JPS6319562A

JPS6319562A - 抗ラフオ−ラ小体単クロ−ン性抗体

Info

Publication number: JPS6319562A
Application number: JP61163414A
Authority: JP
Inventors: Hajime Koda; 好田　肇; Nobuo Hanai; 陳雄花井; Akiko Kumagai; 安希子熊谷
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1986-07-11
Filing date: 1986-07-11
Publication date: 1988-01-27
Also published as: CA1294905C; JPH0570435B2; EP0252768A3; EP0252768B1; EP0252768A2; US4962032A; DE3787416D1; DE3787416T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、ヒトのラフォーラ小体に対する単クローン性
抗体に関する。本発明の単クローン性抗体は、ラフォー
ラ病、糖原病ハｌ型の検出に有用である。

従来の技術ラフォーラ病、糖原病■型の検出は、筋生倹、肝生検な
どによって病理学的に行われている。

ラフォーラ病（ミオクローヌスてんかん）および糖原病
■型は、グリコーゲン分子の枝分かれを形成する酵素で
あるα−１，４−クリカン−６−グルコシルトランスフ
ェラーゼの欠損によって生じる外側技の長い異常グリコ
ーゲン（ラフォーラ小体）が、心筋、神経細胞、肝細胞
、皮膚などに蓄積する疾患である。

ラフォーラ病の多くは家族性に出現し、思春期前後に発
病、けいれん発作、ミオクロニー痴呆、小脳症状、性格
変化などの臨床症状を呈し、進行性の経過をとって１０
余年を経て全身衰弱のため死亡する症候群である。

糖原病■型（Ａｎｄｅｒｓｅｎ病）は、生後まもなく発
育障害があり、肝腫、胛腫、筋緊張低下が出現し、腹水
の合併をみ、２年以内に死亡する症候群である。

発明が解決しようとする間頽点ラフォーラ病、糖原病■型の診断は、筋生倹、肝生倹な
どによって病理学的に診断をしているが、α−アミラー
ゼ処理、β−アミラーゼ処理、ＰＡＳ染色−；ど繁惟な
手法が、２、要であり、かつ、確定的なものはなし）っ異常グリコーゲン（ラフオーラ小体）と反応し、正常の
グリコーゲンとは反応しない単クローン性抗体を確立す
れば、ラフォーラ病、糖原病■型の診断上極めて有効−
；手段となるものと期待される。

問題点を解決するための手段本発明者ろは、ラフォーラ病患者心筋ホモジネート、あ
るいは、それより抽出した異常グリコーゲンでマウスを
免疫し、ハイブリドーマを作製し、異常グリコーゲンと
反応し、正常グリコーゲンと反応しない単クローン性抗
体を確立し、本願発明を完成するに到った。

従来、このような異常グリコーゲンに対する単クローン
性抗体に関する報告は全くない。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明は、ラフォーラ小体に反応する単クローン性抗体
を提供する。本発明の単クローン性抗体はＩｇＧクラス
に属し、その具体例としては、ＫＭ−２７９と名付けた
ものがあげられる。

本発明の単クローン性抗体は、ラフォーラ病患者の心筋
ホモジネートまたはそれから抽出したラフォーラ小体で
哺乳動物を免疫し、該免疫動物の脾細胞と哺乳動物の骨
髄腫ａ胞とを融合させ、得られるハイブリドーマ細胞株
かるラフオーラ小ｌ太に反応するハイブリドーマ細胞株
を選び、該仙胞株を培地に培養するか、哺乳動物の腹腔
に投与して腹水化し、培養物または腹水中にラフオーラ
小体に反応する単クローン性抗体をＭ積させ、該培養物
または復水から該単クローン性抗体を採取することによ
って得られる。

免疫する哺乳動物および骨髄腫細胞の哺乳動物としては
、マウス、ラット、ウシ、ウマなどがあげられる。

哺乳動物としてマウスを用いた、本発明の単クローン性
抗体の具体的製造法を以下に示す。

（１）　　免疫化物細胞の調製マウスをラフォーラ病患者心筋ホモジネートあるいはそ
れから抽出した異常グリコーゲンで免疫して、そのマウ
スから脾細胞を調製する。

ラフォーラ病患者の心筋ホモジネート異常グリコーゲン
は参考例１の方法に従って調製する。

免疫の方法は、８〜ｌＯ週令のＢＡＬＢ／ｃマウスの皮
下あるいは、静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバ
ント〔例えば、フロイントの完全アジュバント（Ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’５Ａｄｊｕｖａ口ｔ）ある
いは、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど
〕とともに、ラフオーラ病患者心筋ホモジネートあるい
はそれから抽出した異常グリコーゲンを１０〜１００■
／匹投与する。以後１〜２週問おきに初回免疫に使った
と同じ抗原を同１２〜５回投与する。

各免疫後４〜７日目に、眼底静脈叢より採血し、血清中
の異常グリコーゲンに対する抗体価を調べる。

抗体価の測定法は、同相酵素免疫測定法（酵素免疫測定
法：医学書腕利　１９７８年）により下記のとおり行う
。

９６穴のＥＩＡ用ブＬ／−）　（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ社製〕に異常グリコーゲンまたは正常グ
リコーー　　ゲンの１０〜５０ｇ／ｍｌリン酸バッファ
ー・セライン（ＰＢＳ　ニリン酸二ナトリウム１．８３
ｇ。

リン酸−カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水
１１、ｐ　）ｌ　７．２　）溶液を５０４７穴ずつ分注
し、４℃で一晩放置して抗原をプレートにコートする。

次いで１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳを２０
０μｍ／穴分注し、プレート底面上の結合性残基をＢＳ
Ａでブロックする。

上記プレートをＰＢＳでよく洗浄後、第１抗体として、
段階希釈した試料（マウス血清、）−イブリドーマ培養
上清、精製抗体）を５０μｇ／穴分注し、４℃で一晩ま
たは、室温で３〜４時間時間放心。ＰＢＳで６回洗浄し
た後、第２抗体として、ウサギ抗マウスイムノグロブリ
ン−ペルオキシダーゼ結合物ＣＤＡＫＯ社製〕の４００
倍希釈液を１００ＪＩＪＩ／大分注し、室温で２時間放
置する。ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基５ｉｔａ１２．２
’−アジノピス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−ス
ルホン酸）ニアンモニウム５５０ｍｇを０．１Ｍクエン
酸緩衝液（ｐ　８４．２　＞１１に溶かした溶液に、使
用直前に過酸化水素１　頭／ｍｌを加えた溶液〕を用い
、発色を［ｌＤ＜＋ｓｎヨの吸光度で測定する。

異常グリコーゲンに対する抗体価が、正常マウス血清の
１０３倍以上（４１５ｎｍてのａ　ｏ　ｒａ　＞になっ
たマウスを免疫化動物細胞の供給源として使う。

細胞融合に供するために、免疫マウスに融合処理の３〜
４日前に、ラフォーラ病患者の心筋のホモジネートある
いはそれから抽出した異常グリコーゲンを１０〜２ＧＱ
ｇ／匹を腹腔内に投与し、追加免疫後、肺臓を摘出し、
牌細泡をｍ製する。

（２）骨髄嗅細胞の調製骨髄腫細胞としては、マウスから得られた迭化細胞を使
用する。たとえば、ａ−アヂグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞味Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕｌ
　（Ｐ３−Ｕｌ）〔カレント・トピックス・イン・ミク
ロバイオロジイ・アント−イムノロシイ（Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ　Ｔｏｐｉｃｓｉｎ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　
ａｎｄ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）８１．　１〜７（１９
７８））　、Ｐ３−ＮＳ　Ｉ／　１−Ａｇ４１　（ＮＳ
−１）〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロシ
イ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）
、６　　。

５１１〜５１９（１９７６）　）　、ＳＰ２１０−Ａｇ
　１４（ＳＰ−２）［：ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）
　、　２７６　。

２６９〜２７０　（１９７８））　、Ｐ３−Ｘ６３−Ａ
ｇ８６５３（６５３）Ｃジャーナル・オブ・イムノロシ
イ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、旦、　１５４８〜
１５５０（１９７９））　、Ｐ　３−Ｘ　６３−Ａｇ　
８　　（Ｘ６３）　　Ｃネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）
、　２５６　、４９５〜４９７（１９７５）　〕などが
用いられる。

これらの細胞株は、８−アザグアニン培地［：ＲＰＭ＋
−１６４０培地にグルタミン（１，５ｍＭ）、２−メル
カプトエタノール（５Ｘ１０−’Ｍ）、ジェンタマイシ
ン（１０■／ｍ１）および牛胎児血清（Ｆｅ２）（１０
％）を加えた正常培地に、さらに８−アザグアニン（１
５■／ｍｌ　）を加えた培地〕で、継代するが、細胞融
合の３〜４日前ｊこ正常培地に継代し、融合当日２×１
０７以上の細胞数を確保する。

（３）　　　細　り包　融　合（１）で免疫したマウスに１０〜２００μｇ／匹のラフ
ォーラ＠患者心筋ホモジネートあるいは異常グリコーゲ
ンを復腔内に投与し、３〜４日後に弾臓を摘出し、脾細
胞を調製する。この脾細胞と（２）で得られる骨髄腫細
胞株をＭＥＭ培地（日永製薬社製）または、ＰＢＳでよ
く洗浄し、細胞数が、胛細胞：骨髄腫細胞−５〜１０：
１になるように混合し、遠心分離にかける。上清を揄で
、沈澱した細胞群をほぐした後、攪拌しながらポリエチ
レングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ１００Ｏ〜４０００）１〜
４ｇ、ＭＥＭ培地１〜４ｍｌ、ジメチルスルホキシド（
Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）　　０．５〜１
．０〜Ｌの混液０．１〜Ｌ、　Ｏｍｌ　／　１０！牌細
胞を加え、０．５〜１０分後にＭＥＭ培地０．５〜３ｍ
ｌを加える。その後０．５〜２分毎にＭ　Ｅ　Ｍ培地０
．５〜３ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を３０〜５Ｑ
ｍｌ加える。

遠心後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、正
常培地５０〜２０　Ｑｍｌを加え、メスピペットでゆる
やかに細胞を懸濁する。この懸濁液を培養用プレートに
半容量／穴ずつ分注し、３〜７％ＣＯ２インキユベータ
ー中、３５〜４０℃で１０〜３０時間培養する。培養プ
レートに半容量／穴のＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサ
ンチン（１０−’〜１０−３Ｍ）、チミジン（１０−’
〜ｔｏ−’Ｍ）およびアミノプテリン（１０−’〜１０
−’Ｍ）を加えた培地〕を加え、さらに１０〜３０時間
培養する。以後１〜３日間日間１コ〜３０捨て、新たに同量のＨＡＴ培地を加え、ＣＯ２インキ二
ヘーター中、３５〜４０℃で１０〜１４日間培養する。

コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上浦半容量を捨て、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からア
ミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後１〜３日
間日間１コ〜３０ＨＴ培地で３〜４日間培養後、培養上
清の一部をとり上記の酵素免疫測定法により、抗異常グ
リコーゲン抗体価を測定する。

抗体価の認められた穴について、限界希釈法によりクロ
ーニングを２〜４回繰り返−し、安定して抗体価の認め
られたものを、抗異常グリコーゲン単りローン性抗体産
生ハイブリドーマ株として選択する。

（４）単クローン性抗体の調製プリスタン（　２．　６．１０．　１４−テトラメチル
ペンタデカン）処理した８〜１０：ｉ！Ａ令ＢＡＬＢ／
ｃ系マウスに（３）で得られた抗異常グリコーゲン単り
ローン性抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜４×１０’〜
７個／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリド
ーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠
心分離して固形分を除去後、５０％硫安、４０％硫安塩
析し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１〜２日間透析する。こ
の透析画分を粗＠製単りローン性抗体として精製、定量
用に供することができる。

さらに精製が必要な場合には、ＤＥ　Ａ　Ｅ−セファロ
ースカラム、プロティンへーカラムあるいはセファクリ
ルＳ−３００カラムなどに通塔し、活性画分（ＩｇＧＳ
　ＩｇＭあるいはＩｇＡ画分）を集める。

抗体のインタイブ、サブクラスの決定は０ｕｃｈ−ｔｅ
ｒ＋ｏｎｙ法（免疫学実験入門、生物化学実験法１５、
学会出版センター刊、ｐ．７４　、　　１９８１年）に
よって行う。

蛋白量の定量は、フォーリン法および２８０ｎｍの吸光
度より算出する。

本発明の単クローン性抗体を生産するハイブリドーマ細
胞株ＫＭ−２７９は英国　ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ（巳ＣＡＣＣ）　！ご１９８６年７月３日付でＥ
ＣＡＣＣＮα８６０７０３０４として寄託しである。

実施例１（１）免疫マウス牌細胞の調製８週令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（静岡県実験動物農業協
同組合）にアジユバントとして水酸化アルミニウムゲル
２ｍｇ／匹および百日咳菌死菌ワクチン（千葉系血清研
究所）１ｘ１０ｓ細胞／匹と抗原としてラフォーラ病患
者心筋ホモジネートあるいはそれから抽出した異常グリ
コーゲン１００ｇ／匹を腹腔内投与し免疫した。

以後、１ないし２週問おきに、ラフォーラ病患者心筋ホ
モジネートあるいはそれから抽出した異常グリコーゲン
１００■／匹を腹腔内に投与し、２回目以降の免疫をか
けた。３回目の免疫以降、免疫の５〜７日後に眼底静脈
叢より採血し、血清中の抗−異常グリコーゲン抗体価を
同相法による酵素免疫測定法で調べた。血清中の異常グ
リコーゲンに対する抗体価が正常マウス血清の１０３倍
以上のマウスに、更に異常グリコーゲン１００ｘ／ｍｌ
を腹腔内投与して追加免疫し、３日後このマウスから脾
細胞を調製して細胞融合に用いた。

〔２）マウス骨髄腫細胞の調製８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細り包Ｐ３−Ｕｌを
正常培地ＣＲＰ、’ＪＩ−１６４０１：　クルタミ７１
．５　ｍ　Ｍ　％　２−メルカプトエタノール５ｘｌＱ
−５Ｍ１ジ工ンタマイシン１０ｘ／ｍｌおよび牛胎児血
清Ｑ、　１ｍｌ　／ｍ＋を加えた培地〕に培！’（３７
℃、ｃｏｉ　５％ａ気）Ｌ、、、４日後に２Ｘｌｏ７以
上の細頭包を１与る。

（３）ハイブリドーマの作製Ｍ　Ｅ　Ｍ　（日永製薬社製）でよく洗浄した免疫マウ
ス牌細１］ａｌＸ１０”個とマウス骨髄腫細胞２Ｘ１０
’個とを混合し、１．２０　Ｏｒｐｍ　テ５分間遠心分
離にかける。

沈澱として得られた脾細胞とＰ３−Ｕｌの混合した細胞
群をよくほぐした後、攪拌しながら３７℃、ホリエチレ
ングリコールー１０００（ＰＥＧ　　１０００　）　２
　ｇ、、ＭＥＭ　２ｍｌおよびＤＭＳｏ　　０．７ｍ１
（７）混液０．５ｍｌを加え、１分後にＭＥＭｌｍｌを
加えた。その後ＭＥＭ１ｍｌを１分毎に５回加えた後、
ＭＥＭを全容量が５０ｍｌとなるよう加える。９００ｒ
ｐＩ１１で遠心分離後、上清を捨て、ゆるやかに細胞を
ほぐした後、ＨＡＴ培地〔上記正常培地にヒポキサンチ
ン１０−’Ｍ、チミジンｌｙ５　Ｘ　１０−’Ｍ、およ
びアミノプテリン４Ｘ１０−’Ｍを加えた培地］　１０
０ｍ１を加え、１０ｍ１メスピペツトでゅるやかに細胞
を墾濁する。

懸濁液を９６大培養用プレート〔ｆａｌｃｏｎ　。

ベクトン・ディッキンソン社製〕に２００■／穴ずつ分
注し、５％ｃＯ□インキュベーター中３７℃で、１０〜
１４日間培養する。

コロニー状に成育してきた融合細胞のみられる穴につい
て、上ｆｆ１１００μＱを捨て、ＨＴ培地〔上記ＨＡＴ
培地よりアミノプテリンを除いた培地〕を１００４加え
、３７℃で培養する。以後２日間同様にＨＴ培地への交
換を行い、培養を続け４日後、培養上清の一部を採取し
、抗異常グリコーゲン抗体価を上記の同相酵素免疫測定
法により測定する。

抗体価の認められた穴については、限界希釈法によりク
ローニングを２回繰り返し、安定して抗体価の認められ
たクローンを抗異常グリコーゲン単りローン性抗体産生
ハイブリドーマ株として、ＫＭ−２７９を選択する。

（４）単クローン性抗体の精製ブリスタン処理（２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン０．５ｍｌ／匹を腹腔内投与し、１〜２週間
飼育する。〕した８ｉ１令ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ
　ｎｕ　−／ｎｕ−）雌マウスに上記で得られたハイプ
リドーマ株各４　Ｘ　１０’細胞／匹を腹腔内注射する
。１０〜２１日後にハイプリドーマ株は腹水癌化する。

１０〜２１日後に腹水のたまったマウスから腹水（４〜
ｌｏｍｌ／匹）を採取し、遠心分離して固形分を除去し
た。上清を５０％硫安塩析、４０％硫安塩析し、ＰＢＳ
（ｐ　Ｈ７，２）で２日間透析する。これを粗精装車ク
ローン性抗体とする。粗精装車クローン性抗体をＤＥＡ
Ｅ−セファロースカラムに通塔後、溶出し、ＩｇＧ画分
を集め、精装車クローン性抗体とする。

ラフォーラ病、糖原病■型の病理診断は通常の免疫組織
学的手法により行うことができる。

具体例は実施例２に示す。

（５）単クローン性抗体の抗原特異性同相酵素免疫測定法により、精装車クローン性抗体の特
異性を検討した。抗原としては、ラフォーラ病心筋由来
異常グリコーゲン（参考例１）、正常グリコーゲン（半
井化学社製）、牛血清アルブミン（シグマ社製）を用い
た。

その結果を第１表に示した。

第１表　　ＫＭ−２７９の反応特異性異常グリコーゲン　　　　　０．９９０正常グリコーゲ
ン　　　　　０．００７牛血清アルブミン　　　　　０
．００８実施例２ミクロトームで５μｍにスライスしたラフォーラ病ある
いは糖原病■型患者由来の心筋や皮膚の゛　　　　ホル
マリン固定パラフィン包埋組織切片を、卵白アルブミン
でコートしたスライドグラスに固定し、キシレンで脱パ
ラフイン後、アルコール−水で段階的に親水化した。レ
ジン水で５分間すすぎ、０．３％Ｈ２０，を含むメタノ
ール中で室温３０分間静置し、内因性ペルオキシダーゼ
をブロックした。次に切片を２０分間ＰＢＳで洗浄後、
希釈したウマ正常血清中で室温２０分間静置した。切片
から過剰の血清を吸い取り、第１抗体（抗−異常グリコ
ーゲン単クローン性抗体ＫＭ−２９７，２０■／ｍｌ　
）と３００分間反応せた。洗浄後、希釈ビオチン化抗体
（ビオチン化つサギ抗■ｇＧ抗体）を３００分間反応せ
、さらに洗浄後、アビジン−ビオチン−ペルオキシダー
ゼ複合体（ベクター社製）を３００分間反応せた。よく
洗浄後、ペルオキシダーゼ基質Ｃ０，０２％Ｈ２０２を
含む０．１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７，２）で
關整した０、１％ジアミノベンジジンテトラヒドロクロ
ライド（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ　ｔｅｔｒ
ａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）３を２分間反応させ、
水冷中で反応を停止した。ヘマトキシレン染色後、アル
コール−水およびキシレンで脱水後、カナダバルサムで
固定し、検鏡した。

その結果、ラフォーラ病、糖原病■型患者由来の心筋や
皮膚では、広汎に、異常グリコーゲンの沈着像（ラフォ
ーラ小体）が観察された。

一方、健常人の心筋や皮膚切片は、同様の処理をほどこ
しても、全く染色像は認められなかった。

参考例１ラフォーラ病患者由来の心筋５〜１０ｇを細切し、最終
濃度が１０％になるように２０％トリクロル酢酸溶液を
加えながらすりつぶしてから、ホモゲナイザーで均質化
する。ホモジネートを３．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心
分離し、その上清をとり、２倍量の９９．５％エタノー
ルおよび１／３０容量の飽和塩化カリウム液を加えてよ
く攪拌する。

再び３．００　Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈澱画
分をとる。この沈澱画分をレジン水に溶解する。

エタノール、飽和塩化カリウムによる沈澱操作を３回く
り返したものを、異常グリコーゲンとして用いた。

発明の効果本発明によれば、ラフォーラ病または糖原病■型の検出
に有用な単クローン性抗体が提供される。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ラフォーラ小体に反応する単クローン性抗体。
（２）ＩｇＧクラスに属する特許請求の範囲第１項記載
の単クローン性抗体。
（３）ラフォーラ病患者の心筋ホモジネートまたはそれ
から抽出したラフォーラ小体で哺乳動物を免疫し、該免
疫動物の脾細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合させ、
得られるハイブリドーマ細胞株からラフォーラ小体に反
応するハイブリドーマ細胞株を選び、該細胞株を培地に
培養するか、哺乳動物の腹腔に投与して腹水化し、培養
物または腹水中にラフォーラ小体に反応する単クローン
性抗体を蓄積させ、該培養物または腹水から該単クロー
ン性抗体を採取することによって得られる特許請求の範
囲第１項記載の単クローン性抗体。