CN103642760B - 一种制备柯萨奇a16型病毒完整实心颗粒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备完整柯萨奇A16型（CA16）病毒实心颗粒的方法，其方法包括如下步骤：将经培养后的CA16病毒收获液，经0.45um的膜包过滤、300KD膜包浓缩后，用Capto^TMCore700和阴离子交换层析填料进行两步层析纯化后，即可得到完整的实心病毒颗粒。本发明提供的方法可以实现完整实心颗粒和非完整颗粒有效的分离，纯化后的病毒颗粒纯度达到95%以上，并可实现批量生产。

Description

一种制备柯萨奇A16型病毒完整实心颗粒的方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纯化柯萨奇病毒A16型实心病毒颗粒的方法。

背景技术：

柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A Group16Strain，CA16）是人手足口病（Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD）的主要致病原之一，与EV71所致的手足口病在临床上很难区别，EV71的流行更受重视，CA16研究较少，长期以来一直认为CA16可能是单纯的HFMD表现，不过近年来研究报道指出CA16感染可能与心肌炎、难治性休克等致死性并发症的发生有关，个别地区还有CA16引起成人致死性肺炎的报道。

近年来手足口病的发病率呈上升趋势，且无有效治疗药物，疫苗的开发尤为迫切。EV71单价灭活疫苗已完成三期临床，但单价疫苗交叉保护性差，无法解决CA16病毒同时感染的现状，CA16疫苗的研发日趋重要。细胞培养病毒的组装完整程度不同，包括实心颗粒和空心颗粒，还有病毒的亚单位结构。与EV71不同，CA16只有在完整病毒时才具有良好免疫保护性，因而，纯化出完整CA16病毒是二价疫苗能否都成功的关键。如何将组装完整的病毒分离纯化出来并提高其回收率是该病毒纯化的技术难题。

发明内容：

针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种能有效分离CA16病毒完整病毒颗粒的纯化方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种制备柯萨奇A16型病毒完整实心颗粒的方法，包括以下步骤：

1）对细胞培养的病毒收获液进行滤膜过滤；

2）用超滤膜进行超滤浓缩病毒悬液；

3）病毒悬液经层析填料Capto^TMCore700层析纯化；

4）再经阴离子交换层析纯化后获得实心颗粒病毒。

其中，所述步骤1）的滤膜孔径为0.45微米。

其中，所述步骤2）中超滤膜的孔径为300KD截留分子量。

其中，所述步骤2）中对病毒悬液浓缩5-10倍，并进行至少10倍体积换液，换成PH为7.5的磷酸盐缓冲液。

其中，所述步骤3）中层析纯化的缓冲液为pH7.5的磷酸盐缓冲液。

其中，所述步骤4）中所用层析填料为阴离子交换树脂二乙氨乙基（DEAE）或Q琼脂糖凝胶FF。

其中，所述步骤4）中包含缓冲液A和缓冲液B，缓冲液A是pH7.5的磷酸盐缓冲液，缓冲液B中含有PH7.5的磷酸盐缓冲液和1M的氯化钠。

本发明提供的病毒纯化工艺中用使用了新型的层析填料Capto^TMCore700，该纯化步骤能很好的将病毒的亚单位结构和分子量小的宿主蛋白有效去除。且本发明使用阴离子交换层析纯化，能将病毒的实心颗粒和空心颗粒进行有效的分离。

附图说明:

图1是经本发明提供的方法纯化后实心病毒颗粒的高效液相色谱分析图谱。

图2是经目前常用纯化技术纯化后实心病毒颗粒的高效液相色谱分析图谱。

图3是经本发明提供的方法纯化后实心病毒颗粒的SDS－PAGE蛋白电泳分析图。

图4是经目前常用纯化技术纯化后实心病毒颗粒的SDS－PAGE蛋白电泳分析图。

图5是经本发明提供的方法纯化后CA16病毒电镜图，其中，A：离子层析精纯后的空心颗粒峰，B：离子层析精纯后的实心颗粒峰。

图6是经目前常用纯化技术纯化后CA16病毒电镜图。

具体实施方式：

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

实施例1纯化效果

1、纯化方法

A-本发明提供的纯化方法：

1）CA16病毒株为在已鉴定为患手足口病的患者咽拭子中分离，经鉴定为CA16病毒并进行了病毒的单克隆，该病毒株经MRC-5细胞培养的病毒病变80%以上后直接收获，收获液经0.45微米滤膜进行过滤；

2）用300KD截留分子量的超滤膜进行超滤浓缩病毒悬液，浓缩8倍，向此浓缩液中添加11倍体积的磷酸盐缓冲液（pH7.5）；

3）病毒悬液经层析填料Capto^TMCore700层析纯化，层析纯化的缓冲液为磷酸盐缓冲液（pH7.5），收集穿透峰为目的样品峰；

4）将步骤3）收集的样品进行离子交换层析纯化，层析填料为阴离子层析纯化介质DEAE，层析纯化时缓冲液A为磷酸盐缓冲液（PBS pH7.5），缓冲液B为磷酸盐缓冲液（PBSpH7.5），1MNaCL，纯化时收集穿透峰为目的样品峰，即为纯化后的实心病毒颗粒样品。

B-目前常用的纯化方法：

1）CA16病毒株为在已鉴定为患手足口病的患者咽拭子中分离，经鉴定为CA16病毒并进行了病毒的单克隆，该病毒株经MRC-5细胞培养的病毒病变80%以上后直接收获，收获液经0.45微米滤膜进行过滤；

2）用300KD截留分子量的超滤膜进行超滤浓缩病毒悬液，浓缩8倍，向此浓缩液中添加11倍体积的磷酸盐缓冲液（pH7.5）；

3）将步骤2）的样品进行离子交换层析纯化，层析填料为阴离子层析纯化介质DEAE，层析纯化时缓冲液A为磷酸盐缓冲液（PBS pH7.5），缓冲液B为磷酸盐缓冲液（PBSpH7.5），1MNaCL，纯化时收集穿透峰为目的样品峰。

4）将步骤3）收集的穿透峰经层析填料分析筛（Sepherose6FF）层析纯化，层析纯化的缓冲液为磷酸盐缓冲液（pH7.5），收集第一个峰为目的样品峰。

2、纯化结果分析

用高效液相色谱分别分析经本发明提供的方法和目前常用的方法纯化后的样品，上样量为100μl，控制流速为0.5ml/min，分析分别结果见图1和图2。通过图1可见使用本发明提供的工艺纯化后得到的病毒液纯度经高效液相色谱检测纯度大于95%，通过图2可见使用目前常用方法纯化后得到的病毒液纯度经高效液相色谱检测纯度偏低，未达到95%的合格要求。

利用SDS－PAGE蛋白电泳法分别分析经本发明提供的方法和目前常用的方法纯化后的样品，结果分别见图3和4。通过图3可以得知，在25KD和35KD之间出现了两条明显可见特异条带，分别为病毒的外壳蛋白VP1和VP2+VP3（VP2和VP3分子量很接近在12%和15%的SDS-PAGE电泳上都不能完全分离开），病毒蛋白的电泳纯度达到90%；通过图4可见使用目前常用工艺纯化后得到的病毒液纯度经SDS－PAGE蛋白电泳检测纯度很低，并且存在空心颗粒蛋白VP0。可见本发明提供的纯化方法得到的完整实心颗粒病毒的纯度要远远高于目前常用技术。

电镜观察结果见图5和6，从使用本发明提供的方法纯化得到的样品，图5中可见大部分为完整的实心颗粒，完整实心颗粒占90%以上。而常规方法纯化的样品的电镜检测，见图6所示，实心颗粒比例较低，低于50%。

实施例2纯化后样品免疫原性的测定

将实施例1中经本发明提供的方法纯化得到的样品以及目前常用方法纯化的样品分别经甲醛灭活后与铝佐剂吸附制备成疫苗，将上述疫苗分别记为A疫苗和B疫苗，将A疫苗和B疫苗以及空心颗粒制成的疫苗分别免疫小鼠后的结果见表1。

表1：纯化后的CA16完整病毒颗粒免疫原性分析

通过表1可见，经本发明提供的方法纯化得到的样品制成的疫苗具有很强的免疫原性，要远远高于经实施例1中使用的目前常用技术纯化样品制备的疫苗，进一步说明了本工艺的纯化效果要优于目前常用方法，可为后期疫苗的研究奠定基础。

Claims (1)

1.一种制备柯萨奇A16型病毒完整实心颗粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)对细胞培养的病毒收获液进行滤膜过滤；

2)用超滤膜进行超滤浓缩病毒悬液；

3)病毒悬液经层析填料Capto^TMCore700层析纯化；

4)再经阴离子交换层析纯化后获得完整实心颗粒病毒；

其中，所述步骤1)的滤膜孔径为0.45微米；

其中，所述步骤2)中超滤膜的孔径为300KD截留分子量；

其中，所述步骤2)中对病毒悬液浓缩5-10倍，并进行至少10倍体积换液，换成pH为7.5的磷酸盐缓冲液；

其中，所述步骤3)中层析纯化的缓冲液为pH7.5的磷酸盐缓冲液；

其中，所述步骤4)中所用层析填料为阴离子交换树脂二乙氨乙基或Q琼脂糖凝胶FF；

其中，所述步骤4)中包含缓冲液A和缓冲液B，缓冲液A是pH7.5的磷酸盐缓冲液，缓冲液B中含pH7.5的磷酸盐缓冲液和1M的氯化钠。