CN107011433B

CN107011433B - 一种葛仙米藻胆蛋白的提取、纯化方法及纯化的藻蓝蛋白

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Publication number: CN107011433B
Application number: CN201710447907.6A
Authority: CN
Inventors: 余佳; 张瑞华; 王玉兰; 占豪; 陈盛; 王维
Original assignee: Hunan Yandi Biological Engineering Co ltd
Current assignee: Hunan Yandi Biological Engineering Co ltd
Priority date: 2017-06-14
Filing date: 2017-06-14
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2037-06-14
Also published as: CN107011433A; WO2018227665A1

Abstract

本发明公开了一种葛仙米藻蓝蛋白的纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)选用阴离子交换柱过柱；(2)配置Tris‑HCl缓冲液Buffer A、Tris‑HCl‑NaCl缓冲液Buffer B；(3)葛仙米藻胆蛋白粗提粉末用Buffer A溶解，离心，过滤；(4)洗泵，用Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；(5)将步骤(3)制备的溶解于Buffer A中的葛仙米藻胆蛋白直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集洗脱液；(6)用盐溶液清洗离子交换柱，然后用碱溶液反向冲洗；(7)对淋洗液进行超滤浓缩，透析，得到纯化的葛仙米藻蓝蛋白水溶液。本发明的方法操作简单，得到的葛仙米藻蓝蛋白浓度和纯度都得到显著提高，适于工业化大规模生产。

Description

一种葛仙米藻胆蛋白的提取、纯化方法及纯化的藻蓝蛋白

技术领域

本发明涉及一种高效提取及纯化葛仙米藻胆蛋白的方法和纯化的藻蓝蛋白。

背景技术

葛仙米(Nostoc sphaeroids Kutzing)，学名拟球状念珠藻，属蓝藻门(Nostocaceae)念珠藻属(Nostoc.)，与发菜同属，古称天仙米、天仙菜，又名水木耳、田木耳、地木耳(Nostoc commune vauch)，是我国传统出口的珍贵药食两用固氮蓝藻。它是一种多细胞的丝状植物，其细胞结构简单、个体由圆球形细胞组成不分枝的单列丝状体，丝状体呈念珠状，群体呈胶质状、球状或其他不规则形状，蓝绿色或黄褐色，肉眼可见，具有固氮能力。《本草纲目》、《药性考》、《全国中草药汇编》等称葛仙米的功效为明目益气、令人有子、解热清隔、利肠胃、痰火能疗、久食延年、消除疲劳、收敛、治夜盲症、烫火伤等功效。

藻胆蛋白是广泛存在于与红藻、蓝绿藻和隐藻的藻胆体(Phycobilisomes，PBS)中的捕光色素蛋白，包括藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)、藻红蛋白(Phycoerythrim，PE)、藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanin，PEC)和别藻胆蛋白(Allphycocyanin，APC)四类。葛仙米藻胆蛋白含量丰富，优于其他藻类。藻蓝蛋白是一类附加值非常高的荧光色素蛋白，可用作可溶性抗原、抗体检测诊断试剂、荧光探针、荧光标记等用于免疫分析，其纯度越高售价剧增。

藻胆蛋白的纯化通常首先需要经过如盐析法、等电点法或者结晶法初步分离除去杂蛋白后，再通过柱层析法纯化，包括羟基石灰石吸附层析法、纤维素系列离子交换层析法、亲和层析和分子排阻层析法。

在藻胆蛋白粗提粉中，杂蛋白含量极高。要分离得到商品应用标准的藻蓝蛋白，用己报道的藻胆蛋白分离纯化方法，操作复杂，导致生产成本太高无法大量制备以满足潜在的市场需求。因此，有必要开发一种简单有效的适合大量制备分离纯化藻蓝蛋白的方法，为实现葛仙米藻蓝蛋白的工业化生产提供技术基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效提取及纯化葛仙米藻蓝蛋白的方法及纯化的藻蓝蛋白。

为实现上述目的，本发明提供了一种葛仙米藻胆蛋白的提取方法，包括以下步骤：(a) 将葛仙米干粉加入水中；(b)加入液氮，不断搅拌，待液氮挥发完全；(c)离心过滤，得到葛仙米藻胆蛋白提取液；(d)冷冻干燥得到葛仙米藻胆蛋白粗提粉末。

步骤(a)中，所述水可以是纯水、去离子水、蒸馏水等。

步骤(a)中，所述葛仙米干粉和水的质量比为1:40～1:70；优选地，为1:50，或1:60。

步骤(b)中，所述液氮的加入量为葛仙米干粉和水总质量的0.5％～1％。

步骤(b)中，所述搅拌的时间为4h-10h；优选地，为6h。

步骤(c)中，所述离心的转速为5000rpm-8000rpm；离心的时间为20min-30min；可以采用碟式离心机离心过滤。

本发明还提供了一种葛仙米藻蓝蛋白的纯化方法，包括以下步骤：(1)选用阴离子交换柱过柱；(2)配置Tris-HCl缓冲液BufferA、Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；(3)葛仙米藻胆蛋白粗提粉末用BufferA溶解，离心，过滤；(4)洗泵，用BufferA缓冲液平衡离子交换柱；(5)将步骤(3)制备的溶解于BufferA中的藻胆蛋白直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集洗脱液；(6)用盐溶液清洗离子交换柱，然后用碱溶液反向冲洗；(7)对步骤(5)的洗脱液进行超滤浓缩，透析，得到纯化的葛仙米藻蓝蛋白水溶液；(8)步骤(7) 得到的葛仙米藻蓝蛋白水溶液0～10℃保存。

步骤(1)中，优选地，所述过柱前可先用去离子水置换阴离子交换柱中的20％的乙醇水，其目的是阴离子交换柱用20％的乙醇水保存，使用前应该将其置换掉。

步骤(1)中，所述阴离子交换柱为Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱；所述阴离子交换柱的介质为粒径为50～150μm，交联度为6％的琼脂糖凝胶组成；优选地，为粒经为90μm，交联度为6％的交联琼脂糖凝胶组成；所述琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，琼脂糖凝胶的结构是稳定的，可以在许多条件下使用(如水，pH4-9范围内的盐溶液)；琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。交联琼脂糖凝胶是生物分离中常用的色谱基质，利用不同的功能基对其表面的羟基进行修饰，进而制备出疏水色谱、离子交换色谱和亲和色谱等商业填料。

步骤(2)中，所述Tris-HCl缓冲液的pH为6～6.8，电导率为4～8μs/cm；优选地，pH为 6.5～6.8，电导率为6～8μs/cm；进一步优选地，pH为6.6、6.8，电导率分别为6μs/cm、8μs/cm。

步骤(2)中，所述Tris-HCl-NaCl缓冲液的pH为5～6.8，电导率为4～8.5μs/cm；优选地， pH为6.5～6.8，电导率为6～8μs/cm；进一步优选地，pH为6.5、6.8，电导率分别为6μs/cm、 8μs/cm。

步骤(2)中，进一步优选地，Tris-HCl缓冲液pH为6时，电导率为4μs/cm时，Tris-HCl-NaCl 缓冲液pH为6，电导率为4μs/cm；或，Tris-HCl缓冲液pH为6.5时，电导率为6μs/cm时， Tris-HCl-NaCl缓冲液pH为6.5，电导率为6μs/cm；或，Tris-HCl缓冲液pH为6.8时，电导率为8μs/cm时，Tris-HCl-NaCl缓冲液pH为6.8，电导率为8μs/cm。

步骤(2)中，所述Tris-HCl缓冲液的配制方法为查阅不同pH值的Tris-HCl量，加水配置，最后用HCl调节准确的pH值；所述Tris-HCl-NaCl缓冲液的配制方法为查阅不同pH值的Tris-HCl量，加水配置，最后用HCl调节准确的pH值，加入NaCl，边加边检测电导率，直至符合目标要求。

步骤(2)中，所述过滤是指用0.2μm的过滤膜减压过滤，除去固体杂质；采用减压泵减压抽滤的方法进行减压。

步骤(3)中，所述葛仙米藻胆蛋白粗提粉末可以按上述方法制备得到；或所述葛仙米藻胆蛋白粗提粉末是由葛仙米干粉和纯水(料液比1:60)提取6h，过滤，冷冻干燥得到。

步骤(3)中，所述葛仙米藻胆蛋白粗提粉末、PB缓冲液的用量比5g:1L～15g:1L；优选地，为10g:1L。

步骤(3)中，所述离心转速可以但不限于5000～10000r/min，如8000r/min。

步骤(3)中，所述离心时间为20min～40min；优选地，为30min。

步骤(3)中，所述过滤用优选采用0.2μm的滤膜过滤。

步骤(4)中，所述洗泵时用去离子水洗1～1.5个柱体积；优选地，用去离子水洗1个柱体积。

步骤(4)中，所述平衡过程用4～6个柱体积的Tris-HCl缓冲液；优选地，用5个柱体积的Tris-HCl缓冲液BufferA。

步骤(5)中，所述Tris-HCl缓冲液的pH为6～6.8，电导率为4～8μs/cm；优选地，pH为 6.5～6.8，电导率为6～8μs/cm；进一步优选地，pH为6.6、6.8，电导率分别为6μs/cm、8μs/cm。

步骤(5)中，所述Tris-HCl-NaCl缓冲液的pH为6～6.8，电导率为4～8μs/cm；优选地， pH为6.5～6.8，电导率为6～8μs/cm；进一步优选地，pH为6.5、6.8，电导率分别为6μs/cm、 8μs/cm。

步骤(5)中，进一步优选地，Tris-HCl缓冲液pH为6，电导率为4μs/cm时，Tris-HCl-NaCl 缓冲液pH为6，电导率为4μs/cm；或，Tris-HCl缓冲液pH为6.8，电导率为8μs/cm时，Tris-HCl-NaCl缓冲液pH为6.8，电导率为8μs/cm。

步骤(5)中，所述上样量为2-4个柱体积；优选地，为2、2.5、3、4个柱体积。

步骤(5)中，所述收集的洗脱液为4～5个柱体积45～100％的洗脱液。

步骤(6)中，所述盐溶液优选为NaCl或KCl，所述盐溶液的浓度为0.02～0.1M；优选地，为0.05M。

步骤(6)中，所述盐溶液的用量为1～2个柱体积。

步骤(6)中，所述碱溶液优选为NaOH或KOH，所述碱溶液的浓度为0.1～0.5M；优选地，为0.1M。

步骤(6)中，所述碱溶液的用量为3～4个柱体积。

步骤(7)中，所述超滤膜孔径为1000D～8000D；优选地，为3000D。

步骤(7)中，所述透析可采用任何常规透析方法进行。

步骤(8)中，所述水溶液保存的温度优选为4℃。

具体地，本发明藻蓝蛋白的纯化方法，包括以下步骤：将葛仙米藻胆蛋白粗提粉末用pH 为6～6.8、电导率为4～8μs/cm的Tris-HCl缓冲液BufferA溶解，8000r/min离心30min，用20μm 的滤膜过滤；用去离子水置换的6％的交联琼脂糖凝胶介质灌柱，用1个柱体积的去离子水洗泵，5个柱体积的缓冲液BufferA平衡，上样4个柱体积，收集pH为6～6.8、电导率为4～8μs/cm 的Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B的梯度洗脱液4～5个柱体积，用3000D的超滤膜超滤浓缩，透析，水溶液4℃保存。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

i)本发明选用的阴离子交换柱如Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱显著提高了纯化效率，省去现有纯化方法中需采用硫酸铵沉淀的步骤，并且大大提高了藻蓝蛋白的浓度和纯度，方法简单，效果明显，可处理量大，为工业化应用提供了基础。

ii)本发明选用的上样条件经实验证明上样量大，一次可纯化的蛋白样品多，纯化方法简单，成本低，大大提高了藻红蛋白的纯化效率，为实现工业化大生产提供基础。

iii)本发明可以去除藻胆蛋白粗提粉末中大部分的杂质，使得藻蓝蛋白的提取率接近 100％，损失量少。

iv)本发明可以将藻蓝蛋白的纯度提纯到90％以上，甚至更高。

v)本发明纯化的藻蓝蛋白，产品附加值高，可应用于化妆品、食品、保健食品以及生物医药等领域，有广阔的开发前景。

附图说明

图1表示实施例7中纯化的藻蓝蛋白的凝胶过滤色谱图。凝胶过滤层析根据蛋白质的分子量的不同在不同的时间出峰，经过峰面积与总面积的比值计算得到每次检测样品的纯度。根据出峰位置估算藻蓝蛋白的相对分子量为50KD-54KD。

图2表示实施例7中纯化的藻蓝蛋白与藻蓝蛋白对照品的紫外光谱(1.藻蓝蛋白；2.藻蓝蛋白标准品)。通过对比，两个样品的出峰位置基本相同，有相近的共轭结构，是同类样品。

图3表示实施例7中纯化的藻蓝蛋白与藻蓝蛋白对照品的荧光光谱(1.藻蓝蛋白；2.藻蓝蛋白标准品)。通过对比，两个样品的出峰位置相同，说明是同类样品。

图4表示三组分SGS-PAGE分析图(1：Marker(Mr从下至上分别是14.3kD、20.1kD、29.0kD、44.3kD、66.4kD、97.2kD)；2：按本发明上述方法制备的藻胆蛋白粗提粉末；3：藻红蛋白；4：实施例7纯化的藻蓝蛋白)根据电泳数据分析藻蓝蛋白的亚基分子量约为17kD、18kD、19kD。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。实施例中未注明的具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

本发明藻蓝蛋白的浓度的检测方法为考马斯亮蓝G250染色法，测定波长为595nm处的吸光值，按李合生的《植物生理生化实验原理和技术》记载方法绘制标准曲线并计算，购买藻蓝蛋白标准品所测得的藻蓝蛋白标准曲线为OD₅₉₅＝0.5919c+0.0062，R²＝0.9975；；浓度的计算方法为：浓度c＝(OD₅₉₅-0.0062)÷0.5919。

本发明藻蓝蛋白的纯度检测由紫外吸收光谱仪检测，纯度的计算方法为：

纯度＝A₆₂₀/A₂₈₀；纯度％＝A₆₂₀/(A₆₂₀+A₂₈₀)×100％。

实施例1采用DEAE-Cellulose 52阴离子交换柱进行实验室小试纯化藻蓝蛋白

将50.01g、50.03g、49.99g葛仙米干粉分别加入2500mL纯水，搅拌均匀后加入20mL液氮，边加边剧烈搅拌。待液氮挥发完全后，继续搅拌，待碎冰完全溶解，离心过滤，冷冻干燥分别得到9.96g、10.02g、9.98g葛仙米藻胆蛋白粗提粉末，分别用pH为7.0、电导率为3.6μs/cm 的Tris-HCl缓冲液BufferA溶解，8000r/min离心30min，用0.2μm的滤膜过滤；采用DEAE-52 阴离子交换柱过柱：1)用1个柱体积的去离子水洗泵；2)用5个柱体积的缓冲液BufferA 平衡；3)上样2个柱体积。收集45～100％pH为7.0、电导率为3.6μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，结果见下表1：

表1

	藻蓝蛋白浓度(g/mL)	纯度	纯度(％)
				第一次	0.93	4.3	81
第二次	0.93	4.3	81
				第三次	0.93	4.3	81

由上表1可见，三次纯化得到藻蓝蛋白浓度均值为0.93g/mL，纯度均值为4.3(81％)。经过三次重复实验验证了本实验有很好的重现性。但是纯化的藻蓝蛋白的纯度和浓度偏低，可见DEAE-Cellulose 52阴离子交换柱纯化藻蓝蛋白效率不高，效果差。

实施例2采用DEAE-Cpato阴离子交换柱进行实验室小试纯化藻蓝蛋白

将50.01g、50.03g、49.99g葛仙米干粉分别加入2500mL纯水，搅拌均匀后加入20mL液氮，边加边剧烈搅拌。待液氮挥发完全后，继续搅拌，待碎冰完全溶解，离心过滤，冷冻干燥分别得到10.01g、10.03g、9.91g葛仙米藻胆蛋白粗提粉末，分别用pH为7.0、电导率为3.6μs/cm的Tris-HCl缓冲液BufferA溶解，8000r/min离心30min，用0.2μm的滤膜过滤；采用DEAE-Cpato阴离子交换柱过柱：1)用1个柱体积的去离子水洗泵；2)用5个柱体积的缓冲液BufferA平衡；3)上样2个柱体积。收集45～100％pH为7.0、电导率为3.6μs/cm的 Tris-HCl-NaCl洗脱液，结果见下表2：

表2

	藻蓝蛋白浓度(g/mL)	纯度	纯度(％)
				第一次	1.03	4.9	83
第二次	1.03	4.9	83
				第三次	1.03	4.9	83

由上表2可见，三次纯化得到藻蓝蛋白浓度均值为1.03g/mL，纯度均值为4.9(83％)。经过三次重复实验验证了本实验有很好的重现性。同样，纯化的藻蓝蛋白的纯度和浓度偏低，可见DEAE-Cpato柱纯化藻蓝蛋白效率不高，效果不好。

实施例3采用DEAE-Sephadex Fast Flow阴离子交换柱进行实验室小试纯化藻蓝蛋白

将50.01g、50.03g、49.99g葛仙米干粉分别加入2500mL纯水，搅拌均匀后加入20mL液氮，边加边剧烈搅拌。待液氮挥发完全后，继续搅拌，待碎冰完全溶解，离心过滤，冷冻干燥分别得到10.06g、9.97g、10.01g葛仙米藻胆蛋白粗提粉末，分别用pH为7.0、电导率为3.6μs/cm的Tris-HCl缓冲液BufferA溶解，8000r/min离心30min，用0.2μm的滤膜过滤；采用DEAE-Sephadex Fast Flow阴离子交换柱过柱：1)用1个柱体积的去离子水洗泵；2)用5个柱体积的缓冲液BufferA平衡；3)上样1个柱体积，收集45～100％pH为7.0、电导率为 3.6μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，结果见下表3：

表3

	藻蓝蛋白浓度(g/mL)	纯度	纯度(％)
				第一次	1.00	5.6	85
第二次	1.00	5.6	85
				第三次	1.00	5.6	85

由上表3可见，三次纯化得到藻蓝蛋白浓度均值为1.00g/mL，纯度均值为5.6(85％)。经过三次重复实验验证了本实验有很好的重现性。但是纯化的藻蓝蛋白的纯度和浓度不高，可见DEAE-Sephadex Fast Flow柱纯化藻蓝蛋白虽然较以上两种阴离子交换柱纯度稍有提高，但是效率仍然不高，效果较差。

实施例4采用Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱进行实验室小试纯化藻蓝蛋白

将50.01g、50.03g、49.99g葛仙米干粉分别加入2500mL纯水，搅拌均匀后加入20mL液氮，边加边剧烈搅拌。待液氮挥发完全后，继续搅拌，待碎冰完全溶解，离心过滤，冷冻干燥分别得到9.98g、10.01g、10.01g葛仙米藻胆蛋白粗提粉末，分别用pH为7.0、电导率为3.6μs/cm的Tris-HCl缓冲液BufferA溶解，8000r/min离心30min，用0.2μm的滤膜过滤；采用Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱过柱：1)用1个柱体积的去离子水洗泵；2)用5个柱体积的缓冲液BufferA平衡；3)上样2个柱体积。收集45～100％pH为7.0、电导率为3.6μs/cm 的Tris-HCl-NaCl洗脱液，结果见下表4：

表4

	藻蓝蛋白浓度(g/mL)	纯度	纯度(％)
				第一次	2.21	10.2	91.7
第二次	2.21	10.2	91.7
				第三次	2.21	10.2	91.7

由上表4可见，三次纯化得到藻蓝蛋白浓度均值为2.21g/mL，纯度均值为10.2(91.7％)。经过三次重复实验验证了本实验有很好的重现性。另外，经Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱纯化的藻蓝蛋白的纯度和浓度均有显著提高，可见藻蓝蛋白的纯化方法适合采用Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱。

实施例5采用本发明方法进行实验室小试纯化藻蓝蛋白

将60.05g、60.01g、60.02g葛仙米干粉分别加入3000mL纯水，搅拌均匀后加入25mL液氮，边加边剧烈搅拌。待液氮挥发完全后，继续搅拌，待碎冰完全溶解，离心过滤，冷冻干燥分别得到12.480g、12.51g、12.50g葛仙米藻胆蛋白粗提粉末用pH为6.0、电导率为4.0μs/cm 的Tris-HCl缓冲液BufferA溶解，8000r/min离心30min，用0.2μm的滤膜过滤；采用Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱过柱：1)用1个柱体积的去离子水洗泵；2)用5个柱体积的缓冲液 BufferA平衡；3)上样2.5个柱体积。收集45～100％pH为6.0、电导率为4μs/cm的Tris-HCl-NaCl 洗脱液，结果见下表5：

表5

	藻蓝蛋白浓度(g/mL)	纯度	纯度(％)
				第一次	2.61	12.0	92.3
第二次	2.61	12.0	92.3
				第三次	2.61	12.0	92.3

由上表5可见，三次纯化得到藻蓝蛋白浓度均值为2.61g/mL，纯度均值为12.0(92.3％)。经过三次重复实验验证了本实验有很好的重现性。另外，经Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱纯化的藻蓝蛋白的纯度和浓度均有显著提高，可见Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱适用于藻蓝蛋白的纯化。

实施例6采用本发明方法进行实验室小试纯化藻蓝蛋白

将75.11g、75.08g、75.10g葛仙米干粉分别加入3750mL纯水，搅拌均匀后加入30mL液氮，边加边剧烈搅拌。待液氮挥发完全后，继续搅拌，待碎冰完全溶解，离心过滤，冷冻干燥分别得到15.10g、15.02g、15.08g葛仙米藻胆蛋白粗提粉末用pH为6.5、电导率为6.0μs/cm 的Tris-HCl缓冲液BufferA溶解，8000r/min离心30min，用0.2μm的滤膜过滤；采用Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱过柱：1)用1个柱体积的去离子水洗泵；2)用5个柱体积的缓冲液 BufferA平衡；3)上样3个柱体积。收集45～100％pH为6.5、电导率为6.0μs/cm的Tris-HCl-NaCl 洗脱液，结果见下表6：

表6

	藻蓝蛋白浓度(g/mL)	纯度	纯度(％)
				第一次	3.13	14.8	93.6
第二次	3.13	14.8	93.6
				第三次	3.13	14.8	93.6

由上表6可见，三次纯化得到藻蓝蛋白浓度均值为3.13g/mL，纯度均值为14.8(93.6％)。经过三次重复实验验证了本实验有很好的重现性。另外，经Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱纯化的藻蓝蛋白的纯度和浓度均有显著提高，可见Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱适用于藻蓝蛋白的纯化。

实施例7采用本发明方法进行实验室小试纯化藻蓝蛋白

将100.10g、99.98g、100.01g葛仙米干粉分别加入5000mL纯水，搅拌均匀后加入40mL 液氮，边加边剧烈搅拌。待液氮挥发完全后，继续搅拌，待碎冰完全溶解，离心过滤，冷冻干燥分别得到20.03g、20.01g、20.05g葛仙米藻胆蛋白粗提粉末用pH为6.8、电导率为8μs/cm 的Tris-HCl缓冲液BufferA溶解，8000r/min离心30min，用0.2μm的滤膜过滤；采用Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱过柱：1)用1个柱体积的去离子水洗泵；2)用5个柱体积的缓冲液 BufferA平衡；3)上样4个柱体积。收集45～100％pH为6.8、电导率为8μs/cm的Tris-HCl-NaCl 洗脱液，结果见下表7：

表7

由上表7可见，三次纯化得到藻蓝蛋白浓度均值为4.50g/mL，纯度均值为18.4(94.8％)。经过三次重复实验验证。实验发现，当上样条件为：用pH为6.8、电导率为8μs/cm的Tris-HCl 缓冲液BufferA溶解时，可以达到上样4个柱体积，所得到的藻蓝蛋白浓度最高，4.50g/mL；同时，洗脱条件为pH为6.8、电导率为8μs/cm的Tris-HCl-NaCl缓冲液BufferB梯度淋洗可以得到纯度为18.4的藻蓝蛋白，大大提高了纯化效率。

实施例7中纯化的藻蓝蛋白的凝胶过滤色谱图如图1所示。凝胶过滤层析根据蛋白质的分子量的不同在不同的时间出峰，经过峰面积与总面积的比值计算得到每次检测样品的纯度。出峰位置约为11mL，根据标准图谱，9mL左右分子量约为67KD，12mL分子量约为43KD，估算藻蓝蛋白的相对分子量为50KD-54KD。

实施例7中纯化的藻蓝蛋白与藻蓝蛋白对照品的紫外光谱如图2所示。通过对比，两个样品的出峰位置基本重合，吸收峰为610nm，有相同的共轭结构，判断为同类样品。

实施例7中纯化的藻蓝蛋白与藻蓝蛋白对照品的荧光光谱如图3所示(1.藻蓝蛋白；2. 藻蓝蛋白标准品)。通过对比，两个样品的特征出峰位置基本相同(450nm和660nm)，说明是同类样品。

实施例8采用本发明方法进行实验室小试纯化藻蓝蛋白

将50.02g、50.01g、49.99g葛仙米干粉分别加入2500mL纯水，搅拌均匀后加入20mL液氮，边加边剧烈搅拌。待液氮挥发完全后，继续搅拌，待碎冰完全溶解，离心过滤，冷冻干燥分别得到9.97g、9.99g、9.91g葛仙米藻胆蛋白粗提粉末用pH为7.5、电导率为3.9μs/cm的Tris-HCl缓冲液BufferA溶解，8000r/min离心30min，用0.2μm的滤膜过滤；采用AgarosixFF-DEAE阴离子交换柱过柱：1)用1个柱体积的去离子水洗泵；2)用5个柱体积的缓冲液BufferA平衡；3)上样2个柱体积。收集45～100％pH为7.5、电导率为3.9μs/cm的Tris-HCl-NaCl 洗脱液，结果见下表8：

表8

	藻蓝蛋白浓度(g/mL)	纯度	纯度(％)
				第一次	2.01	4.7	82.5
第二次	2.01	4.7	82.5
				第三次	2.01	4.7	82.5

由上表8可见，三次纯化得到藻蓝蛋白浓度均值为2.01g/mL，纯度均值为4.7(82.5％)。经过三次重复实验验证了本实验有很好的重现性。缓冲液pH超过6.8时，纯化效果明显下降。

实施例9采用本发明方法进行实验室小试纯化藻蓝蛋白

将50.01g、49.99g、49.98g葛仙米干粉分别加入2500mL纯水，搅拌均匀后加入20mL液氮，边加边剧烈搅拌。待液氮挥发完全后，继续搅拌，待碎冰完全溶解，离心过滤，冷冻干燥分别得到10.01g、9.95g、9.99g葛仙米藻胆蛋白粗提粉末用pH为9.3、电导率为9μs/cm的Tris-HCl缓冲液BufferA溶解，8000r/min离心30min，用0.2μm的滤膜过滤；用1个柱体积的去离子水洗泵，5个柱体积的缓冲液BufferA平衡，上样4个柱体积，收集45～100％pH为9.3、电导率为9μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，结果见下表9：

表9

	藻蓝蛋白浓度(g/mL)	纯度	纯度(％)
				第一次	1.99	1.9	65.5
第二次	1.98	1.9	65.5
				第三次	2.00	1.9	65.5

由上表9可见，三次纯化得到藻蓝蛋白浓度均值为1.99g/mL，纯度均值为1.9(65.5％)。经过三次重复实验验证了本实验有很好的重现性。但是其浓度和纯度均显著低于其他实施例，说明该上样和洗脱的pH范围是不合适，最佳上样条件为Tris-HCl缓冲液BufferA的pH为 6～6.8，电导率为6～8μs/cm，洗脱条件为Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B的pH为6～6.8，电导率为6～8μs/cm。

对比例1

将10.06g、9.99g、10.03g葛仙米藻胆蛋白粗提粉末按文献“田盼盼，逐级盐析法结合双水相萃取纯化葛仙米藻蓝蛋白”记载的方法，采用逐级NH₄SO₄盐析法结合双水相萃取法纯化藻蓝蛋白，检测结果见下表10：

表10

由上表10可见，，经过三次重复实验验证，得到的藻蓝蛋白浓度均值为1.04g/mL，纯度均值为6.11(85.9％)，其浓度以及纯度均显著低于实施例。

对比例1中选用的逐级NH₄SO₄盐析法结合双水相萃取法操作步骤繁杂，实验周期长，增加了实际操作的成本。本发明方法一次层析即可完成纯化过程，而且按对比例1的方法纯化的藻蓝蛋白纯度、浓度远低于本发明方法，进一步验证了本发明方法可操作性强，操作简便，使用成本低，得到的藻蓝蛋白浓度、纯度均高。

对比例2

将10.01g、10.03g、9.98g葛仙米藻胆蛋白粗提粉末按文献“邵明飞，一步柱层析纯化螺旋藻藻蓝蛋白”记载的方法，采用一步Macro-Prep Methyl疏水层析法纯化藻蓝蛋白，检测结果见下表11：

表11

	藻蓝蛋白浓度(g/mL)	纯度	纯度(％)
				第一次	0.93	7.23	87.8
第二次	0.93	7.23	87.8
				第三次	0.93	7.23	87.8

由上表11可见，经过三次重复实验验证，得到的藻蓝蛋白浓度均值为0.93g/mL，纯度均值为7.23(87.8％)，其浓度以及纯度均显著低于实施例5～7。

对比例2中选用的一步Macro-Prep Methyl疏水层析法虽然操作单一，但纯度低，回收率低，难以达到要求的藻蓝蛋白的纯度。本发明方法通过一次DEAE层析既可以完成纯化过程，又可以得到高纯度高浓度的藻蓝蛋白，验证了本发明方法可操作性强，操作简便，使用成本低。

对比例3

将10.01g、10.03g、10.02g葛仙米藻胆蛋白粗提粉末按文献“张允允，蓝隐藻藻蓝蛋白的分离、纯化及性质研究”记载的方法，采用NH₄SO₄盐析、SephadexG-100层析的分离纯化方法纯化藻蓝蛋白，检测结果见下表12：

表12

由上表12可见，经过三次重复实验验证，得到的藻蓝蛋白浓度均值为0.76g/mL，纯度均值为7.07(87.6％)，其浓度以及纯度均显著低于实施例5～7。

对比例3中选用的NH₄SO₄盐析-SephadexG-100层析结合法纯化藻蓝蛋白，操作相对简单，进行了两步纯化，但得到的藻蓝蛋白纯度较低，仅为88％。本发明方法仅通过一次DEAE 层析既可以完成纯化过程，又可以得到高纯度高浓度的藻蓝蛋白，验证了本发明方法可操作性强，操作简便，使用成本低。

由实施例1～9和对比例1～3可见，(1)本发明所选用的Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱的填料是6％的交联度琼脂糖凝胶，在纯化中表现出高载量(120mg/mL)和高稳定性(操作温度4～40℃，操作压力≦3Bar)，性能更好。实验证明本发明方法适于采用该树脂用于纯化藻蓝蛋白，效果明显优于其他DEAE阴离子交换柱(包括DEAE-52纤维素柱以及DEAE-Sephadex Fast Flow柱)；且藻蓝蛋白质损失少，上样量大，纯度高，可能是因为本发明的离子交换柱配基与藻蓝蛋白结合，而与其他杂质蛋白不结合，提高了藻蓝蛋白的吸附量； (2)在缓冲液pH值为6～6.8(较优地为6.5～6.8)时，本发明方法纯化得到的藻蓝蛋白纯度显著高于对比例，是因为只有在该合适的pH范围内，Tris-HCl体系中的盐离子包裹的藻蓝蛋白的带负电部分裸露，使得藻蓝蛋白尽可能多地吸附于Agarosix FF-DEAE柱上，而其他的杂蛋白不被吸附，在上样平衡时就会被排除在柱外；Tris-HCl缓冲体系则相对很难稳定藻蓝蛋白(3)本发明可以通过一步Agarosix FF-DEAE分离得到纯度高、产量高(上样量大，得到的藻红蛋白浓度高)的藻蓝蛋白，大大简化了实验步骤。

综上所述，采用本发明方法可以从葛仙米干粉末提取得到纯化后浓度在4.50g/mL以上，纯度在18.4(纯度94.8％)以上的藻蓝蛋白，并且本发明方法上样量大、方法简单、工艺周期短；同时本发明方法还将纯化的藻蓝蛋白的纯度从已有文献中报道的6.11(纯度85.9％) 提高到18.4(94.8％)，显著提高了藻蓝蛋白的纯度，本领域内实现了一个大的跨度。故本发明方法比其他提取工艺有明显的优势和创新。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims

1.一种葛仙米藻蓝蛋白的纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)选用阴离子交换柱过柱；(2)配置Tris-HCl缓冲液BufferA、Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B；(3)葛仙米藻胆蛋白粗提粉末用BufferA溶解，离心，过滤；(4)洗泵，用BufferA缓冲液平衡离子交换柱；(5)将步骤(3)制备的溶解于Buffer A中的葛仙米藻胆蛋白直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集洗脱液；(6)用盐溶液清洗离子交换柱，然后用碱溶液反向冲洗；(7)对步骤(5)的洗脱液进行超滤浓缩，透析，得到纯化的葛仙米藻蓝蛋白水溶液；

其中，所述Tris-HCl缓冲液的pH为6～6.8，所述Tris-HCl-NaCl缓冲液的pH为6～6.8；

所述Tris-HCl缓冲液的电导率为4～8μs/cm，所述Tris-HCl-NaCl缓冲液的电导率为4～8μs/cm；

所述阴离子交换柱为Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱，所述阴离子交换柱的介质为交联度为6％的琼脂糖凝胶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液的pH为6.5～6.8，所述Tris-HCl-NaCl缓冲液的pH为6.5～6.8。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液pH为6，电导率为4μs/cm时，Tris-HCl-NaCl缓冲液pH为6，电导率为4μs/cm；或，Tris-HCl缓冲液pH为6.5，电导率为6μs/cm时，Tris-HCl-NaCl缓冲液pH为6.5，电导率为6μs/cm；或，Tris-HCl缓冲液pH为6.8时，电导率为8μs/cm时，Tris-HCl-NaCl缓冲液pH为6.8，电导率为8μs/cm。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述琼脂糖凝胶的粒径为50～150μm。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述过柱前先用去离子水置换离子交换柱介质中的20％的乙醇水。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述葛仙米藻胆蛋白粗提粉末、Tris-HCl缓冲液的用量比5g:1L～15g:1L。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)中，所述超滤用的超滤膜孔径为1000D～8000D。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述盐溶液为NaCl或KCl，所述NaCl或KCl的浓度为0.02～0.1M；所述碱溶液为NaOH或KOH，所述NaOH或KOH的浓度为0.1～0.5M。