CN107384878A - 一种精纯猪圆环病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种精纯猪圆环病毒的方法，包括如下步骤：一、对猪圆环病毒细胞培养液进行离心，去除沉淀，收集上清液；二、采用横向切留浓缩滤膜对所述上清液进行横向切留浓缩；三、向浓缩液中加入纯水；四、重复步骤二和步骤三3～5次；五、对浓缩液进行弱阴离子交换层析，线性洗脱后收集第1个洗脱峰，即为猪圆环病毒液；六、采用超滤膜对所述猪圆环病毒液进行浓缩；七、采用凝胶层析介质对步骤六所获得的浓缩液进行分子筛层析分离，收集第一个层析峰，即为猪圆环病毒精纯液。本发明的纯化方法具有操作简单，可纯化量大，纯化效果好的特点。

Description

一种精纯猪圆环病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种精纯病毒的方法，特别是涉及一种精纯猪圆环病毒的方法。
背景技术
猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子大小仅为14～25nm，平均直径为17nm，，由单股环状DNA组成，呈对称的二十面体，是目前发现的最小的动物病毒。猪圆环病毒对外界的具有较强的抵抗力，在高温、酸性等环境中可长期保持活性。目前，猪圆环病毒的灭活疫苗主要采用细胞培养进行生产，但在病毒繁殖后的培养基中含有大量的杂质成分，如猪病毒裂解细胞所产生的细胞碎片、细胞和培养基的蛋白质、糖类、脂类、核酸、以及细胞代谢副产物等，易导致接种猪产生过敏，持续发热等副作用。同时，在制备诊断制剂的过程中也需要使用高纯度的病毒来制备病毒类的单克隆抗体或者ELISA试剂盒。
因此，猪圆环病毒的精纯对于疫苗品质和诊断制品制备都至关重要。目前，纯化猪圆环病毒的方法主要有沉淀法、离心法和透析法等，其中超速离心法应用最为广泛。但超速离心法使用的材料成本高、其价格昂贵、成本较高且费时费力，只能获得少量的样品供实验室研究使用，无法满足产业化的需求可能性。同时，纯化病毒还要针对具体的活性成分的特点采取具体的方法，选择最适合的方法。因此，急需探索新的适合产业化的纯化方法。
发明内容
本发明提供了一种精纯猪圆环病毒的方法，以至少解决现有技术中猪圆环病毒的纯化方法成本高、纯化量少、无法工业化生产的问题。
本发明的具体技术方案如下，一种精纯猪圆环病毒的方法，包括如下步骤：
步骤一：取猪圆环病毒细胞培养液于离心机中，以1000～8000rpm/min的转速离心10～60min，去除沉淀，收集上清液；
步骤二：采用孔径为10～500K的横向切留浓缩滤膜对步骤一所得上清液进行横向切留浓缩，使病毒液浓缩10～40倍；
步骤三：向步骤二所得浓缩液中加入10～40倍纯水；
步骤四：重复步骤二和步骤三3～5次；
步骤五：对步骤四所得浓缩液进行弱阴离子交换层析，线性洗脱后收集第1个洗脱峰，即为猪圆环病毒液；
步骤六：取孔径为10～300K的超滤膜对步骤五所得猪圆环病毒液浓缩10～20倍；
步骤七：采用凝胶层析介质对步骤六所得浓缩液进行分子筛层析分离，洗脱后收集第一个层析峰，即为猪圆环病毒精纯液。
进一步地，所述步骤一中猪圆环病毒细胞培养液以4000～5000rpm/min的转速离心20～30min。
进一步地，所述步骤二中横向切留浓缩滤膜30～300K。
更进一步地，所述步骤二中横向切留浓缩滤膜为30～100K。
进一步地，所述步骤二中病毒液浓缩倍数为15～25倍。
进一步地，所述步骤五中弱阴离子交换层析柱为Macro-prep DEAE层析柱，且使用含有1～2mol/L NaCl、0.01～0.03mol/L Tris的水溶液对弱阴离子交换层析介质进行线性洗脱。
进一步地，所述步骤六中超滤膜孔径为10～100K。
更进一步地，所述步骤六中超滤膜孔径为30～100K。
进一步地，所述步骤七中凝胶为Sepharose 6fast flow凝胶。
进一步地，，所述步骤七中使用0.05～0.3M PBS溶液作为洗脱液进行洗脱。
本发明相对于现有技术，采用弱阴离子交换层析及凝胶层析与传统的离心、浓缩等方法相配合，进而获得具有较高纯度的猪圆环病毒。此外，本发明的纯化方法简单，可纯化量大，易于操作，且纯化材料，如弱阴离子交换层析及凝胶层析等可多次循环使用，有效降低纯化成本。
附图说明
图1为DEAE弱阴离子交换层析对猪圆环病毒分离的效果图。
图2为使用Sepharose 6fast flow层析填料层析分猪圆环病毒的效果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
本发明的实施例及对照实施例中均使用超微量紫外/可见光光度计测量样品蛋白浓度，并使用传统方法TCID50检测猪圆环病毒滴度。
实施例一
本发明实施例一的纯化方法如下：
步骤一：取病毒含量TCID50/ml值为7.5、蛋白质总含量为15mg/ml的猪圆环病毒细胞培养液于离心机中，以5000rpm/min的转速离心30min，去除沉淀，收集上清液；
步骤二：采用孔径为100K的横向切留浓缩滤膜对步骤一所得上清液进行横向切留浓缩，使病毒液浓缩20倍；
步骤三：向步骤二所得浓缩液中加入20倍纯水；
步骤四：重复步骤二和步骤三3～5次；
步骤五：取步骤四所得浓缩液向纯水平衡后的Macro-prep DEAE弱阴离子交换层析介质上样，并使用含有NaCl 1.5mol/L、Tris0.025mol/L的水溶液(pH 8.4)对弱阴离子交换层析介质进行线性洗脱，收集第1个洗脱峰，即为猪圆环病毒液；
步骤六：取孔径为100K的超滤膜对步骤五所得猪圆环病毒液浓缩10倍；
步骤七：取Sepharose 6fast flow凝胶层析介质对步骤六中浓缩液进行分子筛层析分离，使用0.1M PBS溶液作为洗脱液，收集第一个层析峰，即为猪圆环病毒精纯液。
将各处理步骤均换成相同体积计算病毒滴度和总蛋白含量，以确定不同处理步骤对猪圆环病毒含量和杂蛋白的影响，结果如表1所示。
表1：不同处理步骤对猪圆环病毒含量和杂蛋白的影响
此外，DEAE弱阴离子交换层析对猪圆环病毒分离的效果图如图1所示，Sepharose6fast flow层析填料层析分猪圆环病毒的效果图如图2所示。在图1中，下曲线为猪圆环病毒粗纯样品通过Macro-prep DEAE层析填料分离情况；上曲线为溶液中电导(各种离子浓度)变化情况；黑色箭头为猪圆环病毒峰。在图2中，下曲线为猪圆环病毒粗纯样品通过Sepharose 6fast flow层析填料分离情况；上红色曲线为溶液中电导(各种离子浓度)变化情况；黑色箭头为猪圆环病毒峰。
如上表所示，猪圆环病毒细胞培养液中杂质的纯化主要集中于步骤四、步骤五四及步骤七中，由于步骤四的浓缩、步骤五及步骤七的层析纯化具有操作简单、成本低、可纯化量大的特点，使本发明实施例具有较低的纯化成本，且可纯化大量的猪圆环病毒，有效解决现有技术中猪圆环病毒的纯化方法成本高、可纯化量少的问题。此外，如上表所示，本发明实施例的方法具有较好的病毒富集能力，在各步骤中病毒滴度损失量小，可以有效降低纯化过程中的病毒损失。
对照实施例一
本发明对照实施例的纯化方法如下：
步骤一：取病毒含量TCID50/ml值为7.5、蛋白质总含量为15mg/ml的猪圆环病毒细胞培养液于离心机中，以5000rpm/min的转速离心30min，去除沉淀，收集上清液；
步骤二：采用孔径为100K的横向切留浓缩滤膜对步骤一所得上清液进行横向切留浓缩，使病毒液浓缩20倍；
步骤三：向步骤二所得浓缩液中加入20倍纯水；
步骤四：重复步骤二和步骤三3～5次；
步骤五：取Sepharose 6fast flow凝胶层析介质对步骤四中浓缩液进行分子筛层析分离，使用0.1M PBS溶液作为洗脱液，收集第一个层析峰，即为猪圆环病毒精纯液。
将各处理步骤均换成相同体积计算病毒滴度和总蛋白含量，以确定不同处理步骤对猪圆环病毒含量和杂蛋白的影响，如表2所示。
表2：改变纯化步骤对猪圆环病毒含量和杂蛋白的影响
如上表所示，由于缺少Macro-prep DEAE层析的纯化，使对照实例例一方法对于猪圆环病毒细胞培养液的纯化效果下降，进而会影响到后续疫苗及诊断制品的品制，不能满足生产上对于猪圆环病毒的品质要求。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

Claims (10)

1.一种精纯猪圆环病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：取猪圆环病毒细胞培养液于离心机中，以1000～8000rpm/min的转速离心10～60min，去除沉淀，收集上清液；
步骤二：采用孔径为10～500K的横向切留浓缩滤膜对步骤一所得上清液进行横向切留浓缩，使病毒液浓缩10～40倍；
步骤三：向步骤二所得浓缩液中加入10～40倍纯水；
步骤四：重复步骤二和步骤三3～5次；
步骤五：对步骤四所得浓缩液进行弱阴离子交换层析，线性洗脱后收集第1个洗脱峰，即为猪圆环病毒液；
步骤六：取孔径为10～300K的超滤膜对步骤五所得猪圆环病毒液浓缩10～20倍；
步骤七：采用凝胶层析介质对步骤六所得浓缩液进行分子筛层析分离，洗脱后收集第一个层析峰，即为猪圆环病毒精纯液。
2.根据权利要求1所述的精纯猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤一中猪圆环病毒细胞培养液以4000～5000rpm/min的转速离心20～30min。
3.根据权利要求1所述的精纯猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤二中横向切留浓缩滤膜为30～300K。
4.根据权利要求3所述的精纯猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤二中横向切留浓缩滤膜为30～100K。
5.根据权利要求1所述的精纯猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤二中病毒液浓缩倍数为15～25倍。
6.根据权利要求1所述的精纯猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤五中弱阴离子交换层析柱为Macro-prep DEAE层析柱，且使用含有1～2mol/L NaCl、0.01～0.03mol/LTris的水溶液对弱阴离子交换层析介质进行线性洗脱。
7.根据权利要求1所述的精纯猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤六中超滤膜孔径为10～100K。
8.根据权利要求7所述的精纯猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤六中超滤膜孔径为30～100K。
9.根据权利要求1所述的精纯猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤七中凝胶为Sepharose 6 fast flow凝胶。
10.根据权利要求6所述的精纯猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤七中使用0.05～0.3M PBS溶液作为洗脱液进行洗脱。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611327A (zh) * 2018-07-03 2018-10-02 复旦大学 一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法
CN109055323A (zh) * 2018-07-26 2018-12-21 武汉汇研生物科技股份有限公司 一种分离纯化高纯度猪圆环全病毒疫苗的层析方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101974490A (zh) * 2010-11-17 2011-02-16 广东大华农动物保健品股份有限公司 一种猪瘟病毒纯化方法
CN106279376A (zh) * 2016-08-31 2017-01-04 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种猪圆环病毒抗原纯化方法
CN106432432A (zh) * 2016-09-26 2017-02-22 武汉汇研生物科技股份有限公司 一种分离纯化高纯度猪圆环病毒Cap蛋白的层析方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101974490A (zh) * 2010-11-17 2011-02-16 广东大华农动物保健品股份有限公司 一种猪瘟病毒纯化方法
CN106279376A (zh) * 2016-08-31 2017-01-04 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种猪圆环病毒抗原纯化方法
CN106432432A (zh) * 2016-09-26 2017-02-22 武汉汇研生物科技股份有限公司 一种分离纯化高纯度猪圆环病毒Cap蛋白的层析方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611327A (zh) * 2018-07-03 2018-10-02 复旦大学 一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法
CN108611327B (zh) * 2018-07-03 2022-03-18 复旦大学 一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法
CN109055323A (zh) * 2018-07-26 2018-12-21 武汉汇研生物科技股份有限公司 一种分离纯化高纯度猪圆环全病毒疫苗的层析方法

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