CN114702557A - 一种葛仙米藻红蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种葛仙米藻红蛋白(PE)的制备方法，为了保持葛仙米的活性，干燥的葛仙米不直接粉粹，而是先进行溶胀，并且用磷酸盐缓冲液溶胀，相比在纯水中溶胀，磷酸盐缓冲液溶胀能够保持葛仙米的活性。溶胀后的葛仙米经过反复冻融和超声破壁再用磷酸盐缓冲液浸提，将得到的浸提液离心浓缩后，依次用DEAE‑Cellulose52柱DEAE‑SepharoseFF层析柱、羟基磷灰石柱进行分离，得到PE液的纯度为(A545/A280)为7.4，并且保持葛仙米藻红蛋白的最大生物活。

Description

一种葛仙米藻红蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及化工技术领域，具体是一种高纯度高活性葛仙米藻红蛋白的制备方法。

背景技术

藻红蛋白(PE)是藻胆蛋白的一种，藻胆蛋白是红藻和蓝藻特有的捕光色素蛋白，用途极为广泛，既可作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业，又可制成荧光试剂用于临床医学诊断和免疫化学以及生物工程等研究领域中，还是一种重要的生理活性物质，可制成食品和药品用于医疗保健上。此外，它还是一种最具有开发潜力的光敏剂，用于肿瘤的光动力治疗。目前获取藻红蛋白(PE)的主要途径还是直接从藻类植物中提取。葛仙米，学名“拟球状念珠藻”(Nostoc sphaeroids kutz)，属蓝藻门(Cyanophyta)蓝藻纲(Cyanophyceae) 念珠藻科(Nostocaceae)念珠藻属(Nostoc.)，古名天仙菜、天仙米，俗称水木耳，其出现时间早于螺旋藻(Spinclina)。它是我国传统出口的一种珍贵的野生食药两用的蓝藻，但国人少用，故其知名度不高。葛仙米生长在淡水田里，生长期为11月份至次年5月份。它是由东晋时期人称葛仙公的炼丹术家、医学家的《养生论》作者葛洪而得名。

目前，国内外针对葛仙米藻红蛋白提取的技术多采用干燥的葛仙米或干燥的葛仙米粉碎粉，用纯水腹胀，磷酸盐缓冲液浸提的方法，这种方法虽然能够提取到藻红蛋白，但不能保持藻红蛋白的最大生物活性。比如CN106432480公开了一种葛仙米藻胆蛋白的提取方法，直接将干燥的葛仙米粉粹至20-80目，再加入40-60倍重量的纯水提取4-8小时，再离心、过滤冷冻干燥即可，经过粉粹和纯水腹胀会降低藻红蛋白的生物活性。

葛仙米藻红蛋白的分离纯化多采用单一的分离介质，如离子交换树脂或羟基磷灰石或凝胶层析，但不能得到高纯度的藻红蛋白。王广策等在《钝顶螺旋藻C-藻蓝蛋白和多管藻R- 藻红蛋白的分离纯化及摩尔消光系数的测定》，中螺旋藻经过水洗、反复冻融，离心去残渣，用羟基磷灰石柱层析法洗脱得到藻红蛋白和藻蓝蛋白，它们的纯度(指可见光部分的最大吸收与280nm处吸收值之比)可分别为6(R-藻红蛋白)5.5(C-藻蓝蛋白)。但是，该纯度仍有待进一步提高。

鉴于此，有必要开发一种简单、经济、高效的高纯度高活性的葛仙米藻红蛋白(PE)的制备方法。

发明内容

本发明公开一种葛仙米藻红蛋白(PE)的制备方法，为了保持葛仙米的活性，干燥的葛仙米不直接粉粹，而是先进行溶胀，并且用磷酸盐缓冲液溶胀，相比在纯水中溶胀，磷酸盐缓冲液溶胀能够保持葛仙米的活性。溶胀后的葛仙米经过反复冻融和超声破壁再用磷酸盐缓冲液浸提，将得到的浸提液离心浓缩后，依次用DEAE-Cellulose52柱 DEAE-Sepharose FF层析柱、羟基磷灰石柱进行分离，得到PE液的纯度为(A545/A280)为7.4，并且保持葛仙米藻红蛋白的最大生物活。

本申请的技术方案如下：

本申请公开了一种高纯度高活性葛仙米藻红蛋白的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)称取适量干燥的葛仙米样品，用磷酸盐缓冲液溶胀；

(2)经过步骤(1)溶胀后的葛仙米进行反复冻融和超声破壁；

(3)用磷酸盐缓冲液浸提后过滤，反复浸提和过滤若干次后，得到浸提液；

(4)将步骤(3)得到的浸提液离心处理，弃沉淀，浓缩上清液后得到蛋白质浓缩液；

(5)将上述蛋白质浓缩液，用DEAE-Cellulose52柱进行分离，洗脱液为磷酸盐和NaCl 混合缓冲液，收集到洗脱液，然后用磷酸缓冲液透析后得到粗的葛仙米藻红蛋白液；

(6)将上述粗藻红蛋白，用DEAE-Sepharose FF层析柱进行分离，洗脱液为磷酸盐和 NaCl混合缓冲液，用磷酸缓冲液透析后得到较纯的葛仙米藻红蛋白液；

(7)将上述较纯的藻红蛋白，用羟基磷灰石柱进行分离，洗脱液为磷酸盐和NaCl混合缓冲液，用磷酸缓冲液透析后得到纯的葛仙米藻红蛋白液。

(8)将上述纯的葛仙米藻红蛋白液在4℃保存，得到高活性高纯度纯的葛仙米藻红蛋白。

进一步的，所述步骤(1)磷酸盐缓冲液溶胀的条件为:料液比1：20～1:60(最佳料液比为1:50)；在0℃～8℃(最佳温度为4℃)，用pH值6.0～8.0(最佳pH为7.0)的0.02

M～0.1M(最佳浓度为0.05M)磷酸盐缓冲液复水溶胀0.5h～3h。

进一步的，所述反复冻融和超声破壁的条件为，在-10℃～-25℃(最佳温度为-20℃)冷冻 2h～6h(最佳时间为3h)，0℃～8℃(最佳温度为4℃)解冻2h～8h(最佳时间为6h)，反复操作三次，然后300W超声强度下超声波破壁10min～50min(最佳时间30min)。

进一步的，所述步骤(2)中反复冻融法的条件为，在-10℃～-25℃(最佳温度为-20℃) 冷冻2h～6h(最佳时间为3h)，0℃～8℃(最佳温度为4℃)解冻2h～8h(最佳时间为6h)，反复3次，所述破碎时间为30-40min。

进一步的，所述缓冲液的pH值为4～10(最佳pH为7)，缓冲液中NaCl浓度为0.08M～0.32M(最佳浓度为0.20M)，浸提时间为1h～5h(最佳时间为4h)。

进一步的，所述DEAE-Cellulose 52柱规格为直径1.8cm,长40cm；洗脱液为pH值为7.3 的0.05mol/L磷酸盐缓冲液+0.2mol/L的NaCl，洗脱速度为0.6mL/min。

进一步的，所述DEAE-Sepharose FF层析柱规格为直径1.6cm,长40cm；洗脱液为pH值为7.3的0.05mol/L磷酸盐缓冲液+0.2M的NaCl，洗脱速度为0.3mL/min。

进一步的，所述羟基磷灰石柱层析柱规格为直径1.6cm,长20cm；洗脱液为pH值为7.3 的0.05mol/L磷酸盐缓冲液+0.2M的NaCl，洗脱速度为0.3mL/min。

本申请的有益效果：

葛仙米藻红蛋白(PE)的提取、分离、纯化制备，采用磷酸盐缓冲液腹胀、反复冻融和超声破壁技术，使葛仙米细胞壁破裂，用磷酸盐缓冲液浸提蛋白质，为了保持生物活性，整个过程在低温下采用缓冲盐其生物活性。然后用依次用大孔树脂、凝胶层析柱、羟基磷灰石色谱柱组合进行分离纯化，得到高纯度和高活性的葛仙米藻红蛋白(PE)。方法直观、简便、易行。

附图说明

图1是本发明超声波破碎时间与蛋白质浓度的关系曲线图；

图2是本发明DEAE-Cellulose 52柱洗脱曲线图；

图3是本发明通过DEAE-Sepharose FF柱洗脱的PE的紫外可见扫描图；

图4是本发明通过HA洗脱的PE的紫外可见扫描图；

图5是本发明藻红蛋白(PE)的PAGE图；

图6是本发明藻红蛋白(PE)的SDS-PAGE图；

图7是本发明藻红蛋白(PE)的紫外可见光谱图；

图8是本发明藻红蛋白(PE)的荧光扫描图；

图9是本发明藻红蛋白(PE)的红外光谱图；

图10是本发明藻红蛋白(PE)的原子力显微镜；

图11是本发明藻红蛋白(PE)的原子力显微镜。

具体实施方式

下面通过实验分析对本发明作进一步说明：

实施例1

1)磷酸盐缓冲液溶胀，称取适量干燥的葛仙米样品，在4℃，用pH值7.0的0.05M磷酸盐缓冲液复水溶胀2h(料液比1：50)。

2)破细胞壁(反复冻融和超声破壁)，在-20℃冷冻4h，4℃解冻6h，反复操作三次。然后300W超声强度下超声波破壁30min。

3)磷酸盐缓冲液浸提，提取液为pH值7.0的0.05M磷酸盐缓冲液+0.2M NaCl溶液，在4℃浸提4h，过滤得到提取液，反复操作三次。

4)离心浓缩，将上述得到的浸提液，在4℃，14000r/min离心45min后，弃沉淀，得到的上清液在4℃，透析4h浓缩，得到蛋白质浓缩液。

5)将上述蛋白质浓缩液，用直径1.6cm,长40cm的DEAE-Cellulose52柱进行分离，洗脱液为pH值7.3，0.05M磷酸盐缓冲液+0.2M的NaCl，洗脱速度0.6mL/min，采用紫外检测器280nm检测，用分步收集器收集红色部分洗脱液，体积为4mL/管，合并收集到红色洗脱液，然后在4℃，用0.01mol/L，pH 7.3的磷酸缓冲液透析24h，得到粗的葛仙米藻红蛋白(PE) 液。

6)将上述粗藻红蛋白(PE)，用直径1.6cm,长40cm的DEAE-Sepharose FF层析柱进行分离，洗脱液为pH值7.3，0.05M磷酸盐缓冲液+0.2M的NaCl，洗脱速度0.3mL/min，采用紫外检测器280nm检测，用分步收集器收集红色部分洗脱液，体积为1.5mL/管，合并收集到红色洗脱液，然后在4℃，用0.01mol/L，pH 7.3的磷酸缓冲液透析24h，得到较纯的葛仙米藻红蛋白(PE)液。

7)将上述较纯的藻红蛋白(PE)，用柱直径1.6cm,长20cm的羟基磷灰石柱进行分离，洗脱液为pH值7.3，0.05M磷酸盐缓冲液+0.2M的NaCl，洗脱速度0.6mL/min，采用紫外检测器280nm检测，用分步收集器收集红色部分洗脱液，体积为1.5mL/管，合并收集到红色洗脱液，然后在4℃，用0.01mol/L，pH 7.3的磷酸缓冲液透析24h，得到纯的葛仙米藻红蛋白(PE)液。

将上述纯的葛仙米藻红蛋白(PE)液在4℃保存，得到高活性高纯度纯的葛仙米藻红蛋白(PE)，PE的纯度为(A₅₄₅/A₂₈₀)为7.4，对H₂O₂清除率为70.39％。

以下为具体试验分析过程：

1实验材料

1.1原料：葛仙米(干燥)。

1.2试验主要试剂：氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾，上海试剂四厂：分析纯；DEAE-Cellulose 52、 DEAE Sephadex Fast Flow，Pharmacia公司；羟基磷灰石(HA)，自制。

1.3主要仪器设备：UV-265型紫外可见记录光谱仪、高速冷冻离心机，ShimadzuJapan；超声波破碎仪，北京医药器材厂；756-荧光光度计，上海仪器总公司；SBS系列数控部分收集器，上海沪西分析仪器厂；HD-93-1核酸蛋白检测仪，上海金达生化仪器有限公司XWT-S 小型台式记录仪，上海自动化仪表三厂DYY-Ⅲ4高压双稳电泳仪，北京六一仪器厂；Nicoler-SX-170型红外光谱仪，美国；AJ-Ⅲ原子力显微镜，上海爱建纳米公司。BPCL-4 微弱发光测定仪

2实验方法

2.1葛仙米细胞壁破碎时间

原料经反复冻融3次后，准确称取等量藻体10份，分别于超声细胞粉碎机破碎藻细胞0-45min，每份样品间隔5min，然后高速冷冻离心去沉淀，测定其上清液蛋白质的浓度。以蛋白质的浓度为纵坐标，破碎时间为横坐标作图。

2.2葛仙米藻红蛋白(PE)提取工艺

为最大限度地提取出葛仙米藻胆蛋白，并保持其生物活性，需要对影响其提取的因素优化。本方法选取缓冲液pH、盐浓度和浸提时间这3个最主要的影响因素，按照三因素二次旋转正交回归设计方案，制备出23组浸提样，分别测定其藻红蛋白(PE)得率和蛋白含量，对其提取工艺进行了优化。

2.3树脂的准备与层析柱的填装

称取一定量的树脂，先以0.5mol/LNaOH处理30min，抽滤，水洗至pH 9，然后以0.5mol/LHCl处理30min，水洗至pH7左右，再以0.5mol/LNaOH处理30min，使之转为 OH-型，然后用0.5mol/LNaCl溶液洗，使之转为Cl^-型。处理好的树脂上柱，装填好的柱致密均匀，无气泡，柱上端留30mm左右的空间，用缓冲液平衡柱填料以备用。

2.4羟基磷灰石的制备

把2L烧杯放在磁力搅拌器上，用恒流泵以6ml/min的流速等量地将1L的2mol/L的CaCl2 溶液和2MK2HPO4溶液加入烧杯中并持续搅拌，搅拌速度以刚好能连续搅动液面为准。滴加完毕后，静置一段时间，倾去上清液。以约3L蒸馏水分多次洗涤沉淀。向重新悬浮于水中的沉淀中加入2mol/L的KOH溶液，使其pH达到11，并于80℃水浴2h，静置后的沉淀以蒸馏水水洗至中性，再加入0.05mol/L，pH7.3的磷酸缓冲液于80℃水浴1h，静置后倾去上清液，以沉淀分离介质装填1.6cm×20cm层析柱。

2.5分离纯化

将浸提液，对0.01mol/L，pH 7.3的磷酸缓冲液透析24h，浓缩后，分别上DEAE-Cellulose 52柱、DEAE-Sepharose FF层析柱、HA柱。

2.6藻红蛋白对氧自由基清除能力生物活性

取待测样品和比较例(用葛仙米干粉提取的藻红蛋白)各100μL于测量杯中(以蒸馏水作空白对照)，加入50μL，0.1mmol/L H₂O₂(0℃)，原位注入850μL鲁米诺—碳酸盐缓冲液(pH9.5)，反应总体积为1mL，启动发光记录240s内发光强度。

2.7藻红蛋白纯度的鉴定

2.7.1聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.7.1.1常规PAGE电泳

浓缩胶缓冲液pH6.8，浓缩胶5％，分离胶pH8.9，分离胶12％，不加SDS，电极缓冲液为Tris-Gly溶液，样品不需要处理，上样浓度为2mg/ml，上样量为20μl。恒压90-180V。染色液为甲醇：水：冰醋酸＝5：4：1，染色6h，脱色12h，最后用7％的醋酸溶液保存。

2.7.1.2SDS-PAGE

配制分离胶和浓缩胶缓冲液和电极缓冲液，加SDS，样品需在100℃中煮3-5min。其余条件与常规PAGE相同。

2.7.2光谱测定

分离纯化所得的藻红蛋白(PE)样品分别做紫外可见吸收光谱、荧光光谱及红外光谱测定。

2.7.3原子力显微镜分析

样品用去离子水溶解，配制成一定浓度的溶液，用云母制片，通过原子力显微镜观察其形貌。

3实验结果

3.1破壁时间的确定

在比较并分析了传统的细胞破碎法后，最终选定反复冻融法和超声波法来处理葛仙米藻细胞，反复冻融法的条件为，在-20℃冷冻时间3h，解冻时间6h，反复3次；并确定了超声波破壁的最佳条件(见图1),由图1可知，破碎时间小于30min时，蛋白质浓度随破碎时间的增加而升高，当时间大于30min时，变化趋向平缓。由此确定破碎时间为30-40min，最适破碎时间为30min。

3.2葛仙米藻红蛋白(PE)提取工艺

利用SAS软件，可以得到如下回归模型：

Y＝6.8205+0.4994x1+0.2675x2+0.4597x3-0.1300x1x2–0.1125x1x3-0.1357x2x3– 0.5983x12–0.3580x22–0.2254x32

根据各变量的显着性检验，可得出三因素对葛仙米藻胆蛋白得率的贡献率依次为：缓冲液 pH值，浸提时间，缓冲液盐浓度。

通过计算机模拟可得到最高的回归值Y＝7.1250％(0.1887，0.08547，0.5330)，即表现在 pH值为7.3，缓冲液盐浓度为0.21M，浸提时间为4.3h时，葛仙米藻胆蛋白得率理论最高值可达7.1250％。因此，本方法提取条件为pH值为7.3，缓冲液盐浓度为0.20M，浸提时间为 4h。

3.3DEAE-Cellulose 52柱分离纯化结果

将藻红蛋白(PE)粗提液上DEAE-Cellulose 52柱，洗脱曲线如图2：层析柱规格为直径 1.8cm,长40cm；洗脱液为pH值为7.3的0.05mol/L磷酸盐缓冲液+0-0.2mol/L的NaCl，洗脱速度为0.6mL/min。收集红色滤液，分步收集6mL/管。

3.4凝胶层析和羟基磷灰石层析柱分离纯化结果

将上述收集的红色组分透析过夜，上经pH值为7.3的0.05mol/L磷酸盐缓冲液平衡好的 DEAE-Sepharose FF层析柱，层析柱规格为直径1.6cm,长40cm；洗脱液为pH值为7.3的0.05mol/L磷酸盐缓冲液+0.2M的NaCl，洗脱速度为0.3mL/min。分步收集器收集，1.5mL/管，收集所需级分(见图3)，于4℃透析浓缩后，上羟基磷灰石柱层析柱，规格为直径1.6cm,长20cm；洗脱液为pH值为7.3的0.05mol/L磷酸盐缓冲液+0.2M的NaCl，洗脱速度为 0.3mL/min。分步收集器收集，1.5mL/管，结果见图4。

3.5藻红蛋白活性的测定

按照上述的方法，用浓度为0.10mg/mL的葛仙米藻红蛋白对氧自由基的清除作用，本发明对H₂O₂清除率为70.39％，比较例为57.18％。结果表明，本发明能保持葛仙米藻红蛋白的最大生物活性。

3.6藻红蛋白纯度的鉴定

3.6.1电泳

3.6.1.1非变性电泳：浓缩胶3％，分离胶12％，恒压，见图5。

3.6.1.2变性电泳(SDS-PAGE)：浓缩胶3％，分离胶12％，恒压，见图6。

藻红蛋白(PE)分子量：30,913+20,895道尔顿。

3.6.2紫外可见光谱分析

经羟基磷灰石分离后的PE的紫外可见光谱见图7。

根据蛋白质纯度最直接表达的计算公式(A_入max/A₂₈₀)，由图8可计算得到PE的纯度为 (A₅₄₅/A₂₈₀)为7.4，这与文献已报道的PE最高纯度为6.0，高出了很多。

3.6.3荧光光谱分析

以365nm为激发光，在室温下用765CR荧光光谱扫描，其结果见图8。

从上图可知，PE的最大发射波长为580nm，其荧光强度可达99％。

3.6.4红外图谱

采用傅立叶红外仪测定葛仙米藻红蛋白(PE)的红外光谱(见图9)，从藻红蛋白(PE) 的红外光谱可以看出，在1234cm-1有红外吸收峰，它属于β-折叠结构；在1297cm-1有红外吸收峰，它属于α-螺旋结构。比较两者吸收峰的相对强度，说明α-螺旋结构所占比例远大于β- 折叠结构。

3.6.5原子力显微镜观察

将藻红蛋白(PE)用去离子水溶解成1μg/ml的溶液，用AFM观察藻红蛋白(PE)在中性环境中的立体形貌特征，结果见图10-11。

从图10-11可以看出，在中性环境下，藻红蛋白(PE)分子呈颗粒状不均匀分布或以棒状的形式存在，颗粒状不均匀分布的平均直径大小为64nm左右。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (8)

1.一种高纯度高活性葛仙米藻红蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)称取适量干燥的葛仙米样品，用磷酸盐缓冲液溶胀；

(2)经过步骤(1)溶胀后的葛仙米进行反复冻融和超声破壁；

(3)用磷酸盐缓冲液浸提后过滤，反复浸提和过滤若干次后，得到浸提液；

(4)将步骤(3)得到的浸提液离心处理，弃沉淀，浓缩上清液后得到蛋白质浓缩液；

(5)将上述蛋白质浓缩液，用DEAE-Cellulose52柱进行分离，洗脱液为磷酸盐和NaCl混合缓冲液，收集到洗脱液，然后用磷酸缓冲液透析后得到粗的葛仙米藻红蛋白液；

(6)将上述粗藻红蛋白，用DEAE-Sepharose FF层析柱进行分离，洗脱液为磷酸盐和NaCl混合缓冲液，用磷酸缓冲液透析后得到较纯的葛仙米藻红蛋白液；

(7)将上述较纯的藻红蛋白，用羟基磷灰石柱进行分离，洗脱液为磷酸盐和NaCl混合缓冲液，用磷酸缓冲液透析后得到纯的葛仙米藻红蛋白液。

(8)将上述纯的葛仙米藻红蛋白液在4℃保存，得到高活性高纯度纯的葛仙米藻红蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种高纯度高活性葛仙米藻红蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)磷酸盐缓冲液溶胀的条件为:料液比1：20～1:60，在0℃～8℃，用pH值6.0～8.0的0.02M～0.1M磷酸盐缓冲液复水溶胀0.5h～3h。

3.根据权利要求1所述的一种高纯度高活性葛仙米藻红蛋白的制备方法，其特征在于，所述反复冻融和超声破壁的条件为，在-10℃～-25℃下冷冻2h～6h，再在0℃～8℃解冻2h～8h，反复操作三次，然后300W超声强度下超声波破壁10min～50min。

4.根据权利要求1所述的一种高纯度高活性葛仙米藻红蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中反复冻融法的条件为，在-10℃～-25℃，冷冻2h～6h，再在0℃～8℃，解冻2h～8h(最佳时间为6h)，反复3次，所述破碎时间为30-40min。

5.根据权利要求1所述的一种高纯度高活性葛仙米藻红蛋白的制备方法，其特征在于，所述缓冲液的pH值为4～10，缓冲液中NaCl浓度为0.08M～0.32M，浸提时间为1h～5h。

6.根据权利要求1所述的一种高纯度高活性葛仙米藻红蛋白的制备方法，其特征在于，所述DEAE-Cellulose 52柱规格为直径1.8cm,长40cm；洗脱液为pH值为7.3的0.05mol/L磷酸盐缓冲液+0.2mol/L的NaCl，洗脱速度为0.6mL/min。

7.根据权利要求1所述的一种高纯度高活性葛仙米藻红蛋白的制备方法，其特征在于，所述DEAE-Sepharose FF层析柱规格为直径1.6cm,长40cm；洗脱液为pH值为7.3的0.05mol/L磷酸盐缓冲液+0.2M的NaCl，洗脱速度为0.3mL/min。

8.根据权利要求1所述的一种高纯度高活性葛仙米藻红蛋白的制备方法，其特征在于，所述羟基磷灰石柱层析柱规格为直径1.6cm,长20cm；洗脱液为pH值为7.3的0.05mol/L磷酸盐缓冲液+0.2M的NaCl，洗脱速度为0.3mL/min。

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