JPS622162A - 抗ｂモノクロ−ナル抗体およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗Ｂモノクローナル抗体の製造法に関する。さ
らに詳しく言えば、本発明は、動物をヒトＢ型赤血球で
免疫し、該動物から採取した脾細胞とミエローマ細胞と
の融合細胞を生成セシメることによシ抗Ｂモノクローナ
ル抗体を産生ずる細胞株を得、該細胞株を培養すること
により、抗Ｂモノクローナル抗体を産生させることを特
徴とする抗Ｂモノクローナル抗体の製造法を提供するも
のである。

ヒトの血液型の判定は、現代医療において輸血や臓器移
植等を始めとする多くの施術知おける重要課題となって
いるばかりでなく、犯罪捜査における個人識別や親子鑑
定における遺伝形質分析等、その利用域は広範にわたっ
ている。

現在、多くの種類の血液型様式が発見されて　　　□い
るが、なかでもＡＢＯ式血液型はその基本ともされてい
るものであり、抗原性の強さからも、医学的に最も重要
視されてきたものである。

ＡＢＯ式血液型をきめるには、通常抗Ａ判定用血清およ
び抗Ｂ判定用血清が用いられ、被検血球における凝集反
応（抗原抗体反応）の有無をもって判定されている。

我が国において、現在一般に使用されている判定用血清
は、厚生省が規定した判定用血清製造基準にもとづいて
製造し、市販されているが、この判定用血清製造基準に
よると、抗Ｂ判定用血清は凝集素価が、Ａｌ型血球に対
して２５６倍、Ａ２型血球およびＡＩＢ型血球に対して
１２８倍、Ａ２型血球に対しては６４倍以上でなくては
ならず、凝集力はＡ□型血球に対して１５秒以内、Ａ２
型およびＡＩＢ型血球に対して加秒以内、Ａ２型血球に
対しては４５秒以内に凝集を開始しなくてはならず、ま
た、抗Ｂ判定血清は凝集素価２５６倍以上、凝集力は１
５秒以内で凝集を開始しなくてはならないことになって
いる。

判定血清の製造者は、かかる条件を満たす血清を有して
いる人間を選別した上で、採血して製造するわけである
が、このような高い力価の血清を有する人間は、限られ
て来るため、判定血清の製造には、著しい困難性が存在
している。

このだめに動物を免疫して高い力価の血清を得ようとす
る試みも行われているが、この場合には、抗Ａおよび抗
Ｂ以外に異種凝集素を始めとする多くの他の抗体が産生
されてくる。そこでこれらの抗Ａおよび抗Ｂ以外の抗体
を取り除くために吸収という操作が行われるが、すべて
の抗体を完全に取り除くことはなかなか難しく、これも
、判定用血清の製造上、解決すべき問題点として存在し
ていた。

最近、細胞工学の分野において、モノクローナル抗体を
分離する方法が開発され、この方法により得られたモノ
クローナル抗体は、単一の抗体産生クローンから産生さ
れたものであって、他の抗体成分を混じない単一均等な
ものであシ、抗体としては理想的な性状をもっているた
め、このモノクローナル抗体作製法を血液型判定用血清
の製造に利用すれば、比較的力価が高く、不純物の少い
精製された判定用血清が得られることＫなる。従来モノ
クローナルのＡＢＯ式血液型判定用血清は、抗Ａ血清の
みが製造市販されているが、抗Ｂ血清については未だ製
造市販されていない。

モノクローナル抗Ｂ血清が作られない理由は、免疫され
る動物（通常はマウス）および培地に入れられている仔
牛の血清中に一部Ｂ型抗原が存在するためであろうと推
測される。

本発明者は、次の諸点について配慮し、実、＠を行つた
結果、抗Ｂモノクローナル血清を作製することに成功し
た。

■）免疫方法 ■　免疫動物は通常のモノクローナル抗体作製法と同様
にマウスを用いた。この場合、唾液による凝集阻止試験
、血球による吸収試験によりＢ抗原を全く有しないか、
あるいは比較的に弱いマウスを選んだ。

■　免疫方法は、１０チヒトＢ型血球浮遊液を０．５−
ずつ、３日間間隔で４同腹腔内注射により免疫した。一
般的な免疫方法としては多くの方法がみられる。例えば
濃度では１０チ、２０チ、５Ｃ１免疫、回数では１回免
疫、２回免疫、６回免疫等があシ、部位も腹腔内注射、
皮下注射、静脈内注射等がある。

本発明者は最もオーツドックスな前記の方法を採用した
。その理由は、抗Ｂ抗体（とくに１ｇＭ抗体）がこの方
法で最もよく作られるからである。

■　牌摘出時期：最終免疫より４日目に肺臓を摘出し、
岬胞を採取した。一般的に免疫動物の牌ｉｌｌ摘出には
、最終免疫後１〜２週間とされているが、判定用血清の
使用目的からＩｇＭ抗体が必要であるので、できるだけ
早い時期（４日目）Ｋ目的の牌細胞を採取した。

２）細胞採取操作 免疫動物を屠殺後、牌を摘出し、牌細胞を分離、採取す
る。この操作においても次の点が考慮された。

■　免疫動物の中、抗Ｂ抗体産生が充分である動物（抗
体価の高いもの）を用いた。

■　牌細胞の分離をよくするため、ステンレス、メツシ
ュ（ステンレスの金網で＋あのもの）を用いた。一般的
なモノクローナル法では牌を細切するが、細胞破壊を防
ぐ意味でこの方法を採用した。

■　牌細胞の採取についても、細胞破壊の予防につき充
分に注意し、暴力的な操作を避けた。

３）細胞融合 次にマウスミエローマ細胞と脾細胞との融合を行うわけ
であるが、この操作においても次の点が考慮された。

■　マウスミエローマ細胞はＭＳ−１を用いた。

モノクローナル抗体用に用いられるマウスミエローマ細
胞（、では多くの種類があるが、比較的細胞融合がよい
ＭＳ　−１を選んだ。

■　この操作中でも、細胞破壊をできるだけ避ける意味
で、通常よく行われるピペッティング（ピペットによる
攪拌等）は全く行わず、操作に充分注意した。

■　細胞増殖用の培地についても、Ｂ型抗原ができるだ
け少いものを選別し、用いるようにした。

本発明は上述の如き配慮に基づいて成功した抗Ｂモノク
ローナル抗体作製の実験結果に基づいてなされたもので
あり、従って、本発明は、以下に詳述する如き新規な抗
Ｂモノクローナル抗体ならびにその製造法を提供するも
のである。

すなわち、本発明は、動物をヒトＢ型赤血球で免疫し、
該動物から、免疫後の脾細胞を採取し、該脾細胞とミエ
ローマ細胞との融合細胞を生成せしめることにより抗Ｂ
モノクローナル抗体を産生ずる細胞株を得、該細胞株を
培養することにより、抗Ｂモノクローナル抗体を産生さ
せることを特徴とする抗Ｂモノクローナル抗体の製造法
をその要旨とするものである。

以下に本発明を一具体例に従って詳細に説明する。

１、ヒトＢ型血球による動物の免疫 抗体産生細胞を採取するため、ヒトＢ型血球で予めマウ
スを免疫した。その方法は次の通りである。

１）　　Ｂ型のヒトよシ血液をへ・にリン加にて採血し
、採血後分離遠心（３０００ｒｐｍ、４℃、５　ｍｉｎ
　）　Ｌ、沈渣を生理食塩水で充分に洗浄する。

１）得られた血球を１０多浮遊液に調製し、マウス（系
統：　ＢＡＩ、Ｂ　／Ｃ）腹腔内に０．５！ｎｌ／匹注
射する。この操作は３日おきに計４回行なう。

２、マウスミエローマ細胞の培養 マウスミエローマ細胞としてＨＧＰＲＴ欠損株であるＰ
３　　ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（通常ＭＳ−１と略す）
細胞株を用いた。細胞は１０　％　ＦＢＳ−ＲＰＭ工１
６４０培地で培養しだが、復帰変異を防ぐだめ１５μｇ
／ｒｎｌの８−アザグアニンを培地中に加えた。細胞濃
度は最大２　ｗ　５　Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ　／ｒｎ
ｌとして、２日おきに培地を交換した。培地交換は培養
フラスコの底部をピペットでピペッティングすることに
より付着している細胞を遊離し、十分に懸濁して少量の
細胞浮遊液を残し捨てる方法をとった。

残存浮遊液に１０倍量の新しい培地を加え、５チＣＯ２
、３７℃で培養する。なお、使用する培地は予め３７℃
の水浴で保温しておく。

３、細胞融合 抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は次のように行
った。

Ｉ）脾細胞の調整：免疫したマウスより無菌的に肺臓を
摘出し、ＲＰＭ工１６４０培地１０ηｒｌを容れた啄ト
リディツシュ中で洗浄する。その後ステンレス網上で肺
臓をしごくようにして細胞をばらばらにし、細胞浮遊液
を得る。この浮遊液を遠心管に移し、静置して大きな残
渣を除いた後、遠心（２０００ｒｐｍ、５　ｍｉｎ　）
を行ない細胞を分離する。得だ細胞塊に培地（ＲｐＭｒ
　１６４０　）を加え懸濁して、再び遠心による分離を
行ない細胞塊を得る。

この操作は細胞の洗浄であり計３回行なう。

洗浄が完了したら、適当量のＲＰＭ工１６４０培地に懸
濁し、Ｂｕｒｋｅｒ　−Ｔηｒｋ型血球計算板を使用し
て細胞濃度を測定する。

＋Ｉ）　　ＭＳ−１の調製：ＭＳ−１の培養フラスコを
取り出し、フラスコ底面に付着した細胞をはがしピペッ
ティングして遠沈管に移す。

これを遠心（２０００ｒｐｍ、　　５　ｍｉｎ　）　Ｌ
、、上清を捨て、細胞を３−１）と同様の方法で計３回
洗浄した後、同じく細胞濃度を測定する。

１１１）融合 ａ）前項の１１）よりＭＳ　−１を細胞数２．５×１０
’　Ｃｅ１ｌｓに調整し、牌細胞は１　、ＯＸ１０８ｃ
ｅｌｌｓとして両者に混合する。この液を５０　ｍｌの
遠心管に容れ、１７００ｒｐｍ、５　ｍｉｎ、室温で遠
心し、上清を捨てて両者の混合した細胞塊を得る。

ｂ）ａ）の細胞混合塊を培養融合させるが、この際に上
清は完全に除去しておく０次にこの細胞塊に加温した５
０４　ＢＥｏ　１　ｍｌを加える。その際にはビはット
の先端で細胞塊をゆつ〈シとかき混ぜながら１分間位か
けてゆっくり加えていく。その後同じピ滅ットでさらに
１分間ゆっくりと攪拌する。次に別のピペットでＲＰＭ
工１６４０培地の１ｍｌをゆっくりかき混ぜながら、１
分間かけて加える。そして更にもうｌ　ｒａｔのＲＰＭ
ニー１６４０培地を同様の方法でやはり１分間かけてゆ
っくり加える。次に遠心管の壁をつたわらせながら、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地の７−を２〜３分聞かけてゆっく
り加えてい・く。この時は遠心管を振りながらゆっくり
混合する。

Ｃ）上記の混合液を１７０Ｏｒｐｍ、５　ｍｉｎ、室温
で遠心し、上清を完全に除き、これに１０％　ＦＢＳ　
−ＲＰＭＩ−１６４０培地を１２．５ｍＡ’加える。

遠心管の底に固まっている細胞をピ滅ットの先端でゆつ
くシはがし、蓋をして、遠心管を１８σ１回回転し細胞
を懸濁する。

ｄ）　　ｃ）の細胞懸濁液を０．１ｍｌずつ９６穴平底
のマイクロプレートに分注し、５　％　００２インキユ
ベーター中で培養する。

４、　　ＨＡＴ培地による融合細胞の選択融合した細胞
だけを選択するため、ＨＡＴ培地に培養する。

ＨＡＴ培地は１０％ＦＢＳ　−ＲＰＭ工１６４０培地疋
ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地
であシ、この培地中ではＭＳ　−１と牌細胞との融合細
胞および牌細胞または脾細胞同士の融合細胞だけが生存
できる。ただし、ＭＳ−１と融合しない牌細胞または脾
細胞同士の融合細胞は、細胞分裂能を持たないため、培
地中ではＭＳ−１と牌細胞の融合細胞のみが増殖するこ
とになる。

具体的な操作は次の如くである。

ａ）３−ｉｉｉ）で作製したプレートに、培養開始の翌
日よりＱ、ｌ　ｍｌ　／　ｗｅｌｌのＨＡＴ培地を加え
る。

ｂ）プレート作製後、２．３．５．８．１１．１４日目
に各Ｗｅ　ｌ’ｌの上清を約０．１ｍｌ吸収除去し、新
しいＨＡＴ培地をＱ、ｌ　ｒｎｌ　／　ｗｅｌｌずつ加
える。

Ｃ）その後、３日ごとに同様な方法でＨＡＴ培地による
培地交換を行なう。この操作は２週間はど行なう。その
後は通常の１０％ＦＢＩ９−　ＲＰＭＩ　１６４０　　
培地に変える。

５、スクリーニング 融合細胞が増殖し、細胞コロニーが形成されてきた場合
には早期にスクリーニングを行う。

その理由は、同じＷｅｌｌに数種類の融合細胞が存在す
ると、その増殖速度に差異があるため目的とする細胞が
他の増殖の速い細胞により発育を抑えられるためである
。スクリーニング法として、極めて感度が高く、少量の
抗体をも検出できる間接ＥＬＩＳＡ法（Ｅｕｚｙｍｅ　
Ｌｉｎｋｅｄ工ｍｍ、ｕｕｏｓｏｒ−ｂｅｎｔ　Ａｓ５
ａｙ　）と、少し感度は低いが、特異性と凝集能とを有
効に検出できる凝集試験法の２つの方法が用いられた。

１）間接ＥＬＩＳＡ法 ａ）赤血球膜分画の調製：Ａ型、Ｂ型皿液から遠心（３
０００ｒｐｍ　、　４℃、５　ｍｉｎ　）によ　　　　
□シ赤血球を分離し、等量の生理食塩水を加えて懸濁し
、これを５回洗浄する。遠心後の血球に約１５倍量の１
０　ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７，
４）を加え、１〜２分間攪拌し、４℃で１５分間静置す
る。この操作によシ赤血球は完全に溶血する。溶血液を
１０００Ｏｒｐｍ、４℃、２０ｍ１ｎ遠心し、膜分画で
ある化１殿を得る。これに１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−Ｈ
Ｃｌ　ｂｕｆｆｅｒ　　を加え懸濁する。この液をさら
に１００００　ｒｐｍ、４℃、２０ｍ１ｎで同条件で遠
心し、沈澱を得る。この操作は沈澱が白色となるまでく
りかえす。その後、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　
ｂｕｆｆｅｒの適当量を用いて懸濁し、吸光度によるタ
ンパクの定量を行ない、一定量ずつ分注し一４０℃に保
存して、その後の実験に供する。

ｂ）次にａ）で調製した膜分画をタン、ｅり量として’
Ｏａｌ　／；ｎｌとなるように０　、０５　Ｍ　ｃａｒ
ｂｏ−ｎａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　（ｐＨ９，５）で希釈
する。ＥＬＩＳＡ用の９６ｗｅｌｌマイクロプレートに
２００μｌ　／ｗｅ　１１ずつ分注し、４℃で一晩放置
する。

Ｃ）放置後ＰＢＳ　−ｔｗｅｅｎ　２０　（ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ　ｂｕ−ｆｆｅｒ　８ａｌｉｕｅにＴｗｅｅｎ
２０を０．０５　％となるように溶かしたもの）１ｇで
プレートを洗浄する。洗浄後、０．５チＢＳＡ　−ＰＢ
Ｓ　（ＢＳＡ　：ｂｏｖｉｎ”ｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌ−
ｂｍｉｎｅ　）を２５０　Ｉｌｌ　／　ｗｅｌｌ分注し
、３７°Ｃで３時間、室温で１時間放置する。

ｄ）プレートの液を捨て、Ｃ）と同様にプレートを洗浄
する。洗浄後のプレートの各Ｗｅｌｌに９６　ｗθ１１
マイクロプレート中で培養中の融合細胞の培養上清１０
０μｌを入れ、室温で一晩放置する。

ｅ）　　ＰＢＳ　−ｔｗｅｅｎ　２０１１でプレートを
洗浄し、その後、市販のアルカリフォスファターゼ標識
抗マウスエよウサギ抗体の液を各Ｗｅｌｌに２００μＥ
ずつ加える。このプレートを３７℃で１時間、室温で３
時間放置する。

ｆ）同様に洗浄後、基質溶液（ｄｉｅｔｈａｎａｌａ−
ｍｉｕｅ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｋ　ｐ−ｎ１ｔｒｏｐｈｅｎ
ｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅを１■／ゴとなるように溶か
す）２００μｌを各ｗｅ１１に分注し、室温で加分間放
置する。

ｇ）放置後、溶液が黄色となるｗｅｌｌを確認する。こ
れは培養上清中に膜分画に反応する抗体が存在すると、
この段階で反応陽性となり、黄色を呈するからである。

以上の実験を、Ａ型膜およびＢ型膜の双方に対して行な
う。この実験により、Ｂ型膜またはＡ型Ｂ型の両方の膜
に反応する培養上清が検出される。

１１）血球凝集試験 一般に用いられているホールグラス法により行なう。そ
の方法は以下の通りである。

ａ）　　Ａ型、Ｂ型、０型の各ヒト血液を採血し、赤血
球を生理食塩水で十分に洗浄し、５チ赤血球浮遊液を作
製する。

ｂ）　　ＫＬＩＳＡで陽性と判断したＷ１３１１より培
養上清１００μｌを分取し、ホールグラスの各穴にＩＱ
・スツールピペットで一滴ずつ入れておく。

Ｃ）５％赤血球浮遊液を・Ｑスツールピペットで一滴ず
つｂ）のホールグラスの各穴に入れ、ホールグラスを回
しながら血球と培養上清とを充分に混ぜ、放置する。

ｄ）３０分後、各穴の血球の凝集の有無を確認する。

６、　２４ｗｅｌ１組織培養用プレートによる培養前記
５項で確認された抗体産生細胞を洞穴組織培養プレート
に移し、ｌ　ｍｌの培養を行なう。

その方法は以下の通りである。これは、次に行なうクロ
ーニングと細胞の凍結保存が目的である。

１）マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、４週令）より胸腺を摘出し
、脾細胞の分離と同じ方法で胸腺細胞を採取し、細胞数
を数える。

１１）遠心後、胸腺細胞を１０係−ＦＢＳ　−ＰＲＭ工
１６４０培地に４　Ｘ　１０７ｃｓｌ１日／ｍｌ　とな
るように再浮遊し、２４Ｗｅ１１プレートの各Ｗｆ３１
１に０．５ｍｌずつ分注する。

ｌ１１）胸腺細胞を含む各ｗｅ１１に９６　Ｗｅｌｌ　
マイクロプレートの融合細胞を懸濁し加え、培養を続け
る。

１ｖ）３日後、各ＷｅｌｌにＱ、５ｍ１０１０　％　Ｆ
ＢＳ　−ＲＰＭ工１６４０培地を加える。

ｖ）更に２日後、各ｗｅｌｌからＱ、５ｍｌだけ培養上
清を除き、新しい培地Ｑ、５ｍｌを加える。

この操作を３日に１回行なう。

ｙｉ）　　２４Ｗ１３１１プレートでの培養開始後７〜
１０日で培養上清について血球凝集試験だよシ抗体産生
の有無を調べ、抗体産生が確認された細胞について一部
は凍結保存し、一部についてはクローニングを行なう。

７、限界希釈法によるクローニング 単個細胞すなわちモノクローンの細胞から派生しだ株（
細胞群）を得るためにクローニングを行なわなければな
らない。その方法は限界希釈法により行なう。

１）マウス（ＢＡＬＢ／ｃ　、　４週令）から胸腺を摘
出し、牌細胞の分離と同様に胸腺細胞を分離洗浄し、細
胞数を測定する。その後、１０慢ＦＢＳ　−ＲＰＭ工１
６４０培地に再び懸濁し、細胞濃度を２　Ｘ　１０７ｃ
ｅｌｌθ／ゴとする。

ｉｔ）　　２４Ｗ１３１１プレートで培養中の融合細胞
を何個のｗｅｌｌから培地ごとに分取し、細胞数を測定
する（、細胞数は前出の血球計算板で濃度を測り、計算
によシ求める）。

ｔｉｉ　）　　ｌ　）　テ調製した胸腺細胞浮遊液４．
６ｍ／に１１）の融合細胞２３０個を極少量の１０　％
　ＦＢＳ−ＲＰＭ１１６４０培地に浮遊させ加える。こ
の混合液をよく懸濁し゛、９６　ｗｅ　１１マイクロプ
レートの３６Ｗθ１１に１００μｌずつ分注する。この
操作により、各Ｗθ１１の細胞数は計算上５　ｃｅｌｌ
ｓ／ｗθ１１となる。

ｉｖ）　　１ｆｆ）の操作後、残った約１　ｍｌの細胞
浮遊液にＩ）で調製した胸腺細胞浮遊液４　ｍｌを加え
、よく懸濁する。この懸濁液を１１１）の９５ｗｅｌｌ
マイクロプレートの残っている３６Ｗ８１１に１００μ
ｅずつ分注する。このｗｅｌｌの細胞数は計算上１ｍＡ
’／ｗθ１１となる。

ｖ）　ｌｖ）の操作で残った細胞浮遊液に１．４ｍｌの
胸腺浮遊液を加えよく懸濁し、これを同じプレートの残
り２４ｗｅｌｌに１００μｌずつ分注する。この時の細
胞数は計算上Ｑ、５　ｃｅｌｌ／ｗｅ１：ｔとなる。

ｖｌ）　　このように作製したプレートを３７℃、５％
ＣＯ２存在下で培養し、５日後、１００μｅの１０チ１
１１’ＢＳ　−ＲＰＭＩ　１６４０培地を加え、７日後
に上清１００μｌを捨て、同培地を１００μｅ加える。

その後は３日ごとに培地を交換する。

約２週間後Ｋ　ＥＬＩＳＡおよび血球凝集試験により抗
体産生の有無を調べる。

ｖｉｉ）　ｖｉ）の操作で抗体を産生じているｗｅｌｌ
が判明したならば、そのｗｅｌｌＫついて６に記載しだ
１　ｍｌ培養法を再び行なう。これにより細胞がコロニ
ーを形成してくると、７と同様の方法で再びクローニン
グを行なう。この場合、再クローニングに供する細胞は
Ｖおよびｖｌの０．５　ｃｅｌ’ｌ　／　ｗｅｌｌまた
はｌ　ｃｅｌｌ／　ｗｅｌｌのｗｅｌｌから採取した方
が良い。その理由は５　ｃｅｌｌｓ　／　ｗｅｌｌよシ
もＩ　ｃｅ’ｌｌ、４ｅｌｌ、１　ｃｅｌｌ　／　ｗｅ
ｌｌよシも０．５　ｃｅｌｌ　／　ｗａｌｌのほうが、
できた細胞コロニーの形成が単個細胞からのものである
確率が高いからである。

ｖｉｌｌ）２回目のクローニングが終了したならば、再
び１ゴの培養を行ない、充分育ったならば更に大きな培
養器に順次変えて培養していく。

８、マウス腹腔内培養 ７−ｖｉｉｌ）で多量に培養した細胞は、更にマウス腹
腔内での培養を行い、抗体活性の高い腹水を採取する。

１ｎｖｉｔｒｏの培養系では培地中の抗体量はせいぜい
数μｍ７７ｍ１であるが、細胞をマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ
）の腹腔内で増殖すると腹水中の量は数ｒｒｑ　／　ｒ
ｎｌとなる。その方法は以下の通シである。

Ｉ）マウス（ＢＡＬＢ／ｃ　）の腹腔内に０．５ｍｌの
プリスタン（２，６％１０，１４−テトラメチル滅ンタ
デカ／）を注射しておく。これは細胞を投与する１０日
および３日前に実施する。

１ｉ）　　最後のプリスタン投与の３日後に２　Ｘ　１
０’ｃｅ１１８の細胞を０．５ｍｌのＲＰＭＸ　１６４
０培地に墾濁し、腹腔内に投与する。

１１））次第に腹水が留シ、腹部が膨満してきたならば
、１８デージの注射針を腹部にさし、滴下する腹水を集
め；遠心（３０００ｒｐｍ、４℃、１０　ｍｉｎ　）　
ｌ、、その上清を腹水標品とする。

本発明方法により得られた上記の抗Ｂモノクローナル抗
体の各種性質を下記の、■の標品を用い検討した。

■　雑種細胞培養上滑 ■　マウス腹水 なお、これら標品の性状等は以下の表に示す通りである
。

（１１抗体価（倍数希釈法） 方法 １）試験管立てに１０本の試験管を並べ、各々に０．１
　ｍＡ’の生理食塩水を入れる。この時、試験管陽は左
から順に１〜１０までとする。

１ｔ）ＩＪｎｌの試験管に抗体試料０．１１１１１を入
れ、よく混和し、メスピペットを用いて、その０．１ｒ
ｎｌをｔ２の試験管に入れる。

１ｉｉ）　　ｔｍ２の試験管でもＩＩ）と同じ操作を行
ない、０．１ｍＡ！を陽３の試験管に入れる。

ｌｖ）　　このように、Ｎｎｌ−１０の試験管で順次抗
体試料を倍数希釈し、２〜１０２４倍の希釈系列をつく
る。

ｙ）　　ノＱスツールピペットで各試験管からホールグ
ラスに１滴づつ試料を入れる。

ｖｉ）　　次に２％赤血球浮遊液を１滴ずつ■）のホー
ルグラスに滴下しよく混和した後室温で加分間放置して
凝集の有無を調べる。

ここで使用した血球はヒトＢ型、ヒトＡＢ型赤血球およ
びウサギ赤血球である。

結果 １）腹水 表に示す通り、腹水の５１２倍までの希釈液はヒトＢ型
、ＡＢ型赤血球を凝集させるが、１０２４＠希釈液では
凝集がみられない。ま〜た、ウサギ赤血球に対しては２
５６倍までの希釈液が凝集を示す。しだがって、得られ
た腹水の抗体価はヒトＢ型、ＡＢ型赤血球に対しては５
１２倍、ウサギ赤血球に対しては２５６倍である。

１１）培養上清 表に示すようにヒトＢ型、ＡＢ型赤血球に対しては１６
倍希釈液までが凝集を示し、ウサギ赤血球に対しても１
６倍希釈液までが、凝集を示す。

したがって、培養上清の抗体価は、ヒトＢ型、ＡＢ型赤
血球に対しては１６倍、ウサギ赤血球に対しても１６倍
である。

（２）　　ヒトＡＢＯ式血液型赤血球に対する特異性作
製したモノクローナル抗体がＢ型およびＡＢ型赤血球だ
けに反応するか否かを凝集試験により調べた。

方法 １）ヒトＡ、Ｂ、ＡＢ、０各型赤面球を生理食塩水で充
分に洗浄し、各々５俤浮遊液とする。

１１）抗体試料をホールグラスの各穴に・Ｑスツールピ
ペットで１滴づつ入れ、次Ｋｉ）で調製した５％赤血球
浮遊液を入れて、充分に混和した後、室温でＩ分間放置
し凝集の有無を調べる。（２）分経過後に凝集を認めな
いものについては、更に加分間放置し凝集の有無を調べ
る。

結果 １）培養上清 この表から、培養上清は市販ヒト由来抗Ｂ血清同様、Ｂ
およびＡＢ型赤血球だけを凝集し、Ａおよび０型赤血球
にはまったく凝集反応を示さない。したがって、この培
養上清はヒトＢ型抗原に特異的に反応し、ヒトＢ型赤血
球およびヒトＢ型赤血球だけを特異的に凝集させる抗体
であり、市販ヒト由来抗Ｂ血清と比べ、その特異性（で
は何ら遜色はないことが認められる。

Ｉｔ）　　復水 １）の培養上清での実験にくらべ、検体数は少ないが、
細胞をマウス腹腔内に投与し得た復水はヒトＢ型、ＡＢ
型赤血球だけを特異的に凝集し、Ａ型ふ；よびＯ型赤血
球にはまったく凝集を示していない。

（３）　　ヒト各種血液型赤血球に対する特異性ヒト赤
血球上にはＡＢＯ式血液型抗原以外にも様々な血液型抗
原が存在している。本発明方法により得られた抗体が他
の抗原には反応しないことを調べるために、すでに各種
血液型が判明している市販のパネルセル（オーソー社）
を用い、その凝集の有無を検査した。使用した・Ｑネル
セルの抗原組成は次の通りである。

ホールグラス法による凝集試験を行なった。

１）　　ホールグラスの各穴に、ｅスツールピペットで
抗体試料を一滴づつ入れる。

１１）これ乙・々ネルセししの浮遊液を一滴づつ加え、
よく混和して１時間放置し、凝集の有無を調べた。

試埃結果は、以下の通りであった。

前記の培養上清、腹水ともにこれらの赤血球全てに凝集
を認めなかった。しだがって、・ｅネルセル上のＭＮＳ
　、　Ｒｈ　、　Ｌｅｗｉｓ　、　Ｋｒ１ｌ、Ｄｕｆｆ
ｙ。

Ｋｉｄｄ、　Ｐ式血液型抗原には、本発明にょる抗Ｂモ
ノクローナル抗体はまったく反応しないと考えられる。

したがって、本発明によるモノクローナル抗体はＢ型抗
原知のみ特異的１ｃ反応するものと認められる。

（４）赤血球凝集開始時間 前記の培養上清、腹水が、ヒトＢ型赤血球をどの程度の
時間で７疑集させるかを調べ、市販ヒト由来抗Ｂ血清と
比較した。

方法 Ｉ）ホールグラスの穴に抗体試料を一滴入れる。

１０　　このホールグラスに５％ヒトＢ型赤血球浮遊液
を一滴滴下し、計測しはじめる。

ｉｉｔ　）　　よく混和しながら赤血球が凝集しはじめ
るところで計測を終了し、凝集開始時間とした。

結果 前記の各抗体試料によるヒトＢ型赤血球の凝集開始時間
は以下の通りである。

培養上清：　１３．４秒 腹水：４．０秒 市販ヒト由来抗Ｂ血清＝６．７秒 （各位は１０回測定した値の平均値である。）（５）抗
体試料のタン・Ｑり量 現在、タンパク定量法として確立し、一般的に用いられ
ているＬｏｗｒｙ法により測定を行なった。標準タンパ
ク溶液としてばＢＳＡ　（牛血清アルブミン）を用い、
その量を０、加、４０、跡、１００各μＩとして検量線
を描き、これを使って抗体試料中のタンパク量を求めた
。

前記のそれぞれの抗体試料中のタン・Ｑり濃度は以下の
通りであった。

培養上清＋　７．４５　ｍ９７ｍ１ 腹水　　：　１８．１η／ｒｎｌ （６）各種動物血球に対する特異性 現在市販されているヒト由来抗Ｂ血清は、ヒトＢ型、Ａ
Ｂ型血球以外にも様々な動物血球をも凝集する。したが
って、本発明により得られた抗体が動物血球に対してど
のような特異性を示すかを次の方法により検討した。

：）各種動物血球を生理食塩水でよく洗浄し、５ｑ６血
球浮遊液とした。

ｉ）　　抗体試料をホールグラスの各穴に一滴づつノ々
スツールピペットで滴下し、更に１）で調製した５％血
球浮遊液を一滴づつ滴下して十分に混和した後、室温に
放置した。

１ｉｉ）　　１時間放置後、血球凝集の有無を確認した
。なお、この実験は前述の培養上清（Ｃついてのみ行な
った。

検討結果は以下の通りである。

動物血球としてはウマ、ウシ、ブタ・　ヒツジ・ヤギ、
ウサギ、マウス、ラット、）１ムスター、チン／Ｒンヂ
ー、日本ザル、カニクイザル、アカゲザル、インガメ、
ダルマガエル、日本アカガエルの血球を使用し、市販ヒ
ト由来抗Ｂ血清についてもその特異性を調べた。

その結果、上の表に示したように、現在用いられている
ヒト由来抗Ｂ血清はウシ、ブタ、ウサギ、マウス、ラッ
ト、モルモット、ハムスター、日本ザル、カニクイザル
、アカゲザル、イ／ガメ、日本アカガエルの全ておよび
ヒツジ、ヤギ、チン・ｅンヂーの一部の血球に凝集反応
を起しているのに対して、本発明によるモノクローナル
抗体は、ウサギ血球だけを凝集させた。

このことから、本発明によるモノクローナル抗体は従来
のヒト由来抗Ｂ血清に較べ、極めて特異性の高い抗体で
あると結論される。

（７）免疫グロブリンクラス 免疫グロブリンには工ｇＧ　、　工ｇＡ、　　１６Ｍ等
の種類があるが、前述により作製した抗体がこれらのど
のクラスに属するかをオクタローニー法ニより調べた。

（註オクタローニー法：オクタローニーにより創案され
た寒天ゲル内沈降反応で、２次元の寒天ゲル平板内を抗
原および抗体が拡散して反応し、最適比のところで抗原
抗体反応をおこし、沈降線が形成されるのを観察する方
法）オクタローニー法による観察結果は以下のとおりで
ある。

本発明方法により得られた前記の培養上清のモノクロー
ナル抗体は抗マウスエｇＭウサギ抗体（この抗体はマウ
スの工ｇＭに対する抗体であり、モノクローナル抗体は
マウスの抗体産生細胞由来の抗体である）とだけ沈降線
を形成し、抗マウスエｇＧ抗体、抗マウスエｇＡ抗体と
はまったく反応していない。したがって、上記のモノク
ローナル抗体の免疫グロブリンクラスは工ｇＭであると
結論される。

なお前記の腹水についても同様の実験を行なったが、こ
の腹水はマウス生体内から工ｇＧ、ＩｇＡ・　工ｇＭ（
外から投与した培養細胞由来の免疫グロブリン）が混入
するため、抗マウスエｇＡ、１ｇＧ、ＩｇＭ抗体すべて
と沈降線を形成した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 動物をヒトＢ型赤血球で免疫し、該動物から免疫後の脾
   細胞を採取し、該脾細胞とミエローマ細胞との融合細胞
   を生成せしめることにより抗Ｂモノクローナル抗体を産
   生する細胞株を得、該細胞株を培養することにより、抗
   Ｂモノクローナル抗体を産生させることを特徴とする抗
   Ｂモノクローナル抗体の製造法