DE3784364T2

DE3784364T2 - Tumorassoziiertes antigen.

Info

Publication number: DE3784364T2
Application number: DE8787303195T
Authority: DE
Inventors: Karen Gray Burnett; Lana Suzanne Grauer; Esther Hui-Yim Oh
Original assignee: Hybritech Inc
Current assignee: Hybritech Inc
Priority date: 1986-04-17
Filing date: 1987-04-13
Publication date: 1993-07-22
Anticipated expiration: 2007-04-14
Also published as: ATE86261T1; EP0242154A2; GR3007245T3; EP0242154B1; JPS62270598A; AU5752490A; EP0242154A3; AU7144787A; DE3784364D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Charakterisierung von Antigenen, speziell tumorassoziierten Antigenen. Zusätzlich betrifft sie Antikörper, die eine spezifische Reaktivität mit diesen Antigenen aufweisen. Darüberhinaus betrifft sie Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper und diagnostische sowie therapeutische Anwendungen hierfür.
Die potentielle Rolle von monoklonalen Antikörpern bei der Diagnose und Behandlung von Krebs beim Menschen befand sich in letzter Zeit im Mittelpunkt von Untersuchung und Spekulation. Von speziellem Interesse ist ihre Anwendung in Immunoassays, um den Verlauf der Krebserkrankung, z.B. während einer Therapie, detektieren und überwachen zu können. Ebenfalls von speziellem Interesse sind die potentiellen Anwendungen von monoklonalen Antikörpern bei der Abbildung und Therapie von Tumoren durch ihre Fähigkeit, tumorassoziierte Antigene in vivo zu binden.
Entwicklungen in der Technologie der monoklonalen Antikörper ermöglichen es, die Komplexität der Antigene der humanen Tumoren zu untersuchen. Die präzise Immunoreaktivität von monoklonalen Antikörpern erlaubt die spezifische Identifizierung und Differenz jerung von Antigenen, die von humanen Tumoren exprimiert werden. Deswegen stellt die Charakterisierung solcher verschiedener tumorassoziierter Antigene durch ihre Reaktivität mit bestimmten monoklonalen Antikörpern ein Mittel dar, um die Technologie der monoklonalen Antikörper noch vollständiger bei der Krebsdiagnose und Krebstherapie auszunutzen.
Merkwürdigerweise werden bestimmte Antigene, obwohl sie von humanen Tumorzellen exprimiert werden, auch von normalen Zellen exprimiert. Folglich werden diese Antigene nicht als tumorspezifisch aber als tumorassoziiert bezeichnet. Der diagnostische und therapeutische Wert solcher tumorassoziierter Antigene ergibt sich aus der überwiegenden Menge an auf Tumorzellen exprimiertem Antigen im Verhältnis zu normalen Zellen und zusätzlich durch die Selektivität der Antikörper in vivo gegenüber durch Tumorzellen exprimiertem Antigen verglichen mit normalen Zellen. Die relative Selektivität von in vivo verabreichten Antikörpern gegenüber Antigen, das von Tumorzellen exprimiert wird dürfte (1) von der erhöhten Antigenexpression der Krebszellen aufgrund des veränderten und schnellen Stoffwechsels von malignen Zellen und (2) der besseren Zugänglichkeit der Antigene des Tumorgewebes für Antikörper aufgrund des Verlusts von Abgrenzungseigenschaften der Tumorzellmembranen herrühren.
Zur Zeit ist nur eine geringe Anzahl an tumorassoziierten Antigenen gut charakterisiert. Zusätzlich können bestimmte tumorassoziierte Antigene, die als diagnostische oder prognostische Marker brauchbar sind, nicht bei allen Patienten oder bei allen Stadien und Erscheinungsformen der Krankheit vorhanden sein. Diagnostische Unterscheidung und therapeutische Wirksamkeit werden deswegen durch die Identifizierung und Charakterisierung von mehr als einem tumorassoziierten Antigen, das vom gleichen Tumorgewebe exprimiert wird, gesteigert. Weiterhin ist es für die Zwecke der Krebsdiagnose und Krebstherapie wünschenswert, auf einen Satz oder ein Feld von unterschiedlichen Antigenen, die mit bestimmten Arten von humanen Tumoren verbunden sind, zurückgreifen zu können. Folglich besteht ein Bedarf zur weiteren Identifizierung und Charakterisierung von einzigartigen tumorassoziierten Antigenen.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Charakterisierung eines neuartigen Antigens, das im humanen Gewebe, speziell im Brustkarzinom, vorkommt. Folglich richtet sich die Erfindung auf ein bestimmtes tumorassoziiertes Antigen, das zumindest durch seine Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper YBY088 charakterisiert ist.
Ebenfalls werden gemäß dieser Erfindung Antikörper mit einer Spezifität für das Antigen der Erfindung und Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper bereitgestellt. Zusätzlich richtet sich die Erfindung auf die Verwendung solcher Antikörper zur Detektion von Krebs und zur Überwachung des Verlaufs des Krankheitszustands mit immunohistochemischen Verfahren und Immunoassays. Die Erfindung richtet sich im weiteren auf die Verwendung solcher Antikörper zur in vivo Diagnose und Behandlung von Krebs beim Menschen.
Die vorliegende Erfindung liefert, wie oben erwähnt, ein neues tumorassoziiertes Antigen. Gemäß dieser Erfindung wird der monoklonale Antikörper YBY088 für die Charakterisierung dieses bisher noch nicht beschriebenen Antigens verwendet. Der monoklonale Antikörper YBY088 wird durch eine Hybridzellinie erzeugt, die bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, hinterlegt wurde (16. April 1986). Proben können mit Bezug auf die dem Zelliniendepot zugewiesene Hinterlegungsnummer HB9076 frei bezogen werden.
Die physikochemischen und immunologischen Eigenschaften des Antigens der vorliegenden Erfindung und speziell seine Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper YBY088 erlauben seine Charakterisierung und Unterscheidung von anderen Antigenen, die im normalen Gewebe und im Tumorgewebe vorkommen. Folglich sind die identifizierenden Merkmale und Eigenschaften des durch die Erfindung bereitgestellten Antigens folgende:
(a) Das Antigen ist in humanen Brustzellinien, speziell der T47D Brustzellinie (ATCC HTB 133) vorhanden.
(b) Das Antigen ist eine Membrankomponente von Brustkarzinomen. Enzym-gebundene Immunosorbent Bindungsassay Standardverfahren (ELISA) zeigen bei Verwendung des monoklonalen Antikörpers YBY088 das Vorkommen des Antigens in relativ niedrigeren Konzentrationen in Plasmamembranen an, die aus normalen Brust- oder Pankreasgewebe gereinigt wurden. Im Vergleich weist YBY088 keine merkliche Reaktion mit Membranen auf, die aus gutartigen Geweben, wie Dickdarm-, Leber-, Niere-, Lunge-, Prostata- und Harnblasengewebe, gereinigt wurden.
(c) Das Antigen wird im Cytosol von einer Vielzahl von normalen Geweben und Brustkarzinomen gebildet. Wie durch ELISA- Techniken gezeigt werden kann, reagiert YBY088 mit Cytosol, das aus gutartigen Geweben aus Brust, Dickdarm, Leber, Niere, Lunge, Prostata, Gehirn und Bauchspeicheldrüse gereinigt wurde, genauso wie mit Tumorgeweben, wie Brustkarzinom, Dickdarmkarzinom und der Mukosa von Dickdarmkarzinom.
(d) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western Immunoblot Analyse mit SDS Extrakten von der humanen Brustzellinie T47D zeigen, daß YBY088 mit den Molekulargewichtskomponenten des Antigens in den Bereichen von etwa 68 000 bis etwa 80 000, etwa 40 000 bis etwa 48 000, etwa 28 000 bis etwa 32 000 und etwa 16 000 bis etwa 19 000 reagiert. Alternativ dazu zeigen SDS-PAGE und Western Immunoblot Analyse mit Extrakten nicht ionischer Detergenzien der humanen Brustzellinie T47D, daß YBY088 mit Molekulargewichtskomponenten in den Bereichen von etwa 28 000 bis etwa 32 000 und etwa 16 000 bis etwa 19 000 reagiert. Modifizierung des Antigens durch zerstörende Behandlungen vor der SDS-PAGE und Western Immunoblot Analyse demonstriert, daß das Antigen gegenüber Behandlung mit Proteinase K empfindlich ist. Folglich ist dadurch die Proteinbeschaffenheit des Antigens gezeigt, weil die Reaktivität des Antigens mit YBY088 durch Behandlung mit Proteinase K zerstört wird.
(e) Isoelektrische Fokussierung des Antigens mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese zeigt, daß das Antigen isoelektrische Punkte bezüglich der Molekulargewichtskomponenten des oben genannten Antigens in den Bereichen von etwa pH 8,0 bis etwa pH 8,8, etwa pH 5,2 bis etwa pH 5,8, etwa pH 6,2 bis etwa pH 6,8 und etwa pH 8,0 bis etwa pH 8,8 aufweist. Genauer gesagt liegen die isoelektrischen Maximalwerte bei etwa pH 8,4, etwa pH 5,5, etwa pH 6,5 und etwa pH 8,4.
(f) Das Antigen ist nicht in humaner Milch detektierbar. Durch SDS-PAGE und Western Immunoblot Analyse findet sich keine detektierbare Reaktivität von YBY088 mit den Membranen der Milchfetttröpfchen.
(g) Das Antigen ist nicht mit Blutbestandteilen verbunden. Durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsorter Analyse (FACS) findet sich keine detektierbare Reaktivität von YBY088 mit Blutbestandteilen, einschließlich Lymphozyten, roten Blutkörperchen, myeloischen Bestandteilen und Blutplättchen.
Zusammengefassend ist das erfindungsgemäße Antigen, das von Ausgangsmaterialien wie Membranen oder Cytosol stammt, die aus normalem humanem Gewebe oder Tumorgewebe gereinigt worden sind, dadurch gekennzeichnet, daß es seiner Beschaffenheit nach ein Protein ist und Molekulargewichtskomponenten in den Bereichen von etwa 68 000 bis etwa 80 000, etwa 40 000 bis etwa 48 000, etwa 28 000 bis etwa 32 000 und etwa 16 000 bis etwa 19 000 aufweist. Zusätzlich ist das Antigen dadurch gekennzeichnet, daß es bezüglich der Molekulargewichtskomponenten des Antigens isoelektrische Punkte in den Bereichen von etwa pH 8,0 bis etwa pH 8,8, etwa pH 5,2 bis etwa pH 5,8, etwa pH 6,2 bis etwa pH 6,8 und etwa pH 8,0 bis etwa pH 8,8 aufweist. Weiterhin kommt das tumorassoziierte Protein der vorliegenden Erfindung im Cytosol einer Vielzahl von normalen Geweben und Tumorgeweben vor und wird in der Membran von Brustkarzinomen exprimiert.
Von spezieller Bedeutung in der Unterscheidung des Antigens der vorliegenden Erfindung von anderen Antigenen, einschließlich anderer tumorassoziierter Antigene, ist die Spezifität des monoklonalen Antikörpers YBY088 für mindestens eine Determinante des Antigens. Die spezifische Reaktivität von YBY088 für das durch die Erfindung beschriebene Antigen stellt ein Mittel zur Isolierung und Reinigung des Antigens von anderem Material humanen Ursprungs dar und zu guter Letzt auch für die Charakterisierung der genauen Antigendeterminanten, die das Antigen umfaßt. Ein solches gereinigtes Antigen und dessen Determinanten sind bei der Produktion von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern unter Verwendung im Fach gut bekannter Techniken für diagnostische und therapeutische Anwendungen brauchbar. Zum Beispiel können Maus-Hybridomazellen erhalten werden, die direkt gegen das Antigen gerichtete monoklonale Antikörper bilden. Zusätzlich kann das Antigen und dessen Determinanten zur Erzeugung monoklonaler Antikörper verwendet werden, die gegen andere Moleküle als das Antigen der vorliegenden Erfindung gerichtet sind und eine spezifische Determinante oder Determinanten mit dem hierin beschriebenen Antigen gemeinsam haben. Dies ist speziell dann nützlich, wenn bestimmte Antigene oder deren Determinanten während verschiedener Stadien oder Erscheinungsformen eines Krankheitszustandes verschieden exprimiert werden. Alternativ dazu kann das Antigen benutzt werden, um eine Immunantwort in einem Kanninchen, Ziege oder anderem Tier hervorzurufen, von dessen Serum polyklonale Antikörper erhalten werden können. Weiterhin kann das Antigen zur Charakterisierung von interessanten Antikörpern verwendet werden, wie monoklonaler Antikörper oder Antikörper, die in humanem Gewebe, Blut oder anderen Körperflüssigkeiten vorkommen.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden monoklonale Antikörper, die Spezifität für das hierin beschriebene Antigen aufweisen und Verfahren zu deren Herstellung bereitgestellt. Vorzugsweise gehören solche monoklonale Antikörper der IgG-Klasse an und besitzen eine Immunoreaktivität mit dem tumorassoziierten Protein der vorliegenden Erfindung, die im wesentlichen der des monoklonalen Antikörpers YBY088 gleicht. Solche monoklonalen Antikörper sind zur Detektion, Diagnose und Behandlung von Krebs beim Menschen, speziell Brustkarzinomen, nützlich. Weiterhin besitzen solche Antikörper Anwendungsmöglichkeiten in der weiteren Isolierung und Reinigung des von der Erfindung bereitgestellten Antigens und der Charakterisierung von genauen Deterininanten.
Wie oben beschrieben werden monoklonale Antikörper normalerweise nach dem von Köhler und Milstein, Nature 256, 495-497 (1975) beschriebenen Verfahren hergestellt. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird eine Maus oder ein anderer geeigneter Wirt mit der löslichen Fraktion des gereinigten Antigens der Erfindung oder der löslichen Fraktion von humanem Tumorgewebe, das von einem Brustkarzinom stammt, immunisiert. Anschließend an die Immunisierung werden die Milzzellen der immunisierten Maus mit den Zellen einer geeigneten Maus-Myelomlinie fusioniert, um eine Mischung von Hybridzellinien zu erhalten. Die Hybridzellinien werden in einem geeigneten Medium kultiviert und danach Hybridzellinien selektioniert und kloniert, die einen Antikörper bilden, der eine spezifische Reaktivität mit dem hierin beschriebenen Antigen aufweist, und der gebildete Antikörper wird gewonnen.
Deshalb wird in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper bereitgestellt, das gekennzeichnet ist durch:
(a) Immunisieren eines Wirts mit der löslichen Fraktion eines humanen Tumorgewebes, das von einem humanem Brustkarzinom stammt oder einem Antigen, das von humanem Gewebe oder einer krebsartigen Humanzellinie stammt, wobei dieses Antigen ein Protein mit Molekulargewichtskomponenten in den Bereichen von etwa 68 000 bis etwa 80 000, etwa 40 000 bis etwa 48 000, etwa 28 000 bis etwa 32 000 und etwa 16 000 bis etwa 19 000 ist und die isoelektrischen Punkte bezüglich dieser Molekulargewichtskomponenten in den Bereichen von etwa pH 8,0 bis etwa pH 8,8, etwa pH 5,2 bis etwa pH 5,8, etwa pH 6,2 bis etwa pH 6,8 und etwa pH 8,0 bis etwa pH 8,8 liegen.
(b) Fusionieren von Milzzellen des Wirts mit geeigneten Myelomzellen, um eine Hybridzellinie zu erhalten.
(c) Kultivieren der Hybridzellinie in einem geeigneten Medium und Selektieren und Klonieren jener Hybridzellinien, die gegen das in (a) definierte Antigen reaktiv sind und
(d) Gewinnung des gebildeten monoklonalen Antikörpers.
Die vorliegende Erfindung schlägt Verfahren zur in vitro Detektion und Diagnose von Krebs, insbesondere Brustkrebs, beim Menschen vor. Die Charakterisierung des einzigartigen tumorassoziierten Proteins der Erfindung, wie es hierin dargelegt wird, erlaubt seine Detektion in Gewebsproben von Patienten durch immunohistochemische Verfahren und/oder in Flüssigkeitsproben von Patienten durch in vitro Immunoassayverfahren. Eine Bestimmung des Vorkommens und/oder der Menge des tumorassoziierten Antigens der vorliegenden Erfindung in Proben von Patienten durch immunohistochemische Verfahren und/oder Immunoassayverfahren ist von bedeutenden diagnostischen Nutzen und zeigt das Fortschreiten eines Krankheitszustands an oder korreliert mit diesem.
Immunohistochemische Methoden zur Detektion von Antigenen in Gewebsproben von Patienten sind im Fach gut bekannt und müssen nicht im Detail beschrieben werden. Kurz gesagt wird erfindungsgemäß eine Gewebsprobe, die von einem Patienten mit Krebsverdacht erhalten wurde, mit einem Antikörper, vorzugsweise monoklonalen Antikörper, der die Spezifität mit dem hierin beschriebenen tumorassoziierten Protein besitzt, zusammengebracht. Speziell für den Einsatz vorzuziehen ist der monoklonale Antikörper YBY088. Die Stellen, an denen der Antikörper gebunden wird, werden danach durch selektives Anfärben der Gewebsprobe durch immunohistochemische Standardverfahren bestimmt.
Ähnlich sind Verfahren zur in vitro Detektion von antigenwirkenden Substanzen in Flüssigkeitsproben von Patienten durch Immunoassayverfahren im Fach gut bekannt und bedürfen keiner Wiederholung hierin. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Flüssigkeitsproben von Patienten mit mindestens einem Antikörper, vorzugsweise monoklonalen Antikörper, zusammengebracht, der eine spezifische Reaktivität mit dem tumorassoziierten Protein der Erfindung besitzt, und der so an die Probenbestandteile gebundene Antikörper wird bestimmt. Qualitative und/oder quantitative Bestimmungen des Vorkommens des durch die Erfindung definierten Antigens können durch kompetitive oder nicht-kompetitive Immunoassayverfahren zustandegebracht werden. Monoklonale Antikörper oder polyklonale Antikörper können verwendet werden, vorausgesetzt, die Antikörper besitzen die erforderliche Spezifität für das durch die Erfindung bereitgestellte Antigen. Vorzugsweise wird der monoklonale Antikörper YBY088 verwendet. Zusätzlich sind die für den Gebrauch vorzuziehenden Assays zweilagige immunometrische Assays ("two-site") unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die darauf selektioniert werden, daß sie an nicht-störende Determinanten des hierin beschriebenen Antigens binden.
Die vorliegende Erfindung legt weiterhin Verfahren zur in vitro Diagnose und Therapie von Krebs, speziell Brustkarzinome, beim Menschen nahe. Verfahren zur Tumorlokalisation und Tumordetektion werden in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ausgeführt, indem einem Patienten mit Krebsverdacht eine im voraus bestimmte wirksame Menge an Antikörper verabreicht wird, der eine spezifische Reaktivität mit dem tumorassoziierten Protein der vorliegenden Erfindung besitzt und danach die Stellen, an denen sich der Antikörper befindet, durch bildgebende Standardverfahren detektiert werden. Der Antikörper, vorzugsweise YBY088 ist markiert, vorzugsweise mit gamma-Strahlung emmittierenden Radionukliden, so daß eine Detektion ermöglicht wird, und dem Patienten in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger verabreicht.
Deswegen wird als zusätzlicher Aspekt der Erfindung eine therapeutische oder diagnostische Formulierung bereitgestellt, die einen, wie beschriebenen, monoklonalen Antikörper zusammen mit einem pharmazeutisch oder diagnostisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel hierfür enthält. Ein pharmazeutisch annehmbarer Träger ist einer, der bei der Behandlung oder Diagnose eines Warmblüters brauchbar ist. Ein diagnostisch annehmbarer Träger ist einer, der in diagnostischen Testverfahren brauchbar ist. Solche Träger oder Verdünnungsmittel sind Fachleuten vollständig vertraut und bedürfen keiner weiteren Erklärung.
In Übereinstimmung mit Verfahren, die durch die vorliegende Erfindung zugänglich sind, wird eine im voraus bestimmte wirksame Menge an Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, der eine Spezifität für das durch die Erfindung beschriebene Antigen besitzt, dem Krebspatienten verabreicht. Der Antikörper, vorzugsweise YBY088, wird mit einem geeigneten therapeutischen Mittel gekoppelt, z.B. Radioisotopen, vorzugsweise beta-Teilchen aussendende Substanzen, Arzneimittel, Toxine, biologische Proteine, das für die Ablagerung an der Tumorstelle ausgewählt wurde und einem Krebspatienten in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger verabreicht wird.
Zusätzlich werden Fachleute im Zusammenhang mit der in vivo Krebsdiagnose und Krebstherapie erkennen, daß Antikörperpräparationen, die Mischungen von Antikörpern oder Fragmente davon enthalten, z.B. Antikörper-Cocktails, die eine Spezifität für das tumorassoziierte Antigen der Erfindung besitzen, in bestimmten Fällen benutzt werden können, um die Detektion, Lokalisation und Behandlung von Tumoren zu steigern.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert.

BEISPIEL I

Herstellung des monoklonalen Antikörvers YBY088

Lymphknoten-Lymphozyten, die von einem Patienten mit Brustkrebsdiagnose erhalten wurden, werden aufgetaut und über Nacht in RPMI-1640 (Flow Laboratories, Alexandria, VA) kultiviert, das 10 % fetales Rinderserum (FBS) enthält. 30 x 10&sup6; Lymphozyten und 30 x 10&sup6; von P3/HT, (einer Nebenlinie von der Mausmyelomzellinie P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580)) werden mit 35 % Polyethylenglycol-1 000 in serumfreien RPMI-7,5 % Dimethylsulfoxid fusioniert. Die Zellen werden mit Zelldichten von 10&sup5; Gesamtzellen pro Probenloch in 96-Loch Mikrotiterplatten (Costar, Cambridge, MA) in RPMI-10 % FBS - HAT (10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 4 x 10&supmin;&sup7; M Aminopterin und 1,6 x 10&supmin;&sup5; M Thymidin) ausgebracht. Die Kulturen werden für 2 Wochen in 5 % CO&sub2; gehalten und danach der Überstand durch frisches HAT-Medium einmal wöchentlich ersetzt. Vom Überstand aus Probenlöchern mit wachsenden Kulturen werden nach 40 Tagen Proben genommen und auf das Vorkommen von Ig durch Enzym-gebundene Immunosorbent Bindungsassays (ELISA) getestet.
Ig-bildende Klone werden dann mittels ELISA auf spezifische Reaktivität mit Membranen und Cytosolen von Brusttumoren gescreent. Der monoklonale Antikörper, ein IgM Antikörper, wird als YBY088 bezeichnet und weitergehend charakterisiert und für die Charakterisierung des Antigens ausgewählt, wie das hierin dargestellt ist.

BEISPIEL II

Antigen Charakterisierung

Der monoklonale Antikörper YBY088 wird verwendet, um das Antigen der vorliegenden Erfindung durch die hierin dargelegten Verfahren zu charakterisieren.
Membran- und Cytosolfraktionen von humanem Gewebe werden zur Antigencharakterisierung verwendet, indem auf die Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper YBY088 gescreent wird und diese werden folgendermaßen präpariert:
Proben aus Operationen und 10 Stunden nach dem Tod entnommene Autopsieproben werden in Stücke geschnitten und bei -80ºC gelagert. Das Gewebe wird in vier Volumen 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM Calciumchlorid, 2 mM Phenylmethylsulfonat (Homogenisierungspuffer) bei 4ºC in einem Dounce Homogenisator homogenisiert. Alle weiteren Schritte werden bei 4ºC durchgeführt. Das Homogenisat wird bei 100 x g für 5 Minuten zentrifugiert, um Zellkerne und intakte Zellen zu entfernen. Der Überstand wird entfernt und bei 130 000 x g für eine Stunde zentrifugiert. Der Überstand dieser Hochgeschwindigkeitszentrifugation wird entfernt und als Cytosolfraktion bezeichnet. Das Pellet wird in einem Volumen Homogenisierungspuffer resuspendiert und auf einen 40 %/20 % diskontinuierlichen Saccharosegradienten in 10 mM Tris-HCl pH 7,2 aufgebracht. Der Gradient wird bei 130 000 x g für 17 Stunden zentrifugiert. Das Material an der 40 %/20 % Interphase wird abpipettiert und 5-fach in Homogenisierungspuffer verdünnt und für 60 Minuten bei 25 000 x g zentrifugiert. Das Pellet wird in Homogenisierungspuffer resuspendiert, aliquotiert und bei -80ºC gelagert.

Membran/Cytosol ELISA

Das Vorkommen des mit dem monoklonalen Antikörper YBY088 reagierenden Antigens in gereinigten Membran- und Cytosolfraktionen von normalem Humangewebe und humanem Tumorgewebe wird durch einen Enzym-gekoppelten Immunosorbent Bindungsassay (ELISA) bestimmt, was durch die Absorbtion bei 490 nm gemessen wird.
Um den Membran/Cytosol ELISA ausführen zu können, werden 10 ug/Probenloch Cytosol oder 2 ug/Probenloch Membran, wie oben präpariert, in Flachboden-Mikrotiterplatten (Dynatech, Alexandria, GA) bei 37ºC über Nacht getrocknet. Die Platten werden drei Mal mit kaltem Leitungswasser gewaschen. 50 ul 20 %tiges Pferdeserum in PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, 0,15 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat pH 7,2) werden zugegeben, gefolgt von 50 ul Hybridoma-Überstand, und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen werden die Probenlöcher mit 100 ul eines monoklonalen Maus-anti-human-IgM-POD (Meerrettichperoxidase) Konjugats (ZSAG11, Boeringer Mannheim, Indianapolis, IN, 1985/86 Katalog Nr. 0952, konjugiert durch das Verfahren von M.B. Wilson und P.K. Nakane, Elsevier North Holland Biomedical Press, 1978), das 1:1 000 in 5 % Pferdeserum-PBS verdünnt ist, für eine Stunde inkubiert. Gebundenes Enzym wird durch Inkubation mit 100 ul 1 ug/ml o- Phenylendiamin, 0,03 % H&sub2;O&sub2; in 0,1 M Citrat-Phosphatpuffer pH 5,0 für 30 Minuten im Dunkeln detektiert. Die Probenlöcher werden durch die Zugabe von 50 ul NH&sub4;SO&sub4; pro Probenloch abgestoppt. Die Absorbtion bei 490 nm wird in einem Dynatech-ELISA-Mikrotiterplattenphotometer abgelesen. Alle Assays enthalten Postivkontrollen, die routinemäßig O.D. Werte von 1,0 bis 2,0 ergeben, und Daten, die den Abgleich zwischen einzelnen ELISA's ermöglichen.
Wie unten in Tabelle I gezeigt, reagiert YBY088 mit Membranfraktionen von Brustkarzinomen und Cytosolfraktionen von einer Vielzahl an normalen Geweben, einschließlich Brust-, Dickdarm-, Nieren-, Lungen-, Leber-, Gehirn-, Prostata- und Bauchspeicheldrüsengewebe. Folglich wird das Vorkommen des Antigens der Erfindung in der Membran von Brustkarzinomen und dem Cytosol einer Reihe von gutartigen Geweben angezeigt. Wie in Tabelle I gezeigt, ist das Antigen nicht mit der Membran von von anderen normalen Geweben, einschließlich Dickdarm, Niere, Lunge, Leber, Prostata, Gehirn und Harnblase, verbunden. Eine relativ schwache Reaktivität von YBY088 zeigt sich jedoch mit Membranfraktionen von normalem Brust- und Pankreasgewebe und der Mukosa von Dickdarmkarzinomen, was auf das Vorkommen des Antigens in der Membran solcher Gewebe in relativ geringen Konzentrationen hindeutet.

Biochemische Analyse des Antigens

SDS-PAGE und Western Immunoblot Analyse

Das Molekulargewicht und die biochemische Beschaffenheit des durch YBY088 charakterisierten Antigens werden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western Immunoblot Analyse bestimmt.
Eine humane Brustzellinie, T47D, (R.Dulbecco, Salk Institute, ATCC HTB 133) wird in den Beispielen verwendet, um das Molekulargewicht und die biochemische Beschaffenheit des Antigens zu bestimmen und wird wie folgt präpariert. In autoklavierbaren MEM (Irvine Scientific, Irvine California) kultivierte, mit 8 % Pferdeserum-2 % fetalem Rinderserum supplementierte, Monolayer von T47D Zellen werden drei Mal in PBS gewaschen, von den Kulturflaschen mit einem Gummischaber abgeschabt und mittels Zentrifugation drei Mal in PBS gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in einer der folgenden Puffer mit ungefähr 20 x 10&sup6; Zellen pro ml resuspendiert: (1) 0,5 % NP4O - 0,5 % Desoxycholat - 5 mM EDTA - 100 mM Tris pH 8,0 und (2) 2 % SDS - 0,125 M Tris pH 6,8. Die Zellsuspensionen werden ultrabeschallt (Heat Systems, Ultrasonics Inc., Modell W-375) und bei 130 000 x g für 30 Minuten zentrifugiert (Beckman, Palo Alto, CA).
25 ug der wie oben beschriebenen T47D Extrakte werden in Probenpuffer für Gele (0,12 M Tris pH 6,8, 4 % SDS, 20 % Glycerin, 0,002 % Bromphenolblau, 5 % 2-Mercaptoethanol) gelöst und durch diskontinuierliche SDS-PAGE (Laemmli, U.K. Nature 227:680-685, 1970) auf einem 7,5 %igen oder 10 %igen Gel mit 3 %igem Sammelgel aufgetrennt.
Die aufgetrennten Proteine werden elektrophoretisch auf Nitrozellulose (0,1 m, Schleicher & Schuell, Inc., Keene, New Hampsire) mit 200 mA für drei Stunden nach dem Verfahren von Towbin et al., PNAS 76 43 (1979) übertragen. Die Nitrozellulosereplikas werden dann in 3 % Rinderserumalbumin (BSA)-PBS für 30 Minuten inkubiert, worauf sie über Nacht in versiegelten Beuteln mit Hybridomaüberstand inkubiert werden, der 1:1 mit 5 % Magermilch - 0,001 % Thimerosal - 0,1 % Antischaum A Emulsion (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) verdünnt wurde. Die Nitrozellulosestreifen werden mit PBS - 0,1 % Tween für 30 Minuten mit fünfmaligem Pufferwechsel gewaschen und mit ¹²&sup5;I-markiertem Ziegen-antihuman IgM (Tago, Burlingame, CA), 500 000 cpm/ml Magermilchreagenz für zwei Stunden inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS - 0,1 % Tween werden die Nitrozellulosestreifen luftgetrocknet und auf einem Röntgenfilm (Kodak XAR-5) für 18-72 Stunden mit einer Verstärkerfolie (Cronex DuPont Lightning Plus) bei -70ºC exponiert.
Um die biochemische Beschaffenheit des Antigens zu bestimmen, wird das Antigen den folgenden zerstörend wirkenden Behandlungen vor der SDS-PAGE und der Western Immunoblot Analyse unterzogen.
(a) Periodatoxidation des Antigens vor der PAGE: Proben der T47D Zellinie werden auf 50 mM NaIO&sub4; in PBS pH 7,4 eingestellt und bei 0ºC für eine Stunde inkubiert. Alternativ dazu wird die Probe auf 10 mM NaIO&sub4; in 50 mM Na-Acetat pH 4,5 eingestellt und bei 0ºC für eine Stunde inkubiert.
(b) Periodatoxidation des Antigens nach Fraktionierung durch PAGE: Proben der T47D Zellinie werden zuerst durch PAGE fraktioniert und hinterher auf Nitrozellulosepapier durch Western Blot immobilisiert. Die Nitrozellulosestreifen werden in 10 mM NaIO&sub4;, 50 mM Na-Acetat pH 4,5 für eine Stunde bei 4 ºC inkubiert. Anschließend an die Inkubation werden die behandelten Streifen in 50 mM NaBH&sub4; für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann drei Mal mit PBS vor der Immunofärbung gewaschen.
(c) Milde alkalische Oxidation: Um o-verknüpfte Kohlenhydrate vom Protein abzulösen, werden Proben der T47D Zellinie auf 0,1 N NaOH eingestellt und für 18 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der pH wird mit 1 N HCl vor der Zugabe des Probenpuffers für die Elektrophorese auf 7,4 gebracht. Alternativ dazu wird wie in (b) auf Nitrozellulosestreifen immobilisiertes Antigen mit 0,1 N NaOH bei Raumtemperatur für 18 Stunden inkubiert. Die Streifen werden drei Mal mit PBS - 0,1 % Tween vor der Immunofärbung gewaschen.
(d) Neuraminidaseverdau: Proben der T47D Zellinie werden auf pH 5 mit 100 mM HOAc eingestellt und Neuraminidase (Calbiochem) in einer Endkonzentration von 0,1 Unit/ml zugegeben. Die Probe wird für eine Stunde bei 37ºC inkubiert und der Verdau durch Zugabe des SDS-PAGE Probenpuffers gefolgt von einer fünfminütigen Erhitzung auf 100ºC gestoppt.
(e) Endoglykosidase F Verdau: Endoglykosidase F wird durch das Verfahren von Elder und Alexander (1982) PNAS 79:4540 präpariert. Die vereinigten Fraktionen, die das Enzym enthalten, werden in 50 % Glycerin bei -20ºC gelagert. Eine Probe der T47D Zellinie wird mit 0,1 M Phosphatpuffer, der 0,05 M EDTA, 1 % NP-4O, 0,1 % SDS, 1 % 2-Mercaptoethanol enthält, auf ein Endvolumen von 40-80 ul verdünnt. Die Probe wird 2 Minuten gekocht, abgekühlt und Endo F wird zugegeben (1:5 V/V). Die Probe wird über Nacht bei 37ºC inkubiert und durch die Zugabe von Probenpuffer gefolgt von einer fünfminütigen Erhitzung auf 100ºC gestoppt.
(f) Proteinase K Verdau: Antigen enthaltende Proben werden mit Proteinase K (Sigma, Typ II) durch Zugabe von 40 ug Enzym pro Probe behandelt. Der Verdau wird bei 37ºC für 1 Stunde ausgeführt und durch die Zugabe von SDS-PAGE Probenpuffer gefolgt von einer fünfminütigen Erhitzung auf 100ºC beendet.
Alle Reaktionen werden durch Zugabe des Probenpuffers für Gele gestoppt.
Durch SDS-PAGE und und Western Immunoblot Analyse unter Verwendung von SDS-Extrakten der T47D Brustzellinie ergibt sich, daß die Molekulargewichtskomponenten des Antigens in den Bereichen von etwa 68 000 bis etwa 80 000, etwa 40 000 bis etwa 48 000, etwa 28 000 bis etwa 32 000 und etwa 16 000 bis etwa 19 000 liegen. Bei Verwendung von Extrakten der T47D Brustzellinie mit nicht-ionischen Detergenzien ergeben sich alternativ dazu für das Antigen Molekulargewichtskomponenten, die in den Bereichen von etwa 28 000 bis etwa 32 000 und etwa 16 000 bis etwa 19 000 liegen. Chemische und enzymatische Modifikation des Antigens gefolgt von SDS-PAGE und Western Immunoblot Analyse zeigen die Proteinbeschaffenheit des Antigens. Spezifisch wird durch die Behandlung des Antigens mit Proteinase K der Verlust der Reaktivität des Antigens mit YBY088 gezeigt. Der Verlust der Reaktivität des Antigens mit YBY088 rührt nicht von den oben beschriebenen alternativen Modifizierungen her.

Isoelektrisch fokussierende zweidimensionale Gelelektrophorese

Eine zweidimensionale Gelanalyse wird unter Verwendung von Detergenzien- oder Harnstoffextrakten von T47D Zellen im wesentlichen übereinstimmend mit dem Verfahren von O'Farell (P.H. O'Farell, J.Biol. Chem. 250:4007-4021, 1975) ausgeführt. Isoelektrisch fokussierende Röhrchengele mit pH 3,5-9,5 Ainpholinen (LKB) werden für 15 Minuten bei 200 Volt, 30 Minuten bei 300 Volt und 30 Minuten bei 400 Volt vorfokussiert, gefolgt von einer Fokussierung bei 300 Volt für 16 Stunden. Eine Auftrennung in der zweiten Dimension auf SDS-PAGE wird auf 5-15 %igen Gelen ausgeführt. Elektroblotting auf Nitrozellulose und Analyse durch Immunofärbung werden dann wie beschrieben ausgeführt.
Eine isoelektrische Fokussierung des Antigens durch diese Technik zeigt isoelektrische Punkte, die bezüglich der Molekulargewichtskomponenten des Antigens in den Bereichen von etwa pH 8,0 bis etwa pH 8,8, etwa pH 5,2 bis etwa pH 5,8, etwa pH 6,2 bis etwa pH 6,8 und etwa pH 8,0 bis etwa pH 8,8 liegen.

Analyse der Antikörperreaktivität mit Membranen aus Milchfetttröpfchen

Um zu bestimmen, ob das hierin beschriebene Antigen in humaner Milch detektierbar ist, wird die Reaktivität von YBY088 mit Membranen humaner Milchfetttröpfchen mit den unten beschriebenen Standardverfahren ermittelt.
Membranen aus humanen Milchfetttröpfchen werden wie folgt präpariert. Huinane Milch wird bei 10 000 x g für 15 Minuten zentrifugiert. Die Sahne, die im Rörchen oben schwimmt, wird gewonnen und in 0,01 M Tris-HCl Puffer pH 7,5, der 1 mM MgCl&sub2; und 0,28 M Saccharose enthält, resuspendiert. Diese Suspension wird rezentrifugiert und die gewaschene Sahne wird in 0,05 M Tris-HCl Puffer pH 7,5 resuspendiert. Die gewaschenen Membranen der Milchfetttröpfchen werden für 10 Minuten bei 10 000 Upm unter Verwendung eines Brinkman Polytrons homgenisiert. Nach Inkubation bei 37ºC für 20 Minuten, die den Triglyceriden gestattet, sich zu vereinigen, wird die Suspension bei 105 000 x g für eine Stunde bei 37ºC zentrifugiert. Die Membranen der Milchfetttröpfchen im Pellet werden in eiskalten 0,2 M Tris-HCl Puffer pH 8,0 suspendiert, der 1 mM PMSF in einer Proteinkonzentration von 10 mg/ml enthält.
SDS-PAGE und Western Immunoblot Analyse werden im wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt und zwar unter Verwendung von 25 ug der in obiger Weise hergestellten Membranen der humanen Milchfetttröpfchen.

Analyse der Antikörperreaktivität mit Blutkomponenten

Um zu bestimmen, ob das Antigen mit Blutkomponenten verbunden ist, wird die Reaktivität von YBY088 mit Blutkomponenten, einschließlich Lymphocyten, roter Blutkörperchen, myeloischer Komponenten und Blutplättchen, die zweimal bei 1 000 Upm jeweils 5-8 Minuten zentrifugiert werden, ermittelt. Das Plasma wird gesammelt und bei 2 000 Upm für 4-6 Minuten zentrifugiert, um die Blutplättchen zu pelletieren, die in einem geeigneten Volumen Plasma resuspendiert werden. Die blaßgelbe Schicht wird ebenfalls gesammelt und zweimal bei 1 000 Upm jeweils 4-6 Minuten zentrifugiert, um die Lymphocyten zu sammeln. 10-12 ml 0,83 % Ammoniumchlorid - 0,14 % Kaliumbicarbonat - 0,05 mM EDTA pH 7,3 werden zum Pellet gegeben, für 5 Minuten inkubiert und nochmals bei 1 000 Upm für 4- 6 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wird einmal gewaschen und in RPMI - 10 % fetales Rinderserum in einer Konzentration von 40 Millionen Zellen/ml resuspendiert. Die roten Blutkörperchen werden ebenfalls in RPMI - 10 % fetales Rinderserum in einer Konzentration von 40 Millionen Zellen/ml resuspendiert.
50 ul des humanen Antikörperüberstandes werden in 96-Loch Mikrotiterplatten verteilt, gefolgt von 25 ul (1 Million Zellen) der Zellsuspension und für 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Die Zellen werden drei Mal mit PBS durch Zentrifugation gewaschen und mit 50 ul eines Ziegen-anti-human IgM-FITC Konjugats (Tago, Burlingame, CA) für 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Die Zellen werden erneut wie vorher gewaschen und in Röhrchen überführt, die 0,5-1,0 ml 1 % Formalin enthalten und einer Analyse mit einem Fluoreszenz Aktiviertem Zellsorter unterzogen.
Die obige Analyse zeigt keine spezifische Aktivität von YBY088 mit Membranen aus humanen Milchfetttröpfchen oder Blutkomponenten, einschließlich Lymphocyten, roter Blutkörperchen, myeloischer Komponenten und Blutplättchen. Folglich ist das durch die vorliegende Erfindung beschriebene Antigen weder in humaner Milch detektierbar, noch ist das Antigen mit Blutbestandteilen verbunden. TABELLE 1 YBY088 Reaktivität mit normalen Geweben und Tumorgeweben ELISA Reaktivität-* Membran Cytosol Brustkrebs Dickdarmkrebs Dickdarmkrebs der Mukosa gutartige Brust gutartiger Dickdarm gutartige Niere gutartige Lunge gutartige Leber gutartiges Gehirn gutartige Prostata gutartige Bauchspeicheldrüse gutartige Harnblase * Ausgedrückt in Prozent (%) des Maximalwerts der Kontrolle = O.D.490nm Testantikörper = 100 x O.D.490nm Antikörper der Positivkontrolle

Claims

1. Aus Humangewebe stammendes Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Antigen ein Protein mit Molekulargewichtskomponenten in den Bereichen von etwa 68 000 bis etwa 80 000, etwa 40 000 bis etwa 48 000, etwa 28 000 bis etwa 32 000 und etwa 16 000 bis etwa 19 000 ist, daß die isoelektrischen Punkte bezüglich dieser Molekulargewichtskomponenten in den Bereichen von etwa pH 8,0 bis etwa pH 8,8, etwa pH 5,2 bis etwa pH 5,8, etwa pH 6,2 bis etwa pH 6,8 und etwa pH 8,0 bis etwa pH 8,8 liegen und daß dieses Antigen eine Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper YBY088 aufweist, der von der Hybridomazellinie ATCC HB9076 gebildet wird.

2. Antigen nach Anspruch 1, wobei das Antigen bezüglich dieser Molekulargewichtskomponenten isoelektrische Maximalwerte von etwa pH 8,4, etwa pH 5,5, etwa pH 6,5 und etwa pH 8,4 aufweist.

3. Antigen nach Anspruch 2, wobei die Reaktivität dieses Antigens mit dem monoklonalen Antikörper YBY088 durch die Behandlung dieses Antigens mit Proteinase K zerstört werden kann.

4. Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das assoziierte Antigen ein tumorassoziiertes Antigen ist, das von Brustkarzinomen exprimiert wird.

5. Antikörper, der eine Reaktivität gegen ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 aufweist.

6. Antikörper nach Anspruch 5, der ein monoklonaler Antikörper ist.

7. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 6, der mit einem von Brustkarzinomen exprimierten tumorassoziierten Protein reagiert.

8. Monoklonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß dieser eine spezifische Reaktivität mit einem tumorassoziierten Protein besitzt, das Molekulargewichtskomponenten in den Bereichen von etwa 68 000 bis etwa 80 000, etwa 40 000 bis etwa 48 000, etwa 28 000 bis etwa 32 000 und etwa 16 000 bis etwa 19 000 aufweist und die isoelektrischen Punkte bezüglich dieser Molekulargewichtskoinponenten in den Bereichen von etwa pH 8,0 bis etwa pH 8,8, etwa pH 5,2 bis etwa pH 5,8, etwa pH 6,2 bis etwa pH 6,8 und etwa pH 8,0 bis etwa pH 8,8 liegen und daß dieses Antigen eine Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper YBY088 aufweist, der von der Hybridomazellinie ATCC HB9076 gebildet wird.

9. Monoklonaler Antikörper YBY088.

10. Hybridzellinie ATCC HB9076.

11. Antikörper nach einem der Ansprüche 5 bis 9 zur Verwendung als diagnostisches oder therapeutisches Mittel eingesetzt wird.

12. Diagnostische oder therapeutische Formulierung, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Antikörper nach einem der Ansprüche 5 bis 9 zusammen mit einem diagnostisch oder pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel hierfür enthält.

13. Verfahren zur Detektion und Diagnose von Krebs in einem Patienten mit Krebsverdacht, dadurch gekennzeichnet, daß eine vom Patienten entnommene Gewebsprobe oder Flüssigkeitsprobe mit einem Antikörper zusammengebracht wird, der eine spezifische Reaktivität mit einem Antigen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 aufweist.