KR101250095B1 - 항-Ａ 및 항-Ｂ 항체 그리고 다중반응성 ＩｇＧｓ가 결핍된면역글로블린 Ｇ(ＩｇＧ) 농축물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 치료용 용도를 위한 면역글로블린 G 농축물에 관한 것으로, 항-A 및 항-B 항체들의 각각의 함량은, 인 비트로(in vitro)의 간접 쿰스 테스트에서 네거티브 결과와 일치한다. 이러한 IgG 농축물은, 또한, 전체 IgG 함량을 기준으로, 0.01% 내지 0.1% 사이, 구체적으로는 0.07% 내지 0.1% 사이의 다중반응성 IgG 함량을 갖는다.
면역글로블린 G 농축물, IgG, 항-A 항체, 항-B 항체, 다중반응성, 면역친화성 크로마토그래피

Description

항-Ａ 및 항-Ｂ 항체 그리고 다중반응성 ＩｇＧｓ가 결핍된 면역글로블린 Ｇ(ＩｇＧ) 농축물{IMMUNOGLOBULIN G(IgG) CONCENTRATE DEPLETED OF ANTI-A AND ANTI-B ANTIBODIES AND OF POLYREACTIVE IgGs}
본 발명은, 항-A (AcaA)와 항-B (AcaB) 항체가 결핍된, 그리고 다중반응성을 격감시킨 면역글로블린 G 농축물(IgG), 및 상기 농축물을 얻기 위한 방법에 관한 것이다.
다양한 감염 또는 선천적인 결핍을 치료하기 위한 면역글로블린(Ig)이 풍부한 인간 플라즈마 분획의 용도는, Cohn의 에탄올 침전 방법의 개발 이후부터 알려져 왔다(Cohn 등, 1946, J. Am. Chem. Soc. 68, 459; Oncley 등, 1949, J. Am Chem. Soc. 71, 541).
예를 들어 인간 플라즈마로부터 획득된, 정맥 내 경로를 통한 주사를 위한, 고도로 정제된 Ig 농축물(IgIV)을 생산하기 위한 필요성이 증가하고 있다. 면역글로블린의 복합 구조(디설파이드 브리지에 의해 결합된 네개의 폴리펩타이드 체인들), 그리고 수 천의 기증자들로부터의 플라즈마 혼합물에 존재하는 항체들의 다양 성으로 인해, 현재 면역글로블린의 바이오테크놀로지의 발전이 촉진되지 않고 있다. 비록 모노클로날 항체들이 유전 공학에 의해 생산되지만, 그들의 극단적인 특이성은 다중 특이성이 나타날 필요가 있는 치료 응용분야에서는 단점이 될 수 있다.
추가적으로, 예를 들어 자가 면역 오리진의, 다수의 병리증상들은 현재 IgG 농축물로 치료하고 있으며, 이로 인해 최근 몇 년 사이에 유럽과 미국에서 상기 농축물이 부족한 실정이다.
면역글로블린과 특히 IgG 농축물을 얻기 위한 방법들은, 에탄올에 의한 단백질의 선택적인 침전에 추가하여, 폴리에틸렌 글리콜에 의한 침전, 제어된 단백질 가수분해 효소의 처리 등과 같은 다양한 다른 방법들을 또한 포함할 수 있으며, 이는 과민성 반응의 위험성과 관련하여, 보체계(complement system)을 활성화할 수 있는 면역글로블린의 집합체들을 제거하기 위한 것이다. 또한, IgGIV에 있어서 이량체의 존재는, 인 비보(in vivo)에서 동맥 혈압의 저하와 관련된다(Bleeker W. K. 등, Blood, 95, 2000, p.1856-1861).
에탄올 침전에 대한 대안으로는, 옥타노익산에 의한 침전을 사용하는 방법이, Steinbuch 등(Rev. Franc. Et. Clin. et Biol. 1969, XIV, 1054)에 설명되어 있다. 이러한 산은, 대부분의 플라즈마 단백질을 침전시키고, 상등액에 면역글로블린을 남긴다. 이러한 면역글로블린의 정제는, IgGs를 보유하고 있지 않는 조건하에서, 음이온 교환체, DEAE-셀룰로오스를 통해 얻어진다. 그런 다음, IgG를 보유하지 않는 분획은 농축된다.
또한, 크로마토그래피 기술을 이용하여 생산물의 순도를 높이기 위한, 다양한 방법들이 개발되어 왔다. 특히 특허출원 제EP0703922호와 제WO99/64462호에서는, 하나는 음이온 교환, 다른 하나는 양이온 교환에 의한, 둘 이상의 연속적인 크로마토그래피 공정들의 조합을 설명하고 있다. 이러한 방법들의 특이성은 음이온 교환체의 특성에 의해 제공되며, 그에 의해 면역글로블린 G를 체류시키지 않고, 대신 통상적인 크로마토그래피 조건하에서, 예비-정제 공정 동안 동시-정제된 다른 단백질의 대부분을 고정시킨다. 상기 출원인에 의해 출원된, 유사 특허 출원 제WO02/092632호에서는, 크로마토크래피 미디엄에서 그들의 보유을 위해, 알칼리성 pH에서 수행되는, 음이온 교환체 상에서 단일 크로마토그래피 공정을 이용한 Ig 농축물의 제조를 개시하고 있다.
그러나, 다수의 과학 간행물들은, 상기 분별 기술들에 의해 얻어지는 IgGs의 주입은, 치료를 진행하는 환자들에게, 때로는 심각한, 갑작스런 용혈(haemolysis)을 유발할 수 있다는 점을 지적한다. 예로서, Buchta C 등, Biologicals, 33, 2005, 41-48, Wilson J. R. 등, Muscle ＆ Nerve, 29(9), 1997, 1142-1145, Copelan E. A. 등, Transfusion, 26, 1986, 410-412 및 Misbah S. A. 등, Drug Safety, 9, 1993, 254-262 등의 간행물들이 언급될 수 있다. 용혈증상이 있는 환자들의 혈액에 대한 영향에 관한 연구는, 특히 직접 쿰스 테스트(direct Coombs test-DCT)를 이용하여 수행된, 적혈구들이 표면상에 존재하는 항원 A, B 또는 D에 대응되는 면역글로블린으로 덮혀지고, 그로 인해 그들의 용혈이 유발된다는 것을 보여준다. 이것이, 시장에서 입수 가능한 IgGs가, 항-D 면역글로블린의 존재 또는 항-A 또는 항-B 적정농도가 높은 다른 항체들의 존재를 피하기 위해, 선택된 플라즈마로부터 얻어지는 이유이다.
상기 언급된, Buchta 등은, IgGs와 같은 플라즈마 유도체에서, B와 O 혈액 그룹 제공자로부터 기원된 항-A 항체, 및 A와 O-그룹 제공자들로부터 유래된 항-B 항체의 현저한 감소를 달성하기 위한, 그리고 이러한 플라즈마 유도체들로 환자들을 치료할 때, 이러한 항체들의 레벨과 직접적으로 관련 있는 용혈의 위험성을 최소화시키는 관점에서, 여러 가지 접근들을 고려하였다. 제공자를 선택하는 것, 항-A 및 항-B 항체를 제거하는 것, 특이적인 그룹, A 및/또는 B로부터 기원된 혈장의 유도체를 생성하는 것, 그리고 배치로부터 항-A 및 항-B 항체에서 높은 적정 농도를 갖는 플라즈마를 차단하는 것이, 두드러지게 관찰된다. 일부 접근들은 비용 또는 행해지는 공정들의 복잡성으로 인해 비-현실적인 것으로 고려된다. 항-A 및 항-B 항체들은, 상기 언급된 에탄올 분류과정 동안, 부분적으로 제거된다는 점을 유념해야 한다.
IgG에 대한 수요가 꾸준히 증가하기 때문에, 통계적으로, 보다 많은 숫자의 O-그룹 제공자들을 포함할 수 있도록, 제공자의 풀을 더욱 확대할 필요가 있다. 결과적으로, IgGs와 같은 혈액 유도체들은, 종래의 분류방법에 의해 그들을 제거하기에는, 너무 높은 양의 항-A 및 항-B 항체들을 포함할 것이다.
이러한 증가하는 수요는, 항-A 및 항-B 항체들의 낮은 함량을 확실히 하기 위해서, 단지 AB 그룹의 제공자들만을 선택할 수 있도록 계획하는 것을 방해한다.
정제된 IgG 농축물 또는 침전물의 각각의 배치(batch)는, 간접 쿰스 테스 트(indirect Coombs test-ICT)의 인 비트로(in vitro)에서의 응용인, 유럽 약전(European Pharmacopeia, 1997)의 테스트 2.6.20을 이용하여, 항-A 및 항-B 항체들을 조절한다. 상기 ICT 테스트는, IgG 농축물 내에 함유된 IgG 타입의 항-A 또는 항-B 항체들로 덮혀진, 적혈구 세포들의 서스펜션에, 인간 IgG의 모티프에 대응되는 항체들(항글로블린)의 용액을 첨가하는 것으로 구성된다. 이러한 항체들은, 적혈구 세포에 부착된, 항-A 또는 항-B 항체들에 결합되고, 그로 인해 IgGs 사이의 브릿지의 형성을 통해 그들의 응집을 야기한다. 상기 항-A 또는 항-B 항체들의 검출을 위한 분석은, 혈액학적 혈청학에서 이러한 종래의 테스트(Coombs test)에 의해 직접적으로 영향을 받는다.
유럽 약전(European Pharmacopeia)에 의하면, IgIV는, 초기 농도를 30 g/l로 감소시킨 IgG 용액과 함께 수행된, 1:64의 희석 용액에서의 ICT 테스트에서, A 또는 B 적혈구의 어떠한 응집도 보여서는 안된다.
이는, 테스트되는 IgG 샘플들은 적정농도, 즉 더 이상 응집을 일으키지 않는 최종 희석 수치를 얻기 위해 희석되어야 하기 때문이다. 1:64 보다 낮은 희석 농도의 IgIV 용액 상에서 네거티브 ICT 결과는, 유럽 약전에 따라서, 허용 가능한 항-A 및 항-B 항체의 낮은 함량을 나타낸다. 그러나, 비록 유럽 약전에 의해 규정된 데스트, 즉 1:64 미만의 희석 비율의 농도에 대해, 네거티브 결과를 나타내는 IgG 농축물이라도, 용혈 반응의 위험성을 차단하지는 못한다(Buchta 등, 위에서 언급됨).
미국과 일본 약전에는 항-A 및 항-B 항체의 잔류 함량을 조절하기 위한 필요 성에 대한 규정이 없다는 것을 유념해야 한다.
위에서 언급한 바와 같이, 항-A 및 항-B 항체들은 에탄올 분별에 의한 IgG 농축물의 제조과정 동안 부분적으로 제거되지만, 잔류 함량은 유럽 약전의 상한치를 초과할 수 있는 것으로 관찰된다. 추가적으로, 상기 출원인에 의해 개발된, 그리고 그의 특허 출원 제WO02/092632호에서 설명된 방법에 따라 제조된 농축물은, 에탄올 분별에 의해 얻어진 것 보다 더 높은 함량을 갖는다. IgG 농축물의 일부 배치는 유럽 약전에서 설정된 임계치보다 높은 함량을 가질 수 있기 때문에, 따라서 얻어진 IgG 농축물의 항-A 및 항-B 항체에 관한 추가적인 정제가 필요하다.
IgG 농축물로부터 이러한 항체들을 제거하기 위한 한 가지 기술은, 혈액형의 항원 A 및 B에 유사한 올리고사카라이트 타입의, 미디엄로서 면역흡착제를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의한 정제로 구성되고, 상기 올리고사카라이드는 특히 크로마토그래피 메트릭스 상에서 그라프트된 트리사카라이드이다.
예로서, Mazid M.A. 등, J. Appl. Biomater., 3(1), 1992, 9-15의 간행물에서, 혈액형 A 및 B, 특히 A-트리사카라이드에 특징적인, 합성된 올리고사카라이드의 햅텐이 그라프트된, 실리카 입자들을 포함하는 크로마토그래피 미디엄을 사용하는 방법에 대해 언급되어 있다. 또한, Hout M. S. 등(ASAIO J, 46(6), 2000, 702-706)에는, 전체 혈액으로부터 항-A 및 항-B 항체의 제거를 위해, 특이적인 항-A 및 항-B 항원으로 그라프트된 관상 섬유질 멤브레인의 용도에 대하여 설명한다. 또한 상기 크로마토그래피 미디엄는 매우 안정적이어서, 상기 농축물에 있어서 이러한 잔류 헵텐의 배출을 제한하는 것으로 보고되어 있다.
특허 출원 제WO01/27623호에는 혈액 그룹 A 및 B의 항체에 탈-특이적화된 플라즈마, 즉 어떠한 리시버에 대해 안정적인 플라즈마를 얻기 위한 방법이 설명되어 있다. 이러한 특이성들은 본질적으로 면역글로블린 M(IgM)에 의해 운반된다. 탈-특이성은 그룹 A에 대한 실험적 친화성 미디엄을 통과한 후, 또한 실험적으로, 그룹 B에 대한 또 다른 친화성 미디엄을 통과함으로써 얻어진다. 항-A 및 항-B가 동시에 존재하는 경우(그룹 O)에 있어서, 상기 두 개의 미디엄 서포트에 대한 연속적인 통과가 필요하다.
시장에서 상업적으로 입수 가능한 IgG 농축물의 추가적인 특징들 중의 하나는, 그들의 다중반응성이다. IgG와 같은 폴리클로날 항체들은 보통은 유일한 형태의 단일 에피토프(항원의 모티프)와 결합된다는 것이 연상된다. 그러나, 항체의 이러한 정밀한 특이성은 때때로 다른 항원 모티프로 확장될 수 있고, 그러나 공칭(nominal) 모티프에 대한 것보다 더 약한 결합을 가진 두번째 에피토프에 대한 친화성을 보여줄 수 있다. 폴리클로날 IgG는, 액틴, 미오신, 트리니트로페닐-개질된 알부민과 같은 구조들과 더 크거나 또는 더 작은 정도로 반응할 수 있다.
이러한 관점에서, 정맥 면역글로블린(IgIV)은 다음을 포함하는 폴리클로날 인간 IgG의 조제물이다:
- 외부 항원에 대응되는 그리고 면역화 과정으로부터 산출되는 면역 항체;
- 세포 간 단백질, 표면 멤브레인 항원, 순환 자가 단백질 및 다른 항체들의 다양한 영역을 인식하는 천연 항체들. 후자는 항-이디오타입 항체라 한다(Kazatchkine M.D. 등, Immunol. Rev., 139, 1994, 79-107).
천연 항체들은 계획된 면역화로부터 산출되지 않는다(Coutinho A. 등, Curr. Opin. Immunol., 7, 1995, 812-818). 그것들은, 그것들이 자기 항원에 대한 다양한 친화성을 나타내는 다중반응성이다(Berneman A. 등, Eur. J. Immunol., 22, 1992, 625-632 그리고 Lacrox-Desmazes 등, J. Immunol. Methods, 216, 1988, 117-137).
IgIV의 화학적 처리(6M 우레아, 1.3M 소듐 티오시아네이트 및 산 처리 pH=2.0)는, 이러한 폴리클로날 면역글로블린의 다중반응성 활성을 증가시킬 수 있다(Bouvet J. P.등, J. Autoimmun., 16(2), 2001, 163-172). 그러나, 상기 면역글로불린으로 처리한 환자들에 있어서, 유리한 효과는 증명되지 않았다.
요약하면, IgIV 제조 과정에서 존재하는 상기 항체들의 다중반응성의 활성은 다음의 경우에 의한 것일 수 있다:
- 각각의 개별적인 플라즈마에 함유된 천연 항체들의 존재,
- 각각의 개별적인 플라즈마에 함유된 항-이디오타입 항체들의 존재,
- 상기 생산 방법에 의해 발생된 항체들의 다중반응성.
그러므로, 일부 권위자들은, 다중반응성은 IgG의 고유한 특성이고, 따라서 인체 내에 천연적으로 존재한다고, 생각한다.
다른 이들은, 모노클로날 또는 폴리클로날 IgG를 정제하기 위한 방법은, 정제 이전에 측정할 수 없는 다중반응성을 보일 수 있다고 설명한다. 실제로 플라즈마로부터 IgG를 생산하기 위한 방법들은, 또한, 생산과정 동안 IgG의 산화 “스트레스” 그리고 부분적인 카르보닐화로 해석되는, 다중반응성을 발생시킨다.
이는, Bouvet J. P. 등, Journal of Autoimmunity, 16, 2001, pp. 163-172에서 확인되고, 폴리클로날 IgG는, 특히 우레아로 처리한 후에, 고도로 다중반응성화 된다. 이 문헌에서는, 또한 임상 용도에서 IgG의 효능의 일부가 그들의 다중반응성에 의한 것이라고 지적하고 있다.
그러므로, 이러한 IgG 농축물의 다중반응성은, 모든 다가의 IgG의 0.5 내지 1%를 차지하는 통상적인 정제 방법에 의해 얻어진 다중반응성의 IgG와 천연 다중반응성의 Ig의 조합된 존재에 의해 설명될 수 있다. IgG 조제물로 환자를 치료하는 것은, 1 내지 2 g/kg 까지의 높은 투여량이 요구될 수 있다. 이러한 투여량은 짧은-기간의 치료, 즉 투여받는 자의 생리적인 IgG 양보다 7 내지 10 배 이상 많은 양으로 하루 내의 치료를 가능케 한다. 결과적으로, IgG 농축물에 있어서 상기 생산 방법에 의해 발생된 이러한 수준의 다중반응성의 IgG는, 열, 구토 또는 두통과 같은 부작용들을 유발할 수 있다.
그러므로, 본 출원인의 유럽 특허출원 제1059088호에서 나타난 바와 같은 장점을 갖는, 천연 및 항-이디오 타입 항체들로 인한 항체들의 다중반응성은, 상기 생산 방법에 의해 산출된 항체들의 다중반응성과 구분되어야 한다. 본 출원인의 유럽 특허출원 제1059088호에서 나타난 바와 같이, 인간 다가의 IgIV들로부터 분리된, 플라즈마 내에 천연적으로 함유된 다중반응성의 IgG의 분획은, 이러한 분획에서 요구되는 것보다 보다 작은 투여량으로, 류마티스 다발성 관절염과 같은 특정의 염증성 질병들을 치료하기 위해 바람직하게 사용될 수 있다.
그러므로, 적혈구의 용혈에 관해서 그리고 치료과정 동안 IgG의 다량 투여로 일어날 수 있는 부반응에 관해서, 양쪽의 역반응을 피하기 위해, 치료 용도를 위한, 특히 정맥 주사를 위한, IgG 농축물에 대한 필요성이 나타나며, 현저히 결핍된 항-A 및 항-B 항체들 그리고 상기 생산 방법에 의해 발생된 그것들의 다중반응성은, 면역치료에 관하여 최소 동일한 효능을 갖는, 현재 시장에서 상업적으로 입수 가능한 IgG 농축물과 비교하여, 바람직하게는 크게 감소된다.
그러므로, 본 발명은 치료의 용도를 위한 면역글로블린 G의 농축물에 관한 것으로, 항-A 및 항-B 항체들의 개별적인 함량은 인 비트로(in vitro)의 간접 쿰스 테스트(indirect Coombs test)에서 네거티브 결과를 제공하는 특징이 있다.
본 발명은, 또한, 천연 및 항-이디오타입 항체들보다 덜 내성화될 수 있는, 이러한 다중반응성의 항체들을 발생시키지 않는 것이 가능한, 면역글로블린 G를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 설명에서, 상기 방법으로 얻어진 IgIV는 다른 테스트된 IgIV 보다 낮은 다중반응성을 갖는다.
본 발명에서, 이러한 농축물의 IgG는, 바람직하게는 혈장로부터 또는 이미 IgG가 풍부한 혈장 분획으로부터 얻어진 폴리클로날 IgG이다. 치료의 용도를 위한 IgG 농축물은, 현재 종종 사용되는, 바람직하게는 50 내지 100g/L 사이의 IgG 농도를 갖는다. 이러한 농축물들은 임상 용도로 사용되고, 특히 정맥 내의 경로로 주사될 수 있다. 이러한 목적을 위해서는, 바이러스에 안전해야 하고, 선택적으로 이러한 임상 용도와 양립가능한 안정제와 같은 첨가물들이 포함될 수 있다.
본 출원인은, 표준 IgG 농축물에서 얻어지는 것, 즉 에탄올 분별 및/또는, 위에서 언급된 바와 같이, 크로마토그래피와 관련된 정제기술들을 이용함으로써 얻어지는 것보다, 훨씬 적은 항-A 및 항-B 항체 함량을 갖고, 그리고 상기 항체들을 제거하기 위한 추가적인 처리를 받지 않아도 되는, IgG 농축물을 제공하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 또한 그들은 함량은, 치료를 받는 일부 환자들에 있어서 용혈의 위험성을 상당히 제한하는, 유럽 약전에서 허용되는 임계치보다 한참 아래에 있다. 본 발명의 IgG 농축물에 대해 항-A 및 항-B 항체의 양을 평가하기 위한 테스트를 실시하였을 때, 항-인간 IgG 항체들의 존재하에서 A, B 및/또는 AB 적혈구의 인 비트로(in vitro) 응집 테스트의 결과는, 특히 유럽 약전의 방법에 의해 규정된 30 g/L의 초기 농도에서, 체계적으로 네거티브인 것으로 관찰되었다. 본 발명의 IgG 농축물에 대해, 앞서 언급된, 간접 쿰스 테스트를 수행하면, 희석되지 않은 IgG 샘플들에 대해서도 체계적으로 네거티브 결과가 나타난다. 그러므로 이러한 농축물들에 있어서 항-A 및 항-B 항체들의 함량은 이미 상기 ICT 테스트에 의해 측정-불가인 것으로 나타난다.
만약 항-A 및 항-B 항체들의 레벨이 IgG 농축물에서 매우 낮다면, IAT 테스트는 더 이상 적용할 수 없다. 심지어 유럽 약전의 조건하에서도 적혈구의 응집 반응이 더 이상 일어나지 않기 때문에, 심지어 항-인간 IgG 항체들을 첨가하더라도, 항-A 및 항-B 항체들의 밀도가 너무 약해서 적혈구에 고정된 항-A 및 항-B 항체들의 결합에 의한 적혈구들과 상기 항-인간 IgG 항체들 사이의 브릿지를 형성할 수 없기 때문에, IAT 테스트를 적용할 수 없다.
그러나, 이러한 항체들을 고정하는 적혈구의 면역 용혈작용을 야기함으로써, 그리고 항-A 및 항-B 항체들을 제거하기 위한 처리를 거치지 않은, 종래의 농축물과 비교하여 결핍을 측정함으로써, 매우 낮은 농도에서 이러한 항-A 및/또는 항-B 항체들의 존재를 다양화하는 것이 가능하다. 면역 용혈작용은, 항체가 보체 인자의 존재하에서 그것의 타겟에 부착되었을 때 일어나는, 특이적인 면역학적 반응이다. 보체 활성의 활성화는, 적혈구의 멤브레인을 뚫는 퍼포린의 방출에 이르게 하고, 헤모글로빈의 이탈을 허용하게 된다. 그 다음에 요구되는 것은 오로지, 민감한 방법, 예를 들어 방사성 추적자를 이용한 방법을 사용하여, 존재하는 항-A 및 항-B 항체들의 양에 비례하는, 방출된 헤모글로빈의 양을 측정하는 것이다.
본 출원인은, 본 발명의 IgG 농축물은, 항-A 항체의 함량은 23 ng/mg IgG 이하이고, 구체적으로는 19와 23 ng/mg IgG 사이이며, 항-B 항체의 함량은 20 ng/mg IgG 이하이고, 구체적으로는 12와 20 ng/mg IgG 사이라는 점을, 특히 바람직한 방법으로 설명한다.
유리하게는, 본 출원인은, 또한 매우 낮은 함량의 다중반응성의 IgG를 갖는 상기 IgG 농축물, 특히 상기 생산 방법에 의해 발생된 농축물을 제공하는 것이 가능하며, 그로 인해, 종래 기술에 따른 IgG 농축물 만큼 면역요법의 치료에 효과적인, 거의 비-다중반응성의 특징을 이러한 농축물에 전달할 수 있다는 것을 발견하였다. 상기 생산 방법으로 인한 이러한 IgG의 다중반응성 특징의 지각할 수 있는 부재는, 높은 투여량이 요구되는 치료에 수반될 수 있는 부작용의 위험성을 실질적으로 감소시킨다.
또한 유리하게는, 상기 방법으로 인한 IgG 농축물에 있어서 다중반응성의 IgG의 존재, 특히 정제 방법 동안의 산화 “스트레스” 및 카르보닐화에 의해 발생된 이러한 존재로부터, 유발되는 역효과를 수정하는 것이 가능하다.
바람직하게는, 다중반응성의 IgG의 잔기 함량은, 0.01% 내지 0.1% 사이, 특히 0.07% 내지 0.1% 사이이다. 본 발명에서, 다중반응성의 IgG의 함량은 몰 또는 중량 퍼센트이다. 이러한 함량은, 본 출원인의 특허 출원 제1059088호에서 설명된 방법을 이용하여 측정된다.
본 발명에 따른 IgG 농축물은, 적혈구 상에 존재하는 에피토프에 대응되는, 활성성분에 있어서 항-A 및 항-B 항체들의 인지할 만한 부존재로서 정의된다.
상기 IgG 농축물은, 적절한 안정제의 존재하에서, 액체 또는 동결건조된 형태일 수 있고, 이후의 사용을 위해 저장될 수 있다. 이러한 안정제들은, 바람직하게는 본 출원인의 특허 출원 제WO2004/091656 A2호에서 개발된 것들일 수 있으며, 즉 당알콜(sugar alcohol), 바람직하게는 만니톨, 소르비톨 또는 그들의 이성질체들의 혼합물, 글리신의 혼합물 및 Tween?80, Tween?20, Triton? X100 또는 Pluronic? F68과 같은 비-이온성 계면활성제의 혼합물이며, 상기 세 개의 화합물들 모두는 약학적으로 허용되는 것이다.
이러한 화합물들의 상기 성분 배합의 농도는, 액체 및/또는 동결건조된 형태를 안정화하기 위해, 본 출원인에 의해 측정되었다.
바람직하게는, 상기 농축물에 있어서 최종 만니톨 농도는 30g/L 내지 50g/L 사이이고, 계면활성제의 최종 농도는 20 내지 50 ppm 사이이며, 그리고 글리신의 최종 농도는 7 g/L 내지 10 g/L 사이이다. 이러한 화합물들의 농도는 IgG 농축물에서 최종 농도를 나타낸다.
상기 IgG 농축물은, 치료 용도를 위해, 앞서 언급한 바와 같이, 특히 정맥 내 경로를 통해 주입될 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 본 발명의 IgG 농축물은, 예를 들어, Tween? 80/TnBP 또는 Triton? X 100/TnBP의 혼합물을 사용하는 공정, 및/또는 상기 용매-계면활성제 바이러스 박멸제 처리, 예를 들어, 전염성 해면 상뇌증의 원인이 되는-프리온에 의해 제거되지 않는 바이러스 및/또는 다른 거대 분자들을 선택적으로 제거하기 위한 필터링 공정과 같은, 종래 기술로 알려진 통상적인 용매-계면활성제 처리를 사용하여 바이러스에 안전해야 한다.
본 발명은 또한 상기 언급된 바와 같은 IgG 농축물을 얻기 위한 방법에 관한 것으로,
a) 바이러스 불활성화 공정과 관련된, 에탄올 분별 및/또는 크로마토그래피 분리에 의해 IgG 농축물을 제조하는 공정,
b) 매트릭스가 혈액형 A 및 B와 항원 유사성을 갖는 올리고사카라이드와 그라프트된, 미디엄 서포트의 혼합물을 통해 상기 IgG 농축물을 용출시키는, 면역친화성 크로마토그래피 공정, 및
c) 바이러스 및/또는 20 nm 보다 큰 크기의 입자들을 제거하기 위한 여과 공정들을 포함한다.
본 출원인의 한 주목할만한 방식으로, 이러한 방법은 유리하게 산업적 판매가 실행될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 제조 공정들을 항-A 및 항-B 항체들을 제거하기 위한 특이적인 공정과 조합함으로써, 바람직하게는, 전체 IgG 함량에 대해 0.1% 미만의, 다중반응성의 IgG 함량을 포함하는, 치료의 용도를 위한, 본 발명의 IgG 농축물을 얻는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 추가적으로, 상기 농축물에 있어서, 원하지 않는 항-A 및 항-B 항체의 함량은, 유럽 약전에서 설명된 테스트의 제한치보다 훨씬 더 낮으며, 심지어 상기 희석되지 않은 샘플들에 대한 ICT 테스트에 대해 네거티브 결과를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 a) 공정은, 이미 언급된 방법들과 같은, IgG 농축물을 얻는 방법 자체일 수 있다. 그것은 Cohn 등에 의해 개발된 에탄올 분별 또는 예를 들어 특허 제EP0703922호와 제WO99/64462호에서 설명된 것과 같은 크로마토그래피 분리와 관계된다. 특히 바람직하게는, 본 출원인의 특허 출원 제WO94/29334호와 제WO02/092632A1호에 의해 개발된, 그리고 더욱 상세하게는 특허 출원 제WO02/092632A1호에서 설명된 방법에 의할 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 본 발명에 따른 방법의 a) 공정은, 혈장로부터 또는 혈장의 IgG가 풍부한 분획로부터 액체 오염물질을 첨전, 알칼리 pH 에서 수행된 음이온 교환 수지상에서의 단일 크로마토그래피, 그리고 pH 4 내지 7 사이의 적절한 버퍼를 이용한 하나의 공정에서 IgG의 선택적인 용리(elution)의 사전-정제공정을 포함한다.
상기 방법의 a) 공정은, 바이러스 불활성화 처리, 바람직하게는 Horowits에 의한 미국 특허 제4764369호에서 설명된 용매-계면활성제를 사용하는 것을 포함한다. 이것은, 특히 이러한 처리의 화학적 잔기들을 제거하기 위해 수행되는 수반하는 크로마토그래피 공정 이전에, 또는 적용 가능할 때, 실행되는 것이 적절하다.
수집된 IgG 분획은 이미 충분히 농축되어 있으며, 그런 다음 한외여과(ultrafiltration) 및 멸균 여과(sterilizing filteration)에 의한 추가적인 농축단계를 거칠 수 있다.
이러한 농축물은, 그런 다음, 혈액형 A 및 B와 유사성을 갖는 항원 그룹으로 그라프트된 두개의 미디엄 서포트의 혼합물 상에서, 바람직하게는 상기 미디엄 혼합물로 충진된 컬럼 상에서, 면역친화성 크로마토그래피에 적용된다.
바람직하게는, 상기 크로마토그래피 미디엄는, 아가로즈 타입의, 천연 교차결합된 폴리머 메트릭스로 구성되고, 스페이서 또는 커플링 암이 상기 메트릭스 상에서 그라프트되고, 이는 차례로 올리고사카라이드와 그라프트되며, 이러한 올리고사카라이드는 바람직하게는 혈액형 A 및 B의 에피토프에 대응되는 트리사카라이드이다. 특히, 혈액형 A의 에피토프에 대응되는, 트리사카라이드는 N-아세틸-갈락토사민(GalNac)-갈락토오스(Gal)-푸코오스(Fuc) 구조를 갖고, 혈액형 B의 에피토프에 대응되는 트리사카라이드는 갈락토오스-갈락토오스-푸코오스 구조를 갖는, 상기 미디엄을 이용함으로써, 매우 좋은 결과가 얻어진다. 상기 미디엄는, 매우 유리하게는, Glycorex Transplantation AS 사(스웨덴)의 GLYCOSORB ABO? 상표로 상업적으로 입수 가능한, 겔 또는 수지이다.
예를 들어, 이러한 미디엄가 사용된다면, 혈액형 A에 대응되는 트리사카라이드는 다음의 구조를 갖는다:
Figure 112008053898207-pct00001
N-아세틸-갈락토사민(GalNac)
갈락토오스(Gal)
푸코오스(Fuc)
예를 들어, 이러한 미디엄가 사용된다면, 혈액형 B의 에피토프에 대응되는 트리사카라이드는 다음의 구조를 갖는다:
Figure 112008053898207-pct00002
유리하게는, 혈액형 A 및 혈액형 B에 유사한 항원 그룹과 그라프트된 미디엄 혼합물은, 25/75 내지 75/25 (v/v) 사이에서 포함된 각각의 비율을 갖는다. 상기 컬럼 내에서 두 개의 미디엄 서포트 비율을, 혈액형의 분배에 따른 기증자 개체수에 따라, 조절하는 것이 실제로 가능하다. 통상적인 용도를 위해서, 상기 컬럼은, 상기 언급된 각각의 특이적 미디엄의 50/50 (v/v) 혼합물로 충진되는 것이 바람직하다. 15 내지 25 cm 길이의 분석 컬럼이 사용될 수 있고, 직경은 0.5 내지 1 cm이다. 파일롯 스케일에 적용하기 위해서, 40 내지 60 cm 길이 및 40 내지 60 mm 너비의 컬럼이 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 상기 컬럼을 600 ml의 면역친화성 미디엄로 충진하는 것이 가능하다.
상기 미디엄는, 2 순환을 사용하는 동안, 1M NaOH에 저장한다. 사용하기 전에, 상기 미디엄을 물로 세척한다.
상기 면역친화성 크로마토그래피 컬럼에, 그런 다음, IgG 농축물을 충진하며, 미디엄의 밀리리터 당, 바람직하게는 0.2 내지 4 리터의 비율로, 상세하게는 1 내지 2 리터의 비율로 충진한다. 상기 미디엄의 특이성은 IgG의 선행 패킹이 요구되지 않는다는 것으로, 즉, 선행 기술로 알려진 플라즈마 분류 기술들에 의해 얻어진 어떠한 IgG 분획 또는 농축물도 적절하게 사용할 수 있다.
상기 농축물의 용출(percolation)은 어떠한 용리 메커니즘을 수반하지 않는다. 그러므로, 상기 IgG 농축물이 얻어지는 방법에 관계없이, 상기 컬럼을 통해 용출되며, 선택적으로 펌프를 이용할 수 있다. 이러한 용출은, 항-A 및 항-B 항체와 다중반응성 IgG가 체류되도록 한다. 유리하게는, 상기 컬럼은 물로 세척하고, 컬럼의 데드 볼륨(dead volume)에 여전히 존재하는 IgG를 모은다.
상기 IgG 농축물이 용출된 이후에, IgG 분획은, 상기 생산 방법으로부터 유래된 항-A 및 항-B 항체와 다중반응성 IgG가 격감된 상태로 얻어진다. 상기 항-A 및 항-B 항체들은, 그들의 구조를 변형시키는, 상기 크로마토그래피 미디엄의 항원 모티프 상에 체류된다. 그러므로 상기 생산 방법 동안 발생된 다중반응성 IgG는, 또한 이러한 구조적 변형에 의해 노출된 자리에 체류된다. 이러한 다중반응성 IgG가 이차적으로 보유하는 친화성은, 항-A 및 항-B 항체의 친화성보다 훨씬 낮다. 그것들의 용리는, 상기 IgG가 통과한 후에, 예를 들어, pH 3-8, 6에서 0.1 내지 1.5 M 사이의 농도를 갖는 알칼리-토금속염을 함유하는, 용리 버퍼를 사용한 분별(fractionation)에 의해 가능하다.
상기 b) 공정 이후에, 상기 방법은 한외여과 및 멸균 여과에 의한 농축 공정을 포함할 수 있다.
상기 크로마토그래피 컬럼과 상기 미디엄는, 그런 다음, 상기 미디엄에 체류된 항-A 및 항-B 항체를 탈착시키기 위해, pH 2.8, 글리신-HCl과 같은 산 용액으로 세척한다. 이러한 미디엄는, 그런 다음, 물로 헹궈내고 1 M NaOH 용액으로 처리한다.
항-A 및 항-B 항체와 다중반응성 IgG가 크게 격감된 상기 IgG 농축물은, 그런 다음, 용매-계면활성제 처리에 견딜 수 있는 어떠한 바이러스들을 제거하기 위해, 그리고 프리온, 생산 공정 동안 발생된 IgG 폴리머, 마이셀 리포폴리사카라이드, 응집된 핵산 및 단백질과 같은 20 nm보다 큰 크기의 다른 입자들을 제거하기 위해 여과를 실시하였다. 상기 처리는, 유리하게는 100 에서 15 nm까지 다공성을 감소시킨 필터에서 실행되는 나노여과이고, 상세하게는 100, 50 및 20 nm의 체류 임계치를 감소시킨 세 개의 필터들을 연속적으로 배열한 상태에서 실행될 수 있다.
상기 c) 공정 이후에, 상기 방법은 안정제를 첨가하는 첨가 공정을 포함할 수 있으며, 이는 첫째 저장하는 동안 IgG 농축물의 안정성을 확보하기 위한 것이고, 둘째로는 관련된 다양한 상태에서 IgG의 변성을 방지하기 위한 동결 건조(lyophilisation)를 가능하게 하기 위한 것이다. 바람직하게는, 약학적으로 허용될 수 있으며, 상기 IgG의 두 가지 예상되는 저장 형태, 즉, 액상 형태 또는 동결 건조된 형태를 안정화하기 위한 목적에 부응하는, 그리고 특허 출원 제WO2004/091656A2호에 설명된 바와 같이, 이러한 IgG의 치료 효능을 유지 내지 심지어 향상시키는, 단일 안정화 조제물이 추가된다.
또 다른 실시예들에서, 특허 제WO02/092632A1호에서 설명된 바와 같이, 다른 면역글로블린의 선택적 수집이 또한 가능하다.
상기 IgG 농축물은, 선택적으로 한외여과, 이후의 멸균 여과에 의한 수반되는 농축 공정에 적용되며, 바람직하게는 4℃ 범위의 온도에서 병에 저장될 수 있다.
위에서 충분히 설명된 바와 같이, 본 발명의 IgG 농축물은, 유럽 약전에 의해 허용된 임계치보다 훨씬 낮은 항-A 및 항-B 항체 함량을 갖는다. 그러므로, 거기에서 설명된 분석 방법 2.6.20(1997)은, 본 발명의 IgG 농축물에서는, 매우 낮은 레벨의 상기 항체들을 측정하기에 민감도가 불충분한 것일 수 있다. 그러므로, 항-A 및 항-B 항체들의 측정하기 위해, 유럽 약전에서 적용된 ICT 테스트 보다 낮은 검출 임계치를 요구하는, 이러한 항체들에 대한 분석 방법을 개발하는 것이 필수적이다.
본 발명의 IgG 농축물에 있어서 항-A 및/또는 항-B 항체들에 대한 상기 분석방법은,
a) 혈액형 A, B 및/또는 O Rh+(Rhesus+)의 적혈구의 서스펜션을 제조 및 조정하는 공정,
b) 생물학적으로 허용 가능한 버퍼에서, 0 내지 200 ng/ml의 농도 범위에 대해, 모노클로날 항-D 항체의 용액을 제조하는 공정,
c) 상기 적혈구를 IgG 용액 샘플과 또는 모노클로날 항-D 항체와 접촉시키고, 그로 인해 얻어진 적혈구의 혼합물을 소정의 시간 동안 배양하는 공정,
d) 각각의 적혈구 혼합물에 플루오로크롬으로 표지된 항-인간 IgG 항체 F(ab’)2 단편을 첨가하고, 상기 적혈구를 배양하는 공정,
e) 상기 d) 공정에서 얻어진 각각의 적혈구 혼합물에 대해 유세포 분석(flow cytometry)을 수행하는 공정, 및
f) 상기 IgG 농축물에서 항-A 및/또는 항-B 항체들의 함량을 측정하는 공정으로 구성되는 공정들을 포함한다.
항-A 및/또는 항-B 항체들의 함량을 측정하기 위한 상기 방법의 일실시예는, 소 혈청 알부민 BSA를 0.8 내지 1.5 중량% 함유하는, pH 7.0 내지 7.4 사이의 PBS 버퍼에서, 혈액형 A, B 및/또는 O의 적혈구의 1 %v/v 서스펜션을 제조하는 것을 포함할 수 있다. 상기 서스펜션의 적혈구는, 통상적인 유세포 측정 장치에 의해 산출되고, 상기 장치의 작동법은 당해 기술 분양의 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있으며, 상기 서스펜션은 37 내지 43.106 적혈구/ml 서스펜션이 되도록 조정한다.
모노클로날 항-D 항체들의 용액들을 제조하고, 상기 용액의 농도 범위는 0 내지 200 ng/ml 버퍼이며, 상기 버퍼는 바람직하게는 7.0 내지 7.4 사이의 pH의 PBS 버퍼이고, 선택적으로 0.8 내지 1.5 중량% 소 혈청 알부민 BAS를 함유한다. 그로부터 제조된 각각의 용액은, 몰 흡광 계수(ε)를 측정하기 위해 흡착측정에 의해 분석된다.
본 발명의 IgG 농축물은, 그런 다음, 소 혈청 알부민 BSA를 0.8 내지 1.5 중량% 함유하는, pH 7.0 내지 7.4 사이의 PBS 버퍼를 사용하여, 1 내지 5 mg/ml의 수치 범위의 농도, 바람직하게는 1 mg/ml 농도로 조절된다.
각 혈액형의 적혈구 서스펜션의 50 내지 100 ㎕의 부피를, 마이크로플레이트, 예를 들어 96-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 위치시킨 다음, 50 내지 100 ㎕의 IgG 용액을 이러한 적혈구의 서스펜션에 첨가하거나, 50 내지 100 ㎕의 항-D 항체 용액을 이러한 적혈구 서스펜션에 첨가한다.
상기 전부를, 30 내지 40℃의 일정한 온도, 바람직하게는 37℃에서, 1시간 30분 내지 2시간 30분 사이, 상세하게는 2시간 동안, 배양한다.
그로 인해 얻어진 적혈구의 다른 혼합물들을, 바람직하게는 상기의 BSA를 함유하는 PBS 버퍼로 세척하고, 원심분리하며; 그런 다음, 앞서 정의된 PBS 및 BSA 버퍼에 존재하는 마이크로웰 플레이트에 함유된 각각의 적혈구 혼합물들에 대해, 50 내지 100 ㎕ F(ab’2) 염소 항-인간 IgG 항체를 첨가하며, 이는 플루오로크롬, 예를 들어 피코에리트린으로 표지된다.
상기 전체를 어두운 곳에서 약 20 내지 30 분 동안 배양한다.
그로 인해 얻어진 적혈구의 다른 혼합물들을 세척하고, 분석되는 화합물의 형광을 측정하는 장치를 포함하는, 시장에서 상업적으로 입수할 수 있는 어떠한 적절한 장치를 이용하여 유세포 분석(flow cytometry)을 수행한다.
평균 형광 강도(MFI)는 모노클로날 항-D 항체의 농도에 관련되어 제공되며, 선형 회귀 방정식은 엑셀 소프트웨어를 이용하여 얻어진다. 그런 다음, 각 샘플들에 대하여, 항-D 항체 당량에 있어서 농도는 선형 회귀 방정식을 이용하여 얻어진다. 상기 샘플들의 삼중의 배치들을 분석하여, 엑셀 소프트웨어를 이용하여, 평균 농도를 측정하고, 변동계수를 계산한다.
본 발명의 IgG 농축물에 있어서 항-A 및 항-B 항체들의 함량은 감소될 수 있으며, 이는 유리하게는 상기 제공된 함량이다.
바람직하게는, 상기 IgG 농축물에 있어서 항-A 및 항-B 항체들에 대한 하나의 분석 방법은, 본 발명의 문맥에서 적용된 유세포 분석에 의해 수행되며, 그 원리는, 항-A 및 항-B 항체 함량의 원하는 특이적 측정법에 따라, 이러한 항체들의 함량에 비례하는 형광 시그널의 측정을 이용하는, 혈액형 A 또는 B의 인간 적혈구의 용도에 기초한다.
상기 분석 방법은,
a) 혈액형 A 또는 B의 적혈구의 서스펜션을 제조 및 조정하는 공정,
b) 상기 적혈구를 IgG 용액의 희석된 샘플과 접촉시키고, 얻어진 혼합물을 소정의 시간 동안 배양하는 공정,
c) 플루오로크롬으로 표지된 항-IgG 항체의 존재하에서, 상기 적혈구를 배양하는 공정, 및
d) 상기 c) 공정에서 얻어진 적혈구의 서스펜션에 대해 유세포 분석(flow cytometry)을 수행하는 공정들을 포함한다.
혈액형 A 또는 B 적혈구의 1 %v/v 서스펜션은, 소 혈청 알부민 BSA를 0.8 내지 1.5 중량% 함유하는, pH 7.0 내지 7.4 사이의 PBS 버퍼에서 제조된다. 상기 서스펜션의 적혈구는, 통상적인 유세포 측정 장치에 의해 산출되고, 상기 장치의 작동법은 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있으며, 상기 서스펜션은 37 내지 43.106 적혈구/ml 서스펜션이 되도록 조정한다.
서스펜션의 50 내지 100 ㎕의 부피를 96-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 위치시킨 다음, 30 g/l의 용액으로부터 0.234 g/l의 IgG 용액이 얻어질 때 두 배씩 희석시킨, 다른 IgG 용액들 50 내지 100 ㎕를 첨가한다.
상기 전부를, 30 내지 40℃의 일정한 온도, 바람직하게는 37℃에서, 1시간 30분 내지 2시간 30분 사이, 상세하게는 2시간 동안, 배양한다.
상기 적혈구들을, 상기의 BSA를 함유하는 PBS 버퍼로 세척하고, 원심분리하며, 그런 다음, 각 웰에, 피코에리트린과 같은 플루오로크롬으로 표지된, 50 내지 100 ㎕의 F(ab’2) 염소 항-인간 IgG 항체를 첨가한다.
상기 전체(c) 공정)를 빛에서 멀리하여 약 20 내지 30 분 동안 배양한다.
얻어진 서스펜션을 세척하고, 분석되는 화합물에 대한 형광 측정 장치를 포함하는, 시장에서 상업적으로 입수 가능한 어떠한 적절한 장치를 이용하여, 유세포 분석(flow cytometry)을 수행한다.
예를 들어, B1, B2 및 B3로 칭한, 세 개의 IgG 농축물들의 항-A 및 항-B 항체의 함량을 하기 표 1에 나타내었다. 상기 B1, B2 및 B3 각각은, 항-A 및 항-B 항체들의 소모를 위해서, Cohn의 방법(위에서 언급된) 이후에 에탄올 분별에 의해(B1), 특허 출원 제WO02/092632호에 따라(B2), 그리고 특허 출원 제WO092632호 이후에 면역친화성 크로마토그래피(B3)에 의해 제조된다. 하기 결과는, 샘플 B1에서 항-A 및 항-B 항체들의 대조군 적정 농도에 대해 상대적인 것이며, B1에서의 이러한 항체들의 함량을 참조로서 1로 임의적으로 정하였다.
샘플 항-A 항체 적정 농도 항-B 항체 적정 농도
B1 1 1
B2 3.65 3.85
B3 0.68 0.52
상기 표의 결과는, 먼저 Cohn의 방법에 따라 제조된 IgG 농축물(B1)의 항-A 및 항-B 항체의 함량이, 특허 출원 제WO02/092632호에 설명된 방법에 따라 제조된 IgG 농축물(B2)의 경우보다, 네 배 정도 적게 포함된다는 것을 나타낸다. 추가적으로, 특이적 면역친화성 컬럼 상에서의 이러한 IgG 농축물에 대한 수반되는 처리는, 항-A 항체의 적정 농도를 5에 가까운 수치까지, 항-B 항체의 경우에는 7에 가까운 수치까지 감소시킨다.
항-A 및 항-B 항체의 함량을 측정하기 위해, 유리하게 적용될 수 있는, 또 다른 방법은, 당해 기술분야의 당업자에게 알려진, 보체와의 인 비트로(in vitro) 용해로 구성되나, 이는 본 발명의 필요에 따라 특이적으로 설계된다.
상기 분석 방법은,
a) 적절한 방사성 마커를 이용하여, 미리 산출된 혈액형 A, B, AB 및 O 중에서 선택된 파파인-처리된 적혈구의 서스펜션을 방사성 동위원소 표지하는 공정,
b) 상기 방사성 동위원소 표지된 적혈구를 미리 측정된 부피의 IgG 농축물 샘플과 접촉시키는 공정,
c) 혈액형 AB로부터의 일반 혈청을, 상기 b) 공정의 부피와, 동일한 부피로 첨가하는 공정,
d) 상기 c) 공정에서 얻어진 혼합물을 소정의 시간 동안 배양하는 공정, 및
e) 얻어진 상기 배양된 용액의 방사능을 측정하는 공정들을 포함한다.
혈액형 A, B, AB 또는 O의 파파인-처리된 적혈구의 1 %(v/v) 서스펜션을 제조하고, 이는, 그런 다음, 106 적혈구를 얻기 위해 Malassez 셀에서 산출된다. 100 μCi의 51Cr(적혈구 1 부피당 1 부피)를 첨가한다. 상기 전체를 1 내지 2 시간 동안 배양하고, 그런 다음, 상기 방사성 동위 원소 표지된 적혈구를 4 내지 6 번 세척한다.
그런 다음, 상기 방사성 동위 원소 표지된 적혈구를, 예를 들어 100 ㎕의 부피에 대해, 4-6.106 방사성 동위 원소 표지된 적혈구 당, 바람직하게는 1 내지 3 mg/ml의 농도, 상세하게는 1.2mg/ml의 농도에서, IgG 농축물의 샘플들과 접촉시킨다.
상기의 부피와 동일한 부피, 예를 들어, 혈액형 AB로부터의 일반 혈청 100 ㎕를, 다른 보충 인자들을 제공하기 위해, 상기의 혼합물에 첨가한다.
얻어진 반응 혼합물을, 30 내지 40℃의 일정한 온도, 바람직하게는 37℃에서, 바람직하게는 3 내지 5 시간, 상세하게는 4 시간 동안 배양한다.
상기 반응 혼합물은 바람직하게는 원심분리 되고, 상기 배양된 용액의 방사성은 적절한, 상업적으로 입수 가능한 장치를 이용하여 측정된다. 상기 용액의 측정된 방사성은 처리된 적혈구의 용혈반응의 크기, 그리고 그로인한 항-A 및 항-B 항체의 함량에 비례한다.
예를 들어, 혈액형 A, B 및 AB의 적혈구에 대해 얻어진 용혈반응의 크기를, 본 발명의 IgG 농축물(B3) 그리고 시장에서 상업적으로 입수 가능한 농축물들 중에서 가장 낮은 용혈을 갖는 선행 기술에 다른 IgG 농축물(C1)을 고려하여, 하기 표 2에 나타내었다.
% 적혈구의 용혈(haemolysis) B3 C1 (prior art)
Group A 6 13
Group B 5 11
Group AB 6 13
아래의 실시예들을 통해 본 발명을 예시적으로 상술하지만, 본 발명의 범주가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
40 g/l의 IgG 농축물(B2) 샘플을, 특허 출원 제WO02/092632호에 설명된 방법을 따라 얻었다.
길이 50 cm이고 직경이 44 mm인 크로마토그래피 컬럼을, 혈액형 A 및 혈액형 B의 에피토프에 대응되는 트리사카라이드로 그라프트된 GLYCOSORB ABO? 미디엄의 50/50 (v/v) 혼합물로 충진하고, 1200 ml의 물로 미리 세척하는 단계를 거쳤다.
상기 B2 IgG 농축물을, 펌프를 이용하여 미디엄 0.2 l/ml의 비율로 주입하였다. 한 번 이러한 부피가 컬럼을 통해 용출되면, 상기 컬럼은 최소 부피의 주사용제용(IP) 물로 세척하여, 상기 컬럼의 데드 볼륨에 존재하는 IgG를 수집한다.
B3 IgG 농축물은 항-A 및 항-B 그리고 다중반응성 IgG가 고갈된 약 40 g/l에서 수집되며, 그런 다음, 한외여과를 수행하여 상기 농축물을 60 g/l가 되도록 하고, 세 개의 필터들이 일렬로 배열되고 100, 50 및 20nm로 감소되는 보유 임계치를 갖는 나노필터 공정을 통해 바이러스를 제거하였다.
글리신(7 g/l), 만니톨(30g/l) 및 20 ppm Tween 80?의 혼합물로 구성되는 안정화 희석제들을 60 g/l로 상기 IgG 농축물에 용해시키고, 상기 IgG 농축물을 IP 물을 이용하여 50 g/l로 조절한 후, 상기 농축물에 대해 멸균 여과를 수행하고 병들에 나누었다.
실시예 2: IgIV 에 있어서 항-A/B의 정량화
1) 분석의 원리
1-1) 인간 적혈구의 준비
혈액형 A Rh+, B Rh+ 또는 O Rh+의 인간 적혈구의 서스펜션은, pH=7.4, PBS 버퍼+1%BSA에서, 40 x 106 적혈구/ml의 농도로 표준화하였다.
1-2) 모노클로날 항-D 배열의 제조
모노클로날 항-D(R297이라 함)의 제조는, pH 7.4의 PBS 버퍼에 대응하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 분석하였다. 단백질의 몰 흡광 계수(ε)는 다른 아미노산의 조성에 대해 상대적으로 계산되고, 모노클로날 항-D에서의 농도(C)는 하기 식을 적용하여 얻었다:
C = OD/El, 여기서 l은 OD 측정이 수행되는 용기의 너비
0 내지 200 ng/ml 범위의 모노클로날 항-D 항체는 12 포인트에서 생산되었다(200; 150; 100; 75; 50; 25; 12.5; 6.25; 3.13; 1.56; 0.78 및 0 ng/ml).
1-3) 면역글로블린 용액의 제조
시장에서 상업적으로 입수 가능한, 여러 가지의 정맥 주사용 면역글로블린들을 테스트하였다. 이러한 글로블린들의 주요 특징들은 아래 표에 자세히 나타내었다:
Figure 112008053898207-pct00003
* 특허 출원 제WO02/092632호에 설명된 방법 이후에, 실시예 1에서 설명된 면역친화성 공정에 의해 얻어짐
** 특허 출원 제WO02/092632호에 설명된 방법 이후에, 실시예 1에서 설명된 면역친화성 공정 없이 얻어짐
여러 가지의 면역글로블린 조제물은, pH=7.4의 PBS+1%BSA 버퍼를 이용하여, 1 mg/ml의 농도로 조절하였다.
1-4) 적혈구의 민감화
둥근-바닥의 마이크로플레이트에서, 다음을 웰에 넣었다:
- 40 x 106 적혈구/ml의, A Rh+, B Rh+ 또는 O Rh+ 적혈구의 서스펜션 50 ㎕,
- 분석을 위한, 50 ㎕의 항-D 배열 또는 50 ㎕의 (IgIV) 샘플.
분석을 위한 샘플들은 삼중 배치에 넣어 두었다.
상기 플레이트는, 그런 다음, 교반하면서, 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다.
1-5) 세척
상기 플레이트를 770 g에서 1 분 동안 원심분리하였다. 상등액은, 뒤집어서 버리고, 그런 다음, 200 ㎕의 PBS+1% BSA를 각각의 웰에 첨가하였다. 이러한 과정을 3 회 반복하였다.
1-6) 접합 및 세척의 추가
피코에리트린(PE)로 표지된 염소 항-인간 IgG F(ab’2) (Fc 특이적)(Beckmann Coulter, Ref: PN IM0550)를, pH 7.4, PBS + 1% BSA 버퍼에서, 1/20th 로 희석한 후, 상기 용액의 50 ㎕를 각 웰에 넣었다. 상기 플레이트는, 그런 다음, 상온의 어두운 곳에서, 20 내지 30 분 동안 배양하였다. 상기 1-5)에서 설명된 바와 같이, 세 번 연속하여 세척하였다.
1-7) 유세포 분석의 읽기
상기 적혈구의 서스펜션을, 적절한 프로그램을 사용하여, 유세포 분석기(Beckmann Coulter FC500)로 읽었다. 읽기는 50000번 수행되었고, 상기 장치는 자동적으로 각각의 도트 또는 샘플의 평균 형광 강도(MFI)를 계산하게 된다.
1-8) 결과의 해석
상기 MFI는 모노클로날 항-D 항체의 농도에 관련되어 얻어지고, 선형 회귀 방정식은 엑셀 소프트웨어를 이용하여 얻어진다. 그런 다음, 각 샘플에 대하여, 항-D 항체 당량의 농도는 선형 회귀 방정식을 이용하여 얻어진다. 상기 샘플들을 삼중으로 분석하였기 때문에, 엑셀 소프트웨어를 이용하여, 평균 농도가 결정되고, 변이계수(CV)는 계산된다.
2) 결과
2-1) 항-A 항체의 농도
명칭 Rh+ O
적혈구		 Rh+ A 적혈구
(항-A Ig ng/mg Ig)		 CV %
다가의 면역글로블린 A ns 55.4 4.5
다가의 면역글로블린 B ns 44.4 3.4
10% 정맥용
인간 면역글로블린, C		 ns 117.9 14.6
IgNG 2 ns 22.2 5.5
IgNG 1 ns 119.8 4.9
TEGELINE ns 35.6 5.0
ns = 나타나지 않음
2-2) 항-B 항체의 농도
명칭 Rh+ O
적혈구		 Rh+ B 적혈구
(항-B Ig ng/mg Ig)		 CV %
다가의 면역글로블린 A ns 64.0 0.9
다가의 면역글로블린 B ns 42.4 5.1
10% 정맥용
인간 면역글로블린, C		 ns 89.0 20.5
IgNG 2 ns 16 9.9
IgNG 1 ns 155.2 4.8
TEGELINE ns 44.2 8.0
ns = 나타나지 않음
3) 결론
상기 친화성 공정은 실제로 항-A 및 항-B 항체들의 제거에 공헌한다. 상업적으로 입수 가능한, 테스트된 여러 가지의 면역글로블린들 중에서, 제품 IgNG2가 가장 적은 수의 항-A 및 항-B 항체를 함유하는 제품이다.
실시예 3
혈액형 A의 적혈구의 서스펜션 1 %(v/v)를, 1 중량% 소 혈청 알부민(BSA)를 함유하는, pH 7.4, PBS 버퍼에서 제조하였다. 적혈구의 서스펜션 50 ㎕를 취하여, 상기 흐름을 측정하는 내부 표지 용액 50 ㎕와 함께, 유세포 분석 튜브(Beckmann-Coulter Epics XL)에 첨가하였다. 상기 서스펜션를 40.106 적혈구/ml로 조절하였다.
IgG 용액의 여덟 개의 배치들을, 실시예 1에서 얻어진 상기 IgG 농축물(v/v)의 인자 2에 의해, 연속적인 희석에 의해 제조되었으며, 가장 농축된 배치는 30 g/l이고, 가장 희석된 배치는 0.234 g/l이다. 상기 서스펜션의 50 ㎕의 부피를, 96-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 위치시킨 후, 여러 가지 희석된 IgG 용액들의 50 ㎕를 첨가하였다.
상기 전체를, 교반하면서, 37℃의 온도에서, 2 시간 동안 배양하였다.
그런 다음, 각 웰을 상기의 BSA를 함유하는 PBS 버퍼 200 ㎕로 세척하고, 상기 마이크로플레이트를 2000 rpm에서 1 분 동안 원심분리 하였다. 상등액을 제거한 후에, PBS-BSA로 1/20로 희석한, 염소 항-인간 IgG F(ab’2) 항체의 용액 50 ㎕를 첨가하고, 피코에리트린 플루오로크롬(Beckmann Coulter)으로 표지하였다.
상기 전체를 어두운 곳에서 30 분 동안 배양하였다.
획득된 상기 서스펜션을, 앞서 살펴본 바와 같이, 세척하였다.
각 웰의 잔기는 100 ㎕의 PBS-BSA에 용해시켰다. 상기 마이크로플레이트의 각 웰에 함유된 부피를, 500 ㎕의 등기류 시스액(Isoflow sheath fluid)이 첨가된(Coulter) 튜브에 옮긴 다음, 데이터 획득 및 결과 분석을 위한 소프트웨어를 포함하는 Coulter-Beckmann Epics XL 장치 상에서 유세포 분석을 수행하였다. 형광광도법(fluorometry)를 각 샘플에 대하여 측정하였다.
상기 동일한 과정을 혈액형 B의 적혈구에 대하여 수행하였다.
이러한 작동 모드는, IgG(B3)의 세 개의 다른 배치들에 대해서 적용하였고, 또한 Cohn의 방법(위에서 언급됨)에 따른 에탄올 분별에 의해 제조된 IgG(B1)의 세 개의 다른 배치들에 대해서도 적용하였다.
얻어진 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
샘플 항-A 항체의 적정농도 항-B 항체의 적정농도
B1 1 1
B2 (3 배치들) 3.80; 3.55; 3.59 3.80; 4.45; 3.31
B3 (3 배치들) 0.66; 0.68; 0.69 0.33; 0.73; 0.50
실시예 4
혈액형 A, B, AB 또는 O의 파파인-처리된 적혈구의 1 %(v/v) 서스펜션을 제조하고, 그런 다음, 106 적혈구를 얻기 위해 Malassez 셀에서 산출하였다. 100 μCi의 51Cr(적혈구 1 부피당 1 부피)를 첨가하였다. 상기 전체를 1 시간 동안 배양한 후, 상기 방사성 동위 원소 표지된 적혈구를 5 번 세척하였다.
그런 다음, 상기 방사성 동위 원소 표지된 적혈구를, 실시예 1에서 얻어진 IgG 농축물(B2) 샘플과, 100 ㎕의 부피에 대해, 5.106 방사성 동위 원소 표지된 적혈구 당 1.2 mg/ml의 농도에서, 접촉시켰다.
상기와 동일한 100 ㎕ 부피의 혈액형 AB로부터의 일반 혈청을, 다른 보체 인자들을 제공하기 위해, 상기의 혼합물에 첨가하였다.
그런 다음, 얻어진 상기 반응 혼합물을, 37℃에서, 4 시간 동안 배양하였다.
상기 반응 혼합물을 2000 rpm에서 1 분 동안 원심분리 하고, 상기 배양된 상등액의 방사성을, 상업적으로 입수 가능한 적절한 장치를 이용하여, 측정하였다. 상기 용액의 측정된 방사성은 처리된 적혈구의 용혈반응의 크기, 그리고 결과적으로 항-A 및 항-B 항체의 함량에 비례한다.
동일한 과정을 모두 Rh+인 혈액형 B, AB 및 O의 적혈구에 대하여, 그리고 IgG(B2)의 세 개의 다른 배치들에 대해 수행하였다.
추가적으로, 상기 공정은, C2 내지 C4로 표기한 IgG 농축물의 상업적 샘플들의 세 개의 배치들에 대해, 그리고 음성 대조군으로 포함된 C5로 표기된 그룹 O+로부터의 혈청 샘플에 대해 적용하였다.
상기 용액의 측정된 방사성은 처리된 적혈구의 용혈반응의 크기, 그리고 결과적으로 적혈구에 결합된 항-A 및 항-B 항체의 양에 비례한다.
상기 용혈 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
% 적혈구의 용혈 B3 C2 C3 C4 C5
그룹 A+ 6
6.2
6.5		 16
15.5
16.3		 13
13.5
13.2		 30
31
31		 34
34.4
34.6
그룹 B+ 5
4.8
5.4		 13.1
13.3
13.4		 11.2
10.8
10.9		 25
25.3
25.4		 34
34.4
34.6
그룹 AB+ 6
5.9
6.5		 16
15.7
16.3		 15.1
15.1
15.4		 31
31.4
30.9		 34
34.4
34.6
그룹 O+ 0.1
0.15
0.12		 0.2
0.25
0.21		 0.22
0.24
0.24		 0.33
0.32
0.30		 2
2.2
2.7
상기 얻어진 결과는, 여러 가지 혈액형들로부터 기원된 적혈구의 용혈 퍼센트가 가장 낮기 때문에, 본 발명에 따른 친화성 크로마토그래피에 적용된, IgG 농축물 B3가, 가장 적은 양의 항-A 및 항-B 항체들을 포함한다는 것을 보여준다.
음성 대조군으로 포함된 표현형 O+의 적혈구에서는, 용혈이 관찰되지 않았다.
실시예 5
IgG 농축물 B2의 다중반응성(면역친화성 크로마토그래피 이전) 및 실시예 1에서 설명된 크로마토그래피 이후(IgG 농축물 B3)의 다중반응성의 측정.
이러한 IgG 농축물의 다중반응성의 측정은, 다중반응성의 IgG와 반응하는 두 개의 항원을 사용하는, 유럽 특허 제1059088호에 의해서 수행된다. 이들은, 디니트로페닐 그룹(DNP 알부민)에 의해 변형된, 미오신과 알부민이다.
표 5는 실시예 3의 샘플들 B2, B3 및 C4에 있어서 다중반응성 IgG의 강화인자를 제공하며, 그의 IgG 함량을 참조로서 1로 임의적으로 정하였다.
이러한 측정들은, 상기 IgG의 세 개의 다른 배치들 상에서 수행되었다.
샘플 미오신 DNP 알부민
B1 1 1
B2 (3 배치들) 1.2; 0.8; 1.2 3.2; 1.0; 2.0
B3 (3 배치들) 0.4; 0.4; 0.4 1.0; 1.0; 1.0
C4 (3 배치들) 2.0; 2.0; 2.0 8.0; 6.0; 7.0
상기 결과는, 본 발명의 B3 IgG 농축물은 선행 기술의 농축물 C4 보다 5 내지 8 배 적은 다중반응성 IgG를 함유한다는 것을 나타낸다.
실시예 6
항-A 및 항-B 항체들과 다중반응성 IgG가 고갈된 상기 B3 IgG 농축물의 효능을, 상기 B1 IgG 농축물과 비교하는 실시예.
상기 테스트는, 본 발명의 IgG 농축물의 면역조절 활성을 향상시키기 위한 관점에서, FcγRI 및 FcγRIII 수용기가 결핍 처리된 마우스를 포함한다. 이러한 동물들은 혈소판감소성 자반증에 대한 모델로 사용되었다.
대조군으로 사용된 IgG 농축물(B1)은, Cohn에 따라 에탄올 분별에 의해 얻어진다.
상기 실험 프로토콜은 Teeling J.L. 등(Blood, 15/08/2001, vol. 98, 넘버 4, pp. 1095-1099)에 의해 설명된 프로토콜이다.
9.108/ml 내지 2.108/ml의 항-혈소판 모노클로날 IgG의 주입에 의해 파괴된 혈소판은, 1 g/kg의 치료 용량에서, IgG 농축물 B1 및 B3로 처리된 동물들에 있어서, 7.108/ml까지 상승되었다.
본 발명에 따른 상기 B3 IgG 농축물의 면역조절 활성은, 면역친화성 크로마토그래피에 의해 변형되지 않았다.

Claims (17)

  1. 치료용 면역글로블린 G(IgG) 농축물로서,
    상기 IgG의 농축물은 혈장으로부터 얻어지거나 또는 IgG가 풍부한 혈장 분획으로부터 얻어지고,
    초기 농도를 30 g/l로 감소시킨 IgG 용액과 함께 수행된 1:64의 희석 용액에서의 인 비트로(in vitro) 간접 쿰스(Coombs) 테스트에서 네거티브 결과를 나타내는, 항-A 및 항-B 항체를 포함하는 치료용 면역글로블린 G의 농축물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 항-A 항체의 함량은 23 ng/ml 이하이고, 항-B 항체의 함량은 20 ng/ml 이하인 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로블린 G의 농축물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    전체 IgG 함량을 기준으로, 다중반응성 IgG의 잔류 함량이 0.01% 내지 0.1% 사이인 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로블린 G의 농축물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역글로블린 G의 농축물은, 상기 농축물의 저장이 가능하도록 하는 안정제를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로블린 G의 농축물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 안정제는 당 알코올, 글리신 및 비-이온성 계면활성제의 혼합물인 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로블린 G의 농축물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역글로블린 G의 농축물은 정맥 내 경로를 통해 주사되는 것을 특징으로 하는 치료용 면역글로블린 G의 농축물.
  7. 제 1 항에 따른 IgG 농축물을 제조하는 방법에 있어서,
    a) 바이러스 불활성화 공정과 관련된, 에탄올 분별, 크로마토그래피 분리, 또는 에탄올 분별 및 크로마토그래피 분리에 의해 IgG 농축물을 제조하는 공정,
    b) 매트릭스가 혈액형 A 및 B와 항원 유사성을 갖는 올리고사카라이드기와 그라프트된, 미디엄의 혼합물 상에서 상기 IgG 농축물을 용출시키는, 면역친화성 크로마토그래피 공정, 및
    c) 바이러스, 20 nm 보다 큰 크기의 입자, 또는 바이러스 및 20 nm 보다 큰 크기의 입자들을 제거하기 위한 여과 공정들을 포함하는 것을 특징으로 하는 IgG 농축물의 제조 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 a) 공정은, 혈장으로부터 또는 혈장의 IgG가 풍부한 분획로부터 액체 오염물질을 침전, 알칼리 pH 에서 수행된 음이온 교환 수지상에서의 단일 크로마토그래피, 그리고 pH 4 내지 7 사이의 버퍼를 이용한 하나의 공정에서 IgG의 선택적인 용리(elution)의 사전-정제공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 IgG 농축물의 제조 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 올리고사카라이드기는 혈액형 A 및 B의 에피토프에 대응되는 트리사카라이드인 것을 특징으로 하는 IgG 농축물의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 혈액형 A의 에피토프에 대응되는 트리사카라이드는 N-아세틸-갈락토사민(GalNac)-갈락토오스(Gal)-푸코오스(Fuc) 구조를 갖고, 혈액형 B의 에피토프에 대응되는 트리사카라이드는 갈락토오스-갈락토오스-푸코오스 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 IgG 농축물의 제조 방법.
  11. 제 7 항에 있어서,
    상기 바이러스 불활성화 공정은 용매-계면활성제로 수행되는 것을 특징으로 하는 IgG 농축물의 제조 방법.
  12. 제 7 항에 있어서,
    상기 혈액형 A 및 혈액형 B와 항원 유사성을 갖는 기와 그라프트된 미디엄 서포트의 혼합물은, 각 미디엄 서포트에 대해, 25/75 내지 75/25 (v/v)로 포함된 각각의 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 IgG 농축물의 제조 방법.
  13. 제 7 항에 있어서,
    상기 방법은, 한외여과(ultrafiltration), 및 멸균 여과(sterilizing filtration)에 의한 농축공정들을 포함하는 것을 특징으로 하는 IgG 농축물의 제조 방법.
  14. 제 7 항에 있어서,
    바이러스를 제거하기 위한 여과는 나노여과(nanofiltration)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 IgG 농축물의 제조 방법.
  15. 제 7 항에 있어서,
    상기 방법은, c) 공정 이후에, IgG 농축물의 저장을 위한 안정제를 첨가하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 IgG 농축물의 제조 방법.
  16. 제 1 항에 따른 면역글로블린 G의 농축물에서 항-A 및 항-B 항체를 분석하는 방법에 있어서,
    a) 혈액형 A 또는 B의 적혈구의 서스펜션을 제조 및 조정하는 공정,
    b) 적혈구를 IgG 용액의 희석된 샘플과 접촉시키고, 얻어진 혼합물을 소정의 시간 동안 배양하는 공정,
    c) 플루오로크롬으로 표지된 항-IgG 항체의 존재하에서, 적혈구를 배양하는 공정, 및
    d) 상기 c) 공정에서 얻어진 적혈구의 서스펜션에 대해 유세포 분석(flow cytometry)을 수행하는 공정들을 포함하는 것을 특징으로 면역글로블린 G의 농축물에서 항-A 및 항-B 항체의 분석 방법.
  17. 제 1 항에 따른 면역글로블린 G의 농축물에서 항-A 및 항-B 항체를 분석하는 방법에 있어서,
    a) 방사성 마커를 이용하여, 미리 산출된, 혈액형 A, B, AB 및 O 중에서 선택된 파파인-처리된 적혈구의 서스펜션을 방사성 동위원소 표지하는 공정,
    b) 상기 방사성 동위원소 표지된 적혈구를 소정의 IgG 농축물 샘플과 접촉시키는 공정,
    c) 혈액형 AB로부터의 일반 혈청을, 상기 b) 공정의 부피와, 동일한 부피로 첨가하는 공정,
    d) 상기 c) 공정에서 얻어진 혼합물을 소정의 시간 동안 배양하는 공정, 및
    e) 배양된 용액의 방사능을 측정하는 공정들을 포함하는 것을 특징으로 면역글로블린 G의 농축물에서 항-A 및 항-B 항체의 분석 방법.
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