(制备带有季铵盐的阴离子树脂)：将氯甲基化树脂用二氯甲烷溶胀40～50min，然后加入三正丁胺和无水乙醇，在氮气流中回流反应6～7h后冷却，过滤，收集固态物质；其中，氯甲基化树脂的质量和三正丁胺的摩尔数的比值是20g：(0.25～0.35)mol，氯甲基化树脂的质量和无水乙醇的体积的比值是20g：(90～110)mL；
将固态物质用蒸馏水和1moL/L盐酸分别洗涤3次，再用蒸馏水洗涤至中性，最后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤2次，之后抽干，再于55～65℃真空干燥9～10h，得到带有季铵盐的阴离子树脂。
S102(活化载体材料)：利用活化剂N，N’-羰基二咪唑溶液将载体材料进行活化反应，得到活化后载体材料；其中，N，N’-羰基二咪唑溶液的质量浓度为60～220g/L；载体材料在N，N’-羰基二咪唑溶液中的体积百分比为30％～50％，活化反应的温度为25～37℃，活化反应的时间为1～2小时。
S103(制备用于吸附胆红素的阴离子高分子微球)：将活化后载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂混合，将得到的混合物在100～120r/min的搅拌速率下进行程序升温处理，具体为：以1.2～1.5℃/min的升温速率升温至89～95℃后保温0.5～1.5h，然后以0.2～0.3℃/min的升温速率继续升温至125～130℃，保温6～8h，再以2.1～2.3℃/min的降温速率降至常温，得到阴离子高分子微球；其中，载体材料选自树脂、葡聚糖凝胶微球、琼脂糖凝胶和丙烯酸凝胶微球中的一种或者多种；载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂的质量比为1：(0.48～0.62)。
在本发明的进一步实施方式中，还包括将活化后载体材料用双氨基试剂进行处理的步骤，具体包括：
在丙酮中加入双氨基试剂，再加入活化后载体材料，之后在温度为25～37℃、转速为120～140r/min的摇床中反应2～4小时；反应结束后，用6～10倍体积的去离子水反复清洗，再用0.10～0.14mol/L、pH值为8.2的硼酸缓冲液清洗；其中，丙酮、双氨基试剂、活化后载体材料的体积比为1.0：(0.21～0.25)：(0.43～1.0)；双氨基试剂选自二氨基二丙基亚胺、己二胺、乙二胺中的一种或多种。
下面结合具体实施例对本发明提供的用于吸附胆红素的阴离子高分子微球及其制备方法作进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种用于吸附胆红素的阴离子高分子微球的制备方法，包括步骤：
S101(制备带有季铵盐的阴离子树脂)：将氯甲基化树脂用二氯甲烷溶胀45min，然后加入三正丁胺和无水乙醇，在氮气流中回流反应6.5h后冷却，过滤，收集固态物质；其中，氯甲基化树脂的质量和三正丁胺的摩尔数的比值是20g：0.30mol，氯甲基化树脂的质量和无水乙醇的体积的比值是20g：100mL；
将固态物质用蒸馏水和1moL/L盐酸分别洗涤3次，再用蒸馏水洗涤至中性，最后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤2次，之后抽干，再于60℃真空干燥9.5h，得到带有季铵盐的阴离子树脂。
S102(活化载体材料)：利用活化剂N，N’-羰基二咪唑溶液将载体材料进行活化反应，得到活化后载体材料；其中，N，N’-羰基二咪唑溶液的质量浓度为150g/L；载体材料在N，N’-羰基二咪唑溶液中的体积百分比为40％，活化反应的温度为29℃，活化反应的时间为1.5小时；载体材料为琼脂糖凝胶。
S103(制备用于吸附胆红素的阴离子高分子微球)：将活化后载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂混合，将得到的混合物在110r/min的搅拌速率下进行程序升温处理，具体为：以1.38℃/min的升温速率升温至92℃后保温1.1h，然后以0.26℃/min的升温速率继续升温至128℃，保温7h，再以2.2℃/min的降温速率降至常温，得到阴离子高分子微球；其中，载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂的质量比为1：0.56。
实施例2
本实施例提供一种用于吸附胆红素的阴离子高分子微球的制备方法，包括步骤：
S101(制备带有季铵盐的阴离子树脂)：将氯甲基化树脂用二氯甲烷溶胀40min，然后加入三正丁胺和无水乙醇，在氮气流中回流反应6h后冷却，过滤，收集固态物质；其中，氯甲基化树脂的质量和三正丁胺的摩尔数的比值是20g：0.25mol，氯甲基化树脂的质量和无水乙醇的体积的比值是20g：90mL；
将固态物质用蒸馏水和1moL/L盐酸分别洗涤3次，再用蒸馏水洗涤至中性，最后依次用无水乙醇，丙酮各洗涤2次，之后抽干，再于55℃真空干燥9h，得到带有季铵盐的阴离子树脂。
S102(活化载体材料)：利用活化剂N，N’-羰基二咪唑溶液将载体材料进行活化反应，得到活化后载体材料；其中，N，N’-羰基二咪唑溶液的质量浓度为60g/L；载体材料在N，N’-羰基二咪唑溶液中的体积百分比为30％，活化反应的温度为25℃，活化反应的时间为1小时；载体材料为琼脂糖凝胶。
S103(制备用于吸附胆红素的阴离子高分子微球)：将活化后载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂混合，将得到的混合物在100r/min的搅拌速率下进行程序升温处理，具体为：以1.2℃/min的升温速率升温至89℃后保温0.5h，然后以0.2℃/min的升温速率继续升温至125℃，保温6h，再以2.1℃/min的降温速率降至常温，得到阴离子高分子微球；其中，载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂的质量比为1：(0.48～0.62)。
实施例3
本实施例提供一种用于吸附胆红素的阴离子高分子微球的制备方法，包括步骤：
S101(制备带有季铵盐的阴离子树脂)：将氯甲基化树脂用二氯甲烷溶胀50min，然后加入三正丁胺和无水乙醇，在氮气流中回流反应7h后冷却，过滤，收集固态物质；其中，氯甲基化树脂的质量和三正丁胺的摩尔数的比值是20g：0.35mol，氯甲基化树脂的质量和无水乙醇的体积的比值是20g：110mL；
将固态物质用蒸馏水和1moL/L盐酸分别洗涤3次，再用蒸馏水洗涤至中性，最后依次用无水乙醇，丙酮各洗涤2次，之后抽干，再于65℃真空干燥10h，得到带有季铵盐的阴离子树脂。
S102(活化载体材料)：利用活化剂N，N’-羰基二咪唑溶液将载体材料进行活化反应，得到活化后载体材料；其中，N，N’-羰基二咪唑溶液的质量浓度为220g/L；载体材料在N，N’-羰基二咪唑溶液中的体积百分比为50％，活化反应的温度为37℃，活化反应的时间为2小时；载体材料为质量比为1：1的葡聚糖凝胶微球和琼脂糖凝胶的混合物。
S103(制备用于吸附胆红素的阴离子高分子微球)：将活化后载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂混合，将得到的混合物在120r/min的搅拌速率下进行程序升温处理，具体为：以1.5℃/min的升温速率升温至95℃后保温1.5h，然后以0.3℃/min的升温速率继续升温至130℃，保温8h，再以2.3℃/min的降温速率降至常温，得到阴离子高分子微球；其中，载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂的质量比为1：0.62。
实施例4
本实施例提供一种用于吸附胆红素的阴离子高分子微球的制备方法，包括步骤：
S101(制备带有季铵盐的阴离子树脂)：将氯甲基化树脂用二氯甲烷溶胀45min，然后加入三正丁胺和无水乙醇，在氮气流中回流反应6.5h后冷却，过滤，收集固态物质；其中，氯甲基化树脂的质量和三正丁胺的摩尔数的比值是20g：0.30mol，氯甲基化树脂的质量和无水乙醇的体积的比值是20g：100mL；
将固态物质用蒸馏水和1moL/L盐酸分别洗涤3次，再用蒸馏水洗涤至中性，最后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤2次，之后抽干，再于60℃真空干燥9.5h，得到带有季铵盐的阴离子树脂。
S102(活化载体材料)：利用活化剂N，N’-羰基二咪唑溶液将载体材料进行活化反应，得到活化后载体材料；其中，N，N’-羰基二咪唑溶液的质量浓度为150g/L；载体材料在N，N’-羰基二咪唑溶液中的体积百分比为40％，活化反应的温度为29℃，活化反应的时间为1.5小时；载体材料为琼脂糖凝胶。
S103(将活化后载体材料用双氨基试剂进行处理)：在丙酮中加入双氨基试剂，再加入活化后载体材料，之后在温度为31℃、转速为130r/min的摇床中反应3小时；反应结束后，用8倍体积的去离子水反复清洗，再用0.12mol/L、pH值为8.2的硼酸缓冲液清洗，得到处理后载体材料；其中，丙酮、双氨基试剂、活化后载体材料的体积比为1.0：0.23：0.75；双氨基试剂为二氨基二丙基亚胺。
S104(制备用于吸附胆红素的阴离子高分子微球)：将处理后载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂混合，将得到的混合物在110r/min的搅拌速率下进行程序升温处理，具体为：以1.38℃/min的升温速率升温至92℃后保温1.1h，然后以0.26℃/min的升温速率继续升温至128℃，保温7h，再以2.2℃/min的降温速率降至常温，得到阴离子高分子微球；其中，载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂的质量比为1：0.56。
实施例5
本实施例提供一种用于吸附胆红素的阴离子高分子微球的制备方法，包括步骤：
S101(制备带有季铵盐的阴离子树脂)：将氯甲基化树脂用二氯甲烷溶胀40min，然后加入三正丁胺和无水乙醇，在氮气流中回流反应6h后冷却，过滤，收集固态物质；其中，氯甲基化树脂的质量和三正丁胺的摩尔数的比值是20g：0.25mol，氯甲基化树脂的质量和无水乙醇的体积的比值是20g：90mL；
将固态物质用蒸馏水和1moL/L盐酸分别洗涤3次，再用蒸馏水洗涤至中性，最后依次用无水乙醇，丙酮各洗涤2次，之后抽干，再于55℃真空干燥9h，得到带有季铵盐的阴离子树脂。
S102(活化载体材料)：利用活化剂N，N’-羰基二咪唑溶液将载体材料进行活化反应，得到活化后载体材料；其中，N，N’-羰基二咪唑溶液的质量浓度为60g/L；载体材料在N，N’-羰基二咪唑溶液中的体积百分比为30％，活化反应的温度为25℃，活化反应的时间为1小时；载体材料为琼脂糖凝胶。
S103(将活化后载体材料用双氨基试剂进行处理)：在丙酮中加入双氨基试剂，再加入活化后载体材料，之后在温度为25℃、转速为120r/min的摇床中反应2小时；反应结束后，用6倍体积的去离子水反复清洗，再用0.10mol/L、pH值为8.2的硼酸缓冲液清洗，得到处理后载体材料；其中，丙酮、双氨基试剂、活化后载体材料的体积比为1.0：0.21：0.43；双氨基试剂为己二胺。
S104(制备用于吸附胆红素的阴离子高分子微球)：将处理后载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂混合，将得到的混合物在100r/min的搅拌速率下进行程序升温处理，具体为：以1.2℃/min的升温速率升温至89℃后保温0.5h，然后以0.2℃/min的升温速率继续升温至125℃，保温6h，再以2.1℃/min的降温速率降至常温，得到阴离子高分子微球；其中，载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂的质量比为1：(0.48～0.62)。
实施例6
本实施例提供一种用于吸附胆红素的阴离子高分子微球的制备方法，包括步骤：
S101(制备带有季铵盐的阴离子树脂)：将氯甲基化树脂用二氯甲烷溶胀50min，然后加入三正丁胺和无水乙醇，在氮气流中回流反应7h后冷却，过滤，收集固态物质；其中，氯甲基化树脂的质量和三正丁胺的摩尔数的比值是20g：0.35mol，氯甲基化树脂的质量和无水乙醇的体积的比值是20g：110mL；
将固态物质用蒸馏水和1moL/L盐酸分别洗涤3次，再用蒸馏水洗涤至中性，最后依次用无水乙醇，丙酮各洗涤2次，之后抽干，再于65℃真空干燥10h，得到带有季铵盐的阴离子树脂。
S102(活化载体材料)：利用活化剂N，N’-羰基二咪唑溶液将载体材料进行活化反应，得到活化后载体材料；其中，N，N’-羰基二咪唑溶液的质量浓度为220g/L；载体材料在N，N’-羰基二咪唑溶液中的体积百分比为50％，活化反应的温度为37℃，活化反应的时间为2小时；载体材料为质量比为1：1的葡聚糖凝胶微球和琼脂糖凝胶的混合物。
S103(将活化后载体材料用双氨基试剂进行处理)：在丙酮中加入双氨基试剂，再加入活化后载体材料，之后在温度为37℃、转速为140r/min的摇床中反应4小时；反应结束后，用10倍体积的去离子水反复清洗，再用0.14mol/L、pH值为8.2的硼酸缓冲液清洗，得到处理后载体材料；其中，丙酮、双氨基试剂、活化后载体材料的体积比为1.0：0.25：1.0；双氨基试剂为二氨基二丙基亚胺。
S104(制备用于吸附胆红素的阴离子高分子微球)：将处理后载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂混合，将得到的混合物在120r/min的搅拌速率下进行程序升温处理，具体为：以1.5℃/min的升温速率升温至95℃后保温1.5h，然后以0.3℃/min的升温速率继续升温至130℃，保温8h，再以2.3℃/min的降温速率降至常温，得到阴离子高分子微球；其中，载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂的质量比为1：0.62。
对比例1
本对比例提供一种用于吸附胆红素的阴离子高分子微球的制备方法，包括步骤：
S101(活化载体材料)：利用活化剂N，N’-羰基二咪唑溶液将载体材料进行活化反应，得到活化后载体材料；其中，N，N’-羰基二咪唑溶液的质量浓度为150g/L；载体材料在N，N’-羰基二咪唑溶液中的体积百分比为40％，活化反应的温度为29℃，活化反应的时间为1.5小时；载体材料为琼脂糖凝胶。
S102(将活化后载体材料用双氨基试剂进行处理)：在丙酮中加入双氨基试剂，再加入活化后载体材料，之后在温度为31℃、转速为130r/min的摇床中反应3小时；反应结束后，用8倍体积的去离子水反复清洗，再用0.12mol/L、pH值为8.2的硼酸缓冲液清洗，得到处理后载体材料；其中，丙酮、双氨基试剂、活化后载体材料的体积比为1.0：0.23：0.75；双氨基试剂为二氨基二丙基亚胺。
S103(制备阴离子高分子微球)：将处理后载体材料和市面上购买的带有季铵盐的阴离子树脂混合，将得到的混合物在110r/min的搅拌速率下进行程序升温处理，具体为：以1.38℃/min的升温速率升温至92℃后保温1.1h，然后以0.26℃/min的升温速率继续升温至128℃，保温7h，再以2.2℃/min的降温速率降至常温，得到阴离子高分子微球；其中，载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂的质量比为1：0.56。
对比例2
本对比例提供一种用于吸附胆红素的阴离子高分子微球的制备方法，包括步骤：
S101(制备带有季铵盐的阴离子树脂)：将氯甲基化树脂用二氯甲烷溶胀45min，然后加入三正丁胺和无水乙醇，在氮气流中回流反应6.5h后冷却，过滤，收集固态物质；其中，氯甲基化树脂的质量和三正丁胺的摩尔数的比值是20g：0.30mol，氯甲基化树脂的质量和无水乙醇的体积的比值是20g：100mL；
将固态物质用蒸馏水和1moL/L盐酸分别洗涤3次，再用蒸馏水洗涤至中性，最后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤2次，之后抽干，再于60℃真空干燥9.5h，得到带有季铵盐的阴离子树脂。
S102(活化载体材料)：利用活化剂N，N’-羰基二咪唑溶液将载体材料进行活化反应，得到活化后载体材料；其中，N，N’-羰基二咪唑溶液的质量浓度为150g/L；载体材料在N，N’-羰基二咪唑溶液中的体积百分比为40％，活化反应的温度为29℃，活化反应的时间为1.5小时；载体材料为琼脂糖凝胶。
S103(将活化后载体材料用双氨基试剂进行处理)：在丙酮中加入双氨基试剂，再加入活化后载体材料，之后在温度为31℃、转速为130r/min的摇床中反应3小时；反应结束后，用8倍体积的去离子水反复清洗，再用0.12mol/L、pH值为8.2的硼酸缓冲液清洗，得到处理后载体材料；其中，丙酮、双氨基试剂、活化后载体材料的体积比为1.0：0.23：0.75；双氨基试剂为二氨基二丙基亚胺。
S104(制备阴离子高分子微球)：将处理后载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂混合，将得到的混合物在110r/min的搅拌速率下升温至128℃，保温10h，再以2.2℃/min的降温速率降至常温，得到阴离子高分子微球；其中，载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂的质量比为1：0.56。
对比例3
本对比例提供一种用于吸附胆红素的阴离子高分子微球的制备方法，包括步骤：
S101(制备带有季铵盐的阴离子树脂)：将氯甲基化树脂用二氯甲烷溶胀45min，然后加入三正丁胺和无水乙醇，在氮气流中回流反应6.5h后冷却，过滤，收集固态物质；其中，氯甲基化树脂的质量和三正丁胺的摩尔数的比值是20g：0.30mol，氯甲基化树脂的质量和无水乙醇的体积的比值是20g：100mL；
将固态物质用蒸馏水和1moL/L盐酸分别洗涤3次，再用蒸馏水洗涤至中性，最后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤2次，之后抽干，再于60℃真空干燥9.5h，得到带有季铵盐的阴离子树脂。
S102(将载体材料用双氨基试剂进行处理)：在丙酮中加入双氨基试剂，再加入载体材料琼脂糖凝胶，之后在温度为31℃、转速为130r/min的摇床中反应3小时；反应结束后，用8倍体积的去离子水反复清洗，再用0.12mol/L、pH值为8.2的硼酸缓冲液清洗，得到处理后载体材料；其中，丙酮、双氨基试剂、载体材料的体积比为1.0：0.23：0.75；双氨基试剂为二氨基二丙基亚胺。
S1034(制备阴离子高分子微球)：将处理后载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂混合，将得到的混合物在110r/min的搅拌速率下进行程序升温处理，具体为：以1.38℃/min的升温速率升温至92℃后保温1.1h，然后以0.26℃/min的升温速率继续升温至128℃，保温7h，再以2.2℃/min的降温速率降至常温，得到阴离子高分子微球；其中，载体材料和带有季铵盐的阴离子树脂的质量比为1：0.56。
通过对本发明实施例1至实施例6制备得到的用于吸附胆红素的阴离子高分子微球进行试验来评价其效果，并以对比例1至对比例3制备得到的阴离子高分子微球作为对照。
1、胆红素免疫吸附柱的离体实验
将本发明实施例1至实施例6、对比例1至对比例3制备得到的用于吸附胆红素的阴离子高分子微球5mg装于Φ10×100mm的层析柱中，用生理盐水充分冲洗柱子，分别取相同的110mL患高胆红素血症病人的血浆分别过不同组别的胆红素免疫吸附柱循环30分钟，分析过柱前后血液中主要成分的变化，得到的结果如下表1所示。其中，直接胆红素实验前的含量均为129.15μmol/L，间接胆红素实验前的含量均为213.42μmol/L，总蛋白实验前的含量均为54.5g/L，谷丙转氨酶实验前的含量均为66.8U/L，胆固醇实验前的含量均为1.38mmol/L。
表1胆红素免疫吸附柱的离体实验结果
从上述实验结果可知，本发明实施例1至实施例6制备得到的用于吸附胆红素的阴离子高分子微球对直接胆红素、间接胆红素有很强的吸附能力，对血浆中的其它成分吸附很少，说明该发明实施例1至实施例6提供的用于吸附胆红素的阴离子高分子微球选择性较好，并且实施例4至实施例6的效果好于实施例1至实施例3的效果；对比例1和对比例3制备得到的阴离子高分子微球对直接胆红素、间接胆红素的吸附能力较弱，对比例2制备得到的阴离子高分子微球对直接胆红素、间接胆红素和血浆中其他成分的吸附能力均较强，其吸附的选择性差。
2、用于吸附胆红素的阴离子高分子微球的再生性能实验
将本发明实施例1至实施例6、对比例1至对比例3制备得到的用于吸附胆红素的阴离子高分子微球5mg装于Φ10×100mm的层析柱中，用生理盐水充分冲洗柱子，分别取相同的110mL患高胆红素血症病人的血浆分别过不同组别的胆红素免疫吸附柱循环30分钟，用含有1M NaCl、0.02％的吐温-80、pH值为7.5的0.05M磷酸缓冲液作为洗脱剂将吸附在阴离子高分子微球上的胆红素等物质洗脱下来，洗脱的整个过程大概需要20～30分钟。洗脱完毕后，用生理盐水将柱中的洗脱剂置换出来，再分别取相同的110mL患高胆红素血症病人的血浆分别过不同组别的胆红素免疫吸附柱循环30分钟。重复以上操作6次，每次都分析过柱前后血浆中的主要成分，确定对总胆红素的吸附容量。得到的结果如下表2所示。
表2用于吸附胆红素的阴离子高分子微球的再生性能实验结果
从上述实验结果可知，本发明实施例1至实施例6制备得到的用于吸附胆红素的阴离子高分子微球再生性能均很强，并且实施例4至实施例6的效果好于实施例1至实施例3的效果；对比例1至对比例3制备得到的阴离子高分子微球再生性能均较弱。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims (10)

1.一种阴离子高分子微球的制备方法，其特征在于，包括步骤：
在载体材料中引入带有季铵盐的阴离子树脂，得到所述阴离子高分子微球；其中，所述载体材料选自树脂、葡聚糖凝胶微球、琼脂糖凝胶和丙烯酸凝胶微球中的一种或者多种；所述载体材料和所述带有季铵盐的阴离子树脂的质量比为1：(0.48～0.62)。
2.根据权利要求1所述的阴离子高分子微球的制备方法，其特征在于，所述带有季铵盐的阴离子树脂的制备方法包括步骤：
将氯甲基化树脂用二氯甲烷溶胀，然后加入三正丁胺和无水乙醇，在氮气流中回流反应后冷却，过滤，收集固态物质；
将所述固态物质进行洗涤，之后抽干，再进行真空干燥，得到所述带有季铵盐的阴离子树脂。
3.根据权利要求2所述的阴离子高分子微球的制备方法，其特征在于：
所述氯甲基化树脂的质量和所述三正丁胺的摩尔数的比值是20g：(0.25～0.35)mol，所述氯甲基化树脂的质量和所述无水乙醇的体积的比值是20g：(90～110)mL。
4.根据权利要求2所述的阴离子高分子微球的制备方法，其特征在于：
所述溶胀的时间是40～50min；
所述回流反应的时间是6～7h；
所述洗涤具体包括步骤：将所述固态物质用蒸馏水和1moL/L盐酸分别洗涤3次，再用蒸馏水洗涤至中性，最后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；
所述真空干燥的温度是55～65℃，所述真空干燥的时间是9～10h。
5.根据权利要求1所述的阴离子高分子微球的制备方法，其特征在于，在所述载体材料中引入所述带有季铵盐的阴离子树脂具体包括步骤：
利用活化剂将载体材料进行活化反应，得到活化后载体材料，之后和所述带有季铵盐的阴离子树脂混合，将得到的混合物进行程序升温处理，再降温至常温；
其中，所述活化剂是N，N’-羰基二咪唑溶液。
6.根据权利要求5所述的阴离子高分子微球的制备方法，其特征在于：
所述N，N’-羰基二咪唑溶液的质量浓度为60～220g/L；所述载体材料在所述N，N’-羰基二咪唑溶液中的体积百分比为30％～50％，所述活化反应的温度为25～37℃，所述活化反应的时间为1～2小时。
7.根据权利要求5所述的阴离子高分子微球的制备方法，其特征在于：
所述程序升温处理具体包括：以1.2～1.5℃/min的升温速率升温至89～95℃后保温0.5～1.5h，然后以0.2～0.3℃/min的升温速率继续升温至125～130℃，保温6～8h；所述程序升温处理过程中持续搅拌，所述搅拌的速率为100～120r/min；
所述降温的速率为2.1～2.3℃/min。
8.根据权利要求5所述的阴离子高分子微球的制备方法，其特征在于：
和所述带有季铵盐的阴离子树脂混合之前，还包括将活化后载体材料用双氨基试剂进行处理的步骤，具体包括：
在丙酮中加入双氨基试剂，再加入所述活化后载体材料，之后进行反应，反应结束后依次用水和硼酸缓冲液清洗；
其中，所述丙酮、所述双氨基试剂、所述活化后载体材料的体积比为1.0：(0.21～0.25)：(0.43～1.0)；所述双氨基试剂选自二氨基二丙基亚胺、己二胺、乙二胺中的一种或多种；
所述反应的温度为25～37℃，所述反应的时间为2～4小时，反应过程在摇床中进行，所述摇床的转速为120～140r/min；
所述硼酸缓冲液的摩尔浓度为0.10～0.14mol/L，所述硼酸缓冲液的pH值为8.2。
9.权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的阴离子高分子微球。
10.权利要求9所述的阴离子高分子微球在吸附胆红素中的应用。
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