JPS62270598A - 新規な腫瘍関連抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 本発明は抗原群、特に腫瘍関連抗原の特徴付けに関する
ものである。更に、該抗原Ｉ旧こ特異的に反応する抗体
群に関するものである。更にまた、本発明は該抗体の生
産方法、並びにこれらの診断及び治療」二の使用方法に
関するものである。

ヒトの癌を診断及び治療する上に於いて、モノクローナ
ル抗体の潜在的役割が、近年の研究及び考察の的となっ
ている。特に関心を集めているの（」、癌の経過、例え
ば治療期の癌の経過を検査し、監視Ｂ−るための免疫検
定法にモノクローナル抗体が使用できることである。モ
ノクローナル抗体はまた、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）に
於いて腫瘍関連抗原群と結合できる能力によって腫瘍の
影像化（イメージング）及び治療に使用できる可能性を
有しているごとム特に関心を集めている。

更にモノクローナル抗体技術の発達により、ヒト腫瘍に
於１」る複雑な抗原性の研究が可能となっている。具体
的に言えば、モノクローナル抗体の精密な免疫反応によ
って、ヒト腫瘍から発現されろ抗原を同定し、区分する
ことができる。従って、このようなはっきりした腫瘍関
連抗原群を、ある種のモノクローナル抗体との精密な免
疫反応によって特徴（＝Ｊ（ｊることは、癌を診断及び
治療ずろためにモノクローナル抗体技術を有効的に活用
する手段をＧたらずことになる。

矛盾するにうであるが、ある種の抗原群はヒト腫瘍細胞
から発現するはれども、正常細胞からも＝３＝ 発現する。従って、これらの抗原群は、「腫瘍に特異的
な抗原」と称号せずに１腫瘍関連抗原」と呼ぶことにす
る。これらの腫瘍関連抗原群が診断及び治療に於いて重
要であることは、腫瘍細胞から発現される抗原が正常細
胞と比較して相対的に過剰量であること、更にイン・ビ
ボ（生体内）に於いて正常細胞による抗原よりも腫瘍細
胞によって発現される抗原に対するほうが抗体が選択的
であることに基づくものである。生体内に投与された抗
体が腫瘍細胞から発現される抗原に対し相対的に選択性
を示すことは、（１）悪性増殖の、異常で急速な代謝に
基づき、癌細胞による抗原の発現性が増大していること
、及び（２）腫瘍細胞の膜のバリヤーとしての性質の破
壊に基づき、抗体に腫瘍組織抗原が接近しやすくなって
いること、が関係していると考えられる。

現在までのところ、限られた量の腫瘍関連抗原群しか十
分に特徴付けが為されていない。更に、診断あるいは予
後のマーカーとして有用な腫瘍関連抗原の中には、全患
者、即ち疾病の全段階及び＝４− 全症状にわたり存在し得ないものがある。従って、同一
の腫瘍組織により発現される１つ以上の腫瘍関連抗原群
を同定し、特性化することによって、診断上の識別及び
治療効果が向」ニされる。更に、癌の診断及び治療を行
うには、特定の型のヒト腫瘍に関連している特殊な抗原
の集合体（ｓｅｔ）あるいはパネル（ｐａｎｅｌ）を利
用するのが望ましい。このような事情から、特異的な腫
瘍関連抗原群を更に同定し、特性化する必要がある。

本発明はヒト組織、特に乳癌に存在する新規な抗原類に
特徴付けを行うことに基づくものである。

従って、本発明は、少なくともモノクローナル抗体ＹＢ
ＹＯ８Ｂとの反応性によって特徴付けることのできる特
異な腫瘍関連抗原を提供するものである。

本発明は更に、本発明の抗原に特異的な抗体及びこのよ
うな抗体群を生産するための方法も提供するものである
。また本発明は、免疫組織化学的方法及び免疫検定法に
よって癌を検出し、その病態の経過を監視するための抗
体の使用例を提供し、更に、ヒトに於１：ｌる癌を生体
内に於いて診断及び治療するための該抗体の使用例をも
提供するものである。

前記のように、本発明は新規な腫瘍関連抗原を提供する
。本発明に従えば、ごの従来開示されていない抗原を特
徴（１けるためにモノクローナル抗体ＹＢＹ　０８８を
利用する。モノクローナル抗体ＹＢＹ０８８は、アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクシａン（ＡＴＣＣ）
［１２３０］　　パークローン・ｌ”ライブ、Ｏツ’）
ビｌ／、ＭＤ２０８５２］に寄託（４月１６日、１９８
６）されている雑種細胞系（ハイブリッド・セルライン
）から得られる。

この試料はこの細胞系寄託物にイマ１けられた受託番号
Ｉ］Ｂ９０７６により入手することができる。

本発明の抗原の生化学的及び免疫学的特性、特にモノク
ローナル抗体ＹＢＹ０８８との反応性により、その特徴
イ」け、並びに正常組織及び腫瘍組織に存在するその他
の抗原との識別が可能になる。

従って、本発明に係る抗原の同定可能な特徴及び特性を
以下に記載する： （ａ）本抗原は、ヒト乳房細胞系、詳細にはＴ４７１）
乳房細胞系（ＡＴＣＣＨＴＢ　＋　３３）に存在する。

（１））本抗原は、乳癌の膜成分である。モノクローナ
ル抗体ＹＢＹ　０８８を使用した標準的な固相酵素免疫
測定法（Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ、）により、乳癌から精製
された原形質膜中に抗原が存在すること、並びに正常な
乳房及び膵臓組織から精製された原形質膜中には比較的
低濃度であるが抗原が存在することか示される。それと
比較して、ＹＢＹ　０８８は、結腸組織、肝組織、腎組
織、肺組織、前立腺組織及び膀胱組織などの良性組織か
ら精製された膜とは明瞭な反応を示さない。

（ｃ）本抗原は、各種の正常組織及び乳癌のサイドシル
（細胞質ゾル）中で産生される。ＥＬＩＳＡ技法によっ
て示されるように、ＹＢＹ０８８は、乳房組織、結腸組
織、肝組織、腎組織、肺組織、前立腺組織、脳組織及び
肝組織などの良性組織、並びに乳癌、結腸癌及び結腸癌
の粘膜などの腫瘍組織から精製されたサイドシルと反応
する。

（ｄ）ヒト乳房細胞系Ｔ４７ＤのＳＤＳ抽出エキスを用
いた５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｓ’
ＤＳ−ＰＡＧＥ）及びウェスターン免疫ブａ−）ト分析
（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ　ａｎａｌｙ
ｓｉｓ）によって、ＹＢＹ０８８は、分子量約６８，０
００〜約ｓｏ、ｏｏｏ、約４．０．０００〜約４８，０
００、約２８，０００〜約３２，０００、及び約１６゜
０００〜約１９，０００の範囲の抗原の分子量成分と反
応することが明らかになった。あるいは、乳房細胞系Ｔ
　４７　Ｄの非イオン性洗浄剤抽出ニギスを用いた５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥ及びウェスターン免疫プロット分析によっ
て、ＹＢＹ０８８は分子量約２８，０００〜約３２，０
００、及び約１６，０００〜約１９，０００の範囲の抗
原の分子量成分と反応することが判明した。５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ法及びウェスターン免疫プロット分析の前に抗原
を粉砕して改良すると、抗原はプロテイナーゼＫによる
処理に反応するようになる。従って、抗原のＹＢＹ０８
８との反応性がプロテイナーゼに処理によって破壊され
るので、抗原の木質はタンパク質であることが明らかで
ある。

（ｅ）２次元ゲル電気泳動法を用いた抗原の等電点電気
泳動法により、前述の各分子量について抗原は、約吐■
８．０〜約ｒ）Ｈ８，８、約ｐｌ（６．２〜約ｐＨ６．
８、約ｐＨ６，２〜約叶１６．８、及び約ｐＨ８，０〜
約ｐＨ８，８の範囲の等電点を有することが判明した。

詳細には、抗原の等電点ピークは約ｐＨ８，４、約１）
Ｈ６．５、約ｐＨ６、５、及び約ｐＨ８４である。

（ｆ）抗原は、ヒト母乳中には検出されない。ＳＤ　Ｓ
　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ法及びウェスターン免疫プロット分
析法では、ＹＢＹ　０８８のヒト乳脂肪球状膜との反応
は認められない。

（ｇ）抗原は血液成分と関連性がない。蛍光励起細胞分
離捕集装置分析（ＦＡＣ３）では、ＹＢＹ０８８の血液
成分（リンパ球、赤血球細胞、骨髄成分及び血小板）と
の反応は認められない。

前述した、ヒト正常組織若しくはヒト腫瘍組織から精製
された膜又はサイドシルから選ばれる供給源から誘導さ
れ得る本発明の抗原は、本質的にタンパク質であり、約
６８，０００〜約８０，０００、約、ｔｏ、０００〜約
４８．０００、約２８．０００〜約３２，０００、及び
約１６，０００〜約１９．０００の範囲の分子量成分を
打するものとして特徴付けられる。更に本発明の抗原は
、各抗原の分子量成分について、約ｐＨ８，０〜約ｐＨ
８，８、約ｐＨ６，２〜約１）Ｈ６．８、約１）Ｉ（６
，２〜約１）Ｔ〜１６゜８、及び約ｐＨ８，０〜約叶Ｉ
８．８の範囲の等電点を有するものとして特徴付（プら
れる。更に本発明の腫瘍関連タンパク質は、各種の正常
及び腫瘍組織のサイトゾル中に存在し、乳癌の膜によっ
て発現される。

本発明の抗原をその他の腫瘍関連抗原などの他の抗原類
と識別する上で特に重要なことは、抗原の少なくとも１
つの決定基に対するモノクローナル抗体ＹＢＹ０８８と
の特異性である。本発明によって特徴付けられる抗原に
対するＹＢＹ０８８の特異的反応は、ヒトを起源とする
その他の物質からこの抗原を分離精製する手段、更には
抗原としての正確な抗原決定基を特徴付ける手段をもた
らずものである。このような精製された抗原及びこれら
の決定基は、当業界周知の方法を使用して診断及び治療
に使用できるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗
体を生産するのに有用である。

例えば、抗原に対するモノクローナル抗体を産生ずるネ
ズミハイブリドーマ（ネズミ雑種細胞）を得ることがで
きる。更に、本発明の抗原及び抗原決定基は、先に特徴
付けを行った抗原と共通する決定基又は決定基群を有す
る、本発明の抗原以外の分子群に対するモノクローナル
抗体を生産するために使用することもできる。このこと
は、ある種の抗原又は抗原決定基が病状の種々の段階あ
るいは発症時に、異なって発現される場合に特に有用で
ある。あるいは、本発明の抗原は、家兎、ヤギ又は他の
動物に於いて免疫反応を刺激するために使用することが
でき、該動物の血清ポリクローナル抗体を得ることがで
きる。更に本発明の抗原は、注目されている抗体、例え
ばモノクローナル抗体又はヒ）・組織、血液若しくはそ
の他の体液に存在する抗体群を特徴付けるために使用す
ることがで−１１〜 きる。

本発明は、本発明で特徴付けられる抗原に特異的なモノ
クローナル抗体及びその生産方法を提供する。好ましく
は、このようなモノクローナル抗体は１ｇ０群であり、
モノクローナル抗体ＹＢＹ０８８と実質的に同様な本発
明の腫瘍関連タンパク質と免疫反応性を有するものであ
る。このようなモノクローナル抗体は、ヒトに於ける癌
、特に乳癌を検出、診断及び治療するのに有用である。

更にこのような抗体は、本発明によって提供される抗原
を更に分離精製するため、並びに正確な決定基を特徴付
けるために利用することができる。

前記のモノクローナル抗体は、通常、ケーラーとミルス
タイン［Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２５６．４．９５−４９７（
１９７５）］の方法に従い生産することができる。本発
明に従えば、本発明の精製抗原の可溶性分画又は乳癌由
来のヒト腫瘍組織の可溶性分画を用いて、マウスあるい
は他の適当な宿主を免疫する。免疫を行った後、免疫化
マウスの牌臓細胞を適当なマウス骨＝１２− 髄腫系の細胞群と融合させ、雑種細胞系を得る。

得られた雑種細胞系を適当な培地で培養し、次いで本発
明で特徴付けられる抗原と特異的に反応する抗体を産生
ずる雑種細胞系を選別し、クローンし、その結果産生さ
れたモノクローナル抗体を回収する。

このように本発明は、下記の工程からなるモノクローナ
ル抗体の生産方法を提供する：（ａ）ヒト乳癌由来のヒ
ト腫瘍組織又はヒト組織由来の抗原又はヒト癌細胞系の
可溶性分画を用いて宿主を免疫すること（該抗原は、分
子量約６８．０００〜約８０，０００、約４０，０００
〜約４８゜０００、約２８，０００〜約３２，０００、
及び約１６．０００〜約１９，０００の範囲の成分であ
って、該分子量成分に関して約ｐ）（８、Ｏ〜約ｐＨ８
゜８、約＋）Ｈ６．２〜約ｐＨ６．８、約ｐＨ６，２〜
約ｐＩ（６、８、及び約ｐａｌ　８　、０〜約ｐＨ８、
８の範囲の等電点を有しているタンパク質である）、（
ｂ）該宿主の胛臓細胞を適当な骨髄腫細胞と融合させ、
雑種細胞系を得ること、 （ｃ）該雑種細胞系を適当な培地で培養し、（ａ）に記
載の抗原と反応する雑種細胞系を選別してクローンする
こと、及び （ｄ）産生されたモノクローナル抗体を回収すること。

本発明は、ヒトの癌、特に乳癌をｉｎ　ｖｉｔｒｏ（試
験管内）に於いて検出及び診断するための方法を提示す
るものである。前述した本発明の特異な腫瘍関連タンパ
ク質の特徴付１月こより、免疫組織化学法による患者の
組織試料中、及び／又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ免疫検定法に
よる但者の体液試料中の該タンパク質の検出が可能にな
る。免疫組織化学法及び／又は免疫検定法によって患者
検体中の本発明の腫瘍関連抗原の存在及び／又はその量
を検定するこ　　２とは、診断」二の重要な利用法であ
り、病状の経過を示し得るもの、あるいはそれに相関す
るものである。

患者の組織検体中の抗原を検出する免疫組織化学法は当
業界周知のものであるので詳細に記載する必要はないだ
ろう。本明細書にて簡潔に示せば、癌の疑いのある患者
（疑似癌患者）から得られた組織検体を本発明により特
徴付けられる腫瘍関連タンパク質に特異的な抗体、好ま
しくはそのモノクローナル抗体と接触させる。使用する
のに特に好ましいものは、モノクローナル抗体ＹＢＹ０
８８である。次いで、抗体が結合する部位（サイト）を
、標準的な免疫組織化学的手法によって組織検体を選択
的に染色することにより検出する。

同様に、免疫検定法により患者の体液試料中の抗原性物
質をｉｎ　ｖｉｔｒｏにて検出する方法は、当業界周知
であるので、本明細書で繰り返す必要はないであろう。

本発明に於いては、患者の体液試料を本発明の腫瘍関連
タンパク質と特異的に反応する少なくとも１つの抗体、
好ましくはモノクローナル抗体と接触させ、試料成分と
結合した抗体を検出する。拮抗的又は非拮抗的な免疫検
定法によって、本発明に係る抗原の存在を質的及び／又
は量的に検定することができる。モノクローナル抗体又
はポリクローナル抗体は、本発明により提供される抗原
に対して必要な特異性を有していれば、−１５＝ いずれも用いることができる。好ましくは、モノクロー
ナル抗体ＹＢＹＱ８ｇを使用する。更に、使用するのに
好ましい免疫検定法は、本発明によって特徴付けた抗原
の非干渉性決定基群と結合する、選択されたモノクロー
ナル抗体を使用する２点免疫検定法（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ
　ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙｓ）である。

本発明は更に、ヒトに於ける癌、特に乳癌の生体内診断
及びその治療方法を提示する。本発明によれば、本発明
の腫瘍関連タンパク質と特異的に反応する抗体を、前も
って決定しておいた有効量で、疑似癌患者に投与し、次
いで標準的な影像法により抗体の分布部位を検出するこ
とによって、腫瘍の位置を推定し、検出するという方法
が実施できる。検出を可能にするためには、抗体、好ま
しくはＹＢＹ０８８を好ましくはγ線を放射する放射性
核種を用いて標識し、薬学的に許容できる担体に入れて
患者に投与する。

このように本発明は更に、記述したような、薬学的又は
診断上許容できる担体あるいはその希釈剤とともにモノ
クローナル抗体を含有する、治療＝１６− あるいは診断用製剤を提供するものである。薬学的に許
容できる担体は、晶面動物を治療又は診断するのに使用
し得るものが選ばれ、また、診断上許容できる担体は、
診断試験法を行うのに使用し得るものが使われる。この
ような担体あるいは希釈剤は、当業者にとって周知のこ
となので、更に説明を加えない。

本発明により可能になった癌の治療方法に従い、本発明
に係る腫瘍関連抗原と特異的に反応する抗体、好ましく
はモノクローナル抗体の前もって決定しておいた有効量
を、癌患者に投与する。抗体、好ましくはＹＢＹ０８８
は適当な治療剤、例えば放射性同位元素、好ましくはβ
粒子放出物質、薬物、毒物又は腫瘍部位に集まるように
選択された生物的タンパク質と接合（コンジュゲート）
させ、薬学的に許容できる担体に入れて癌患者に投与す
る。

更に、イン・ビボ（生体内）での癌の診断及び治療とい
う関係で、当業者ならば理解できるであろうが、本発明
の腫瘍関連抗原に対し特異的に反応する抗体又は抗体の
断片（ｆ　ｒａｇｍｅｎｔ）、即ち抗体断片の混合体（
ｃｏｃｋｔａｉ　ｌｓ）の混合物を含有する抗体製剤は
、ある場合には、腫瘍の検出、位置の推定、及び治療を
効果的に行うのに使用することができる。

本発明を更に詳細に説明するために実施例を挙げるが、
これは本発明を制限するものではない。

実施例１　モノクローナル抗体ＹＢＹ０８８の生産 乳癌と診断されている患者から得たリンパ節リンパ球を
解凍し、１０％ウソ胎児血清（Ｆ’ＢＳ）を含有するＲ
ＰＭＩｉ６４０［フロー・ラボラトリーズ（Ｐ　ｌｏｗ
　Ｌ　ａｂｏｒａＬｏｒｉｅｓ）、アレキザンドリア、
ＶＡＩで一夜培養した。リンパ球（３０ｘｌＯ°個）と
Ｐ　３／ＨＴ（３０Ｘ　ｌ　０８個）［マウス骨髄腫細
胞系Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣＣ１２，Ｌ　
　ｌ５８０）の繁殖系統］を、無血清ＲＰＭＩ−７．５
％ジメヂルスルホキンド中の３５％ポリ、エチレングリ
コール−１０００を用いて融合させた。ＲＰＭｌ−１０
％ＦＢＳ−ＨＡ’ｒ（］　０−　’Ｍヒボギザンヂン、
４．ｘｌＯ−７Ｍアミノプテリン、及び１゜６ｘｌＯ−
５Ｍデミジン）中、９６−ウェル（ｗｅｌｌ）平板「コ
スタ−（Ｃｏｓｖｅｒ）ケンブリッジ、ＭＡ、］の１個
のウェル毎に全細胞一度１０５個にて細胞をプレートし
た。培養を５％ＣＯ２雰囲気下で２週間行い、その後１
週間に１回上清を新鮮なＨＡ　Ｔ培地と交換した。４０
日目位増殖培養物のウェルから」二清をサンプリングし
、同相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって免疫グロ
ブリン（Ｉｇ）の存在を試験した。

次いで、ＥＬＩ　ＳＡによってＩｇ−産生クローンを乳
癌由来の膜及びザイトゾルとの特異的反応性に関してス
クリーニングした。モノクローナル抗体、ＩｇＭ抗体を
ＹＢＹ　０８８と命名し、更に本発明に係る抗原の特徴
付けに使用するために特性決定及びその選別を行った。

聚鼾鯉ん　抗原の特徴付は モノクローナル抗体ＹＢＹ０８８を使用し、本明細書に
て述べた方法によって本発明の抗原の特徴イ」けを行っ
た。

ヒト組織の膜及びサイドシルの分画を使用し、モノクロ
ーナル抗体の反応性をスクリーニングすることによって
抗原の特徴イマ１けを行った。尚、ヒト組織の膜及びザ
イトゾルの分画は下記のごとくに調製した； 死後１０時間以内に外相的に採取した解剖検体を切断し
、−８０℃にて保存した。ダウンス粉砕器（Ｄｏｕｎｃ
ｅ　ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）を用い、組織を４容量の
１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７，６．２ｍＭ塩化カルシウ
ム、２ｍＭフェニルメチルスルホネート（ホモジネート
用緩衝液）中にて４℃でホモジネートした。一連の工程
は全て４℃に於いて行った。ホモンネ＝１・を遠心分離
（］００ｘ４，５分間）にかけ、細胞核と無傷の細胞を
取り除いた。」二清を取り出し、遠心分離（１３０，０
００Ｘ４．１時間）にかけた。この高速遠心分離によっ
て得られた上清を取り除き、これをザイトゾル分画と命
名した。

このペレットを１容量のホモジネート用緩衝液に再懸濁
し、１０ｍＭ１・リスー塩酸叶Ｉ７．２中の４０％／２
０％不連続型シヨ糖グラジェントに重２Ｌ一 層した。グラジェントを遠心分離（１３０，０００×９
．１７時間）にかげた。４０％／２０％中間期の物質を
ピペットを用いて取り出し、ホモジネート用緩衝液を用
いて５倍容量に希釈し、遠心分離（２６．０ＯＯＸＩ？
、６０分間）にかけた。得られたペレットをホモジネー
ト用緩衝液に再懸濁し、標本化して一８０℃で保存した
。

膜／ザイトゾルＥＴ、ＴＳＡ汰 ヒト正常組織並びにヒト腫瘍組織の精製膜及びザイトゾ
ル分画中にモノクローナル抗体ＹＢＹ　０８８と反応す
る抗原が存在するか否かを固相酵素免疫測定法（ＥＬＭ
ＥｉＡ）によって検定し、４９０ｎｍに於ける吸光度を
測定した。

膜／ザイトゾルＥＬＩＳＡを実施するために、前記のよ
うに調製したザイ［・ゾルＩＯμｇ／ウェル又は膜２１
１ｇ／ウェルを平底マイクロリットル平板（グイナテッ
ク（Ｄ　ｙｎａｔｅｃｈ）、アレキザンドリア、ＧＡ）
ｌで３７°Ｃにて一夜乾燥させた。得られた平板を冷水
道水を用いて３回洗浄した。２０％ウマ血清のＰＢＳ（
リン酸緩衝生理食塩水）（０゜１５Ｍ　ＮａＣＬ　　２
０ｍＭ　リン酸ナトリウムｌ）　ｌ−１７２）溶液５０
μθを加えた後、ハイブリト−マ−１−清５０μσを加
え、室温にて１時間インギュベートシた。洗浄した後、
５％ウマ血ｉｐｆ　−Ｐ　Ｂ　Ｓで１：ｌ０００に希釈
したモノクローナル・マウス抗−ヒｌ−ｒｇＭ−１−Ｉ
ＲＰコンジコゲ−１・体［ウィルソン（Ｗｔｌｓｏｎ、
Ｍ、Ｂ、）及びナヵネ（Ｎａｋａｎｅ、　Ｐ　、Ｋ　。

）、エルセピア−・ノース・ホーランド・バイオメディ
カル、プレス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１
ｌａｎｄＢ　ｉｏｍｅｄｉｃａｌ　　Ｐ　ｒｅｓｓ、　
　Ｉ　９７８　）の方法によってコンジュゲートしたＺ
ＳＡＧ　Ｉ　１．ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｌ＋ｅｉｍ）、インディアナポ
リス、ＩＮＸ　１９８５／８６　ツノタ［１グ＃０９５
２］１００μρとともにラボ刀しを１時間インキュベー
トした。結合した酵素をｌμｇ／ｘρｏ−７、：ｒ−ニ
ー　１／　ンジアミン、０．０３％ＴＩ’、Ｏ７の０．
１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ５、０溶液（１００μ
ｇ）との暗所に於ける３０分間インギコベートにょって
検出した。ウェル毎にＮＨ，５Ｑ４（５０μρ）を加え
てウェルをクエンチした。グイナテックＥＬＩＳＡ平板
測定器にて４．９０　ｎｍに於ける吸光度を測定した。

全ての分析は、０４Ｄ、値１０〜２０の値を常に示し、
各ＥＬＩＳΔの測定値を正規化するデータを提供するポ
ジティブコントロールを組み込んで行った。

後記の第１表に示すように、ＹＢＹ０８８は乳癌の膜分
画、４（２びに乳房、結腸、腎、肺、肝、脳、前立腺、
及び膵組織などの各種の正常組織のザイトゾル分画と反
応した。このようにして、本発明の抗原が乳癌の膜及び
多くの良性組織のザイトゾル内に存在することが確認さ
れる。第１表に示すように、本発明の抗原は、結腸、腎
、肺、肝、前立腺、脳、及び膀胱などの他の正常組織の
膜とは関連性がない。しかし、ＹＢＹ０８８の比較的弱
い反応が、正常乳房及び膵組織の膜分画並びに結腸腫瘍
の粘膜に於ける膜内で認められることから、比較的低濃
度であるが本発明抗原が該組織の膜に存在することが確
認される。

坑■ｐ廻■ＶＬ分析− Σ分梶 ＹＢＹ０８８によって特徴付（づられる抗原の分子量及
び生化学的性質を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動（Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ）及びウェスター
ン免疫プロット分析によって検定した。

この実施例では、ヒト乳房細胞系、Ｔ４．７Ｄ（Ｒ、ブ
ルベツコ、ザルク・インスヂヂコ−１（Ｒ，ＤｕＩｂｅ
ｃｃｏ、　Ｓ　ａｒｋ　Ｉ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、ＡＴ
ＣＣＨＴＢ＋３３）を用い、抗原の分子量及び生化学的
性質を検定し、以下のようにして調製した。オートクレ
ーブ処理できるＭＥＭ［アーヴイン・ザイエンテッフィ
ク（Ｉ　ｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、アーヴ
インヵルフォルニア］中で培養し、８％ウマ血清−２％
ウシ胎児血清を加えたＴ４７Ｄ細胞単層物を、ＰＢＳ中
で３回すすぎ、ゴム冠ポリスマンを用いてフラスコから
こずり取り、ＰＢ、Ｓ中に於ける遠心分離によって洗浄
した。洗浄した細胞を下記の緩衝液のいずれかに約２０
ｘｌＯ６個／πρの割合にて再懸濁した。

（１）０．５％ＮＰ４０−０．５％デオキシコール酸−
５ｍＭＥＤＴΔ−１００ｍＭ）−リス［）Ｈ８，０、伎
び （２）２％５ＤＳ−０，１２５Ｍ　　＋−リスｐＨ６，
８６細胞懸濁液を音波分解し［ヒート・システムズ（Ｈ
ｅａｔ　Ｓ　ｙｓｔｅｍｓ、ウルトラソニック　Ｉｎｃ
、、Ｗ−３７５型）］、１３０，０００ｘｈにて３０分
間気体を飛散させた［ベックマン（Ｂ　ｅｃｋｍａｎ）
、ボロアルタ、ＣＡ］。

前記のごとく調製したＴ４４Ｄエキス（２５７１ｇ）を
ゲル試料緩衝液（０，１２Ｍトリスｐｒ−ｒｅ、ｓ、４
％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．００２％ブロモフ
ェノールブルー、５％２−メルカプトエタノール）中に
溶解し、３％重層ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ　ｇｅｌ）を
入れた７、５％又は１０％ゲル」二、不連続Ｓｉ）　Ｓ
　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　［レムリ（Ｌ　ａｅｍｍｌ　ｉ）
、Ｕ、に、、ネイチャー２２７：６８０−６８５、＋９
７０１によって分離した。

トービン（Ｔｏｗｂｊｎ）らの方法［ＰＮＡＳ、７６４
３（］　９７９）］に従って、分離したタンパク質を２
００ｍＡで３時間電気泳動にかけ二ｌ・ロセルロース［
０，１ｍ、　ンコレインヤー及びシ２．−ル（Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ＆　Ｓ　ｃｈｕｅｌ　Ｉ）　Ｉ　ｎｃ、　
、キーン、ニコーハンブンヤー１まで移動させた。次い
で、ニトロセルロース・レプリカ（複製物）を３％ラウ
ン清アルブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳとともに３０分間イ
ンキュベートした後、５％脱脂乳−０，００１％チメロ
ザールー０．１％消泡性エマルジョンＡ［シグマ・ケミ
カルＣｏ、（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）
、セント・ルイス、ＭＯ］を用いてＩｌｌに希釈したハ
イブリドーマ上清とともに一夜、袋枠を施した中でイン
キュベートした。ニトロセルロースのストリップ（小片
）をＰＢＳ−０，１％トウィーン（１″ｗｅ、ｅｎ）を
用いて、緩衝液を５回替えて３０分間洗浄し、１２５■
−標識したヤギ抗ヒ）ｉｇＭ［タボ（Ｔａｇｏ）、バー
リンガム、ＣＡ］、５００．０００ｃｐｍ／ｍｌ脱脂乳
試薬とともに２時間インキュベート−した。ＰＢＳ−０
，１％トウィーンを用いて洗浄した後、ニトロセルロー
スのストリップを風乾し、増感スクリーン［クロネック
ス・デコボン・ライトニング・プラス（Ｃｒｏｎｅｘ　
Ｄｕｐｏｎｔ　Ｌｉｇｂｔｎｉｎｇ　Ｐｌｕｓ）］を用
い、−７０℃でＸ−線フイルム［コダック（Ｋｏ（ｌａ
ｋ）ＸΔＲ−５１に１８−７２時間感光させた。

抗原の生化学的性質を調べるために、５ＤＳ−ＰＡＧＥ
とウェスターン免疫プロット分析を行う前に、抗原に下
記の破壊処理を施した。

（ａ）ＰＡＧＥ前の過ヨウ素酸塩酸化：Ｔ４７Ｄ細胞系
の試料をＰＢＳ（ｐＨ７，４，）中、５０ｍＭＮａ１Ｏ
，になる様に調節し、０℃にて１時間インキュベートシ
た。あるいは、試料を５０ｍＭ酢酸すトリウム（＋）Ｈ
４，、５）中、Ｉ　ＯｍＭ　Ｎａｌ　Ｏ，に調節し、Ｏ
′Ｃにて１時間インキコベートした。

（ｔ＋）ＰＡｃＥによる分別後の過ヨウ素酸塩酸化：Ｔ
　４７　Ｄ細胞系の試料をまず、ＰＡＧＥによって分別
し、続いてウェスターン・プロット法によりニトロセル
ロース紙に固定化した。ニトロセルロース・ストリップ
をｌ　ＯｍＭ　Ｎａ　Ｉ　０４．５０ｎ＋Ｍ酢酸すトリ
ウム（叶■４５）中にて１時間、４℃でインキュベート
した。インキュベ−１・した後、得られた処理済みスト
リップを５０ｍＭ　ＮａＢＨ，中で室温にて３０分間イ
ンキュベートし、次いで免＝２７− 疫染色の前にＰＢＳを用いて３回洗浄した。

（Ｃ）弱アルカリ酸化　タンパク質から〇−結合炭水化
物を取り去るために、Ｔ４７Ｄ細胞系の試料を０．ＩＮ
　ＮａＣ１になる様に調節し、室温にて１８時間インキ
ュベー１−　Ｌ、た。電気泳動を行うための試料緩衝液
を加える前に、ｌＮＨＣｌを用いてＩ）Ｈを７．４にし
た。あるいは、（ｂ）に記載のようにニトロセルロース
・ストリップに固定化された抗原を室温にて１８時間、
０．ｌＮＮａＯＨを用いて処理した。免疫染色の前に、
ＰＢＳ−０゜１％トウィーンを用いて３回洗浄した。

（ｄ）ノイラミニダーゼ消化：Ｔ４．７Ｄ細胞系の試料
をＩ　ＯＯｍＭ　ＨＯＡｃを用いてＩ）Ｉ４５に調節し
、ノイラミニダーゼ［カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈ
ｅｍ）］を最終濃度０．１単位／Ｍρまで加えた。試料
を３７℃にて１時間インキコベートし、５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ試料緩衝液を加えた後、１００℃にて５分間加熱して
その消化反応を停止させた。

（ｅ）エンドグルコンダーゼＦ消化：エンドグルコシダ
ーゼＦをエルダー及びアレキザンダ−［Ｅｌ−２８＝ ｄｅｒ＆Ａ］ｅｘａｎｄｅｒ、ＰＮＡＳ　　７９：４５
４．０（１９８２）］の方法によって調製した。酵素を
含有している分画をプールし、５０％グリセロール中、
−２０℃にて保存した。Ｔ４７Ｄ細胞系の試料を、０．
０５Ｍ　ＥＤＴＡＸ　１％ＮＰ−４，０，０，１％ＳＤ
Ｓ及び１％　２−メルカプトエタノールを含有するＯ、
１Ｍリン酸緩衝液（ｐ１４６．１）を用いて最終審ｆｉ
４０−８０μｇまで希釈した。この試料を２分間煮沸し
、冷却してエンドグルコシダーゼＦを加えた（　１　：
　５　（ｖ：ｖ））。試料を３７℃にて一夜インキコベ
ートし、５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を加えた後、１０
０℃にて５分間加熱することによりこの反応を停止させ
た。

（ｆ）プロテイナーゼに消化：抗原を含有する試料を、
プロテイナーゼＫ（シグマ、■型）で処理した（４０μ
ｇの酵素／試料を加えた）。消化処理を３７℃で１時間
行い、５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を加えた後、１．　
Ｏ０℃にて５分間加熱することによりこの反応を停止さ
せた。

全ての反応は、ゲル試料緩衝液を加えることにより停止
させた。

Ｔ４７Ｄ乳房細胞系のＳＤＳ抽出エキスを５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ法及びウェスターン免疫プロット分析することによ
って、抗原は、約６８，０００〜約ｓ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ
、約４０，０００〜約４８，０００、約２８，０００〜
約３２，０００、及び約１６，０００〜約１９，０００
の範囲の分子量成分であることが確認された。他方、Ｔ
４７Ｄ乳房細胞系の非イオン性洗浄剤抽出エキスを使用
すると、抗原成分の分子量は、約２８，０００〜約３２
，０００、及び約１６，０００〜約１９，０００の範囲
であると確認された。抗原を化学的及び酵素的に修飾し
、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスターン免疫ブロツ）・分
析することにＪ−リ、抗原のタンパク質的性質が明らか
になった。具体的にいうと、抗原のＹＢＹ０８８との反
応性は、抗原をプロテイナーゼにで処理することにより
崩壊し得ることが確認された。

前述した別の修飾法によっては抗原のＹＢＹ０８８との
反応性は崩壊されなかった。

等電点分画電気泳動法２次元ゲル電気泳動法本質的にオ
ーファレール［０°Ｆ　ａｒｒｅｌ　Ｉ、　Ｐ　、　Ｈ
，１，１，Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　２５０＋４００７
−４０２１、＋９７５］の方法に従い、Ｔ　４．７　Ｄ
細胞の洗浄剤抽出エキス又は尿素抽出エキスを用いて、
２次元ゲル分析を行った。ｐＩ−１３，５−９，５アン
ホリン（ａｍｐｈｏｌ　１ｎｅｓＸＬ　Ｋ　Ｂ　）を入
れた等電点分画電気泳動用管ゲルを１５分間２００ボル
ト、３０分間３００ボルト及び３０分間４００ボルトで
電気泳動した後、３００ボルトで１６時間電気泳動にか
けた。

Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅでの２次元分離は、５−
１５％ゲル」二で行った。次いで、既述した方法でニト
ロセルロースへの電気的プロットを行い、免疫染色分析
を行った。

この技法による抗原の等電点分画電気泳動により、各抗
原の分子量成分について、約ｐＨ８、０〜約１）Ｈ８，
８、約ｐＨ６．２〜約１１、）Ｈ６．８、約ｐｒ−ｒｅ
。

２〜約ｐｒ−ｒｅ、ｓ、及び約ｐＨ８，０〜約叶１８．
８の範囲の等電点が確認された。

乳脂肪球状膜との抗体反応分析 本発明に係る抗原がヒト母乳に検出されるか否かを調べ
るために、以下に記載の標準的方法によってＹＢＹ　０
８８のヒト乳脂肪球状膜との反応性を評価した。

ヒト乳脂肪球状膜目下記のように調製した。ヒト母乳を
１０，０ＯＯｘ４にて１５分間遠心分離した。遠心管の
上部に浮遊したクリームを回収し、１ｍＭ　ＭｇＣ］ｔ
と０．２８Ｍンヨ糖を含有させた００１Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐｒ−ｒ７．５）に懸濁した。

この懸濁液を再度、遠心分離し、洗浄したクリームを０
．０５Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に再懸濁し
た。洗浄した乳脂肪球状膜をブリンクマン・ポリｌ−ロ
ン（Ｂ　ｒｉｎｋｍａｎ　ｐｏｌｙｔｒｏｎ）を用いて
１０．００ＯｒｐｍにてＩＯ分間ポモジネートシた。ｌ
・リグリセリドが癒着するのに十分な３７°Ｃｌ２Ｏ分
のインキュベートの後、懸濁液をＩ　０６．０００×９
で１時間３７°Ｃに於いて遠心分離にかけた。

ペレット状の乳脂肪球状膜を、ＩＴＩＭＰＭＳＦを含有
した水冷０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８０）中に、
タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌで懸濁した。

上記のように調製したヒト乳脂肪球状膜２５μｇを用い
、本質的に」二記のような５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェス
ターン免疫プロット分析を行った。

ｔｆｒｔ　’Ｉｔ　６分との抗体反応分析本発明の抗原
が血液成分と関連性を示すか否かを調べるために、ＩＯ
ｏｏｒｐｍで５−８分間各々２回遠心分離１７たリンパ
球、赤血球細胞、骨髄細胞などの血液成分と、ＹＢＹ　
０８８との反応性を評価した。この操作により得られた
プラズマを捕集し、２００　Ｏｒｐｍで４−６分間遠心
分離して血小板をペレットにし、その血小板を約等容量
のプラズマに再懸濁した。パフィコート層（軟層）も捕
集し、］０００ｒｐｍで４−６分間各々２回遠心分離し
、リンパ球を得た。０．８３％塩化アンモニウム−０，
１４％重炭酸カリウム−０，０５ｍＭＥＤＴＡ　ｐＨ７
，３（Ｉ　Ｏ−１２ｍりをペレットに加え、５分間イン
キュベートして、Ｉ　０００　ｒｐｍで４−６分間再び
遠心分離した。得られたペレットを１度洗浄し、最終濃
度４０００万個／ｍｌでＲＰＭｌ−１０％ウシ胎児血清
中に再懸濁した。赤血球も最終濃度４０００万個／ｍｌ
でＲＰＭＩ−１０％ラン胎児血清中に再懸濁した。

ヒト抗体上清（５０μのを９６−ウェル・マイクロタイ
ター平板に分配した後、細胞懸濁液２５μＱ（細胞数１
００万個）も同様に分配し、４℃にて３０分間インキュ
ベートした。遠心分離によってＰＢＳを用いて細胞を３
回洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＭ−ＦＩＴＣコンジュゲート
５０μρ［タボ（Ｔａｇｏ）、バーリンガム、ＣＡ］と
ともに４℃にて３０分間インキュベートした。前回同様
、細胞を再び洗浄し、１％ポルマリン（０，５−１，０
ｍ１）を入れた管に移し、蛍光励起細胞分離捕集装置に
よる分析を行った。

前記の分析により、ＹＥＹ０８８はヒト乳脂肪球状膜、
又はリンパ球、赤血球細胞、骨髄成分及び血小板などの
血液成分とは、特異的に反応しないことが確認された。

故に、本発明により特徴付けられる抗原は、ヒト乳中に
は検出されず、血液成分とは関連性のない抗原である。

第１表 木下記の百分率（％）を表す ＯｌＤ、４９ｏｎｍ被検抗体

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト組織から得られる抗原であって、約６８，００
   ０〜約８０，０００、約４０，０００〜約４８，０００
   、約２８，０００〜約３２，０００、及び約１６，００
   ０〜約１９，０００の範囲の分子量成分を有し、該分子
   量成分に関して約ｐＨ８．０〜約ｐＨ８．８、約ｐＨ５
   ．２〜約ｐＨ５．８、約ｐＨ６．２〜約ｐＨ６．８、及
   び約ｐＨ８．０〜約ｐＨ８．８の範囲の等電点を有する
   タンパク質として特徴付けられる該抗原。 ２、各分子量成分に関してそれぞれ約ｐＨ８．４、約ｐ
   Ｈ５．５、約ｐＨ６．５、及び約ｐＨ８．４に等電点ピ
   ークを有する第１項に記載の抗原。 ３、モノクローナル抗体ＹＢＹ０８８と反応する少なく
   とも１つの抗原決定基を有する第１項又は第２項に記載
   の抗原。 ４、抗原のモノクローナル抗体ＹＢＹ０８８との反応性
   を、該抗原をプロテイナーゼＫと処理することにより崩
   壊し得る第３項に記載の該抗原。 ５、関連抗原が乳癌によって発現される腫瘍関連抗原で
   ある第１項から第４項のいづれかに記載の抗原。 ６、第１項から第５項のいづれかに記載の抗原に対し反
   応性を有する抗体。 ７、モノクローナル抗体である第６項に記載の抗体。 ８、乳癌によって発現される腫瘍関連タンパク質と反応
   する第７項に記載のモノクローナル抗体。 ９、約６８，０００〜約８０，０００、約４０，０００
   〜約４８，０００、約２８，０００〜約３２，０００、
   及び約１６，０００〜約１９，０００の範囲の分子量成
   分を有し、該分子量成分に関して約ｐＨ８．０〜約ｐＨ
   ８．８、約ｐＨ５．２〜約ｐＨ５．８、約ｐＨ６．２〜
   約ｐＨ６．８、及び約ｐＨ８．０〜約ｐＨ８．８の範囲
   の等電点を有する腫瘍関連タンパク質と特異的に反応す
   るモノクローナル抗体。 １０、ＹＢＹ０８８である第９項に記載のモノクローナ
   ル抗体。 １１、雑種細胞系ＡＴＣＣ　ＨＢ９０７６によって生成
   されるモノクローナル抗体。 １２、モノクローナル抗体ＹＢＹ０８８。 １３、雑種細胞系ＡＴＣＣ　ＨＢ９０７６。 １４、診断的に又は薬学的に許容できる希釈剤とともに
   、第６項から第１２項のいづれかに記載の抗体を含有す
   る診断用又は治療用製剤。 １５、癌の疑いのある患者から得た組織検体又は体液試
   料を第１項から第５項のいづれかに記載の抗原と接触さ
   せることからなる該患者に於ける癌をインビトロに於い
   て検出並びに診断する方法。