DE3787416T2

DE3787416T2 - Monoklonaler Antikörper gegen Laforakörper.

Info

Publication number: DE3787416T2
Application number: DE87306182T
Authority: DE
Inventors: Akiko C O Patent Depart Furuya; Nobuo C O Patent Departm Hanai; Hajime C O Patent Depa Yoshida
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1986-07-11
Filing date: 1987-07-13
Publication date: 1994-03-17
Anticipated expiration: 2007-07-14
Also published as: CA1294905C; EP0252768A2; JPS6319562A; US4962032A; EP0252768B1; EP0252768A3; DE3787416D1; JPH0570435B2

Description

Diese Erfindung betrifft monoclonale Antikörper gegen menschliche Lafora-Körper.
Die Lafora-Krankheit (Myoclonusepilepsie) und die Typ IV-Glycogenose sind Krankheiten, die durch die Anhäufung von abnormalen Glycogenen (Polyglucosan) im Herzmuskel, in Nervenzellen, in Leberzellen, in der Haut usw. , gekennzeichnet sind, wobei diese abnormalen Glycogene eine lange äußere Seitenkette aufweisen, die durch einen Defekt der alpha-1,4-Glucan-6- Glycosyltransferase verursacht wird, d. h. des Enzyms, das die verzweigte Kette in einem Glycogen-Molekül erzeugt.
Die Lafora-Krankheit scheint erblich zu sein und ist ein Syndrom, bei dem die klinischen Symptome, wie Krampfanfälle, myoclonische Demenz, Kleinhirnsyndrom, Charakterstörung, usw., vor oder nach der Pubertät beobachtet werden können, das sich allmählich verschlechtert und das oft nach zehn oder mehr Jahren wegen allgemeiner Entkräftung mit dem Tod endet.
Typ IV-Glycogenose (Andersen-Krankheit) ist ein Syndrom, bei dem eine Wachstumsstörung kurz nach der Geburt auftritt, verbunden mit Lebervergrößerung, Milzvergrößerung und Muskelhypotonie. Ascites ist eine weitere Komplikation, wobei die Krankheit meistens innerhalb von zwei Jahren mit dem Tod endet.
Es ist bekannt, daß die Lafora-Krankheft und die Typ IV-Glycogenose pathologisch durch Muskel- oder Leberbiopsie diagnostiziert werden können, aber diese Methoden enthalten komplizierte Verfahren wie Behandlung mit alpha-Amylase, Behandlung mit beta-Amylase, Anfärben mit PAS, usw., und müssen nicht immer eine eindeutige Diagnose ergeben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind monoclonale Antikörper mit der Fähigkeit zur Reaktion mit abnormalem Glycogen von Patienten mit Lafora- Krankheit (Lafora-Körper) und mit abnormalem Glycogen von Patienten mit Typ IV-Glycogenose, aber nicht mit normalem Glycogen, entwickelt worden, die deshalb für die Diagnose der Lafora-Krankheit oder der Typ IV-Glycogenose sehr nützlich sind.
Gemäß einem erfindungsgemäßen Gesichtspunkt wird ein monoclonaler Antikörper der IgG-Klasse mit der Fähigkeit zur Reaktion mit abnormalem Glycogen von Patienten mit Lafora-Krankheit (Lafora-Körper) oder mit abnormalem Glycogen von Patienten mit Typ IV-Glycogenose, aber nicht mit normalem Glycogen, bereitgestellt, wobei der monoclonale Antikörper von der Hybridoma-Zellinie KM-279, ECACC Nr. 86070304, erhältlich ist.
Unter einem zweiten Gesichtspunkt werden die Hybridoma-Zellinie KM-279, ECACC Nr. 86070304, und davon abgeleitete Zellinien, nämlich Zellinien, die zur Produktion eines monoclonalen Antikörpers der IgG-Klasse mit der Fähigkeit der Reaktion mit abnormalem Glycogen von Patienten mit Lafora-Krankheit (Lafora-Körper) oder mit abnormalem Glycogen von Patienten mit Typ IV- Glycogenose, aber nicht mit normalem Glycogen, fähig sind, bereitgestellt.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt werden ein pathologisches diagnostisches Verfahren für den Nachweis der Lafora-Krankheit und der Typ IV-Glycogenose durch die Anwendung monoclonaler Antikörper des beschriebenen Typs und ein immunohistochemisches Färbeverfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von abnormalem Glycogen bei Patienten mit Lafora-Krankheit oder von abnormalem Glycogen bei Patienten mit Typ IV- Glycogenose in Proben derartiger Patienten und unter Verwendung derartiger monoclonaler Antikörper bereitgestellt.
Derartige monoclonalen Antikörper können gemäß der vorliegenden Erfindung durch Immunisierung eines Säugetiers mit einem Lafora-Körper enthaltendem Gewebehomogenat von Patienten mit Lafora-Krankheit, vorzugsweise Herzmuskelhomogenate, oder mit daraus extrahierten Lafora- Körpern, durch Fusion von Milzzellen des immunisierten Säugetiers mit Säugetier-Myelomzellen, durch Selektion einer den benötigten monoclonalen Antikörper produzierenden Hybridomzellinie aus den sich daraus ergebenden Hybridomen, und durch die Züchtung des selektierten Hybridoms in einem geeigneten Kulturmedium erhalten werden. Sie können auch durch die intraperitoneale Verabreichung des selektierten Hybridoms an ein Säugetier, wodurch die Vermehrung der Hybridomzellen in der Ascitesflüssigkeit in dem Säugetier veranlaßt wird, gefolgt von einer Trennung des Antikörperprodukts vom Kulturmedium oder von Ascitesflüssigkeit, wie es zutrifft, erhalten werden.
Als Säugetier, das immunisiert wird oder aus dem die Myelomzellen erhalten werden, können Maus, Rind oder Pferd, vorzugsweise Mäuse, verwendet werden.
Ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper aus Mäusen wird im Detail nachstehend beschrieben.

(1) Herstellung der Antikörper produzierenden Milzzellen

Herzmuskelhomogenate von Patienten mit Lafora-Krankheit und abnormales Glycogen werden durch das in Referenzbeispiel 1 beschriebene Verfahren hergestellt. Mäuse werden dann mit den Herzmuskelhomogenaten immunisiert.
Die Immunisierung wird im allgemeinen durch Verabreichung der Herzmuskelhomogenate (10-100 ug pro Tier) zusammen mit einem geeigneten Adjuvans (z. B. Freundsches komplettes Adjuvans oder Aluminiumhydroxid-Gel plus B. pertussis-Impfstoff) subcutan, intravenös oder intraperitoneal an 8 oder 10 Wochen alte BAU3/c-Mäuse ausgeführt. Danach wird die gleiche Verabreichung des Antigens zwei- bis fünfmal in ein- bis zweiwöchigen Intervallen wiederholt. Vier bis sieben Tagen nach jeder Immunisierung wird eine Blutprobe aus dem Augenhintergrund-Venengeflecht entnommen und der Antikörpertiter im Serum bezüglich abnormalem Glycogen untersucht.
Die Bestimmung des Antikörpertiters wird durch einen enzymgebundenen Festphasen-Immunadsorptionstest (Enzymgebundener Immunadsorptionstest, publiziert von Igaku Shoin, Tokyo) wie folgt ausgeführt:
Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung (PBS; 1.83 g Natriumdiphosphat, 0.21 g Kaliummonophosphat und 7.65 g Natriumchlorid pro Uter destilliertem Wasser, pH 7.2) , enthaltend 10 bis 50 ug abnormales Glycogen oder normales Glycogen pro ml, wird in den Vertiefungen einer EIA- Plaue mit 96 Vertiefungen (Flow Laboratories) in einem Volumen von 50 ul pro Vertiefung verteilt. Nach Stehenlassen über Nacht bei 4ºC wird die Platte mit dem Antigen beschichtet. Dann wird 1% BSA (Rinderserumalbumin) enthaltende PBS in den Vertiefungen (200 ul pro Vertiefung) verteilt und die restlichen am Boden jeder Vertiefung noch vorhandenen Bindungsstellen werden mit BSA blockiert. Nach gründlichem Waschen der Platte mit PBS werden Serienverdünnungen der Proben (Mausseren, Überstände der Hybridomkultur oder gereinigte monoclonale Antikörper; jeweils als der erste Antikörper) in den Vertiefungen verteilt (50 ul pro Vertiefung), gefolgt von Stehen über Nacht bei 4ºC oder 3 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur.
Nach sechsmaligen Waschen mit PBS wird eine 400-fache Verdünnung von Kaninchen-anti Maus-Immunglobulin-IgG-Peroxidase-Konjugat (DAKO PATTS a/s) als der zweite Antikörper in den Vertiefungen verteilt (100 ul pro Vertiefung). Die Platte wird dann bei Raumtemperatur 2 Stunden stehengelassen.
Nach gründlichem Waschen mit PBS wird eine ABTS-Substratlösung (hergestellt durch Auflösen von 550 mg 2,2'-Azinobis (3-ethylbenzothiazolin-6- sulfonsäure)-diammoniumsalz in einem Uter 0.1 M Citratpuffer (pH 4.2) und kurz vor der Verwendung Zugabe von Wasserstoffperoxid bis zu einer Konzentration von 1 ul/ml,) aufgegeben und die entwickelte Farbe durch die Extinktions-OD 415 nm -Werte gemessen. Jene Mäuse, bei denen der OD-Wert bei 415 nm (Antikörpertiter bezüglich abnormalem Glycogen) nicht kleiner als 10³-fach ist, verglichen mit dem OD-Wert von normalem Mausserum bei 415 nm, werden als Bezugsquelle von Antikörper-produzierender Zellen verwendet.
Zur Vorbereitung der Zellfusion werden Herzmuskelhomogenate von Patienten mit Lafora-Krankheit oder daraus extrahiertes abnormales Glycogen den immunisierten Mäusen in einer Dosis von 10 bis 200 ug pro Tier 3 bis 4 Tage vor der Fusionsbehandlung verabreicht. Die Milz wird dann herausgeschnitten und die Milzzellen für die Fusion präpariert.

(2) Herstellung der Myelomzellen

Eine von der Maus abstammende, etablierte Myelomzellinie wird verwendet. Geeignete Beispiele sind die gegen 8-Azaguanin resistenten Maus- Myelomzellinien P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology 81, (1978)1-7], P3-NSI/1-Ag41 (NS-1) [European J. Immunology 6, (1976) 511-519], SP2/O-Ag14 (SP-2) [Nature, 276, (1978) 269-270], P3-X63-Ag8 653 (653) [J. Immunology, 123, (1979)1548-1550] und P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, (1975) 495-497)], welche alle kommerziell erhältlich sind. Die Passage dieser Zellinien wird in 8-Azoguanin-Medium [ normales Medium, hergestellt durch Hinzufügen von Glutamin (1.5 mM), 2-Mercaptoethanol (5 · 10&supmin;&sup5; M), Gentamycin (10 ug/ml) und fötalem Kälberserum (FCS) (10%) zu RPMI-1640- Medium, mit einem weiteren Zusatz von 8-Azaguanin (15 ug/ml)]. Die für die Zellfusion selektierte Zellinie sollte 3 bis 4 Tage vor der Fusion in normales Medium überführt werden, um am Tag der Fusion eine Zellzahl von nicht weniger als 2 · 10&sup7; sicherzustellen.

(3) Zellfusion

Die gemäß (1) präparierten Milzzellen und die in (2) erhaltenen Myelomzellen werden gründlich mit MEM (Produkt von Nissui Pharmaceutical) oder PBS gewaschen und in einem Zellzahlverhältnis von Antikörperproduzierenden Zellen: Myelomzellen im Bereich 5 : 1 bis 10 : 1 gemischt und dann einer Zentrifugation unterworfen. Der Überstand wird verworfen und das Zellsediment aufgerührt. Unter Rühren wird ein Gemisch von 1-4 g Polyethylenglycol (PEG 1000-4000), 1-4 ml MEM und 0.5-10 ml Dimethylsulfoxid in einer Menge von 0. 1-1.0 ml pro 108 Milzzellen hinzugefügt und nach 0.5-10 Minuten 0.5-3 ml MFM hinzugefügt. 0.5-3 ml MFM werden dann mehrmals in Intervallen von 0.5- bis 2-Minuten hinzugefügt und dann 30-60 ml MFM hinzugegeben.
Nach Zentrifugation wird der Überstand erneut verworfen und das Zellsediment vorsichtig aufgerührt. Dann werden 50-200 ml normales Medium zu den Zellen hinzugefügt und die Zellen mit einer Meßpipette vorsichtig suspendiert.
Die erhaltene Suspension wird in den Vertiefungen einer Inkubationsplatte in Portionen eines halben Vertiefungsvolumens verteilt. Die Inkubation wird in einem 3-7%-Cc)2-inkubator bei 35-40ºC für 10-30 Stunden durchgeführt. HAT-Medium (normales Medium, ergänzt durch Hypoxanthin (10&supmin;&sup5;-10&supmin;³ M), Thymidin (103w6-10&supmin;&sup4;M) und Aminopterin (10&supmin;&sup8;-10&supmin;&sup7; M)) wird auf die Inkubationsplatte gegeben (ein halbes Vertiefungsvolumen pro Vertiefung) und die Inkubation für weitere 10-30 Stunden durchgeführt. Danach wird die Hälfte des Kulturüberstandes verworfen und das gleiche Volumen von frischem HAT-Medium in Intervallen von 10 bis 30 Stunden für 1-3 Tage hinzugefügt. Die Inkubation im CO&sub2;-Inkubator wird bei 35-40ºC für 10-14 Tage fortgesetzt.
Bei jenen Vertiefungen, in denen gewachsene, fusionierte , koloniebildende Zellen gefunden werden, wird die Hälfte des Überstandes verworfen und das gleiche Volumen HT-Medium (HAT-Medium minus Aminopterin) hinzugefügt, gefolgt von einer Auswechslung des Mediums mit frischen Portionen von HT- Medium in Intervallen von 10 bis 30 Stunden für 1 bis 3 Tage.
Nach 3 bis 4 Tagen Züchtung in HT-Medium wird ein Teil des Kulturüberstandes gesammelt und mit dem vorstehend erwähnten Enzym- Immuntest-Verfahren auf den Antikörpertiter bezüglich abnormalem Glycogen getestet. Die Clonierung wird in den Vertiefungen, für die ein hoher Wert des Antikörpertiters erhalten wird, zwei- bis viermal mit einem Grenzverdünnungsverfahren wiederholt. Auf diese Weise werden jene Clone, für die hohe Werte des Antikörpertiters stabil erhältlich sind, als Hybridomzellinien selektiert, die monoclonale Antikörper gegen abnormales Glycogen produzieren.

(4) Herstellung der monoclonalen Antikörper

Acht- bis zehn Wochen alten, weiblichen BAU3/c-Mäuse, die mit Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan) behandelt worden waren, werden die im Verfahren (3) erhaltenen Hybridomzellen, die monoclonale Antikörper gegen abnormales Glycogen produzieren, intraperitoneal in einer Dosis größer als 2-4 · 10&supmin;&sup5;&supmin;&sup7; Zellen pro Tier injiziert. Nach 10 bis 21 Tagen erzeugen die Hybridomzellen in den Mäusen Ascitescarcinom. Die Ascitesflüssigkeit wird gesammelt, zur Entfernung fester Bestandteile zentrifugiert, einem Aussalzen mit 50% Ammoniumsulfat und mit 40% Ammoniumsulfat unterzogen und dann 1 bis 2 Tage gegen PBS (pH 7.2) dialysiert. Die dialysierte Fraktion wird zur Aufreinigung oder zur quantitativen Bestimmung als grob gereinigter monoclonaler Antikörper verwendet.
Die Fraktion wird über eine DFAE-Sepharose-Säule, Protein-A-Säule oder Sephacryl-S-300-Säule gegeben und aktive Fraktionen (IgG-, IgM- oder IgA- Fraktionen) gesammelt, wenn eine weitere Aufreinigung benötigt wird.
Der Isotyp oder die Unterklasse des Antikörpers wird mit dem Ouchterlony- Verfahren [Seibutsukagaku Jikkenho (Methods in Experimental Biochemistry), Vol. 15, Introduction to Experimental Immunology, S. 74, Gakkai Shuppan Center, 1981)] bestimmt.
Die Proteinmenge wird mit dem Folin-Verfahren bestimmt, gefolgt von einer auf der Extinktion bei 280 nm beruhenden Berechnung.
Das folgende ist ein spezifisches Beispiel des vorstehenden Verfahrens:

BEISPIEL 1

(1) Herstellung der immunisierten Mausbauchspeicheldrüsenzellen

8 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen (Shizuoka Agricultural Cooperative Association for Laboratory Animals) wurden Herzmuskelhomogenate von Patienten mit Lafora-Krankheit und daraus extrahiertes abnormales Glycogen (100 ug pro Tier) als Antigen, zusammen mit Muminiumhydroxid-Gel (2 mg pro Tier) und abgetötetem B. pertussis-Impfstoff (Chiba Serum Institute; 1 · 10&sup9; Zellen pro Tier) als Adjuvans, intraperitoneal injiziert und diese dadurch immunisiert. Eine zweite und nachfolgende Immunisierungen folgten in Intervallen von 1 bis 2 Wochen mit einer Dosis von 100 ug pro Tier.
Bei und nach der dritten Immunisierung wurde eine Blutprobe aus dem Augenhintergrund-Venengeflecht 5 bis 7 Tage nach der Immunisierung entnommen und das Serum jeder Probe mit dem vorstehend beschriebenen enzymgebundenen Festphasen-Immunadsorptionstest auf den Antikörpertiter gegen abnormales Glycogen analysiert.
Jene Mäuse, bei denen im Serum der OD-Wert bei 415 nm, der dem Antikörpertiter bezüglich abnormalem Glycogen entspricht, nicht kleiner als 10³-fach ist, verglichen mit dem OD-Wert von normalem Mausserum bei 415 nm, wurden weiter mit abnormalem Glycogen mit einer Dosis von 100 ug pro Tier intraperitoneal immunisiert. Drei Tage nach der Immunisierung wurden Milzzellen aus solchen Mäusen präpariert und für die Zellfusion verwendet.

(2) Herstellung der Myelomzellen

Die gegen 8-Azaguanin resistente Myelomzellinie P3-U1 der Maus wurde in einem 5%-CO&sub2;-inkubator bei 37ºC in normalem Medium [RPMI-1640, ergänzt mit Glutamin (1.5 mM), 2-Mercaptoethanol (5 · 10&supmin;&sup5; M), Gentamycin (10 ug/ml) und foetalem Kalberserum (0.1 ml/ml)] gezüchtet, so daß das Vorliegen von nicht weniger als 2 · 10/ Zellen nach 4 Tagen gesichert war.

(3) Hybridomherstellung

Die immunisierten Maus-Milzzellen wurden gründlich mit MEM (Produkt von Nissui Pharmaceutical) gewaschen, mit den Maus-Myelomzellen (2 · 10&sup7; Zellen) gemischt und dann einer Zentrifugation unterzogen (1200 Upm, 5 Minuten).
Das ein Gemisch von Milzzellen und P3-U1-Zellen enthaltende Sediment wurde aufgerührt und 0.5 ml eines Gemischs aus 2 g Polyethylenglycol-1000 (PEG1000), 2 ml MEM und 0.7 ml DMSO hinzugefügt, sowie eine Minute danach 1 ml MEM unter Rühren bei 37ºC. Nach fünfmaliger Zugabe von 1 ml MEM in einminütigen Intervallen wurde das Gesamtvolumen durch die Zugabe von MEM auf 50 ml gebracht. Nach Zentrifugation bei 900 Upm wurde der Überstand verworfen und das Zellsediment wurde vorsichtig aufgerührt. 100 ml HAT- Medium [das genannte normale Medium, ergänzt durch Hypoxanthin (10&supmin;&sup4;M), Thymidin (1.5 · 10&supmin;&sup5; M), und Aminopterin (4 · 10&supmin;&sup7; M)] wurden zu den Zellen hinzugefügt. Die Zellen wurden vorsichtig in dem Medium mit einer 10 ml- Meßpipette suspendiert.
Die Suspension wurde in den Vertiefungen einer Inkubationsplatte mit 96 Vertiefungen (Produkt von Falcon, Becton Dickinson) verteilt (200 ug pro Vertiefung). Die Inkubation wurde in einem 5%-CO&sub2;-Inkubator bei 37ºG für 10 bis 14 Tage durchgeführt.
In den Vertiefungen, in denen gewachsene, fusionierte, koloniebildende Zellen zu finden waren, wurden 100 ul Überstand verworfen und 100 ul HT- Medium (HAT-Medium minus Aminopterin) hinzugefügt und bei 37ºC inkubiert, gefolgt von einer Auswechslung des Mediums mit frischen Portionen von HT- Medium in Intervallen von 24 Stunden für 2 Tage in der gleichen Weise.
Nach 4 Tagen Züchtung wurde ein Teil des Kulturüberstandes gesammelt und mit dem vorstehend erwähnten enzymgebundenen Festphasen- Immunadsorptionstest auf den Antikörpertiter gegen abnormales Glycogen geprüft.
Für die Vertiefungen, die einen hohen Wert des Antikörpertiters aufwiesen, wurde die Clonierung zweimal mit dem Grenzverdünnungsverfahren wiederholt. Der Clon, dessen Wert des Antikörpertiters bezüglich des abnormalen Glycogens stabil erhältlich war, wurde als Hybridomzellinie KM- 279 selektiert, die monoclonale Antikörper gegen abnormales Glycogen produziert.
Der vorstehende, monoclonale Antikörper produzierende Hybridomstamm KM-279 ist am 3. Juli 1986 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der "European Collection of Animal Cell Cultures", Großbritannien, mit der Hinterlegungsnummer 86070304 hinterlegt worden.

(4) Reinigung des monoclonalen Antikörpers

Acht Wochen alten, nackten, weiblichen Mäusen (BALB/c nu-/nu-), die mit Pristan behandelt worden waren [0.5 ml 2,6,10,14,-Tetramethylpentadecan (Pristan) intraperitoneal verabreicht und 1 bis 2 Wochen gefüttert], wurden die vorstehend erhaltenen Hybridomzellen in einer Dosis von 4 · 106 Zellen pro Tier intraperitoneal injiziert. Die Ascitesflüssigkeit wurde aus den Ascitesflüssigkeit aufweisenden Mäusen (4 bis 10 ml pro Tier) gesammelt, zentrifugiert, um feste Bestandteile zu entfernen, einem Aussalzen mit 50% Ammoniumsulfat und mit 40% Ammoniumsulfat unterzogen, und dann 2 Tage gegen PBS (pH 7.2) dialysiert und als grob gereinigter monoclonaler Antikörper verwendet.
Eine pathologische Diagnose der Lafora-Krankheit und der Typ IV- Glycogenose wird gemäß dem gebräuchlichen immunohistochemischen Verfahren gemacht. Ein typisches Beispiel wird in Beispiel 2 gezeigt.

(5) Antigenstezffität des monoclonalen Antikörpers

Die Spezifität des gereinigten monoclonalen Antikörpers wurde unter Verwendung des enzymgebundenen Festphasen-Immunadsorptionstests untersucht. Als Antigene wurden abnormales Glycogen, hergestellt aus Herzmuskelhomogenaten von Patienten mit Lafora-Krankheit (Referenzbeispiel 1), normales Glycogen (Produkt von Nakarai Kagaku) und Rinderserumalbumin (Produkt von Sigma) verwendet.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Reaktionsspezifität von KM-279 bestimmt mit EUSA

Antigen Reaktivität (OD415nm)
Abnormales Glycogen 0.990
Normales Glycogen 0.007
Rinderserumalbumin 0.008

BEISPIEL 2

Formalin-fixierte und in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte des Herzmuskels oder der Haut von Patienten mit Lafora-Krankheit oder mit Typ N-Glycogenose, die mit dem Microtom auf eine Dicke von 5 um geschnitten worden waren, wurden auf Glasobjektträger aufgebracht, mit Eiweißalbumin überzogen, in Xylol entparaffiniert und mit wäßrigem Ethanol allmählich hydratisiert.
Nach fünfminütigem Waschen mit deionisiertem Wasser wurde die endogene Peroxidase durch Immersion in 0.3% (Gew./Vol.) Wasserstoffperoxid in absolutem Methanol bei Raumtemperatur für 30 Minuten inaktiviert. Die Schnitte wurden mit PBS 20 Minuten gewaschen und mit verdünntem, normalem Pferdeserum bei Raumtemperatur 20 Minuten inkubiert.
Überschüssiges Serum wurde abgesaugt und der gegen abnormales Glycogen gerichtete monoclonale Antikörper KM-279 (20 ug/ml) wurde als erster Antikörper hinzugefügt. Die Glasobjektträger wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten stehengelassen und dann mit PBS gewaschen. Dann wurde ein verdünnter biotinmarkierter Antikörper (Biotinmarkierter Kaninchen-Anti- IgG-Antikörper) auf die Schnitte gegeben und die Objektträger wurden 30 Minuten stehengelassen. Nach Waschen wurde eine Avidin-Biotin-Peroxidase (Produkt von Vector) auf die Schnitte gegeben und die Objektträger wurden 30 Minuten stehengelassen. Nach gründlichem Waschen wurden die Schnitte 2 Minuten in einer Peroxidasesubstratlösung (Gemisch aus 0.02% Wasserstoffperoxid und 0.1% Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid in 0,1 M Tris- Puffer, pH 7,2) inkubiert und die Umsetzung durch das Einlegen des Glases in eiskaltes Wasser beendet. Die Schnitte wurden mit Hematoxylin gegengefärbt, in Ethanol/Wasser und Xylol entwässert, mit Kanadabalsam ausgefällt und einer mikroskopischen Untersuchung unterzogen. Als Ergebnis wurden gefärbte Formen (Lafora-Körper) zahlreich in Herzmuskel- oder Hautschnitten von Patienten mit Lafora-Krankheit beobachtet. Ähnliche Anfärbungen wurden auch in Herzmuskel- und Hautschnitten von Patienten mit Typ IV-Glycogenose beobachtet, was auf die Fähigkeit des vorliegenden monoclonalen Antikörpers zur Reaktion sowohl mit abnormalem Glycogen als Folge der Typ IV- Glycogenose als auch mit abnormalem Glycogen als Folge der Lafora-Krankheit (Lafora-Körper) hinweist.
Im Gegensatz dazu wurden bei Herzmuskel- oder Hautschnitten von gesunden Personen, wenn die gleiche Behandlung durchgeführt wurde, keine angefärbten Formen beobachtet.

Referenzbeispiel 1

Zuerst wurden 5 bis 10 g des Herzmuskels von Patienten mit Lafora- Krankheit zerkleinert und 20% Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 10% unter Mörsern hinzugefügt. Die Probe wurde dann mit einem Homogenisator homogenisiert. Die Homogenate wurden zur Gewinnung des Überstandes zentrifugiert (3000 Upm, 10 Minuten). Das zweifache Volumen an 99.5% Ethanol und ein Drittel Volumen einer gesättigten Kaliumchloridlösung wurden hinzugefügt und das Gemisch gerührt. Die Probe wurde zentrifugiert (3000 Upm, 10 Minuten) und die Sedimentationsfraktion in deionisiertem Wasser gelöst.
Das Präzipitationsverfahren mit Ethanol und der gesättigten Kaliumchloridlösung wurde zur Gewinnung von abnormalem Glycogen als Sedimentationsfraktion dreimal wiederholt.

Claims

1. Monoclonaler Antikörper der IgG-Klasse mit der Fähigkeit zur Reaktion mit abnormalem Glycogen von Patienten mit Lafora-Krankheit (Lafora-Körper) oder mit abnormalem Glycogen von Patienten mit Typ IV-Glycogenose, aber nicht mit normalem Glycogen, wobei der monoclonale Antikörper von der Hybridom-Zellinie KM-279, ECACC Nr. 86070304 erhältlich ist.

2. Verfahren zur Produktion eines monoclonalen Antikörpers gegen menschliche Lafora-Körper, umfassend die Züchtung von Zellen, die von der Hybridomzellinie KM-279, ECACC Nr. 86070304, stammen und zur Produktion des Antikörpers in einem Kulturmedium oder bei intraperitonealer Verabreichung an ein Säugetier fähig sind, so daß sie die Vermehrung dieser Zellen in einem Kulturmedium oder in der Ascitesflüssigkeit des Säugetiers gleichzeitig mit der Produktion des Antikörpers verursachen, und Gewinnung des Antikörperprodukts aus dem Kulturmedium oder aus den Ascitesflüssigkeiten des Säugetiers, wie es zutrifft.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Säugetiere Mäuse sind.

4. Hybridomzellinie KM-279, ECACC Nr. 86070304, und davon abgeleitete Zellinien, nämlich Zellinien, die zur Produktion eines monoclonalen Antikörpers der IgG-Klasse mit der Fähigkeit zur Reaktion mit abnormalem Glycogen von Patienten mit Lafora-Krankheit (Lafora-Körper) oder mit abnormalem Glycogen von Patienten mit Typ IV-Glycogenose, aber nicht mit normalem Glycogen, fähig sind.

5. Diagnostizierverfahren zum Nachweis pathologischer Veränderungen aufgrund der Lafora-Krankheit und Typ IV-Glycogenose, umfassend die Durchführung eines Immunoassay an einer Gewebeprobe eines Patienten mit einem monoclonalen Antikörper, der spezifisch ist für abnormales Glycogen von Patienten mit Lafora-Krankheit (Lafora-Körper) oder für abnormales Glycogen von Patienten mit Typ IV- Glycogenose, aber nicht für normales Glycogen und entsprechend reagiert, und die Prüfung der Ergebnisse auf die Gegenwart einer positiven Reaktion, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete monoclonale Antikörper ein Antikörper nach Anspruch 1, ein nach dem Verfahren von Anspruch 2 oder 3 hergestellter Antikörper, oder ein von einer Zellinie nach Anspruch 4 erhaltener Antikörper, ist.

6. Immunohistochemisches Färbeverfahren zur Bestimmung der Gegenwart von abnormalem Glycogen von Patienten mit Lafora-Krankheit (Lafora-Körper) oder abnormalem Glycogen von Patienten mit Typ IV-Glycogenose, umfassend die Verwendung einer Gewebeprobe eines Patienten, der vermutlich abnormales Glycogen als Folge der Lafora-Krankheit oder Typ IV-Glycogenose besitzt, eines monoclonalen Antikörpers, der spezifisch ist für abnormales Glycogen von Patienten mit Lafora-Krankheit (Lafora-Körper) oder für abnormales Glycogen von Patienten mit Typ IV-Glycogenose, aber nicht für normales Glycogen und entsprechend reagiert, und Beobachtung der gefärbten Probe, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete monoclonale Antikörper ein Antikörper nach Anspruch 1, ein nach dem Verfahren von Anspruch 2 oder 3 hergestellter Antikörper oder ein von einer Zellinie nach Anspruch 4 erhaltener Antikörper ist.