JPS5933233A - ＨＢｓＡｇを含有しないガンマグロブリンの製造方法及び生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は実質的にＨＩＪｓＡｇを含有していないガンマ
グロブリンの製造方法に関する。

多くの医療状態がガンマグロブリンの注射による治療を
特徴とする特に、ウィルス性肝炎に罹患する危険を除く
ためには、ガンマグロブリフの製造方法が決定的に重要
である。ウィルス性肝炎は、よくても衰弱性の病気であ
シ、最悪の場合には致命的である。それ故、このウィル
スによる注射用製品の汚染の危険を除くために行なわれ
る如何なる進歩も、きわめてｉＬ要なことである。

Ｂ型肝炎ウィルスに世界中で約２億人の人が感染してい
るものと推定されている。ガンマグロブリンの製造のだ
めの基礎材料は、人から採取される血漿であることが多
いから、多数の人間が慢性的又は急性的に感染している
キャリヤーであることを考えると、汚染した、すなわち
、感染した血漿を取得する恐れは著るしいものがある。

このような人からの感染した血漿は、種々の量のウィル
ス粒子を含有しているばかシでなく、異なる大きさ及び
形状のウィルス粒子を含有している。一般的な一形状は
、２２ｎｒｎの平均直径を有する球状ネや子である。こ
れらの球状粒子は一般に１）　＃　Ａを欠いており且つ
自由なウィルスのエンベロープを表わしている。それよ
りも一般的でないものは、４２ｎｍのデー：ｙ　（１）
（ｔｎｔｔ　）粒子であり、これはヴイリオン（Ｖｉｒ
ｉｏｎ　）を表わし旧つエンベロープ及びＤＮＡの分子
を含有する２Ｔｎｍのヌクレオカプシドから成る。遊離
のヌクレオカプシドは感染した肝細胞の核中には認める
ことができようが、一般に血漿中には見出されない。感
染した肝細胞は３．３日の半減期を有する過剰憤のエン
ベロープを合成することが認められており且つ体中に循
環していることが認められる。ウィルス粒子の異なる成
分に従って、異なる免疫学的マーカーが確認されている
。たとえば、核と連合して一般にＨＢｃＡｇ　　と呼ば
れる抗原及びＨＢｅＡｇと呼ばれる“ｅ　ｌ抗原がある
。しかしながら、Ｂ型肝炎ウィルスの感染の検出に用い
られるもつとも一般的な抗原は表面抗原ＨＨｓＡｇであ
る。

ＨＢｓＡｇ表面抗原は一般にエンベロープと連合してい
るものと考えられる。Ｂ型肝炎表面抗原に対して選択的
な免疫グロブリンはＥｍ肝炎感染に対して保護的である
から、その結果として、慢性キャリアーの血漿中に存在
するウィルスを保有しないエンペローブはワクチン源と
して有効に使用することができる。肝炎ウィルスの粒子
の構造と遺猷学的組織は、５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、
　２１３　。

４０６〜４１１（１９８１年７月）中のＢｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　、Ｖｉ；ｕｓ　”と題
するＴｉｏｌｌａｉｓらの文献中に解説されている。持
続性又は慢性肝炎とオーストラリヤ抗原との関連に関す
るさらに詳しい議論は、Ｃ、７？　、　Ｃ、Ｍｏｎｏｔ
ｏｐｉｃ　５ｅｒｉｅｓ、Ｃ０Ｒ，Ｃ，Ｐｒｅｓｓ、　
Ｃ１ｅａｖｅｌａｎｄ、　０Ａｊｏ（１９８２）中のＢ
ｌｕｍｂｅｒｇらによる”　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ　Ａｎ
ｔｉｇｅｎαｎｄ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ”　と題する論
文に見ることができる。Ｂ型肝炎表面抗原の肝炎ウィル
ス伝染性に対する密接な関係は、上記Ｂｌｕｍｂｅｒｇ
の文献の１４頁において論じられている。

歴史的には、肝炎型ウィルス感染の検査と確認のだめの
多くの試験が開発されており、一様に肝炎関連抗原又は
それに対して特異的な抗体の検出を目的とし−Ｃいる。

これらの試験は一般にＵ、Ｓ。

Ｂｕｒｅａ１４ｏｆ　ＢｉｏｌＯｇｉＣｓから人手する
ことができる軽度に陽性（ＤＩＩＩ３ｓＡｇ参照（ｒｅ
ｆｅｒｅｎｃｅ　）・ぐネル試料の検出におけるそれら
の感度に信任して、第一、第二父は第三世代試験として
船・徴付けられている。現在可能なもつとも高感度の試
験は第三世代のカテゴリーに入るものであって、シソオ
イムノアツセイ、酵素結合イムノン−ペントアッセイ（
ｉｒｒｗｎｗｎｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ　）　、逆受
動血球凝集反応及び逆受動ラテックス凝集試験を包含す
る。

これら第三世代の肝炎試験は、たとえは、血清１ｍ／当
り１０９１１ＢｓＡｇ粒子を検出することができる。残
念なことに、伝染性であるためにれ［ｌ　ｒｎｌの血清
当シ約１０′〜ＩＱ？個のｌｌＢｓＡｇ粒子の含有を必
要とするに過ぎない。それ故、現在可能なもつとも高感
度の試験による陰性の結果すら、試料の非伝染性を確実
なものとすることができない。

その結果、感染の可能性のある血漿源からの免疫グロブ
リン注射用試薬のための製造方法は、如何なる製造方法
も実質的にすべての伝染性ウィルス粒子を理想的に除去
できなければならないから、最大の重要事となっている
。現在、チン・ぞンソー生体試験のみが、特定試料の非
伝染性を確実にするために充分な感度を有している。こ
のような試験の費用と必要条件は、日常的な使用に対し
てそれを禁止的なものとしている。これについてはＶｉ
ｒａｌ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ、　Ｅｄ、　Ｖｙａａ　ａ
ｔ　ａｔ、、　’Ｉ’ｈｅＦｒａｎｋｌｉｎ　Ｉｎ５ｔ
ｉｔｕｔｅ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ
。

ＰＡ（１９７８）の第１１章中のＧｇｒｅｔｙらによる
”Ｔｈｅ’ｌ°ｅｓｔ　ｆｏｒ　ＪＩＢ−Ａｓｓｏｃｉ
ａｔｅｄＡｎｔｉｇｅｎｓ　ａｎｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ″を参照するとよい。

現在Ｆ　Ｉ）　、４及びＢｕｒｅａｕ、　　ｏｆ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃｓによって使用が承認されているすべての
免疫グロブリン注射用行別は、１９４０年代にノ・−バ
ードのＥ、Ｃｏｈｎ博士によッテ開発され、Ｃｏｈｎら
、Ｊ、　Ａｍ、　ＣｈｅＴｎ、　　Ｓｏｃ、、　　６８
　、４５９　（１９４６）中に記載されている、アルコ
ール分画方法によって製造されている。この方法は、現
在可能なもつとも高感度の試験によって決定した、肝炎
伝染性に対して陰性な血漿の注意深い選択と結び付けて
、米国政府がこの方法による製剤のみを安全女ものとし
て承認するという見解を採択し、長期間にわたって用い
られている。この方法によって製造される製品が実際に
安全であることは、この製品の無数の非感染受容者によ
ってＶ易に実証することができる。残念なことに、Ｃｏ
ｈｎの方法と関係する′数”の有利な情況にかかわらず
、Ｃｏｈｎの方法がなお完全な非伝染性を保証するもの
ではないということを証明する数々の問題が存在する。

多くの研究者がＣｏｈｎの方法の明白な成功の理由とし
て、血漿スクリーニング方法及び一層高感度な検出試験
（それによって伝染性の疑いのある原料血漿を除くため
）の両方の開発が指摘される。

Ｃｏｈｎの方法の明らかな成功にかかわらず、よシ優れ
た製造方法を開発すべき大きな経済的圧力が存在する。

Ｃｏｈｎの方法は美大な量の血漿を必要とするという点
で不利である。血漿は高価であるばかりでなく、供給量
もまた限られている。

本発明の目的は、Ｃｏｈｎらが開発したものよりモ効率
的なプロセスによって、血漿から安全にＢ型肝炎表面抗
原を除去することができる方法を提供することである。

ＨＢｓＡｇは肝炎の伝染性にもつとも高度に関係する指
標である故に、その除去を尺度として用いる。

ワクチンの製造のだめに有用な肝炎ウィルス粒子は、組
織培養物中で適切に生育させることはできず、それ故、
感染者の血液から単離しなければならない。種々の血清
の病気を生じさせる汚染血液成分を除去するために、血
液からの肝炎抗原の精製が必要でおる。

Ｂ型肝炎表面抗原の精製のためのこのような方法は、Ｍ
ｉｚｕｎｏらによる米国特許第４．１６２：　１９２号
に記載されている。Ａｆｉｚｕｎｏの方法は、望むらく
はＢ型肝炎表面抗原を含有する、普通に取得した血清を
、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム中に通じるこ
とを包含する。カラムは血漿成分の大部分を吸着するが
ＨｌｌｓＡｇＳけ自由に通過させる。次いでこのカラム
からの流出液を陽イオン交換樹脂中に通じ、それによっ
てガンマグロブリンが吸着されて、流出液中に含まれる
所望のＢ型肝炎表面抗原のみが残る。感染した血清の陰
イオン及び陽イオン交換樹脂カラム中の通過により、大
部分の血液成分が除かれたＢ型肝炎表面抗原含有溶液を
得られる。

本発明の別の目的は、ガンマグロブリンを含有しないＨ
ＢｓＡｇ含有溶液を提供するのみならず、すべてのＢ型
肝炎表面抗原が除かれたガンマグロブリン含有溶液を提
供し、それによって安全な注射用のイムノグロブリン試
薬を提供することである。

人の血清からのガンマグロブリンの分離のだめのいくつ
かの通常の方法が、特にＥａｗｍｓｔａｒｋらによって
”　Ａ　Ｐｒｅｐａ、ｒａｔｉｖｅ　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｆ
ｏｒＴｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　７　Ｓ　Ｇ
ａｍｍａ　ＧｌｏｂｕｌｉｎＦｒｏｍ　Ｊｌｕｍａｎ　
Ｓｅｒｕｍ″、Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙａｉｃｓ、　　１０
８　。

５１４〜５２２（１９６４）中に、またＡ、／。

Ｗｅｂｂによッテ”　Ａ　３Ｏ−Ａｊｉｎｕｔｅ　Ｐｒ
ｅｐａｒａ−ｔｉｖｅ　　−Ｍｅｔｈｏｄ　　Ｆｏｒ　
　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ＩｇＧＦｒｏｍ　Ｒ
ｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　　、Ｖｏｘ　　Ｓａｎｇ　　２
３　。

２７９〜２９０（１９７２）中に記載されている。

これらの画報文は、多くの他の汚染計１′１質を代有す
る血清からの種々のガンマグロブリンの部類の分離と選
択により多く関係［７ているけＪｔども、最初の血清試
料からの汚染Ｍ白質及び汚染物質の除去を扱っている。

何れも燐酸塩緩尚液溶出剤と共ニＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セフ
ァデックスカラムクロマトグラフィー材料を使用してい
る。両研究者は共に、汚染蛋白質の除去に関する限りは
、ある程度の成功をおさめているが、しかし何れも安全
な注射用の試薬を提供するだめの汚染されている肝炎ウ
ィルス粒子の除去の問題の解決には失敗している。

本発明の更に他の目的は、汚染されている肝炎ウィルス
粒子の除去において従来の方法によって提供されるもの
よりも効率的な、クロマトグラフィーカラム樹脂／緩価
剤組合わせを使用する方法を提供することである。

Ａ　Ｒａｐｉｄ　４ｆｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｐｒｅｐａｒ
ｉｎｇ　ｐｕｒｅＳｅｒｓｔｍ　Ｇａｍｍａ　Ｇｌｏｂ
ｕｌｉｎ　”　、Ｎａｔｕｒｅ。

１８８ｉ５６〜１５７（１９６０）と題する文献中テ５
ｔａｎｔｏｏｒｔｈによって記載されているもう一つの
方法は、透析して高分子Ｍｌ白質を除去した人血清から
習白質を除くためのノエチルアミノエチルセルロースア
ニオン交換樹脂のに用を包含している。しかしながら、
この方法は肝炎ウィルス汚染物に対する効果に関しては
不成功であシ且つその上注射の可能な試剤の提供にも失
敗しているが、これらは何れも本発明の目的とするとこ
ろである。

Ｃｏｎｄｉｅは米国特許第４．１３６．０９４号”　ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ
　Ｅｕｍａｎａｎｄ　　Ａｎｉｍａｌ　　Ｇａｍｍａ　
　Ｇｌｏｂｕｌｉｎ　ＡｎｄＩｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏＪ
’　Ａｌｂｕｍｉｎ　”　　において、静脈注射投与に
対して安全であると主張しているがンマグロプリンを取
得するための別の方法を記載している。Ｃｏｎｄｉｅの
方法は、気相法によるコロイド状シリカを用いる処理に
よる血漿の安定化、イオン交換樹脂によるガンマグロプ
リントアルブミンの単離と溶出、及び最後に濃縮透析と
滅菌濾過を包含する３操作から成っている。気相法コロ
イド状シリカを用いる工程は血漿中に存在する肝炎連合
（ａｓｓｏｃｉαｔｅｄ）抗原並びに多数の蛋白質加水
分解酵素及びそれらの前駆物質の除去のだめのものであ
る。コロイド状シリカ処理した材料をラジオイムノアッ
セイにょシ肝炎連合抗原の存在について検査した。試験
した材料は陰性であり且つ５０人を超える患者における
大量（３ｏ２を超える）の静脈内投与は肝炎ウィルスの
通過の徴候を示さず且つ肝炎の症状をも生じなかった。

しかしながら、前記のように、今日可能なラジオイムノ
アッセイ方法は試験試料が伝染性肝炎と無関係であるこ
とを保証し得ないということに注目しなければならない
。更に試験を行なうことがなければ、；このような材料
は、限られた臨床的研究に対して必要とするものを超え
る広汎な使用に対して米国政府によって承認されること
はないものと思われる。

本発明の更に他の目的は、血清及び肝炎連合抗原から、
気相法コロイド状シリカを必要とす°ることなく、イム
ノグロブリンを単離するための、きわめて簡単且つ効果
的な方法を提供することである。

胎児又は新生児の溶血性疾患の処置は、どちらかといえ
ば標準的となっており、母親を人起源のＲｈｏ（Ｄ）イ
ムノグロブリンの注射によって処置することによって行
なわれる。このような製品は、本願出願人会社から入手
することができるＲｈｏＧＡｋｆであり、免疫がないＲ
ｈｏ（Ｄ）陰性の母親が、赤血球上に存在して出産時に
Ｒｈｏ（１））陽性の幼児から受は取るＲｈ０（１））
抗原に応答することを防ぐことによって働らく。かくし
て、出産時の母親による抗Ｒｈｏ（抗−Ｄ）生産を防ぐ
ことによって、続いてこの母親のＲｈ０（＃）陽性幼児
を、新生児の溶血性疾患から保護する。この効果的な製
品は、現在はＣｏｈｎアルコール分画式方法によって製
造されているけれども、多くの研究者が、経済的により
有利な製品を提供し、それによって大量の血漿の必要を
減じ且つ肝炎感染の恐れに対する一層すぐれた防護を達
成するために、別個の方法を用いて類似の材料を生産し
よ゛うとする試みを行なっている。このような研究的な
試みは、Ｂｏｐｐｅ　らによシ″ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ
　ｏｆ　ＲｈＩｍｍｕｎｉｚａｔ、ｉｏｎ　　Ｍｏｄｉ
ｆｉｔｔｄ　　Ｐｒｏｄｖ、ｃｔｉｏｎｏｆ　　ＩｇＧ
　　Ａｎｔｉ−Ｊ？ｈ　　Ｆｏｒ　　Ｉｎｔｒａｖｅｎ
ｏｕｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　　ｌｌｙ　　Ｊｏｎ　
　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　　Ｃｈｒｏｍａ−１ｏｇｒａｐｈ
ｙ　”　　Ｖｏｘ　　Ｓａｎｇ、２５　：　３０８〜３
１６（１９７３）中で、及びＦｒ１ｅｓｅｎらによりＣ
ｏ１ｕｔｎｎ　Ｊｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｐｒｅｐａ
ｒａｔｉｏｎａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　ａｎ　Ｒｈ　Ｉｎｍｕ、ｎ。

Ｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｆｏｒ　Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｗｓ　
Ｕｓｅ　”。

ＪｏｔＬｒｎａｌ　　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃ
ｈｔｔｍｉｓｔｒｙ　　３　。

１６４〜１７５（１９８１）中で報告されている。

ドイツｔｙ）Ｉｌｏｐｐｅ　とカナダのＦｒ１ｅｓｅｎ
は共に、燐酸塩緩衝液溶離剤と組み合わせたＤＥＡＥ−
セファデックスクロマトグラフィーカラムを使用してい
る。抗−Ｄ含有血漿のＨｏ　ｐ　ｐ　ｅの源は、少なく
とも６ケ月の＃　１３　ｓ　Ａ　ｇ研究室検査に合格し
たボランティアからのもので、血漿はしばらく保存した
ものであった。それ故、Ｈｏｐｐｅは比較的安全な非伝
染性の血漿を用いて出発した。しかしながら、Ｂ型肝炎
表面抗原の除去に対するＩ’）　ＥＡ　Ｅ　−セファデ
ックス／燐酸塩緩衝剤の組み合わせの有効性を確認する
だめのそれ以上の検査は行なわなかった。その代りにＩ
ｆ　ｏ　ｐ　ｐ　ｅの関心は、凝集した材料の除去及び
比較的高い抗体濃度を有する分解してない、免疫電気泳
動的に（ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｈｏｒｅ　ｔ
　１ｃａｌ　ｌｙ　）純粋１１（ＩＧの単離に向けられ
テイタ。Ｆｒ１ｅｓｅｎの報告は、カナダにおいて使用
するための静脈内Ｒｈ　　ＩｇＧの開発のためにＨｏｐ
ｐｅの方法に対して行なった修飾について記載している
。Ｈｏ　ｐ　ｐ　ｅが行なったと同様に、Ｆｒ１ｅｓｅ
ｎはＲｈ血漿の各単位をＩＩ　Ｂ　８　Ａ　Ｑについて
検査することによって、陽性の検査結果を示す供与者を
すべて除いた。Ｆｒ１ｅｓｔｔｎはＡｂｂｏｔｔＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ、
　　ｌ１ｔｉｎｏｉｓからのラソオイムノアツセイキッ
ト（Ａｕ５ｔｒｉａ■）を使用した。この検査はなおも
つとも鋭敏なものの一つとみなされておシ、その後に開
発された発明においても用いられた。Ｆｒ　ｉ　ｅ　ｓ
　ｅｎは臨床試験によってｆ）ＥＡＥ−セファデックス
樹脂／燐酸塩緩衝剤の組み合わせを用いて生産した材料
がＲｈ免疫の防止のために有効且つ安全であることが示
されたと報告している。しかしながら、Ｆｒ１ｅｓｅｎ
は血漿試料からのＢ型肝炎表面抗原の除去のためのＤＥ
ＡＥ−セファデックス／燐酸塩緩衝剤組み合わせの有効
性を確認するためのそれ以上の試験を報告してはいない
。このことは、少なくとも米国政府の見通しからは、供
与者の血漿試料のスクリーニングにおいて用いられるラ
ソオイムノアツセイ試験は、なお伝染性である恐れのあ
る２〜３倍程度に低いＨＢｓＡｇ粒子の濃度を検出する
ことが不可能であるということによシ、特に重要なこと
である。米国政府が固相方式による注射可能なイムノグ
ロブリン薬品の生産の許可にきわめて制限的であること
は、このような方法によって生産した祭品の感染性の可
能性についてのこの関係による。

本発明の目的は、Ｂ型肝炎表面抗原を除去すべき能力に
おいてＩＩ　ｏ　ｐ　ｐ　ｅ又はＦｒ１ｅｓｅｎが用い
た方法よりもすぐれている樹脂／緩衝剤系を提供するこ
とにある。

本発明の原理及び目的に従って＼ガンマグロブリン含有
体液から実質的にすべてのＢ型肝炎表面抗原を除去する
ための方法を提供する。このような除去はｒ）ＥＡＥ−
セファデックスヌｌ＜ｉ　Ｑ　Ａ　１’：　−セファデ
ックス樹脂の何れかが充填しであるカラムに体液を注入
し、次いで選んだ樹脂がｃ２．４１ｇ　−セファデック
スである場合は０．０２ＡＩｆｍ酸塩緩衝液によシ、又
は何れの樹脂においても使用できるものとして約０．０
４　Ｍ　トリス緩衝液により溶出することによって行な
われる。これらの緩衝液は約７５のｐＨに調節すること
が好−ましい。カラムからの流出液を、一般には２８０
　ｎｍにおける光学的測定によって、；Ｉ’Ｅ白質の存
在について監視し、４１ｉ白質を含有する両分を集める
。蛋白質画分は実Ｍ的に、ＩＩＢｓＡｒｔを含まないガ
ンマグロブリンを含有する。

更に又、１：２に煽釈した体液１　ｔｎｊ’当りに少な
くとも８０Ｔｎ９に等しい比例する量の樹脂の使用が有
利であることが認められている。

本発明の樹脂／緩衝剤の組み合わせは一般に、以下に示
す試験によって支持されるように、Ｂ型肝炎表面抗原の
除去のだめの従来の方法において、　　用いられたＤ　
、Ｅ　ｙｌ　Ｅ−セファデックス−燐酸塩緩衝剤組み合
わせよりも著るしく効果的であることが認められている
。

人への注射用に生産されるイムノグロブリン製剤の安全
性に関する米国政府の正当な関心の故；・ζ、固相精製
用材料及びｄシ出剤の選択は、最終的に政府の１町する
工業的な製造を実現するた、１／’）には、表定的なこ
とである。それ故、後記のように多くの試験管内試験を
既に完了している。現在可能な最良の１ｌＢｓＡｙ検出
試験の限られた鋭敏性の故に、１史用した指導原理は、
Ｂ型肝炎表面抗原を除くために使用する如同なる方法も
、Ｂ型肝炎表面抗原試験の感度そ伝染性の閾値の間のギ
ャップを叩めるだめに、少なくとも２〜３次のａｔ　（
すなわち１００〜１　（１００１ＮＪｓ、４ｇ粒子／７
．〕ｔ’　）で除去することが示されねばならないとい
うことである。

４柚の試験する樹脂−緩動液系（Ｑ、４　Ｅ−セファデ
ックス／トリス、Ｉ）ＪＩＥ−セファデックス／トリス
、Ｄ　ＥＡ　Ｅ−セファデックス／燐酸塩又ハＱ　Ａ　
Ｅ−セファデックス／燐ｆ唆塩）の中の３４′＋［をａ
−有する４本のクロマトグラフィーカラム（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手する
ことができるアクリルプラスチックの０．９×１５ｃＩ
ｎのカラム）を別々に用意した。使用した緩衝液は、何
れも７．５の、ｐＨと５℃において２×ｔ　ｏ　−”　
ｍｈｏｓ　ｏ導ｔ４ｆ有ｔル、ｏ、　０２　、ＭＶｘｆ
ｌｌｌ塩とｏ、　０４　Ａｆ　トリス緩衝液であった。

緩衝剤は試薬品級のもので、それぞれ、Ｍａｔ　ｌ　１
ｎｃｋｒｏｄｔ及び５１ｇｍαから取得した。緩衝液を
り、に、Ｂ。

Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、からのＶａｒｉｏ
ｐｅｒｐｅｘ■装置によってカラム中に送り且つ流出液
を同じ（ＨＬ、　Ｋ、　Ｈ，Ｉｎｓｔｒｕｍｔｔｎｔｓ
、　Ｉｎｃ、からのＵｉｎｉｃｏｒｄ　　ＩＩ　Ｍ’ｏ
ｄｅｌ　　８３００を用いて２８０ｎｍで監視した。結
果をり、Ａ、　Ｂ、Ｉｎｓｔｒｕ−ｍｅｎｔｓ、　Ｉｎ
ｃ、のＡｌｏｄｅｌ　６５２０−７　６チヤンネル直流
記録計上に記録した。ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓから取得したイオン交換樹脂、ＤＥＡ
Ｅ−セファデックス（ロット１３７１６）とＱＡＥ−セ
ファデックス（ロット１５０９）を、使用すべき組み合
わせに従って、燐酸塩又はトリス緩衝液のどちらかで洗
浄し且つ平衡させた。最終樹脂溪度は２０１ｖ／ゴとし
た。充填仮に約８〃ｌ／、すなわち２４０〜３２０　ｍ
ｙの詰めだ樹脂をぼイ１している各カラムを、１時間当
り３０　ｍｌの流速で、２容量の適切な緩衝液で洗浄し
た。

肝炎陽性血漿〔“ホット″（ｈｏｔ　）血漿〕は約２０
０　ｍ９７　ｍｅのウィルス表面抗原（震度を有する慢
性Ｂ型肝炎感染患者から取得した。患者はＡ型、Ｒｈ陰
性でおり且つ肝炎はＡｙ亜類型であった。

Ｂ型肝炎表面抗原の検出はアーζット研究所から市販さ
れているラソオイムノアツセイギット（ｙｈｂｓｒｉα
■−１２５）を用いて行なった。

Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓが推奨してい
るように、方法Ｂを用いた。

血漿を先ず４℃で４．２２９　？　（５ｏｒｖａｌｌ遠
心分離機で５０００回転／回転釦おいて遠心分離して冷
不溶解物を除くことによって調製した。次いで試料を１
：１に希釈し且つｐＨを７．５に調節した。３　ｍｌの
この希釈試料をカラムに加え、樹脂を入れたのち、適切
なカラム緩衝液を送入した。流出液を２８０ｎｍの吸収
の光学密度について監視して、シフトしたベースライン
を有する全流出液部分を集めた。一般には、このピーク
の容積は１６−±１　ｍｌであった。更に２０ｍ１のカ
ラム緩衝液を樹脂上に通じ、それによって結合しない蛋
白質の除去を確実にした。この３　ｍｌの冷不溶解物上
澄液をカラムに加え且つ溶出する操作を、４樹脂緩衝液
系のそれぞれに対して５分離ピークを集メるまで繰返し
た。

集めたピークを、ＨｂｓＡｇ含量についての第３゜世代
ＲＩＡ試ｇのだメニ、ｐ　Ｈ７，５（Ｄ　Ｏ，０１ＡＩ
イミダゾール−〇、１６Ｍ塩化ナトリウム中に５％の牛
の血清アルブミンを含有する緩衝液で希釈した。

それらの結果を、カラム処理前の試料の直線的な低下か
ら決定されるカラムピークの同等の希釈度を与えるべき
カウントの対数に対する希釈度の対数としてプロット［
また。

各樹脂／衝液組み合わせ系から得た結果を第１表に示す
。“系欄は、樹脂／緩衝液組合わぜを示す（ＱＡＥはＱ
ＡＥ−セファデックスを表わし、１）　Ｅ　Ａ　ＥはＩ
）　Ｅ　、４　Ｅ−セファデックスを表わす）。

新しい樹脂／緩衝液系への試料の最初の送入を、樹脂／
緩衝液組み合わせの後に（１）で示す。洗浄時間後のカ
ラム上への試料の第二の送入を（ＩＩ）で示し、同様に
試料の第三の送入を（ｍ）で示す。

（１１”ポット”試料の既知希釈物の標準曲線から得た
希釈度。（１α）２試験の平均。

（１６）１回の試験値 （２１２００，０００ｎ　ｇ／ｍｌの出発ｌｌＢｓＡｇ
濃度を各基に対する等価希釈度によって割ることにより
求めた。

（３）　　ピーク画分中のＨＢｓＡｇ濃度にその容量を
掛けることによって求めた。

（４）下式によって求めた。

加えた画分中のＨＢｓＡｇ濃度 矩）加えた両分中のＨＢｓＡｇの電をピーク画分中のＨ
ＩＪｓＡｇの全量で割ることによって求めた。

（６）　　これらの画分をＡｂｂｏｔｔのキットによる
確認試験によって調べるとき、ＨｉＪ　８．４　ｇに対
して陰性であった。

（力　表中の値は累積値である。

（８）読みがスケールオフしたために近似的な浦外値で
ある。他の値はこの近似に頼っており、それ故、他の系
及び試料の使用に対する値よりも正確度が低い。

純粋に百分率の基準においては、４樹脂／緩衝液系の全
部が、少なくとも新しいカラムの最初の使用に関しては
、Ｂ型肝炎表面抗原の除去に対して同様に効果的である
ことがわかる。、しかしながら、これらの百分率は事実
を隠しており、°°実際数（ｒｅａｌ　ｎｕｒｎ、ｂｅ
ｒｓ　）　”の検査は、特に２００，０００ｎ　Ｑ　／
　ｔｎｅというきわめて大きなり型肝炎表面抗原の出発
濃度の故に、各樹脂／緩衝液系の間の実際の識別を果す
ことができるということを示すものと思われる。たとえ
ば、′キーク画分中のナノグラム単位での全ＨＢｓＡｇ
”と題する欄を調べることによって、３００．０００　
ｎ　ｇの試料（１，５ｍｌの２００、０００　ｎ　ｇ　
／　ｍｌ　）の使用から、それぞれＱＡＥ−トリス、Ｑ
ＡＥ−燐酸塩及びＤＥＡＥ−トリスの樹脂／緩衝液組み
合わせの力木７ムから得たピーク画分中では２−８ｎＱ
、２．１ｎＱ及び３．７ｎｇを測定しつるにすぎないこ
とがわかる。それに対して、ＤＥＡＥ−燐酸塩樹脂／緩
衝液系（常法に従って使用）の最初の送入は、カラムを
通過する多量の１１１１ｓＡｇの画分、ｆ−り中に４５
５．４”ｇ％が示すように、比較的望ましくないことを
示している。

同一系内で異なる樹脂／緩衝液系に対して比較するとき
、第二及び第三の負荷における結果は、Ｂ型肝炎表面抗
原試料負荷の飽和水準に対する上の３種の樹脂／緩衝液
系の相対的な抵抗性を示している。明らかに、ＱＡＥ−
セファデックス樹脂は表面抗原に対して比較的大きな親
和性を有しており、それが比較的効率が低いＤＥＡＥ−
セファデックス樹脂におけるよりも緩衝液の選択の重要
性を低くするものと思われる。ＤＬ′ＡＥ−セファデッ
クス／燐酸塩緩衝液の組み合わせは、カラム処理後のピ
ーク画分中の１１１３　ｓ　Ａ　ｇの濃度が他の如何な
る系におけるよりも少なくとも２００倍は高いことから
みて、Ｂ型肝炎表面抗原の除去に対【７て、もつとも効
果が低い系であることも明らかである。第二の負荷後に
、１）ＥＡＥ／燐酸塩の組み合わせは、汚染する１７Ｂ
ｓＡｇ成分の激しい攻撃に耐える能力がないことを明ら
かに示している。

ｌｌＢｓＡｇ濃度の低下（第１表の最後の欄）はこのよ
うに、カラムがｌｌＢｓＡｇを除く能力を百分率のみよ
シも良く反映する。

前記のＧｅｒｅｔｙは、試験の感度−伝染性ギャツブを
埋めるだめには、系の最低安全系数は表面抗原濃度の約
ｉｏ”の低下がなければならないということを報告して
いる。第１表から、最初の使用に対するＱＡＥ−燐酸塩
、ＱＡＥ−ト＋）ス及び１）ＥＡＥ−トリス樹脂／緩衝
液系は、何れも表面抗原濃度を約１０’だけ低下させ、
それによって約１０”低下の安全係数を与えることがわ
かる。

ＱＡＥ−トリス及びＱＡＥ−燐酸塩系のみが、第二〇カ
ラムの負荷の際に９９．９８％を超える肝炎表面抗原を
除くことによって、適切な安全係数を提供した。他の系
は、そのような環境において必要な保護に失敗し友。更
に表面抗原の適切な除去を確実とするためには、加える
試料ｌ−当シの樹脂の量が理想的には１６０ｑ／ｍ／以
上でなければならないということが見出されている。し
かしながら、未希釈試料のイオン強度の故に、収縮を避
けるためには試料を水でｌ：２に希釈することが好まし
いことが酵められた。この場合に、比率は１：２希釈試
料１　ｍｌ、当りに８０〜以−にの充填ＪＩＩＩＩ’　
ｔｌｉ′Ｔとなる。試料のイオン強度を低下させるため
の池の方法、たとえば　透析、を用いてもよいが、老る
しく強い伝染性の試料のＪｙ扱いを減するだめの手段と
１〜て、本発明の試験に対しては単なる希釈を行なった
。

１ｘｔｏ’　　ドルトンの公称分子犀゛カットオフを有
する膜を通じて行なう集めだカラム流出液の伎涙過工程
は、カラム溶出液中に存在するかも知れないウィルスの
いっそうの減少をもたらすものと思われる。Ｔａｂｏｒ
　　らは、熱不安定性の凝血因子濃縮物中の抗−ｉｔ　
ｎ　ｇの存在によるＢ型肝炎ウィルスの除去を報告して
いる（Ｌαｎｃｅｔ、　１９８０年７月１２日、６８頁
参照）。かくして、樹脂／緩衝液処理、材料に抗ＨＨｇ
を更に供与することによって、ｐ　Ｉ）　ＡとＢｕｒｅ
ａｕ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ　安全性要件を満足す
るガンマグロブリン製品が得られるものと思われる。上
記の実施例及び試験は本発明の好適方式を例証するけれ
ども、本発明の原理と範囲を制限するものではないこと
を了解すべきである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の各段階： α、精製することが必要とされるガンマグロブリン含有
   体液を準備し； ｂ、該体液をＤＥＡＥ−セファデックス及びＱＡＥ−セ
   ファデックスから成る群より選ばれた樹脂の有効量を含
   有するカラム手段にかけ； Ｃ０選んだ樹脂がＱＡＥ−セファデックスでおる場合に
   は約０．０２Ｍの燐酸塩緩衝液及び選んだ樹脂がＤＥＡ
   Ｅ−セファデックス又はＱＡＥ−セファデックスである
   場合には約０６０４Ｍのトリス緩衝液から成る群より選
   ばれた、何れもｐＥを約７．５に調節し、た緩衝液を用
   いて該カラムから体液を溶出し； ｄ、カラム溶出液を蛋白質の存在について監視［２； ｅ、監視に応答して、屏白質含有流出液を集め、それに
   よって実質的にＨＩ３５Ａｒｔを含有しないガンマグロ
   ブリンを取得ｔ−ル ことがら成ることを＠徴とするガンマグロブリン含有体
   液から実質的にすべての／７　Ｂ　ｓ　Ａσを除去する
   方法。 ２　樹脂の有効量が体液１　ｍｌ当り少なくとも１６０
   ■に等しい量である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、樹脂がＱＡＡ−セファデックスであり且つ緩衝液が
   ０．０２　Ｍ燐酸塩緩衝液である特許請求の範囲第２項
   記載の方法。 ４、樹脂がＱＡＥ−セファデックスでｓｂ且つ緩衝液が
   約０．０４　Ｍ　ト＋）ス緩衝液である特許請求の範囲
   第２項記載の方法。 ５　樹脂がＤＥＡＥ−セファデックスであ９月つ緩衝液
   が約０．０４　Ｍ　）　＋）ス緩衝液である特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 ６、％許請求の範囲第２項記載の方法によって製造した
   ガンマグロブリン。 ７、　カラム溶出液の約ｌＸｌ０’　　ドルトンの公称
   分子量カットオフを有する膜を用いる限外濾過の段階を
   さらに包含する特許請求の範囲第２項記載の方法によっ
   て製造したガンマグロブリン。 ８、　カラム溶出液の約ｌＸｌ０’　　ドルトンの公称
   分子量カットオフを有する膜を用いる限外濾過及び限外
   濾過した溶出液へのウィルス性肝炎伝染性を実質的に排
   除するために有効な量の抗−１１１３ｇを添加する段階
   をさらに包含する特許請求の範囲第２項記載の方法によ
   って製造［またがンマグロプリン。 ９　カラム溶出液に有効量の抗−ＨＢｇを添加し、それ
   によってウィルス性肝炎伝染性を実質的に排除する段階
   をさらに包含する特許請求の範囲第２項記載の方法によ
   って製造したガンマグロブリン。 １０、樹脂がＱＡＥ−セファデックスであり目。 つ緩衝液が約０．０５　Ｊｌイミダゾール緩衝液である
   特許請求の範囲第２項記載の方法。