CN112375142B - 静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法，要解决的技术问题是提高人免疫球蛋白的收率，降低成本。本发明的静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法，包括以下步骤：血浆病毒灭活，第一步亲和层析，第二步亲和层析，超滤透析，阴离子交换层析，纳米膜除病毒过滤，超滤，配制。本发明与现有技术相比，采用S/D病毒灭活剂灭活，用Protein A和Protein G两种亲和凝胶分别捕获血浆中IgG1、IgG2、IgG4和IgG3亚型，亲和层析后再用阴离子凝胶进一步纯化，去除白蛋白、IgA、IgM杂质，极大地提高人免疫球蛋白的收率，降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种人血浆蛋白的制备方法，特别是一种静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的分离纯化方法。
背景技术
新型冠状病毒肺炎COVID-19(新冠肺炎)为新发急性呼吸道传染病，是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2SARS-CoV-2(Severe Actue Respiratory Syndrome Coronavirus2)感染引起的急性传染性疾病，目前已成为全球性重大的公共卫生事件。SARS-CoV-2属于冠状病毒科，是一种β属具有包膜的单股正链RNA病毒。迄今为止，已经鉴定出六种冠状病毒感染人类并引起疾病。其中229E型冠状病毒、OC43型冠状病毒、NL63型冠状病毒和HKU1型冠状病毒感染通常为轻度感染，受感染的患者主要表现为发热，咳嗽和影像学上的肺部玻璃密度影，类似于严重急性呼吸综合征冠状病毒SARS-CoV和中东呼吸综合征冠状病毒MERS-CoV感染。其他两种，重症急性呼吸系统综合症冠状病毒SARS-CoV和中东呼吸系统综合症冠状病毒MERS-CoV，则可能引起致命的疾病。SARS-CoV-2是感染人类的冠状病毒科中的第7名成员。受感染的患者主要表现为发热，咳嗽和影像学上的肺部玻璃密度影，类似于SARS-CoV和MERS-CoV感染。
静注新型冠状病毒人免疫球蛋白是从COVID-19康复者恢复期血浆中分离、提纯的制品，并经过两步病毒灭活，具有抗SARS-CoV-2中和抗体效价高、纯度高、病毒安全性高特点，而且临床使用方便。
现有技术的人免疫球蛋白分离纯化工艺为低温乙醇工艺，例如发明专利公开号CN111499736A公开了一种静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法，如图2所示，利用COVID-19康复者恢复期血浆、或经SARS-CoV-2疫苗免疫的健康人血浆，采用三次低温乙醇法提纯静注新型冠状病毒人免疫球蛋白，并经低pH病毒灭活。存在步骤繁多、操作环境需要低温、能耗高、乙醇溶剂易燃易爆的缺陷，而且低温乙醇工艺产品得率较低。在病毒灭活方面，上述方法采用低pH孵放法，制作周期长。
现有技术的人免疫球蛋白制备方法主要存在以下3方面的缺陷：(1)采用低温乙醇工艺，乙醇溶剂易燃易爆，产品收率较低；(2)低pH孵放过程通常需要21天，导致生产周期长；(3)分离过程在低温下进行，增加能耗，而且技术工人长期在低温环境下工作易引发风湿性关节炎的职业病。
发明内容
本发明的目的是提供一种静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法，要解决的技术问题是提高人免疫球蛋白的收率，降低成本。
一种静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法，包括以下步骤：
一、血浆病毒灭活
采用新冠肺炎康复者血浆，融化后血浆去除冷沉淀，将去冷沉淀的血浆用其体积1～3倍、体积浓度为0.85～0.9％的生理盐水稀释，得到稀释后的血浆，用0.5mol/L HCl或醋酸缓冲液调节稀释后的血浆pH至7.0～7.5后，再向内加入其体积1/10的S/D病毒灭活剂，搅拌均匀，在25±1℃、继续搅拌下灭活6小时，得到灭活后血浆；
所述S/D病毒灭活剂为在注射用水中含有体积浓度10％的聚山梨酯-80和3.3％的磷酸三丁酯；
二、第一步亲和层析
将灭活后血浆用0.45μm滤芯过滤，加入到柱高8～12cm、6～8倍柱床体积的Protein A凝胶平衡液层析柱中，按ProteinA凝胶的最大处理量的60～80％上样，过滤后的灭活后血浆与ProteinA凝胶的接触时间为6～10min，收集流穿液1，得到Protein A吸附后血浆；用洗脱液洗脱被吸附在层析柱上的1型免疫球蛋白G(IgG1)、2型免疫球蛋白G(IgG2)和4型免疫球蛋白G(IgG4)，洗脱液线性流速为1.0～1.5cm/min，得到Protein A洗脱液；
所述Protein A凝胶采用MabSelectTMPrismA；将所述Protein A凝胶装填至层析柱内，得到Protein A层析柱，用6～8倍柱床体积的Protein A凝胶平衡液，以1cm/min的线性流速平衡所述Protein A层析柱，得到Protein A凝胶平衡液层析柱；所述Protein A凝胶平衡液为在注射用水中含有10～30mmol/L磷酸二氢钠和0.1～0.3mol/L氯化钠，pH 7.0～7.5；
洗脱液为在注射用水中含有0.1～0.5mol/L甘氨酸，pH 3.0～4.0；
三、第二步亲和层析
将ProteinA吸附后血浆用1M HCl或0.5mol/L HCl调节pH至6.8～7.2，用0.45μm滤芯过滤，加入到柱高8～12cm、6～8倍柱床体积的Protein G凝胶平衡液层析柱中，按Protein G凝胶的最大处理量的60～80％上样，过滤后的ProteinA吸附后血浆与Protein G凝胶的接触时间为4～8min，收集流穿液2，得到Protein G吸附后血浆；用洗脱液洗脱被吸附在层析柱上的3型免疫球蛋白(IgG3)，洗脱线性流速为1.3～2.0cm/min，得到Protein G洗脱液；
所述Protein G凝胶采用Protein G Sepharose 4Fast Flow；将所述Protein G凝胶装填至层析柱内，得到Protein G层析柱，用6～8倍柱床体积的Protein G凝胶平衡液，以1cm/min的线性流速平衡所述Protein G层析柱，得到Protein G凝胶平衡液层析柱；所述Protein G凝胶平衡液为在注射用水中含有5～30mmol/L磷酸二氢钠和0.1～0.5mol/L氯化钠，pH 6.8～7.2；
四、超滤透析
合并Protein A洗脱液和Protein G洗脱液得到合并洗脱液，直接在温度2～8℃下，采用30或50kD的超滤膜包超滤浓缩，至合并洗脱液体积的三分之一，再用4～8倍浓缩后体积的注射用水透析，出口端压力不大于2bar，回流端压力不大于1bar，采用30或50kD的超滤膜包，得到超滤透析后制品；
五、阴离子交换层析
将超滤透析后制品用0.45μm滤芯过滤，先加入到柱高18～22cm、6～8倍柱床体积的阴离子交换层析柱，按阴离子交换层析填料最大处理量的60～80％上样，上样流速为80～200cm/h，再用1～3倍柱床体积的层析平衡缓冲液洗涤层析柱，流速为80～200cm/h，收集流穿液2和洗涤液，合并得到流穿液3；
所述阴离子交换层析填料采用
DEAE，
TMAE，Capto Q或Capto QXP；
所述层析平衡缓冲液为在注射用水中含有10～30mmol/L醋酸钠缓冲液，pH5.0～6.0；
六、纳米膜除病毒过滤
将流穿液3用0.1～0.2μm滤芯过滤，再用20nm的纳米膜进行除病毒过滤，得到除病毒过滤后药液；
七、超滤
将除病毒过滤后药液用30或50KD超滤膜浓缩得到预浓缩药液，用6～8倍预浓缩药液体积的甘氨酸透析液对预浓缩药液进行恒体积透析，出口端压力不大于2bar，回流端压力不大于1bar，得到超滤后原液；
所述甘氨酸透析液为在注射用水中甘氨酸含量为10～30g/L；
八、配制
将超滤后原液用甘氨酸透析稀配，人免疫球蛋白含量为50～60g/L，pH为4.5～5.5，得到静注新型冠状病毒人免疫球蛋白。
本发明的静注新型冠状病毒人免疫球蛋白经0.2μm滤膜除菌过滤，按人免疫球蛋白含量2.5g/瓶规格分装。
本发明的步骤四的超滤透析后制品，人免疫球蛋白含量在5～30g/L，pH在5.0～6.0。
本发明的步骤五，用1～3倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱杂质，流速为80～200cm/h，将白蛋白、IgA和IgM洗掉，所述洗脱缓冲液为在注射用水中含1mol/L的NaCl溶液。
本发明的步骤七的预浓缩药液，人免疫球蛋白含量为80～100g/L，所述超滤后原液，人免疫球蛋白含量为60～80g/L，pH为4.5～5.5。
本发明与现有技术相比，采用S/D病毒灭活剂灭活，用Protein A和Protein G两种亲和凝胶分别捕获血浆中IgG1、IgG2、IgG4和IgG3亚型，亲和层析后再用阴离子凝胶进一步纯化，去除白蛋白、IgA、IgM杂质，极大地提高人免疫球蛋白的收率，降低成本。
附图说明
图1是本发明的方法示意图。
图2是现有技术的方法示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
如图1所示，本发明的静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法，包括以下步骤：
一、血浆病毒灭活
采用新冠肺炎康复者血浆，在室温(25℃)下，融化后血浆按现有技术离心去除冷沉淀，将去冷沉淀的血浆用其体积1～3倍、体积浓度为0.85～0.9％的生理盐水稀释，得到稀释后的血浆，用0.5mol/L HCl或醋酸缓冲液调节稀释后的血浆pH至7.0～7.5后，再向内加入其体积1/10的S/D病毒灭活剂，按现有技术搅拌均匀，在25±1℃、继续搅拌下灭活6小时，得到灭活后血浆。
S/D病毒灭活剂为有机溶剂与去污剂混合物病毒灭活剂，本发明实施例的S/D病毒灭活剂采用在注射用水中含有体积浓度10％的聚山梨酯-80和3.3％的磷酸三丁酯。
S/D病毒灭活可以有效灭活稀释后的血浆中的脂包膜病毒，使得脂包膜病毒滴度降低4log，灭活脂包膜病毒条件温和，不会破坏IgG结构，同时S/D病毒灭活剂能在步骤二和步骤三的两步亲和层析过程中被去除，S/D病毒灭活后血浆病毒安全性更高，更能保证操作技术员的安全。
二、第一步亲和层析
将灭活后血浆用0.45μm滤芯过滤，过滤后的灭活后血浆按现有技术加入到柱高8～12cm、6～8倍柱床体积的Protein A凝胶平衡液层析柱中，按Protein A凝胶的最大处理量的60～80％上样，过滤后的灭活后血浆与Protein A凝胶的接触时间为6～10min，收集流穿液1，得到Protein A吸附后血浆。用洗脱液洗脱被吸附在层析柱上的1型免疫球蛋白GIgG1、2型免疫球蛋白GIgG2和4型免疫球蛋白GIgG4，洗脱液线性流速为1.0～1.5cm/min，得到Protein A洗脱液。
Protein A凝胶平衡液为在注射用水中含有10～30mmol/L磷酸二氢钠和0.1～0.3mol/L氯化钠，pH 7.0～7.5。将Protein A凝胶按照美国思拓凡生命科学的MabSelectTMPrismA产品说明书中的装柱操作说明装填至层析柱内，得到Protein A层析柱，用6～8倍柱床体积的Protein A凝胶平衡液，以1cm/min的线性流速平衡(加入到Protein A层析柱，得到Protein A凝胶平衡液层析柱。Protein A凝胶采用MabSelectTMPrismA，是一种亲和树脂，它的配基是蛋白A，基架是琼脂糖凝胶。
洗脱液为在注射用水中含有0.1～0.5mol/L甘氨酸，pH 3.0～4.0。
Protein A吸附后血浆作为第二步亲和层析的原料。
三、第二步亲和层析
将ProteinA吸附后血浆用1M HCl或0.5mol/L HCl调节pH至6.8～7.2，用0.45μm滤芯过滤，按现有技术加入到柱高8～12cm、6～8倍柱床体积的Protein G凝胶平衡液层析柱中，按Protein G凝胶的最大处理量的60～80％上样，过滤后的ProteinA吸附后血浆与Protein G凝胶的接触时间为4～8min，收集流穿液2，得到Protein G吸附后血浆。用洗脱液洗脱被吸附在层析柱上的3型免疫球蛋白IgG3，洗脱线性流速为1.3～2.0cm/min，得到Protein G洗脱液。
Protein G凝胶平衡液为在注射用水中含有5～30mmol/L磷酸二氢钠和0.1～0.5mol/L氯化钠，pH 6.8～7.2。将Protein G凝胶按照美国思拓凡生命科学Protein GSepharose 4Fast Flow产品说明中的装柱操作说明装填至层析柱内，得到Protein G层析柱，用6～8倍柱床体积的Protein G凝胶平衡液，以1cm/min的线性流速平衡Protein G层析柱，得到Protein G凝胶平衡液层析柱。Protein G凝胶采用Protein G Sepharose 4FastFlow，是一种亲和填料，它的配基是蛋白G，基架是琼脂糖。
新冠肺炎康复者血浆属于稀有资源，因此，在纯化其中的IgG时应获得尽可能大的收率。本发明的方法中使用亲和IgG的亲和凝胶，可以直接捕获新冠肺炎康复者血浆中的IgG，当亲和凝胶的量足够多时，血浆中的绝大部分IgG可以被捕获，有效提高人免疫球蛋白的收率。但是亲和凝胶凝胶处理量低、价格高。在本发明的方法中，Protein A凝胶处理IgG的最大量是80mg/ml，明显高于Protein G的凝胶处理IgG的最大量20mg/ml，Protein A凝胶只能吸附IgG1、IgG2、IgG4，Protein G可以吸附IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，因此，本发明的方法分两步，采用Protein A凝胶与Protein G凝胶分步组合的方式，降低成本，提高人免疫球蛋白的收率。
四、超滤透析
合并Protein A洗脱液和Protein G洗脱液得到合并洗脱液，直接在温度2～8℃下，采用30或50kD的超滤膜包按现有技术超滤浓缩，至合并洗脱液体积的三分之一，再用4～8倍浓缩后体积的注射用水透析，出口端压力不大于2bar，回流端压力不大于1bar，采用30或50kD的超滤膜包，得到超滤透析后制品，人免疫球蛋白含量在5～30g/L，pH在5.0～6.0。
超滤透析的作用为将洗脱液甘氨酸溶液置换成注射用水。
五、阴离子交换层析
超滤透析后制品用0.45μm滤芯过滤，加入到柱高18～22cm、用6～8倍柱床体积的阴离子交换层析柱，按阴离子交换层析填料最大处理量的60～80％上样，上样流速为80～200cm/h，再用1～3倍柱床体积的层析平衡缓冲液洗涤层析柱，流速为80～200cm/h，收集流穿液2和洗涤液，合并得到流穿液3。白蛋白、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM)杂质被吸附在层析柱上，用1～3倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱杂质，流速为80～200cm/h，将白蛋白、IgA和IgM洗掉，进一步提高免疫球蛋白的纯度。
阴离子交换层析填料采用德国默克公司的
DEAE，德国默克公司的
TMAE，美国思拓凡生命科学的Capto Q或美国思拓凡生命科学的CaptoQXP。
将阴离子交换层析填料按照
DEAE、
TMAE、Capto Q或Capto QXP的说明书中的装柱操作说明装填至层析柱内，得到阴离子交换层析柱。
层析平衡缓冲液为在注射用水中含有10～30mmol/L醋酸钠缓冲液，pH 5.0～6.0。
洗脱缓冲液为在注射用水中含1mol/L的NaCl溶液。
本发明的方法使用阴离子交换层析，与现有技术的低温乙醇工艺相比可以IgA的残留量降低至低温乙醇工艺的20～50％，提高人免疫球蛋白的纯度，使IgG在临床使用中更安全。
六、纳米膜除病毒过滤
将流穿液3用0.1～0.2μm滤芯过滤，再用20nm的纳米膜进行除病毒过滤，得到除病毒过滤后药液。使用孔径20nm的滤膜除病毒过后，能截留大于20nm的病毒，如人类微小病毒B19HPV B19(Human parvovirus)。
根据《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》规定，对于免疫球蛋白类制品包括静脉注射用人免疫球蛋白、人免疫球蛋白和特异性人免疫球蛋白，生产过程中应有特定的灭活脂包膜病毒方法，但从进一步提高这类制品安全性考虑，提倡生产过程中加入特定的针对非脂包膜病毒的去除/灭活方法。本发明的方法步骤一使用S/D病毒灭活剂灭活病毒，有效灭活脂包膜病毒后，步骤六纳米膜除病毒过滤法去除非脂包膜病毒以及大于20nm的病毒，如HPV B19，本发明采用上述两种病毒灭活与去除方法，能有效去除病毒，保障血液制品临床用药安全。
七、超滤
将除病毒过滤后药液用30或50KD超滤膜按现有技术浓缩得到预浓缩药液，人免疫球蛋白含量为80～100g/L，用6～8倍预浓缩药液体积的甘氨酸透析液对预浓缩药液进行恒体积透析，采用30或50KD超滤膜，出口端压力不大于2bar，回流端压力不大于1bar，得到超滤后原液，人免疫球蛋白含量为60～80g/L，pH为4.5～5.5。
甘氨酸透析液为在注射用水中甘氨酸含量为10～30g/L。
超滤的作用是醋酸钠溶液与甘氨酸溶液置换。
八、配制
将超滤后原液按现有技术用甘氨酸透析稀配，得到稀配液，人免疫球蛋白含量为50～60g/L，pH为4.5～5.5。
九、除菌分装
将稀配液经0.2μm滤膜除菌过滤，得到静注新型冠状病毒人免疫球蛋白，按人免疫球蛋白含量2.5g/瓶规格分装，保持无菌状态。
本发明方法制备得到的静注新型冠状病毒人免疫球蛋白，按《中国药典》2015年版四部(通则0731第三法)检测蛋白质含量，按《中国药典》2015年版四部(通则0631)检测pH，按《中国药典》2015年版四部(通则3122)检测IgG单体和二聚体含量，《按中国药典》2015年版四部(通则3410)检测抗补体活性，按《中国药典》2015年版四部(通则3425)检测抗A、抗B血凝素，按《中国药典》2015年版四部(通则0541第五法)检测IgG纯度。
用散射比浊法检测IgA残留量、IgM残留量、IgG亚型分布，检测仪器为德国西门子的BN ProSpec型全自动蛋白分析仪，分别使用德国西门子公司的IgA、IgM、IgG检测试剂盒，按照BN ProSpec全自动蛋白分析仪标准操作规程﹝编号：EU0501(S)﹞进行检测。
用酶联免疫吸附测定法检测COVID-19抗体滴度，采用新型冠状病毒抗体检测试剂盒，按酶联免疫吸附试验操作规程(编号：QC1208)进行检测。
本发明的制备方法具有以下优点：
(1)采用条件温和的亲和层析和离子交换层析方法，提高了静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的纯度和收率。血浆IgG回收率大于85％(IgG回收率＝静注新型冠状病毒人免疫球蛋白中IgG的量/血浆中IgG的量*100％)，IgG纯度大于98％，IgA残留量低于50mg/L，IgG亚型分布在正常血浆范围内。
(2)采用Protein A凝胶和Protein G凝胶两种亲和IgG的凝胶组合，捕获IgG，确保了IgG亚型分布的完整性，又提高了凝胶处理量，降低了生产成本。
(3)采用阴离子交换层析方法，有效去除微量杂蛋白，如白蛋白含量低于100mg/L，IgA残留量低于50mg/L，IgM残留量低于5mg/L，IgG单体和二聚体含量之和大于99％。
(4)采用S/D病毒灭活剂和纳米膜过滤除病毒，能有效灭活和去除病毒，结合层析方法，全过程病毒降低量大于12log10。
(5)本发明的方法生产周期为1～2天，传统低温乙醇工艺生产周期为28～30天，有效提高了生产效率，降低能耗和劳动强度，能有效节约生产成本；本发明方法的制备周期只有1～2天，对于突发疫情如新冠肺炎疫情，可以快速地制备临床急需的静注人免疫球蛋白，对挽救重症患者生命有重要作用。
实施例1
一、血浆病毒灭活
取COVID-19康复者血浆1人份，在20～25℃条件下融浆，体积为558ml，去除冷沉淀，收集去冷沉淀血浆550ml，用550ml(1倍)、体积浓度为0.9％的生理盐水稀释，用0.5mol/L HCl调节稀释后的血浆pH至7.24后，加入110ml的S/D病毒灭活剂，搅拌均匀，在25±1℃、继续搅拌下灭活6小时，得到灭活后血浆。
二、第一步亲和层析
将灭活后血浆用0.45μm滤芯过滤，加入到柱高8.3cm、用7倍柱床体积的Protein A凝胶平衡液层析柱中，按Protein A凝胶的最大处理量的64％上样，过滤后的灭活后血浆与Protein A凝胶的接触时间为6.7min，收集流穿液1，得到Protein A吸附后血浆1240ml。用洗脱液洗脱被吸附在层析柱上的1型免疫球蛋白GIgG1、2型免疫球蛋白GIgG2和4型免疫球蛋白GIgG4，洗脱线性流速为1.4cm/min，得到Protein A洗脱液345ml。
Protein A凝胶采用MabSelectTMPrismA。Protein A凝胶平衡液为在注射用水中含有20mmol/L磷酸二氢钠和0.15mol/L氯化钠，pH 7.21。
洗脱液为在注射用水中含有0.25mol/L甘氨酸，pH3.2。
三、第二步亲和层析
将Prims A吸附后血浆用0.5mol/LHCl调节pH至7.03，用0.45μm滤芯过滤，加入到柱高8.5、用6倍柱床体积的Protein G凝胶平衡液层析柱中，按Protein G凝胶的最大处理量的65％上样，过滤后的Prims A吸附后血浆与Protein G凝胶平衡液的接触时间为4.4min，收集流穿液2，得到ProteinG吸附后血浆1225ml。用洗脱液洗脱被吸附在层析柱上的3型免疫球蛋白IgG3，洗脱线性流速为1.8cm/min，得到Protein G洗脱液88ml。
Protein G凝胶采用Protein G Sepharose 4Fast Flow。Protein G凝胶平衡液为在注射用水中含有20mmol/L磷酸二氢钠和0.15mol/L氯化钠，pH 6.98。
四、超滤透析
合并Prims A洗脱液和Protein G洗脱液得到合并洗脱液，直接在温度2～8℃之间，用50kD的超滤膜包超滤浓缩，至合并洗脱液体积的三分之一，再用5倍浓缩后体积的注射用水透析，出口端压力不大于2bar，回流端压力不大于1bar，得到超滤透析后制品，人免疫球蛋白含量在19.2g/L，pH 5.24。
五、阴离子交换层析
超滤透析后制品用0.45μm滤芯过滤，先加入到柱高18cm、用8倍柱床体积的阴离子交换层析填料层析柱，按阴离子交换层析填料最大处理量的65％上样，上样流速为100cm/h，再用2.5倍柱床体积的层析平衡缓冲液洗涤层析柱，流速为100cm/h，收集流穿液2和洗涤液，合并得到流穿液3共713ml。白蛋白、免疫球蛋白AIgA和免疫球蛋白MIgM杂质被吸附在层析柱上，用2倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱杂质，流速为100cm/h，将白蛋白、IgA和IgM洗掉。
阴离子交换层析填料采用
DEAE。
层析平衡缓冲液为在注射用水中含有10mmol/L醋酸钠缓冲液，pH 5.2。
洗脱缓冲液为在注射用水中含1mol/L的NaCl溶液。
六、纳米膜除病毒过滤
将流穿液3用0.1μm滤芯过滤，再用20nm的日本旭化成公司的PlanovaBioEX纳米膜进行除病毒过滤，得到除病毒过滤后药液。
七、超滤
将除病毒过滤后药液用50KD超滤膜浓缩得到预浓缩药液，人免疫球蛋白含量为80g/L，用6倍预浓缩药液体积的甘氨酸透析液对预浓缩药液进行恒体积透析，出口端压力不大于2bar，回流端压力不大于1bar，得到超滤后原液，人免疫球蛋白含量为60g/L，pH为4.53。
甘氨酸透析液为在注射用水中甘氨酸含量为20g/L。
八、配制
将超滤后原液用甘氨酸透析稀配，得到稀配液，人免疫球蛋白含量为48g/L，pH为4.53。
九、除菌分装
将稀配液经0.2μm滤膜除菌过滤，得到静注新型冠状病毒人免疫球蛋白，按人免疫球蛋白含量2.5g/瓶规格分装。
对实施例1进行随机抽样，检测其蛋白质含量，COVID-19抗体滴度，pH，IgG单体+二聚体，IgG亚型分布，抗补体活性，抗A、抗B血凝素，IgA残留量和IgM残留量质量指标，检测结果见表1。
表1实施例1的检测结果
实施例2
一、血浆病毒灭活
取COVID-19康复者血浆2人份，20～25℃条件下融浆，体积为1019ml，去除冷沉淀，收集去冷沉淀血浆1010ml，用2020ml(2倍)、体积浓度为0.9％的生理盐水稀释，用0.5mol/LHCl调节稀释后的血浆pH至7.03后，加入303ml的S/D病毒灭活剂，搅拌均匀，在25±1℃、继续搅拌下灭活6小时，得到灭活后血浆。
二、第一步亲和层析
将灭活后血浆用0.45μm滤芯过滤，加入到柱高12cm、用7倍柱床体积Protein A凝胶平衡液层析柱中，按Protein A凝胶的最大处理量的77％上样，过滤后的灭活后血浆与Protein A凝胶的接触时间为9min，收集流穿液1，得到Protein A吸附后血浆3660ml。用洗脱液洗脱被吸附在层析柱上的1型免疫球蛋白GIgG1、2型免疫球蛋白GIgG2和4型免疫球蛋白GIgG4，洗脱线性流速为1.1cm/min，得到Protein A洗脱液1387ml。
Protein A凝胶采用MabSelectTMPrismA。Protein A凝胶平衡液为在注射用水中含有20mmol/L磷酸二氢钠和0.15mol/L氯化钠，pH 7.0。
洗脱液为在注射用水中含有0.45mol/L甘氨酸，pH 3.7。
三、第二步亲和层析
将Protein A吸附后血浆用0.5mol/L HCl调节pH至7.18，用0.45μm滤芯过滤，加入到柱高15cm、6倍柱床体积的PrimsG凝胶平衡液层析柱中，按Protein G凝胶的最大处理量的76％上样，过滤后的Protein A吸附后血浆与Protein G凝胶的接触时间为9min，收集流穿液2，得到Prims G吸附后血浆3713ml。用洗脱液洗脱被吸附在层析柱上的3型免疫球蛋白IgG3，洗脱线性流速为1.5cm/min，得到Protein G洗脱液97ml。
Protein G亲和凝胶采用Protein G Sepharose 4Fast Flow。Protein G凝胶平衡液为在注射用水中含有20mmol/L磷酸二氢钠和0.15mol/L氯化钠，pH 7.20。
四、超滤透析
合并Protein A洗脱液和Protein G洗脱液得到合并洗脱液，直接在温度2～8℃之间，用50kD的超滤膜包超滤浓缩，至合并洗脱液体积的三分之一，再用5倍浓缩后体积的注射用水透析，出口端压力不大于2bar，回流端压力不大于1bar，得到超滤透析后制品，人免疫球蛋白含量在7.4g/L，pH 5.24。
五、阴离子交换层析
超滤透析后制品用0.45μm滤芯过滤，先加入到柱高20cm、8倍柱床体积的阴离子交换层析层析柱，按阴离子交换层析填料最大处理量的70％上样，上样流速为100cm/h，再用1倍柱床体积的层析平衡缓冲液洗涤层析柱，流速为100cm/h，收集流穿液2和洗涤液，合并得到流穿液3共1338ml。白蛋白、免疫球蛋白AIgA和免疫球蛋白MIgM杂质被吸附在层析柱上，用2倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱杂质，流速为100cm/h，将白蛋白、IgA和IgM洗掉。阴离子交换层析填料采用
DEAE。
层析平衡缓冲液为在注射用水中含有10mmol/L醋酸钠缓冲液，pH 5.2。
洗脱缓冲液为在注射用水中含1mol/L的NaCl溶液。
六、纳米膜除病毒过滤
将流穿液3用0.1μm滤芯过滤，再用20nm的日本旭化成PlanovaBioEX纳米膜进行除病毒过滤，得到除病毒过滤后药液。
七、超滤
将除病毒过滤后药液用50KD超滤膜浓缩得到预浓缩药液，人免疫球蛋白含量为78g/L，用6倍预浓缩药液体积的甘氨酸透析液对预浓缩药液进行恒体积透析，出口端压力不大于2bar，回流端压力不大于1bar，得到超滤后原液，人免疫球蛋白含量为65g/L，pH为4.6。
甘氨酸透析液为在注射用水中甘氨酸含量为20g/L。
八、配制
将超滤后原液用甘氨酸透析稀配，得到稀配液，人免疫球蛋白含量为46g/L，pH为4.6。
九、除菌分装
将稀配液经0.2μm滤膜除菌过滤，得到静注新型冠状病毒人免疫球蛋白，按人免疫球蛋白含量2.5g/瓶规格分装。
对实施例2进行随机抽样，检测其蛋白质含量，COVID-19抗体滴度，pH，IgG单体+二聚体，IgG亚型分布，抗补体活性，抗A、抗B血凝素，IgA残留量和IgM残留量质量指标，检测结果见表2。
表2实施例2的检测结果
实施例3
一、血浆病毒灭活
取COVID-19康复者血浆4人份，20～25℃条件下融浆，体积为2359ml，去除冷沉淀，收集去冷沉淀血浆2304ml，用4600ml(1.997倍)、体积浓度为0.9％的生理盐水稀释，用0.5mol/L HCl调节稀释后的血浆pH至7.44后，加入690ml的S/D病毒灭活剂，搅拌均匀，在25±1℃、继续搅拌下灭活6小时，得到灭活后血浆。
二、第一步亲和层析
将灭活后血浆用0.45μm滤芯过滤，加入到柱高10cm、用7倍柱床体积Protein A凝胶平衡液层析柱中，按Protein A凝胶的最大处理量的60％上样，过滤后的灭活后血浆与Protein A凝胶的接触时间为8min，收集流穿液1，得到Protein A吸附后血浆7734ml。用洗脱液洗脱被吸附在层析柱上的1型免疫球蛋白GIgG1、2型免疫球蛋白GIgG2和4型免疫球蛋白GIgG4，洗脱线性流速为1cm/min，得到Protein A洗脱液2253ml。
Protein A凝胶采用MabSelectTMPrismA。Protein A凝胶平衡液为在注射用水中含有10mmol/L磷酸二氢钠和0.15mol/L氯化钠，pH 7.4。
洗脱液为在注射用水中含有0.3mol/L甘氨酸，pH3.0。
三、第二步亲和层析
将Protein A吸附后血浆用0.5mol/L HCl调节pH至7.01，用0.45μm滤芯过滤，加入到柱高10cm、用6倍柱床体积的Protein G凝胶平衡液层析柱中，按Protein G凝胶的最大处理量的80％上样，过滤后的Protein A吸附后血浆与Protein G凝胶的接触时间为6min，收集流穿液2，得到Prims G吸附后血浆3413ml。用洗脱液洗脱被吸附在层析柱上的3型免疫球蛋白IgG3，洗脱线性流速为1.5cm/min，得到Protein G洗脱液232ml。
Protein G凝胶采用Protein G Sepharose 4Fast Flow。Protein G凝胶平衡液为在注射用水中含有20mmol/L磷酸二氢钠和0.10mol/L氯化钠，pH 7.00。
四、超滤透析
合并Protein A洗脱液和Protein G洗脱液得到合并洗脱液，直接在温度2～8℃之间，用50kD的超滤膜包超滤浓缩，至合并洗脱液体积的三分之一，再用5倍浓缩后体积的注射用水透析，出口端压力不大于2bar，回流端压力不大于1bar，得到超滤透析后制品，人免疫球蛋白含量在9.7g/L，pH 5.81。
五、阴离子交换层析
超滤透析后制品用0.45μm滤芯过滤，先加入到柱高20cm、用6倍柱床体积的阴离子交换层析填料层析柱，按阴离子交换层析填料最大处理量的80％上样，上样流速为100cm/h，再用1倍柱床体积的层析平衡缓冲液洗涤层析柱，流速为100cm/h，收集流穿液2和洗涤液，合并得到流穿液3共2033ml。白蛋白、免疫球蛋白AIgA和免疫球蛋白MIgM杂质被吸附在层析柱上，用2倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱杂质，流速为100cm/h，将白蛋白、IgA和IgM洗掉。
阴离子交换层析填料采用
TMAE。
层析平衡缓冲液为在注射用水中含有10mmol/L醋酸钠缓冲液，pH 5.8。
洗脱缓冲液为在注射用水中含1mol/L的NaCl溶液。
六、纳米膜除病毒过滤
将流穿液3用0.1μm滤芯过滤，再用20nm的日本旭化成的PlanovaBioEX纳米膜进行除病毒过滤，得到除病毒过滤后药液。
七、超滤
将除病毒过滤后药液用50KD超滤膜浓缩得到预浓缩药液，人免疫球蛋白含量为96g/L，用6倍预浓缩药液体积的甘氨酸透析液对预浓缩药液进行恒体积透析，，出口端压力不大于2bar，回流端压力不大于1bar，得到超滤后原液，人免疫球蛋白含量为73g/L，pH为4.57。
甘氨酸透析液为在注射用水中甘氨酸含量为20g/L。
八、配制
将超滤后原液用甘氨酸透析稀配，得到稀配液，人免疫球蛋白含量为50g/L，pH为4.57。
九、除菌分装
将稀配液经0.2μm滤膜除菌过滤，得到静注新型冠状病毒人免疫球蛋白，按人免疫球蛋白含量2.5g/瓶规格分装。
对实施例3进行随机抽样，检测其蛋白质含量，COVID-19抗体滴度，pH，IgG单体+二聚体，IgG亚型分布，抗补体活性，抗A、抗B血凝素，IgA残留量和IgM残留量质量指标，检测结果见表3。
表3实施例3的检测结果
实施例4
一、血浆病毒灭活
取COVID-19康复者血浆4人份，20～25℃条件下融浆，体积为2297ml，去除冷沉淀，收集去冷沉淀血浆2283ml，用2283ml(1.002倍)、体积浓度为)0.89％的生理盐水稀释，用0.5mol/L HCl调节稀释后的血浆pH至7.2后，加入575ml的S/D病毒灭活剂，搅拌均匀，在25±1℃、继续搅拌下灭活6小时，得到灭活后血浆。
二、第一步亲和层析
将灭活后血浆用0.45μm滤芯过滤，加入到柱高10cm、用6倍柱床体积Protein A凝胶平衡液层析柱中，按Protein A凝胶的最大处理量的60％上样，过滤后的灭活后血浆与Protein A凝胶的接触时间为9.5min，收集流穿液1，得到Protein A吸附后血浆5125ml。用洗脱液洗脱被吸附在层析柱上的1型免疫球蛋白GIgG1、2型免疫球蛋白GIgG2和4型免疫球蛋白G(IgG4)，洗脱线性流速为1.0cm/min，得到Protein A洗脱液2373ml。
Protein A凝胶采用MabSelectTMPrismA。Protein A凝胶平衡液为在注射用水中含有10mmol/L磷酸二氢钠和0.15mol/L氯化钠，pH 7.2。
洗脱液为在注射用水中含有0.1mol/L甘氨酸，pH 3.3。
三、第二步亲和层析
将Protein A吸附后血浆用0.5mol/L HCl调节pH至6.96，用0.45μm滤芯过滤，加入到柱高10cm、用7倍柱床体积的Protein G凝胶平衡液平好的层析柱中，按Protein G凝胶的最大处理量的75％上样，过滤后的Protein A吸附后血浆与Protein G凝胶的接触时间为8min，收集流穿液2，得到Prims G吸附后血浆5483ml。用洗脱液洗脱被吸附在层析柱上的3型免疫球蛋白IgG3，洗脱线性流速为1.8cm/min，得到Protein G洗脱液263ml。
Protein G亲和凝胶采用Protein G Sepharose 4Fast Flow。Protein G凝胶平衡液为在注射用水中含有30mmol/L磷酸二氢钠和0.15mol/L氯化钠，pH 7.00。
四、超滤透析
合并Protein A洗脱液和Protein G洗脱液得到合并洗脱液，直接在温度2～8℃之间，用50kD的超滤膜包超滤浓缩，至合并洗脱液体积的三分之一，再用5倍浓缩后体积的注射用水透析，出口端压力不大于2bar，回流端压力不大于1bar，得到超滤透析后制品，人免疫球蛋白含量在11.2g/L，pH 5.63。
五、阴离子交换层析
超滤透析后制品用0.45μm滤芯过滤，先加入到柱高15cm、用8倍柱床体积的阴离子交换层析填料层析柱，按阴离子交换层析填料最大处理量的60％上样，上样流速为80cm/h，再用1倍柱床体积的层析平衡缓冲液洗涤层析柱，流速为80cm/h，收集流穿液2和洗涤液，合并得到流穿液3共1524ml。白蛋白、免疫球蛋白AIgA和免疫球蛋白MIgM杂质被吸附在层析柱上，用2倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱杂质，流速为100cm/h，将白蛋白、IgA和IgM洗掉。
阴离子交换层析填料采用
DEAE。
层析平衡缓冲液为在注射用水中含有10mmol/L醋酸钠缓冲液，pH 5.6。
洗脱缓冲液为在注射用水中含1mol/L的NaCl溶液。
六、纳米膜除病毒过滤
将流穿液3用0.1μm滤芯过滤，再用20nm的日本旭化成的PlanovaBioEX纳米膜进行除病毒过滤，得到除病毒过滤后药液。
七、超滤
将除病毒过滤后药液用50KD超滤膜浓缩得到预浓缩药液，人免疫球蛋白含量为86g/L，用6倍预浓缩药液体积的甘氨酸透析液对预浓缩药液进行恒体积透析，出口端压力不大于2bar，回流端压力不大于1bar，得到超滤后原液，人免疫球蛋白含量为77g/L，pH为5.03。
甘氨酸透析液为在注射用水中甘氨酸含量为30g/L。
八、配制
将超滤后原液用甘氨酸透析稀配，得到稀配液，人免疫球蛋白含量为50g/L，pH为5.03。
九、除菌分装
将稀配液经0.2μm滤膜除菌过滤，得到静注新型冠状病毒人免疫球蛋白，按人免疫球蛋白含量2.5g/瓶规格分装。
对实施例4进行随机抽样，检测其蛋白质含量，COVID-19抗体滴度，pH，IgG单体+二聚体，IgG亚型分布，抗补体活性，抗A、抗B血凝素，IgA残留量和IgM残留量质量指标，检测结果见表4。
表4实施例4的检测结果
从实施例可以看出，本发明的方法利用新型冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆的人血浆，采用亲和层析、离子交换层析全层析工艺方法，同时加入S/D病毒灭活剂病毒灭活、纳米膜除病毒过滤双重病毒灭活与去除方法，制备得到高纯度、高效价的特异性中和静注新型冠状病毒人免疫球蛋白。
本发明的方法用全层析工艺方法代替低温乙醇纯化工艺方法，能够最大程度上保证IgG的结构完整性，显著提高静注新型冠状病毒人免疫球蛋白收率，充分利用宝贵的血浆资源，特别是COVID-19康复者恢复期血浆。采用S/D病毒灭活和纳米膜除病毒过滤的两步病毒灭活工艺，能够有效保障静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的安全性，与现有技术的低pH孵放病毒灭活工艺方法相比，S/D病毒灭活剂病毒灭活工艺方法所需时间更短，低pH孵放病毒灭活工艺方法为21天，本发明的S/D病毒灭活剂病毒灭活为6小时，能够显著地缩短生产周期，降低成本。
Claims (5)
1.一种静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法，包括以下步骤：
一、血浆病毒灭活
采用新冠肺炎康复者血浆，融化后血浆去除冷沉淀，将去冷沉淀的血浆用其体积1～3倍、体积浓度为0.85～0.9％的生理盐水稀释，得到稀释后的血浆，用0.5mol/L HCl或醋酸缓冲液调节稀释后的血浆pH至7.0～7.5后，再向内加入其体积1/10的S/D病毒灭活剂，搅拌均匀，在25±1℃、继续搅拌下灭活6小时，得到灭活后血浆；
所述S/D病毒灭活剂为在注射用水中含有体积浓度10％的聚山梨酯-80和3.3％的磷酸三丁酯；
二、第一步亲和层析
将灭活后血浆用0.45μm滤芯过滤，加入到柱高8～12cm、6～8倍柱床体积的Protein A凝胶平衡液层析柱中，按ProteinA凝胶的最大处理量的60～80％上样，过滤后的灭活后血浆与ProteinA凝胶的接触时间为6～10min，收集流穿液1，得到Protein A吸附后血浆；用洗脱液洗脱被吸附在层析柱上的1型免疫球蛋白G(IgG1)、2型免疫球蛋白G(IgG2)和4型免疫球蛋白G(IgG4)，洗脱液线性流速为1.0～1.5cm/min，得到Protein A洗脱液；
所述Protein A凝胶采用MabSelectTMPrismA；将所述Protein A凝胶装填至层析柱内，得到Protein A层析柱，用6～8倍柱床体积的Protein A凝胶平衡液，以1cm/min的线性流速平衡所述Protein A层析柱，得到Protein A凝胶平衡液层析柱；所述Protein A凝胶平衡液为在注射用水中含有10～30mmol/L磷酸二氢钠和0.1～0.3mol/L氯化钠，pH 7.0～7.5；
洗脱液为在注射用水中含有0.1～0.5mol/L甘氨酸，pH 3.0～4.0；
三、第二步亲和层析
将ProteinA吸附后血浆用1M HCl或0.5mol/L HCl调节pH至6.8～7.2，用0.45μm滤芯过滤，加入到柱高8～12cm、6～8倍柱床体积的Protein G凝胶平衡液层析柱中，按Protein G凝胶的最大处理量的60～80％上样，过滤后的ProteinA吸附后血浆与Protein G凝胶的接触时间为4～8min，收集流穿液2，得到Protein G吸附后血浆；用洗脱液洗脱被吸附在层析柱上的3型免疫球蛋白(IgG3)，洗脱线性流速为1.3～2.0cm/min，得到Protein G洗脱液；
所述Protein G凝胶采用Protein G Sepharose 4Fast Flow；将所述Protein G凝胶装填至层析柱内，得到Protein G层析柱，用6～8倍柱床体积的Protein G凝胶平衡液，以1cm/min的线性流速平衡所述Protein G层析柱，得到Protein G凝胶平衡液层析柱；所述Protein G凝胶平衡液为在注射用水中含有5～30mmol/L磷酸二氢钠和0.1～0.5mol/L氯化钠，pH 6.8～7.2；
四、超滤透析
合并Protein A洗脱液和Protein G洗脱液得到合并洗脱液，直接在温度2～8℃下，采用30或50kD的超滤膜包超滤浓缩，至合并洗脱液体积的三分之一，再用4～8倍浓缩后体积的注射用水透析，出口端压力不大于2bar，回流端压力不大于1bar，采用30或50kD的超滤膜包，得到超滤透析后制品；
五、阴离子交换层析
将超滤透析后制品用0.45μm滤芯过滤，先加入到柱高18～22cm、6～8倍柱床体积的阴离子交换层析柱，按阴离子交换层析填料最大处理量的60～80％上样，上样流速为80～200cm/h，再用1～3倍柱床体积的层析平衡缓冲液洗涤层析柱，流速为80～200cm/h，收集流穿液2和洗涤液，合并得到流穿液3；
所述阴离子交换层析填料采用
EMD DEAE，
EMD TMAE，Capto Q或Capto QXP；
所述层析平衡缓冲液为在注射用水中含有10～30mmol/L醋酸钠缓冲液，pH5.0～6.0；
六、纳米膜除病毒过滤
将流穿液3用0.1～0.2μm滤芯过滤，再用20nm的纳米膜进行除病毒过滤，得到除病毒过滤后药液；
七、超滤
将除病毒过滤后药液用30或50KD超滤膜浓缩得到预浓缩药液，用6～8倍预浓缩药液体积的甘氨酸透析液对预浓缩药液进行恒体积透析，出口端压力不大于2bar，回流端压力不大于1bar，得到超滤后原液；
所述甘氨酸透析液为在注射用水中甘氨酸含量为10～30g/L；
八、配制
将超滤后原液用甘氨酸透析稀配，人免疫球蛋白含量为50～60g/L，pH为4.5～5.5，得到静注新型冠状病毒人免疫球蛋白。
2.根据权利要求1所述的静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：所述静注新型冠状病毒人免疫球蛋白经0.2μm滤膜除菌过滤，按人免疫球蛋白含量2.5g/瓶规格分装。
3.根据权利要求1所述的静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤四的超滤透析后制品，人免疫球蛋白含量在5～30g/L，pH在5.0～6.0。
4.根据权利要求1所述的静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤五，用1～3倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱杂质，流速为80～200cm/h，将白蛋白、IgA和IgM洗掉，所述洗脱缓冲液为在注射用水中含1mol/L的NaCl溶液。
5.根据权利要求1所述的静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤七的预浓缩药液，人免疫球蛋白含量为80～100g/L，所述超滤后原液，人免疫球蛋白含量为60～80g/L，pH为4.5～5.5。
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