DE19837391A1

DE19837391A1 - Immunologische Materialien und Verfahren zum Nachweis von Dihydropyrimidindehydrogenase

Info

Publication number: DE19837391A1
Application number: DE19837391A
Authority: DE
Inventors: Takashi Yoshikubo; Masami Hasegawa
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1997-08-22
Filing date: 1998-08-18
Publication date: 1999-02-25
Also published as: JPH11140099A; FR2767528B1; ITMI981903A0; IT1302026B1; JP2008120824A; US6730488B2; JP4111597B2; ITMI981903A1; US6232448B1; FR2767528A1; US20020072080A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft immunologische Materialien und Methoden, die zur Bestimmung von Dihydropyrimidindehydro genase (DPD) in biologischen Proben geeignet sind.

Dihydropyrimidindehydrogenase (DPD) ist bekannt als ein Enzym, das die Reduktion von Pyrimidinen zu 5,6-Dihydropyri midinen katalysiert, wobei die entstehenden Kataboliten, Dihydrouracil und Dihydrothymin weiter zu β-Alanin bzw. β- Aminoisobuttersäure katabolisiert werden.

Es ist auch bekannt, daß DPD die reduzierenden Reaktionen von 5-Fluoruracil (5-FU) und von verschiedenen Kataboliten von Pyrimidinanaloga und Derivaten katalysiert, die weithin als Antitumorarzneimittel verwendet werden, z. B. 2'-Desoxy-5-fluor uridin (2'-dFUrd), 5'-Desoxy-5-fluoruridin (5'dFUrd, Doxifluoridin) und dgl. Es wurde berichtet, daß der DPD-Pegel in biologischen Proben von einzelnen Personen, die an einem Tumor leiden, ein interessanter Marker für die therapeutische Wirksamkeit von Antitumorarzneimitteln in der Reihe der 5- Fluoruracilderivate ist (siehe z. B. Iigo et al., 1969, Biochem. Pharmacol., 38, 1885 bis 1889).

Es ist bekannt, daß ein Mangel an DPD für die Toxizitität der Metaboliten von Pyrimidin-Antitumorarzneimitteln verantwort lich ist, was während der Chemotherapie zu einem lebensbedro henden Zustand führt (G. Milano und Etienne, 1988, M.C., Pharmacogenetics, 4, 301 bis 306). Kürzlich wurde gefunden, daß die Störung des DPD-Mangels häufiger vorkommt, als ursprünglich gedacht (Diasio und Lu, 1994, J. Clin. Oncol., 12, 2239 bis 2242). Es ist daher wichtig, Patienten mit DPD- Mangel zu finden.

Es besteht daher ein Bedarf für einen empfindlichen und zuverlässigen Test zur Bestimmung des DPD-Gehaltes in biolo gischen Proben.

Verschiedene Methoden für solche Tests wurden beschrieben. Fernandez-Salguero et al. berichteten über ein Dünnschicht chromatographie-(DC)-Verfahren zur Bestimmung der DPD-Aktivi tät bei menschlichen peripheren Lymphozyten (Fernandez- Salguero et al., 1995, Biochem. Pharm. 50, 1015 bis 1020). Bei dem Test wird radioaktiv markiertes Uracil als Substrat verwendet. Jedoch ist eine Methode, bei der eine radioaktive Markierung verwendet wird, offensichtlich nicht für eine Rou tinediagnose in Krankenhäusern geeignet. Außerdem ist ein solches DC-Verfahren zeitaufwendig.

Andere Testmethoden unter Verwendung von HPLC wurden auch beschrieben, z. B. von van Gennip et al., 1982, Adv. Exp. Med. Biol., 253A: 111 bis 118 und Sommadossi et al., 1982, J. Biol. Chem., 257: 8171 bis 8176. Diese Methoden basieren auf der Messung der Enzymaktivität durch Bestimmung der Summe verschiedener Kataboliten von 5-FU unter Verwendung von Reverse-Phase-HPLC. Solche Methoden sind kompliziert und zeitaufwendig.

Das von der vorliegenden Erfindung gelöste Problem besteht darin, Materialien und Methoden zu finden zur Bestimmung des DPD-Gehaltes, die nicht die Nachteile der obigen bekannten Methoden haben, insbesondere solche, die einen einfachen und schnellen Test zur routinemäßigen Verwendung in Kranken häusern liefern.

Das obige Problem wird erfindungsgemäß gelöst, wie in den beigefügten Ansprüchen definiert.

Die vorliegende Erfindung liefert einen monoklonalen Antikör per, der spezifisch dafür ist, Dihydropyrimidindehydrogenase (DPD), insbesondere menschliche Dihydropyrimidindehydro genase, zu erkennen.

Der obige monoklonale Antikörper ist geeigneterweise ein monoklonaler Antikörper, der eine starke Reaktivität für ein Homogenisat aus der Humantumorzellinie HT-3 (ATCC HTB-32) zeigt, aber nur eine geringe Reaktivität oder keine Reaktivi tät für ein Homogenisat aus der Humantumorzellinie MCF-F (ATCC HTB-22).

Der obige monoklonale Antikörper ist ein monoklonaler Anti körper, der eine hohe Spezifität für DPD zeigt.

Geeigneterweise zeigt das Immunpräzipitat, das mit einem Homogenisat aus der Humantumorzellinie HT-3 (ATCC HTB-32) erhalten wird, eine einzige Bande, wenn es mit SDS-PAGE ana lysiert wird.

Der monoklonale Antikörper kann geeigneterweise von einer Hybridomazellinie erzeugt werden, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Hybridomazellinien 2B6-11-1, 9C7-30-1, 5E6-19-1, 3A5-6-1 (FERM BP-6015), 6H5-42-1, 4B9-12-1 (FERM BP-6016), 2E2-B3-1-3 (FERM BP-6014) und 3B12-B1-56-1-2. Bevorzugt ist der monoklonale Antikörper ein solcher, der von einer Hybridomazellinie erzeugt wird ausgewählt aus 3A5-6-1 (FERM BP-6015), 4B9-12-1 (FERM BP-6016), 2E2-B3-1-3 (FERM BP-6014).

Der monoklonale Antikörper kann auch irgendein monoklonaler Antikörper sein, der DPD in äquivalenter Weise bindet, wie von den obigen Zellinien erzeugter monoklonaler Antikör per, d. h. ein monoklonaler Antikörper, der an das gleiche Epitop bindet, wie der von einer der obigen Zellinien erzeugte monoklonale Antikörper oder stark mit einem monoklo nalen Antikörper, der von einer der obigen Zellinien erzeugt wurde, kreuzreagiert.

Die Erfindung betrifft auch eine Hybridomazellinie, die den oben definierten monoklonalen Antikörper erzeugt.

Diese Hybridomazellinie wird geeigneterweise ausgewählt aus der obigen ersten Gruppe von spezifischen Hybridomazellinien und bevorzugt aus der obigen zweiten Gruppe von spezifischen Hybridomazellinien.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Paar von monoklo nalen Antikörpern, das zur qualitativen und/oder quantitati ven Bestimmung von DPD geeignet ist, wobei das Paar einen ersten monoklonalen Antikörper, der spezifisch Dihydropyrimi dindehydrogenase erkennt, und einen zweiten monoklonalen Antikörper, der spezifisch Dihydropyrimidindehydrogenase erkennt, umfaßt, wobei der erste monoklonale Antikörper und der zweite monoklonale Antikörper verschiedene Epitope erken nen.

Ein solches Paar von monoklonalen Antikörpern kann als ersten monoklonalen Antikörper einen monoklonalen Antikörper ausge wählt aus der Gruppe bestehend aus Mab-3A5-6-1, Mab-6H5-42-1 und Mab-3B12-B1-56-1-2 und als zweiten monoklonalen Antikör per einen monoklonalen Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mab-4B9-12-1, Mab-2E2-B3-1-3, Mab-9C7, Mab-2B6 und Mab-5E6-19-1 aufweisen.

Bevorzugt ist der erste monoklonale Antikörper Mab-3A5-6-1 und der zweite monoklonale Antikörper ist Mab-4B9-12-1 oder Mab-2E2-B3-1-3.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zum Nachweis und/oder zur Bestimmung der Menge von Dihydropyrimi dindehydrogenase in einer biologischen Probe, der umfaßt

(a) mindestens einen monoklonalen Antikörper, wie oben definiert und
(b) eine Markierung, um das Immunokonjugat aus monoklonalem Antikörper und Dihydropyrimidindehydrogenase qualitativ und/oder quantitativ nachzuweisen.

Bevorzugt umfaßt der Kit ein Paar von monoklonalen Antikör pern und eine Markierung, wie oben definiert.

In einer anderen Hinsicht betrifft die Erfindung einen Immu noassay zum Nachweis und/oder zur Bestimmung der Menge an Dihydropyrimidindehydrogenase in einer biologischen Probe, der umfaßt, daß man

(a) die Probe mit mindestens einem monoklonalen Antikörper, wie oben definiert, behandelt, um ein Immunokonjugat von Antikörper und Dihydropyrimidindehydrogenase zu erzeugen und
(b) dieses Immunokonjugat mit Hilfe einer Markierung quali tativ oder quantitativ nachweist.

Der Immunoassay kann irgendeine Art von Immunoassay sein, der auf dem Gebiet der Immunoassays bekannt ist (siehe z. B. M. Ferencik, 1993, in "Handbook of immunochemistry", veröffent licht von Chapman & Hall, London, UK). Insbesondere kann er ein Ein-Punkt-Binde-Assay sein, z. B. ein Immunpräzipitations verfahren oder ein Zwei-Punkt-Bindungs-Assay (Sandwich- Assay), z. B. ein ELISA. Ein Zwei-Punkt-Bindungs-Assay verwen det bevorzugt ein Paar von monoklonalen Antikörpern, wie oben definiert.

Herstellung der monoklonalen Antikörper

Die zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern für ein spe zifisches Antigen verwendete Methodik ist im Stand der Tech nik wohlbekannt und wird z. B. von Harlow et al., 1988, in Abschnitt 6 von "Antibodies: a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, New York, USA, beschrieben.

Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper erzeugen, die spezifisch DPD erkennen, werden zuerst hergestellt. Für die sen Zweck wird ein Versuchstier mit dem DPD-Protein oder Fragmenten davon als Antigen immunisiert. Das Versuchstier kann von irgendeiner Art sein, die immunkompetente Zellen besitzt, z. B. Lymphozyten und Milzzellen, die zur Herstellung einer Hybridomazellinie geeignet sind. Geeignete Arten sind z. B. Maus, Ratte, Kaninchen und Ziege. Die Arten Maus oder Ratte sind besonders geeignet. Das Antigen kann das DPD-Pro tein selbst sein oder es können Fragmente davon sein, ein schließlich einer Mischung solcher Fragmente. Das DPD-Protein oder Fragmente davon, die als Antigene verwendet werden, kön nen entweder erhalten werden, indem das Protein aus einer natürlichen Quelle isoliert wird oder indem es mit Hilfe von Gentechnik produziert wird. Das DPD-Protein kann aus natür lichen Quellen erhalten werden, z. B. Lebergewebe, bevorzugt von einem Menschen, mit dem Isolierungsverfahren, das bereits angegeben wurde, z. B. von Lu et al. in J. Biol. Chem. 267, 17102 bis 17105, 1992.

Die Gentechnik liefert bin geeignetes Mittel zur Herstellung rekombinanten Genen. Die Information über die Nucleo tidsequenz von menschlichem DPD ist erhältlich bei der Gen- Bank™/EMBL Datenbank mit der Zugangsnummer U09179 (siehe H. Yokota et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, Seiten 23192 bis 23196). Die Nucleotidsequenz von menschlichem DPD und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz sind in der unten ange gebenen Sequenzbeschreibung als SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 2 angegeben. Auf Basis dieser Sequenzinformation kann ein rekombinantes DPD-Protein oder ein Fragment davon erzeugt werden entweder unter Verwendung einer synthetischen DNA oder eines klonierten DPD-Gens mit Hilfe von üblichen Expressions systemen für rekombinante Gene. Wenn eine Klonierung erwünscht ist, kann die Klonierungsstrategie auf irgendeiner Nucleinsäureamplifikationsmethode basieren, z. B. unter Ver wendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), der Ligase-Ket tenreaktion (LCR), einer Transkriptionsamplifikation oder einer sich selbst erhaltenden Sequenzreplikation. Die Polyme rase-Kettenreaktion (PCR) ist besonders zuverlässig und geeignet. Die PCR-Klonierungsstrategie kann die volle Nucleo tidsequenz des DPD-Gens oder die Teilnucleotidsequenz des Gens liefern. Es wird in den Beispielen gezeigt, daß ein Fragment von DPD in Form eines Fusionsproteins mit GST-Pro tein ein wirksames Antigen zur Immunisierung eines Tieres ist.

Die in SEQ ID Nr. 2 beschriebene Aminosäuresequenz liefert nützliche Informationen für die chemische Synthese von DPD- Fragmenten. Solche synthetischen Peptide sind auch als Anti gen für die vorliegende Erfindung geeignet. Die Antigenizität der Antigene, die mit einer der obigen Methoden hergestellt wurden, kann mit Western-Blotting abgeschätzt werden.

Durch Injektion dieses Antigens in eine Maus, eine Ratte, ein Schaf, Kaninchen oder dgl., können monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, indem Antikörper produzierende Zellen aus einem solchen immunisierten Tier gewonnen werden und die Zellen immortalisiert werden. Die Immunisierung der Tiere mit dem obigen Antigen kann mit im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren durchgeführt wer den, wie sie z. B. in der obigen Literaturstelle Harlow et al. beschrieben wurden. Die Immortalisierung liefert Hybridoma zellinien, die monoklonale Antikörper erzeugen, und sie kann in üblicher Weise durchgeführt werden, z. B. durch Fusion der obigen Zellen min Myelomazellen oder Mausmyelomazellen.

Der Kulturüberstand solcher Hybridomas wird auf monoklonale Antikörper gescreent mit üblichen Verfahren wie Dot-Immuno bindungstests, z. B. Western-Blotting oder Radioimmuno assays, Enzymimmunoassays oder dgl.

Monoklonaler Antikörper können aus Hybridomaüberständen mit üblichen chromatographischen Verfahren, z. B. Ionenaustausch chromatographie, Affinitätschromatographie auf Protein G oder Protein A, HPLC oder dgl. gereinigt werden.

Für die Herstellung großer Mengen von monoklonalen Antikör pern gemäß im Stand der Technik bekannten Methoden können Hybridomas, die den gewünschten Antikörper sezernieren, intraperitoneal in Mäuse injiziert werden, die mit Pristan vor der Injektion vorbehandelt wurden. Bis zu ungefähr 100 mg eines monoklonalen Antikörpers können von solchen Ascites- Tumoren in einer Maus erzeugt werden. Monoklonale Antikörper können z. B. aus Ascitesflüssigkeit gereinigt werden, die von solchen Tumoren erzeugt wird, wie in Beispiel 2 beschrieben.

Monoklonale Antikörper können nach ihrer Unterklasse mit bekannten Methoden, z . B. der Ouchterlony-Immunodiffusion, oder unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Testkits, z. B. Maus-Mono-Ab-ID EIA-Kit (Zymed, San Francisco, CA, USA) gekennzeichnet werden. Bei der vorliegenden Erfindung wird die Unterklasse der jeweiligen monoklonalen Antikörper aus den Hybridomazellinien, die in Beispiel 2 hergestellt wurden, bestimmt mit Mab-2B6-11-1 (IgG1, κ), Mab-9C7-30-1 (IgG1, κ), Mab-5E6-19-1 (IgG3, κ), Mab-3A5-6-1 (IgM, κ), Mab-6H5-42-1 (IgM, κ).

Die erfindungsgemäßen Hybridomazellinien, die als 4B9-12-1, 3A5-6-1 und 2E2-B3-1-3 bezeichnet werden, sind besonders nützlich zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern der vorliegenden Erfindung, insbesondere für Mehrstellenbindungs tests. Solche Zellinien wurden beim National Institute of Bioscience and Human-Technology (NIBHT) in Japan am 8. Juli 1997 gemäß dem Budapester Vertrag mit den folgenden Hinter legungsnummern hinterlegt: FERM BP-6014 für 2E2-B3-1-3, FERM BP-6015 für 3A5-6-1 und FERM BP-6016 für 4B9-12-1.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können für die Immunaffinitätsreinigung von DPD verwendet werden. Solche Antikörper können hierzu an feste Träger gebunden werden mit Methoden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, z. B. durch kovalente Bindung an mit CNBr aktivierte Agarose, z. B. Sepharose oder dgl.

Weiterhin können die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung auch als Diagnosemittel zur Bestimmung des DPD- Gehalts in biologischen Proben verwendet werden, die Tumor gewebe von menschlichen Patienten sein können. Für eine sol che Verwendung können die monoklonalen Antikörper an einen fluoreszierenden Farbstoff, eine Farbe produzierende Sub stanz, wie ein Enzym (Enzym-linked Immunosorbent Assay: ELISA) oder eine im Stand der Technik übliche Markierung, wie Biotin, gebunden werden.

Um die Leistung der Assayart, die unter Verwendung der erfin dungsgemäßen monoklonalen Antikörper gestaltet werden kann, untersuchen, kann der folgende übliche Test angewendet werden, bei dem Radioisotope verwendet werden.

Methode zum Test der enzymatischen Aktivität von DPD

Die Enzymaktivität von DPD kann bestimmt werden, indem die Summe der 5-FU-Kataboliten gemessen wird, d. h. Diydrofluor uracil, α-Fluor-β-ureidopropionat und α-Fluor-β-alanin, die aus [6-¹⁴C]5-FU gebildet werden. Praktisch kann das folgende Verfahren für den obigen Test angewendet werden:
Die Standardreaktionsmischung enthält 10 mM Kaliumphosphat (pH 8,0), 0,5 mM EDTA, 0,5 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM Dithio threitol, 2,5 mM MgCl₂, 250 µM NADPH, 25 µM [6-¹⁴C]5-FU (56 mCi/mmol) und 25 µl rohes Enzym (Endproteinkonzentration: 1 mg/ml) in einem Gesamtvolumen von 50 µl. Die Reaktion wird bei 37°C 30 Minuten lang durchgeführt und dann beendet, indem die Reaktionsröhrchen (0,5 ml Eppendorfröhrchen) 30 Minuten lang in ein siedendes Wasserbad eingetaucht werden. Die Reak tionsröhrchen werden bei -20°C mindestens 20 Minuten lang eingefroren, bevor weitere Manipulationen unternommen werden. Die Proteine werden durch Zentrifugation entfernt und dann werden 10 µl der Überstandsflüssigkeit auf Silicagel-DC-Plat ten getupft (MERCK 5735), auf die vorher 5 µl einer Mischung der authentischen Marker getupft wurden mit 10 mM 5-FU, 50 mM Dihydrouracil, 20 mM β-Ureidopropionat, 10 mM α-Fluor-β-ala nin und 50 mM Harnstoff. Die Flecken werden in einem Lösungs mittelsystem entwickelt in einer Mischung aus Ethylace tat/Isopropanol/H₂O (65 : 23 : 12, V/V/V). Diese entwickelten Marker werden mit den Methoden von Naguib et al., 1985, Cancer Res. 45, 5405, identifiziert. Die Radioaktivität der als 5-FU-Kataboliten identifizierten Flecken kann mit dem BAS-1000-System (Fuji Film) nachgewiesen werden. Die DPD- Aktivität wird ausgedrückt als pmol 5-FU umgewandelt/mg Pro tein/min.

Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Als typische Anwendung der monoklonalen Antikörper der vor liegenden Erfindung in quantitativen immunologischen Assays werden eine Ein-Punkt-Bindungsmethode und eine Zwei-Punkt- Bindungsmethode (ein sogenannter Sandwich-Assay) in Betracht gezogen. Es kann allgemein gesagt werden, daß Zwei-Punkt-Bin dungsmethoden vorteilhaft sind, da eine höhere Genauigkeit und höhere Empfindlichkeit erreicht wird. Ein ELISA unter Verwendung eines Paars von monoklonalen Antikörpern, wie oben definiert, erwies sich als empfindliche und schnelle Assayart (siehe Beispiel 3).

Der ELISA kann durchgeführt werden, indem einer der Antikör per auf einem festen Träger immobilisiert wird, der so immo bilisierte Antikörper dem Kontakt mit einer Probe ausgesetzt wird, von der angenommen wird, daß sie DPD enthält, unter Bildung eines DPD-Antikörper-Konjugats, dieses Konjugat mit dem anderen monoklonalen Antikörper umgesetzt wird, unter Bildung eines sandwichartigen DPD-Konjugats, d. h. Antikörper- DPD-Antikörper, und letzteres Konjugat markiert wird, z. B. mit mit HRP markiertem Ratten-anti-Maus-Immunoglobulin-Anti körper, um das Konjugat nachzuweisen. Wenn HRP als Markierung verwendet wird, kann der Nachweis mit einer farbbildenden Reaktion durchgeführt werden, z. B. unter Verwendung des TMB- Mikronapfperoxidase-Kit-Systems (KPL), das TMB und H₂O₂ als Substrat enthält, das bei der enzymatischen Reaktion, die durch HRP katalysiert wird, Farbe entwickelt. Als Markierung zum Nachweis kann der Ratten-Anti-Maus-Immunoglobulin-Anti körper irgendeine übliche Markierung aufweisen, z. B. Biotin, ein Enzym, ein Radioisotop und dgl. Alternativ kann der mono klonale Antikörper in mobiler Phase mit HRP, Biotin, einem Radioisotop, Latexteilchen und dgl. markiert sein.

Wie in Beispiel 3 gezeigt, kann ein hochempfindlicher ELISA erhalten werden unter Verwendung des oben definierten Paars von monoklonalen Antikörpern. Die hohe Empfindlichkeit macht den Test geeignet zum Nachweis des DPD-Gehaltes ins biologi schen Proben des menschlichen Körpers, sogar im Fall eines geringen Gehaltes an DPD, wie bei dem oben beschriebenen Zustand des DPD-Mangels.

Immunpräzipitation

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind auch geeignet zur Isolierung und Bestimmung von DPD-Proteinen mit einem Immunpräzipitationsverfahren. Die Methodik der Immun präzipitation selbst ist im Stand der Technik wohlbekannt. Unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, wie oben definiert, liefert sie die spezifische Abtrennung des Ziel antigens (DPD) aus einer komplexen Probe aufgrund der hohen Bindungsspezifität des monoklonalen Antikörpers.

Eines der typischen Ausfällungsmittel, die verwendet werden können, ist Protein G-Sepharose 4B, wobei Protein G, das mit dem Fc-Bereich von Maus-Immunoglobulin binden kann, auf der Oberfläche von Sepharose 4B-Kügelchen immobilisiert wird. Dieses Mittel bildet einen Komplex von DPD-Antikörper-Pro tein-G-Sepharose-Kügelchen, wenn DPD vorhanden ist, und der Komplex kann durch Zentrifugation abgetrennt werden. Aus dem gesammelten Niederschlag des Komplexes können Antigen (DPD) und Antikörper unter saurer Bedingung dissoziiert werden, z. B. in einem Glycin-HCl-Puffer, pH 3,0. Das so abgetrennte DPD kann leicht von dem Immunoglobulin mit Hilfe von Gelfil tration isoliert werden. Ein solcher Komplex, an den DPD gebunden ist, ist nicht nur zur Isolierung dieses Enzyms, sondern auch zur quantitativen Auswertung des Enzyms nütz lich. So sind die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung gute Mittel zur Isolierung und Bestimmung von DPD aus komplexen biologischen Proben, wie in Beispiel 6 unten gezeigt.

Antikörper-Einfang-Assay

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind auch geeignet in einem Antikörper-Einfang-Assay. Bei dieser Assayart wird der monoklonale Antikörper auf Oberflächen eines geeigneten Behälters immobilisiert, z. B. den Näpfen einer Mikrotiterplatte. Die Immobilisierung erfolgt mit im Stand der Technik üblichen Methoden. Wenn eine Probe, die DPD enthält, solchen Näpfen zugegeben wird, wird das DPD-Peptid von dem immobilisierten monoklonalen Antikörper der vorlie genden Erfindung eingefangen. Nach dem Waschen der Näpfe wird eine Lösung, die das Substrat von DPD enthält, zugegeben. So liefert das Nachweissystem des enzymatischen Produktes ein Mittel zur Bestimmung der DPD-Aktivität. Diese Assayart ist nützlich, um zu bestimmen, ob das eingefangene DPD eine intakte enzymatische Wirkung hat, da Patienten, die geneti sche Defekte des DPD-Gens tragen, mutierte DPD-Proteine haben können, denen die enzymatische Aktivität fehlt.

Alternativ wird, nachdem DPD von dem immobilisierten monoklo nalen Antikörper eingefangen wurde, der Immunkomplex gewa schen und dann das DPD-Polypeptid mit einer geeigneten Puf ferlösung, z. B. unter sauren Bedingungen, eluiert. Diese Manipulation liefert auch ein gereinigtes DPD-Präparat.

Klinische Methoden unter Verwendung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper

Gemäß einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfah ren zur Bestimmung des DPD-Mangelzustandes bei einem Patien ten, das umfaßt, daß man

(a) eine biologische Probe des Patienten mit einem monoklo nalen Antikörper, wie oben definiert, behandelt und
(b) das Immunokonjugat aus monoklonalem Antikörper und Dihydropyrimidindehydrogenase quantitativ bestimmt.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Ver fahren, um die Empfindlichkeit eines Patienten, der unter Krebs leidet, für die Behandlung mit Antitumorarzneimitteln der Reihe der 5-Fluoruracil-(5-FU)-Derivate abzuschätzen, das umfaßt, daß man

(a) eine biologische Probe des Patienten mit einem monoklo nalen Antikörper, wie oben definiert, behandelt,
(b) das Immunokonjugat aus monoklonalem Antikörper und Humandihydropyrimidindehydrogenase quantitativ bestimmt, um den Gehalt der Dihydropyrimidindehydroge nase in der biologischen Probe des Patienten zu bestim men, um ein Maß für die Empfindlichkeit zu erhalten.

Das obige Verfahren ermöglicht es dem Arzt, indem der gemes sene Gehalt an DPD für einen Patienten mit dem einer Refe renzgruppe von Patienten verglichen wird, die Wirksamkeit der obigen Medikamente vorherzusagen.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfah ren, um die Empfindlichkeit von Patienten, die unter Krebs leiden, für die Behandlung mit Antitumorarzneimitteln der Reihe 5-Fluoruracil-(5-FU)-Derivaten abzuschätzen, das umfaßt, daß man

(a) eine biologische Probe des Patienten mit einem monoklo nalen Antikörper, wie oben definiert, behandelt,
(b) quantitativ das Immunokonjugat aus monoklonalem Anti körper und Humandihydropyrimidindehydrogenase quantita tiv bestimmt, um den Gehalt an Dihydropyrimidindehydro genase in der biologischen Probe des Patienten zu bestimmen,
(c) den Gehalt an Pyrimidinnucleosidphosphorylase in der biologischen Probe des Patienten bestimmt und
(d) das Verhältnis des Gehaltes von Pyrimidinnucleosidphos phorylase zu dem Gehalt an Dihydropyrimidindehydroge nase berechnet, um ein Maß für die Empfindlichkeit zu erhalten.

Die obige Methode ermöglicht es dem Arzt, indem er das berechnete Verhältnis von Pyrimidinnucleosidphosphorylase zu dem Gehalt an Dihydropyrimidindehydrogenase für einen Patien ten mit dem einer Referenzgruppe von Patienten, vergleicht, die Wirksamkeit der obigen Arzneimittel vorherzusagen.

Abkürzungen

Die folgenden Abkürzungen im folgenden werden häufig verwen det.
DPD: Dihydropyrimidindehydrogenase
PyNPase: Pyrimidinnucleosidphosphorylase
GST: Glutation-S-transferase
IPTG: Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
KLH: Keyhole-limpet-Hämocyanin
5-FU: 5-Fluoruracil
CFA: komplettes Freund's-Adjuvans
IFA: inkomplettes Freund's-Adjuvans
EIA: Enzymimmunoassay
ELISA: Enzym-linked Immunosorbent-Assay
DC: Dünnschichtchromatographie
PBS: Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PCR: Polymerase-Kettenreaktion
TMB: Tetramethylbenzidin
(TMB-Kit enthält 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin und H₂O₂)
TBS: Tris-gepufferte Kochsalzlösung (20 mM Tris/50 mM NaCl, pH 7,4)
TTBS: TBS, das 0,05% TWEEN®-20 enthält

Die vorliegende Erfindung wird mit den folgenden Beispielen weiter erläutert. Die folgende Beschreibung ist besser zu verstehen, indem auf die folgenden Fig. 1, 2, 3, 4, 5, 6-1 und 6-2 Bezug genommen wird.

Fig. 1 erläutert die Feststellung der Antigenizität der rekombinanten GST-DPD-Fusionsproteine, die in Beispiel 1 erzeugt wurden, mit Western-Blotting mit Anti-DPD-Peptid-2- Antikörpern. In Fig. 1 ist Bahn 1 ein Molekulargewichts marker, Bahn 2 ist GST-Protein selbst, Bahn 3 ist GST-DPD- Fusionsprotein.

Fig. 2 zeigt das Muster des Western-Blots der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung gegen menschliche Gewe behomogenisate, die DPD enthalten. In dieser Figur steht Bahn 1 für Molekulargewichtsmarker, Bahn 2 für rekombinantes DPD (rDPD), Bahn 3 für ein Xenotransplantat-Homogenisat einer Humantumorzellinie, HT-3, und die Bahnen 4, 5 und 6 sind für die verschiedenen menschlichen Lungenkarzinomhomogenisate.

Fig. 3 zeigt eine Kalibrierungskurve, die mit dem erfin dungsgemäßen ELISA erhalten wurde, der in Beispiel 3 beschrieben wird. In dieser Figur zeigt die horizontale Achse den Logarithmus der HT-3-Aktivität und die senkrechte Achse zeigt den Logarithmus der optischen Dichte (OD) bei der Wel lenlänge von 450 nm. Fig. 3 zeigt, daß der ELISA der vorlie genden Erfindung die Bestimmung der DPD-Aktivität über einen Bereich von etwa 2,5 bis etwa 170 pmol/min/ml ermöglicht.

Fig. 4 erläutert die Beziehung zwischen dem DPD-Gehalt, der mit einem DPD-Aktivitätsassay nachgewiesen wird, und dem ELISA der vorliegenden Erfindung, sowohl bei normalem Gewebe als auch bei Tumorgewebe der Brust. Der DPD-Aktivitätsassay wird mit einer üblichen DC-Methode durchgeführt unter Verwen dung von ¹⁴C-radioaktiver Markierung. Der hier verwendete ELISA ist der, der in Beispiel 3 beschrieben wird.

Fig. 5 erläutert die Ergebnisse der Untersuchung der Empfindlichkeit für Antitumorarzneimittel in der Reihe der 5-Fluor uracil-(5-FU)-Derivate, wie FURFUROLON, indem das Ver hältnis PyNPase/DPD bestimmt wird, wie in Beispiel 5 beschrieben. PyNPase-Gehalte wurden getestet unter Verwendung der von M. Nishida et al., 1996, in Biol. Pharm. Bull. 19 (11), 1407 bis 1411 beschriebenen Methode. Der hier verwen dete ELISA ist der, der in Beispiel 3 beschrieben wird.

Fig. 6 zeigt die Ergebnisse eines Immunpräzipitationsassays unter Verwendung von erfindungsgemäßen monoklonalen Antikör pern, wie in Beispiel 6 beschrieben.

Fig. 6-1(a) und (b) zeigt die Ergebnisse der SDS-PAGE, wobei in (a) die Überstände und in (b) die Eluate der Kügelchen der Immunpräzipitate gezeigt sind. Fig. 6-2(a), (b) und (c) zeigt die Ergebnisse eines Western-Blottings, wobei in (a) das Ergebnis gezeigt wird, das aus dem Überstand erhalten wird, der unter Verwendung eines Anti-DPD-1-Polypeptidanti körpers untersucht wird, (b) das Ergebnis ist, daß bei der Elution der Immunpräzipitate erhalten wird, die unter Verwen dung von Anti-DPD-1-Polypeptidantikörper untersucht werden und (c) das Ergebnis der gleichen Elutionen, wie in (b) zeigt, wobei der monoklonale Antikörper 3A5-6-1 der vorlie genden Erfindung für den Nachweis verwendet wurde. Die jewei ligen Bahnen entsprechen den Ergebnissen des Immunpräzipita tionsassays unter Verwendung der folgenden Proben: Bahn 1: Maus IgG1; Bahn 2: 2B6-11-1; Bahn 3: 2E2-B3-1-3; Bahn 4: B9-12-1 und Bahn 5: 9C7-30-1. Die Bahn c in Fig. 6-2(b) ist der Durchlauf von Homogenisat von HT-3 als positive Kontrolle.

Beispiel 1 Herstellung der Antigene

Wie vorher beschrieben wurde über die Nucleotidsequenz von menschlichem DPD und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz von H. Yokota et al., 1994, in J. Biol. Chem., 269, (37) 23192 bis 23196 berichtet (siehe SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2). Auf Basis der genetischen Information von Position 1170 bis Position 3164 von SEQ ID Nr. 1 wurde ein Fusionsprotein als Antigen hergestellt, wobei das Fusionsprotein exprimiert wurde als GST-DPD-Fusionsprotein mit Hilfe des Wirtsorganis mus E. coli JM 109, der mit dem Vektor pGEX 4 T-3 transfor miert war, der die unten beschriebene genetische Information trug.

1. Konstruktion eines DPD-Expressionsvektors

Auf Basis der genetischen Information von Position 1170 bis 3164 von SEQ ID Nr. 1 wurden drei DNA-Primer hergestellt, um ein Segment des DPD-Gens mit Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu klonieren. Primer 1 (Eco RI-linker + sense) wurde als 25- mer hergestellt mit einer Sequenz, die aus einem Eco RI-lin ker (CGCGAATTC) am 5'-Ende und einem positiven Strang, der Nucleotiden 1770 bis 1785 der SEQ ID Nr. 1 entsprach, bestand.
Primer 1: 5'-CGCGAATTCTTTTGAAGCTGGATGG-3' (SEQ ID NO: 3)
(1770 Eco RI-linker + sense)

Primer 2 (Eco RI-linker + antisense) wurde als 26-mer herge stellt mit einer Sequenz, die aus einem Eco RI-linker am 5'- Ende und einem negativen Strang, der komplementär zu den Nucleotiden 3148 bis 3164 von SEQ ID Nr. 1 war, bestand.
Primer 2: 5'-CGCGAATTCTCACCTTAACACACCGG-3' (SEQ ID NO: 4)
(3164 Eco RI-linker + antisense)

Primer 3 (antisense) wurde hergestellt als 16-mer mit einer Sequenz, die komplementär zu der Sequenz war, die den Nucleo tiden 3495 bis 3510 von SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Primer 3: 5'-AATCAAATATGGAGCA-3' (SEQ ID NO: 5)
(3510 antisense)

Die gesamte RNA wurde aus der humanen Lungendiploidzellinie WI 38 Zelle (ATCC CLL-75) mit einer üblichen Methode unter Verwendung eines RNA-Isolierungs-Kits (Stratagene, Lajolla, CA, USA) präpariert, auf Basis der sauren Guanidiniumthiocya natphenolchloroform-Extraktions-(AGCP)-Methode (siehe z. B. P. Chomczynski und N. Sacci, 1987, Anal. Biochem. 162, 156 bis 159) und wurde einer reversen Transkriptionsreaktion mit reverser Transkriptase RAV-2 unter Verwendung von Primer 3 unterzogen, um ein cDNA-Präparat zu erhalten. Bei der Reak tion wurden 1 µg der gesamten RNA 60 Minuten lang der rever sen Transkriptionsreaktion in 20 µl der Reaktionslösung bei 42°C unterzogen und danach wurde die reverse Transkriptase denaturiert durch 5-minütiges Erhitzen auf 95°C. Das cDNA-Prä parat, das so erhalten wurde, wurde bis zur Verwendung für die PCR-Amplifikation auf 4°C gehalten. Die für die Synthese der cDNA des ersten Strangs verwendete Pufferlösung enthielt 5 mM MgCl₂, jeweils 1 mM dGTP, dATP, dTTP und dCTP, RNase-In hibitor, 20 Einheiten reverse Transkriptase RAV-2 und 0,75 µM der Primer.

Dann wurde dieses cDNA-Präparat der PCR-Amplifikation unter zogen unter Verwendung der Primer 1 und 2 und eines kommer ziellen PCR-Kits, nämlich RT-PCR-Kit (Takara Shuzo, Shiga, Japan) nach den Anleitungen zur Verwendung des Kits mit der Ausnahme, daß DNA-Polymerase (3,5 Einheiten pfu) anstelle von Tag-Polymerase in einer Temperaturwechselvorrichtung (ZYMOREACTOR II, ATTO, Tokio, Japan) verwendet wurde. Die Pufferlösung für die PCR-Amplifikation mit einem Gesamtvolu men von 100 µl enthielt 2 mM MgCl2, jeweils 0,2 mM dGTP, dATP, dTTP und dCTP und jeweils 0,4 µM der Primer. Das PCR-Pro gramm war 32 Zyklen 30 Sekunden lang bei 94°C, 1 Minute lang bei 55°C und 4 Minuten lang bei 75°C. Die so amplifi zierten DPD-cDNA-Fragmente wurden mit Agarosegel-Elektropho rese isoliert als eine Bande, die 1,4 kbp entsprach, und dann unter Verwendung eines QIAEX11-Gel-Extraktions-Kits (QIAGEN, Hilden, Deutschland) gereinigt. Das gereinigte cDNA-Fragment wurde mit Eco-RI verdaut und das Eco-RI-Fragment wurde in die Eco-RI-Stelle des Vektors pGEX4T-3 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) unter Verwendung eines DNA-Ligierungs-Kits (Takara Shuzo, Shiga, Japan) bei 16°C über Nacht eingesetzt. Der so erhaltene Vektor (im folgenden als pGEX4T-3-DPD bezeichnet) konnte ein GST-DPD-Fusionsprotein exprimieren. Die Teil nucleotidsequenz des obigen Insertionsfragmentes wurde bestimmt und es wurde bestätigt, daß sie die erwartete Unter sequenz des DPD-Gens hatte.

2. Expression des GST-DPD-Fusionsproteins

E. coli JM109 (Toyobo, Osaka, Japan) wurde mit pGEX4T-3-DPD transformiert und der Transformant wurde in dem Medium SOB (20 g/l Bactotrypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 0,5 g/l Natri umchlorid, 0,186 g/l Kaliumchlorid und 0,95 g/l Magnesium chlorid; pH 7,0), das 50 µg/ml Ampicillin enthielt, bei einer Temperatur von 22°C gezüchtet, um das Fusionsprotein zu exprimieren. Die Zellen des E. coli-Transformanten wurden behandelt durch Zugabe von 0,5 mM IPTG (Isopropyl-β-D-thio galactopyranosid) und wurden etwa 16 Stunden lang bei 22°C inkubiert und anschließend einer Beschallung in einer gepuf ferten Lösung unterzogen, die 1% TRITON®-X100, 1% Sarcosyl, 10 mM DTT und 2 mM EDTA/PBS enthielt. Das Zellysat wurde zen trifugiert und die lösliche Fraktion wurde auf eine Glutathion-Sepharose-4B-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) aufgetragen. Das adsorbierte GST-DPD-Fusionsprotein wurde mit 10 mM reduziertem Glutathion eluiert. Das GST-DPD-Fusionspro tein wurde als Protein mit etwa 75 kDa auf SDS-PAGE identifi ziert.

Dieses Fusionsprotein wurde durch Reaktion mit einem Anti-DPD-Peptid antikörper bestätigt. Für diesen Zweck wurden zwei Peptide von DPD, nämlich Peptid 1 (SEQ ID Nr. 6) und Peptid 2 (SEQ ID Nr. 7) chemisch synthetisiert auf Basis der als SEQ Nr. 2 beschriebenen Sequenz und wurden mit KLH gekuppelt mit Hilfe der Glutaraldehydmethode, um die Antigene zu erhal ten, wie z. B. von Harlow et al., 1988, in "Antibodies: a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, New York, USA, Seiten 78 bis 79 beschrieben. Die jeweiligen Antigene in einer Menge von 200 µg wurden zusammen mit CFA den Kaninchen subcutan injiziert, um die Tiere zu immunisieren und anschließend erhielten die Tiere Booster-Dosen der gleichen Menge der Antigene mit IFA. Die so erzeugten Antiseren wurden mit einer KLH-Säule (einer Säule, auf der KLH auf einem Trä ger immobilisiert ist, nämlich Affigel-10, erhältlich von BioRad, Hercules, CA, USA) behandelt, um Anti-KLH-Antikörper zu entfernen und dann gereinigt, indem sie auf eine Protein-G-Säule (MAB Trap GII, Pharmacia, Uppsala, Schweden) oder eine Peptidsäule aufgetragen wurden und mit einem Puffer von 0,1 M Glycin-HCl, pH 3,0, eluiert wurden und anschließend mit 1 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, vor der Verwendung neutralisiert wurden. Die Peptidsäule wurde hergestellt, indem das oben erwähnte Peptid 1 oder Peptid 2 an Affigel-15 (BioRad, Hercu les, CA, USA) gekuppelt wurde. Beide polyklonalen Antikörper, gegen DPD-Peptid 1 und gegen DPD-Peptid 2, reagierten mit DPD aus menschlicher und Mäuseleber beim Western-Blotting und wurden daher verwendet, um die Erzeugung von GST-DPD-Fusions protein zu bestätigen. Wie oben beschrieben, wurde bestätigt, daß der Transformant das GST-DPD-Fusionsprotein erzeugte, durch Western-Blotting mit Anti-DPD-Peptid 2 (siehe Fig. 1). In Fig. 1 war Bahn 1 ein Molekülmarker, Bahn 2 GST-Protein selbst, Bahn 3 GST-DPD-Fusionsprotein. Wie auf Bahn 3 zu sehen ist, wurde bestätigt, daß das Fusionsprotein ein Pro tein mit etwa 75 kDa war.

Beispiel 2 Herstellung von monoklonalen Anti-DPD-Antikörpern 1. Zellfusion

GST-DPD-Fusionsprotein, das in Beispiel 1 hergestellt wurde (50 µg/Tier) wurde zusammen mit CFA in Balb/c-Mäuse in einem Volumen von 100 µl/Maus intraperitoneal injiziert und es folgte eine intraperitoneale Booster-Dosis von etwa 10 µg/Tier GST-DPD-Protein zusammen mit IFA zweimal nach einem Intervall von 2 Wochen. 3 Tage nach der letzten Immuni sierung wurden die sensibilisierten Mäuse getötet, um die Milz zu entfernen, und Milzzellen wurden präpariert. Die so erhaltenen Milzzellen wurden sorgfältig mit serumfreiem RPMI-1640-Me dium (Nikken Seibutu Igaku Kenkyusho, Kyoto, Japan) gewaschen, das auf etwa 37°C vorgewärmt worden war. Die anschließenden Fusionsverfahren wurden bei 37°C unter Verwen dung vorgewärmter Reagenzien, einschließlich der Pufferlö sung, durchgeführt.

Die Mausmyelomzellinie P3x63 Ag8-U1 (erhalten von Flow Labo ratories Ltd., Irvine, UK) wurde auch sorgfältig mit dem serumfreien RPMI-1640-Medium gewaschen. Die Milzzellen (etwa 4 × 10⁸) wurden mit der Mausmyelomzellinie P3x63 Ag8-U1 (8 × 10⁷) im Verhältnis von 5 : 1 vermischt und die Zellfusion wurde wie folgt durchgeführt. Die Mischung der Zellen wurde durch Zentrifugation pelletisiert und das Medium abgesaugt, dann wurden zu dem Pellet der Zellmischung 250 µl 50% Poly ethylenglycollösung (PEG1500, Boehringer Mannheim) langsam 1 Minute lang unter Rühren des Pellets mit der Spitze der Mikropipette zugegeben; anschließend wurden weitere 250 µl 50% PEG-Lösung langsam 1 Minute lang unter Rühren des Pellets mit der Spitze der Mikropipette zugegeben und dann wurde das Rühren durch sanftes Drehen des Röhrchens 2 Minuten lang fortgesetzt. Zu der Zellfusionsmischung wurden 50 ml serum freies RPMI-1640-Medium (Nikken Seibutu Igaku Kenkyusho, Kyoto, Japan) langsam tropfenweise 5 Minuten lang zugegeben und die Zellen wurden durch Zentrifugation gewaschen, um PEG zu entfernen.

Die Mischung der nach der Zellfusion pelletisierten Zellen wurde wieder in einem Medium aus RPMI-1640 (Nikken Seibutu Igaku Kenkyusho, Kyoto, Japan), das 10% fötales Kälberserum (FCS), Penicillin/Streptomycin und 2 ME enthielt, suspendiert und in die Näpfe von 96-Napf-Platten pipettiert, die dann unter 5% CO₂ bei 37°C inkubiert wurden. An den Tagen 2, 4 und 7 während der Inkubation wurde die halbe Menge des Mediums in jedem Napf durch HAT-Medium (hergestellt durch Zugabe von HAT-Lösung (Flow Laboratories Ltd., Irvine, UK) zu 10% FCS, das RPMI-Medium enthielt) ersetzt und die Inkubation wurde fortgesetzt. Vom 10. Tag der Inkubation an wurden in einigen der Näpfe traubenförmige Kolonien gebildet und schließlich wurde die Vermehrung der Hybridomazellen in 1056 Näpfen beobachtet.

2. Screenen der monoklonalen Antikörper (2-1) Primäres Screenen

Alle Näpfe, bei denen eine Vermehrung der Hybridomas beobach tet wurde, wurden mit ELISA (Enzym-linked Immunosorbent Assay) auf positive Näpfe wie folgt untersucht. Die Näpfe von 96-Napf-Immunoplatten (Maxisorp, Nunc, Roskilde, Dänemark) wurden mit GST-DPD-Fusionsprotein oder GST beschichtet unter Verwendung einer Menge von 50 µl/Napf der Lösungen, die 1 µg/ml jedes Proteins enthielten. Nicht adsorbiertes Protein wurde mit TTBS ausgewaschen und die Blockierung wurde bewirkt durch 1-stündige Inkubation mit TBS, das 3% Magermilch ent hielt. Die Näpfe wurden wiederum mit TTBS gewaschen und es wurden 50 µl/Napf des Hybridomakulturüberstandes zugegeben und 1 Stunde auf 37°C gehalten. Nachdem die entsprechenden Näpfe mit TTBS dreimal gewaschen worden waren, wurde mit Meerrettichperoxidase (HRP) markiertes Ziege-Antimaus-Immun globulin IgG+A+M (KPL) zugegeben und die Platten wurden 1 Stunde als auf 37°C gehalten. Die jeweiligen Näpfe wurden viermal mit TTBS gewaschen und dann wurde ein Substrat (TMB, Microwell Kit System, KPL) zugegeben. Nach Abschluß der Reak tion durch Zugabe von 1 M Phosphorsäure wurde die Absorption bei 450 nm gemessen unter Verwendung eines Mikroplattenlese geräts. Die positiven Näpfe, die stärker mit der Schicht aus GST-DPD-Fusionsprotein reagierten als der mit GST, wurden als Primärvorrat zusammengefaßt.

(2-2) Sekundäres Screenen

Um die Wirksamkeit des Screenens sicherzustellen, wurde ein zweites Screenen durchgeführt unter Verwendung eines rekombi nanten Proteins mit der vollständigen DPD-Sequenz bei einem Western-Blotting.

(A) Herstellung eines rekombinanten Proteins mit der vollen Sequenz von DPD

Ein rekombinantes Protein mit der vollen Sequenz von DPD wurde hergestellt, indem die gesamte Länge der cDNA von DPD auf Basis der RT-PCR-Klonierung hergestellt wurde und durch Expression des in einen E. coli-Expressionsvektor, pTrcHisA (Invitrogen, San Diego, USA), eingesetzten Gens, wobei diese Methode im wesentlichen die gleiche war wie die im Fall der Klonierung und Expression des GST-DPD-Fusionsproteins beschriebene.

Zuerst wurde cDNA des ersten Strangs hergestellt durch eine reverse Transkriptionsreaktion eines mRNA-Präparats von Humanplacenta und Leber (Clontech, Palo Alto, CA, USA) unter Verwendung des synthetischen Primers 2 und von RAV-2-reverse Transkriptase. Dann wurde eine PCR-Amplifikation der vorgese henen cDNA durchgeführt unter Verwendung der synthetischen Primer 1 und Primer 2 und von pfu DNA-Polymerase (Stratagene, Lajolla, CA, USA). Die PCR wurde durchgeführt unter Verwen dung eines Takara RT-PCR-Kits nach den Anleitungen zur Ver wendung in einer Temperaturwechselvorrichtung ZYMOREAKTOR 11 (ATTO, Tokio, Japan) mit 35 Zyklen 30 Sekunden bei 94°C, 1 Minute bei 55°C und 8 Minuten bei 75°C. Die so amplifizierten cDNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese auf 1% Agarosegel getrennt und die DNA in der gewünschten Bande wurde gereinigt unter Verwendung des DNA-Reinigungskits QIAEX11 (QIAGEN, Hilden, Deutschland). Das gereinigte cDNA-Fragment wurde mit Eco-RI verdaut und anschließend in die Eco-RI-Stelle eines Expressionsvektors subkloniert, nämlich pTrcHisA (Invitrogen, San Diego, USA). Die so klonierte DPD-cDNA exprimierte ein Protein mit etwa 120 kDa als Fusionsprotein des vollständigen DPDs mit einem mit Histidin markierten Protein, das für das weitere Screening verwendet wurde.

(B) Screenen

Das oben erhaltene rekombinante DPD wurde einer Elektropho rese auf NPG-D520L-Gel (Pagel, ATTO, Tokio, Japan) nach der Methode von Laemmli unterworfen und das Protein wurde auf PVDF-Membranen (Immobilon, Millipore, Bedford, MA, USA) geblottet unter Verwendung eines Semi-Dry-Blotters (ATTO, Tokio, Japan). Die PVDF-Membranen, auf die das DPD-Protein geblottet wurde, wurden blockiert unter Verwendung von TBS, das 3% Magermilch enthielt, und wurden mit TTBS gewaschen und anschließend 1 Stunde lang der Reaktion mit den Kulturüber ständen der Hybridomas, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf einem Screener Blotter Mini 28 (Sanplatec Corp., Japan) bei Raumtemperatur unterzogen. Dann wurden die PVDF-Membranen nach dem Waschen mit TTBS mit mit HRP-markiertem Ziege-Anti maus-IgG+A+M-Antikörper (KPL) 1 Stunde lang bei Raumtempera tur umgesetzt. Die Membranen wurden wiederum mit TTBS gewa schen und einer Farbreaktion ausgesetzt unter Verwendung von Konica Immunostaining HRP-1000 (Konica, Tokio, Japan). Die Kolonien, wie z. B. die, die mit 2B6, 9C7, 5E6, 3A5 und 6H5 bezeichnet wurden, die stark mit dem rekombinanten DPD mit etwa 120 kDa reagierten, wurden als Kandidaten gesammelt. Ein monoklonaler Antikörper, der von einem speziellen Hybridom erzeugt wird, z. B. Hybridom 2B6, wird hier bezeichnet, indem "Mab" dem Anfang des Namens des Hybridoms zugefügt wird, z. B. Mab-2B6.

Die obigen Kandidaten wurden kloniert, indem die Grenzwert- Verdünnungsmethode zwei- oder mehrmals wiederholt wurde, um die Hybridomazellinien zu etablieren (einschließlich z. B. 2B6-11-1, 9C7-30-1, 5E6-19-1, 3A5-6-1 und 6H5-42-1). Nach der ersten Grenzwert-Verdünnung wurde die Spezifität der obigen monoklonalen Antikörper, d. h. Mab-2B6-11, Mab-9C7-30, Mab-5E6-19, Mab-3A5-6 und Mab-6H5-42 mit Western-Blotting ausge wertet unter Verwendung der DPD-haltigen Flecken.

Fig. 2 zeigt die Ergebnisse des Western-Blottings für mono klonale Antikörper, die mit den Hybridomazellinien 2B6-11, 9C7-30, 3A5-6-1, 5E6-19 und 6H5-42 erzeugt wurden. Wie in dieser Figur gezeigt, wurden die entstehenden Immunokonjugate mit den Antikörpern und DPD rund um die Position des Moleku largewichts von etwa 110 bis 120 kDa beobachtet.

Die Unterklasse der monoklonalen Antikörper, die mit den obi gen Hybridomazellinien erzeugt wurden, wurde untersucht unter Verwendung des Maus-Mono-Ab-ID-EIA-Kits (Zymed, San Francisco, CA, USA) und wurde bestimmt als Mab-2B6-11-1 (IgGl, κ), Mab-9C7-20-1 (IgGl, κ), Mab-5E6-19-1 (IgG3, κ), Mab-3A5-6-1 (IgM, κ) bzw. Mab-6H5-42-1 (IgM, κ). Es wurde bestätigt, daß die obigen monoklonalen Antikörper für ein Sandwich-ELISA zum Nachweis von DPD anwendbar waren. Um jedoch ein empfindlicheres ELISA-System zu erzeugen, wurde beschlossen, ein weiteres Screening durchzuführen, da die Konzentration von DPD in Tumorgeweben niedriger als in Leber erwartet wurde und eine hohe Empfindlichkeit erwünscht ist, um eine Unterscheidung zwischen einem DPD-Mangelgehalt und einem normalen Gehalt zu treffen.

(2-3) Drittes Screenen

Es wurde der monoklonale Antikörper von Hybridom 3A5-6-1 als Repräsentant genommen, und weitere monoklonale Antikörper, die andere Epitope erkennen, als die, die von dem Antikörper Mab-3A5-6-1 erkannt werden, und die-eine höhere Empfindlich keit beim Nachweis von DPD in Geweben, als die oben erwähnten Antikörper erreichen, gescreent.

Der monoklonale Antikörper Mab-3A5-6-1 wurde verwendet, um die Näpfe der Platte zu beschichten unter Verwendung von 50 µl/Napf in einer Konzentration von 10 µg/ml und nachdem unge bundener Antikörper entfernt worden war, wurden die jeweili gen Näpfe 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert unter Verwendung von TBS, das 3% Magermilch enthielt. Nach dem Waschen mit TTBS wurden die Näpfe mit 50 µl/Napf eines Maus-Leber-Homo genisats in einer Konzentration von etwa 2 mg/ml bei Raumtemperatur 1 Stunde lang umgesetzt. Nach Waschen mit TTBS wurden die Näpfe mit dem Primärvorrat des Hybridoma kulturüberstandes in einer Menge von 50 µl/Napf 1 Stunde lang bei 37°C umgesetzt. Nachdem wiederum mit TTBS gewaschen wor den war, wurden die Näpfe mit mit HRP markierten Ratten-Anti maus-IgG1-spezifischen monoklonalen Antikörpern (Zymed, San Francisco, CA, USA) 1 Stunde lang bei 37°C umgesetzt. Nach dem Waschen mit TTBS wurden die Näpfe einer Farbentwicklung mit dem TMB-Mikronapf-Peroxidase-Kitsystem (KPL) unterzogen, dann wurde die Reaktion gestoppt durch Zugabe von 1 M Phos phorsäure und die Absorption wurde bei 450 nm gemessen unter Verwendung eines Mikrotiterplattenlesegeräts.

Die 22 Näpfe mit starker Reaktion wurden bestimmt und die Hybridomas dieser Näpfe wurden einem weiteren Screenen unter zogen auf gleiche Weise, wie oben beschrieben, indem das Maus-Leber-Homogenisat durch die Homogenisate von Humantumor zellinien HT-3 und MCF-7 ersetzt wurde. Das HT-3 hatte eine DPD-Aktivität von 160 pmol/min/mg Protein und wurde als ein zige Bande um etwa 110 kDa mit Western-Blotting nachgewiesen unter Verwendung von Kaninchen-Anti-DPD-Peptid 1 oder poly klonalem Anti-Peptid-2-Antikörper. Während andererseits die Zellinie MCF-7 eine DPD-Aktivität von etwa 1,6 pmol/min/mg hatte, wurde sie bei dem gleichen Western-Blotting nicht nachgewiesen. Somit wählten die Erfinder die Hybridomas aus (als 4B9 und 2E2 bezeichnet), die stark mit der Zellinie HT-3, nicht aber mit der Zellinie MCF-7, reagierten. Diese Hybridomas 4B9 und 2E2 wurden weiter zwei- oder mehrmals der Grenzwert-Verdünnungsmethode unterzogen und die Hybrido maklone 4B9-12-1 und 2E2-B3-1-3 (deren Antikörper als IgG1, κ, bestimmt wurden) wurden etabliert.

Die monoklonalen Antikörper Mab-4B9-12-1 und Mab-2E2-B3-1-3 wurden in ihrer Spezifität für DPD-Antigene in solubilisier tem Zustand durch Immunpräzipitation bestätigt.

(2-4) Reinigung der monoklonalen Antikörper

Im allgemeinen wird, sobald ein Hybridom, das erfindungsge mäße monoklonale Antikörper erzeugen kann, etabliert ist, die Herstellung und Reinigung der monoklonalen Antikörper durch geführt, mit zur Herstellung und Reinigung von monoklonalen Antikörpern im Stand der Technik bekannten Mitteln. Z.B. kann die Herstellung der monoklonalen Antikörper durchgeführt wer den, indem die Hybridomazellen in einem geeigneten Kultur medium gezüchtet werden und die Antikörper aus der Kultur gewonnen und gereinigt werden. Alternativ kann die Vermehrung der Hybridomazellen durchgeführt werden, indem die Zellen in peritoneale Ascites der Maus gepflanzt werden. Die Herstel lung und Reinigung der monoklonalen Antikörper wird mit einer üblichen Methode durchgeführt, die beispielsweise im folgen den für spezifische monoklonale Antikörper ausgeführt ist.

1) Mab-4B9-12-1

Die Hybridomazellinie 4B9-12-1 wurde in einem serumfreien Medium (PM 1000-Kit, Eiken, Tokio, Japan) bei einer Zellkon zentration von etwa 5 × 10⁵/ml gezüchtet. Der Überstand der Kultur wurde gesammelt und die Antikörper (IgG) wurden gerei nigt, indem der Überstand auf eine HiTrap-Protein-G-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) wie folgt aufgetragen wurde.

Die HiTrap-Protein-G-Säule wurde mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) equlibriert und dann wurde das Überstandpräparat auf die Säule aufgetragen. Nach dem Waschen der Säule mit 20 mM phos phatgepufferter Kochsalzlösung wurden die IgG-Fraktionen mit 0,1 M Glycin-HCl-Puffer (pH 3,0) eluiert. Das so gesammelte Eluat wurde mit 1 M Tris-HCl (pH 9,0) neutralisiert und dann gegen PBS dialysiert. Die Proteinbestimmung der gereinigten Antikörperfraktion unter Verwendung des BIO-RAD Dc-Protein- Assay-Kits (Biorad, Hercules, CA, USA; die Kontrolle war BSA) zeigte etwa 4 mg Antikörper aus 300 ml Kulturüberstand. Die Unterklasse dieses monoklonalen Antikörpers wurde bestimmt als IgG1, κ.

2) Mab-3A5-6-1

Eine Woche nach der Injektion von 0,5 ml Pristan (Sigma, St. Louis, MO, USA) intraperitoneal in Mäuse, wurden 5 × 10⁶ Hybridoma-3A5-6-1-Zellen in die Bauchhöhle der Tiere durch Injektion geimpft. Nach 2 Wochen wurde Ascites von den Tieren gesammelt, zentrifugiert und durch 0,8 um Membranfilter fil triert. Die Reinigung der Antikörper (IgM) wurde durchgeführt unter Verwendung des ImmunoPure IgM-Reinigungskits (Pierce, Rockford, Illinois, USA). Zu 0,5 ml Ascites wurden 0,5 ml ImmunoPure IgM-Bindungspuffer zugegeben und die Mischung auf eine ImmunoPure-Immobilized-MBP-Säule aufgetragen. Nach dem Waschen der Säule mit ImmunoPure IgM-Bindungspuffer wurden die Antikörper mit ImmunoPure IgM-Elutionspuffer eluiert und die Fraktion der Antikörper wurde gegen PBS dialysiert. Die Proteinbestimmung unter Verwendung von BSA als Kontrolle zeigte, daß etwa 2 mg Antikörper (IgM) aus etwa 0,5 ml Ascites erhalten worden waren.

Beispiel 3 ELISA unter Verwendung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper

Als immunologische quantitative Assays sind Ein- Punkt-Bin dungsmethoden und Zwei-Punkt-Bindungsmethoden (sogenannte Sandwichassays) im Stand der Technik wohlbekannt. Es kann allgemein gesagt werden, daß Zwei-Punkt-Bindungsmethoden vor teilhaft sind, da eine höhere Genauigkeit und höhere Empfind lichkeit erreicht wird. Die im obigen Beispiel 2 erhaltenen monoklonalen Antikörper wurden verwendet, um Sandwich-ELISA- Assaysysteme, wie unten beschrieben, zu entwickeln.

(a) Beschichtung mit dem ersten Antikörper

Eine Lösung von Mab-4B9-12-1 wurde hergestellt unter Verwen dung von PBS (pH 7,4) in einer Konzentration von 10 µg/ml und 50 µl dieser Lösung wurden zu jedem Napf von 96-Napf-Immuno platten (Maxsorp, Nunc, Roskilde, Dänemark) zugegeben und die Näpfe wurden mit einem Membrandichtungsmittel verschlossen und bei 4°C über Nacht inkubiert, um den Antikörper zu immo bilisieren (in diesem Beispiel wurden die Platten während der Inkubation verschlossen).

Nach der Gewinnung von ungebundenem Antikörper wurden die Näpfe mit TTBS gewaschen und dann blockiert, indem mit TBS, das 3% Magermilch enthielt, 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert wurde.

(b) Anwendung der Proben

Als Standardprobe, die DPD enthielt, wurde ein HT-3-Xeno transplantat-Homogenisat in einer Konzentration von 2 mg/ml hergestellt. Eine Reihenverdünnung des Homogenisats wurde mit TBS, das 1% Magermilch enthielt, hergestellt und 50 µl der Proben wurden in die jeweiligen Näpfe gegeben und dann wurde die Immunoplatte bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert.

(c) Reaktion mit dem zweiten Antikörper

Nach dem Waschen der Näpfe mit TTBS wurde die zweite Antikör perlösung, die 2 µg/ml Mab-3A5-6-1 in TBS, das 3% Magermilch enthielt, enthalten war, jedem Napf in einem Volumen von 50 µl zugegeben und die Immunoplatte wurde bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert. Durch diese Behandlung wurde ein Immunkonju gat von [Mab-4B9-12-1]-[DPD]-[Mab-3A5-6-1], worin DPD sand wichartig zwischen den zwei monoklonalen Antikörpern angeord net war, erzeugt, wenn DPD in den obigen Proben vorhanden war.

(d) Markierung

Für den Nachweis des Konjugats wurde mit HRP markiert er Rat ten-Antimaus-IgM-Antikörper (Zymed, San Francisco, CA, USA) verwendet, um das Konjugat zu markieren. Dieser im Handel erhältliche markierte Antikörper wurde nach einer 1000-fachen Verdünnung mit TBS, das 3% Magermilch enthielt, verwendet.

Die Näpfe der Immunoplatte wurden mit TTBS gewaschen und es wurden 50 µl des obigen mit HRP markierten Antikörpers zuge geben und die Platte wurde 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert.

(e) Nachweis

Nach dem Waschen der Näpfe wurde die Farbreaktion durchge führt, indem das TMB-Mikronapf-Peroxidase-Kitsystem (KPL) verwendet wurde, das TMB und H₂O₂ als Substrat enthielt, zur Entwicklung der Farbe in der enzymatischen Reaktion, die durch HRP katalysiert wird. Die Substratlösung wurde den jeweiligen Näpfen zugegeben und nachdem die Reaktion durch Zugabe von 1 M Phosphorsäure gestoppt worden war, wurde die Absorption der Näpfe bei 450 nm gemessen mit einem Mikroplat tenlesegerät (BioRad, Hercules, CA, USA).

Die repräsentativen Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten zusam mengefaßt und die Kalibrierungskurve, die mit dem obigen ELISA-System mit Mab-4B9-12-1 und Mab-3A5-6-1 erhalten wurde, ist in Fig. 3 dargestellt. In dieser Figur steht die hori zontale Achse für den Logarithmus der HT-3-Aktivität und die senkrechte Achse für den Logarithmus der optischen Dichte, gemessen bei einer Wellenlänge von 450 nm. Wie in Fig. 3 gezeigt, ermöglicht es das ELISA-System der vorliegenden Erfindung, die DPD-Aktivität über einen Bereich von etwa 2,5 bis etwa 170 pmol/min/ml zu bestimmen. Diese hohe Empfind lichkeit des DPD-ELISA-Assays ist nützlich zur Bestimmung des DPD-Gehaltes in biologischen Proben aus dem menschlichen Kör per. Außerdem macht es der obige DPD-ELISA möglich, den DPD-Gehalt Proben zu bestimmen bei einer Mangelkrankheit, von der bekannt ist, daß ein sehr geringer DPD-Gehalt vorhanden ist.

Tabelle 1

Beispiel 4 Vergleich der Ergebnisse des ELISA und der DPD-Aktivität

Die Korrelation zwischen dem mit dem vorliegenden in Beispiel 3 beschriebenen ELISA-Verfahren bestimmten Gehalt und dem Anteil der enzymatischen Aktivität von DPD wurde untersucht. Die Proben waren Brustkrebsgewebe und benachbartes normales Gewebe, das chirurgisch entnommen wurde. Die Proben wurden in Form von Gewebehomogenisaten präpariert. Kurz gesagt wurden zuerst Tumor und normales Gewebe in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), der 15 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂ und 50 mM Kaliumphosphat enthielt, homogenisiert und dann mit 105 000 × g 90 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde über Nacht gegen 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) und 1 mM 2-Mercaptoethanol dialysiert.

Die DPD-Aktivität wurde mit einer DC-Plattenmethode bestimmt, ähnlich der von Fernandez-Salguero et al., 1995, in Biochem. Pharm. 50, 1015 bis 1020, beschriebenen, wobei die Summe der 5-FU-Kataboliten, d. h. Dihydrofluoruracil, α-Fluor-β-ureido propionat und α-Fluor-β-alanin, die aus [6-¹⁴C]5-FU gebildet wurden, wie oben beschrieben gemessen wurde. Der ELISA wurde auf gleiche Weise durchgeführt, wie in Beispiel 3 beschrie ben, unter Verwendung eines Scaber-Xenotransplantat-Homogeni sats (105 pmol/min/mg) als Standard.

Jede Probe wurde sowohl mit dem obigen DC-Plattenverfahren als auch mit ELISA getestet und die Daten für jede Probe wur den auf einem Diagramm aufgetragen, auf der vertikalen Achse die Menge an DPD in pmol/min/mg, die mit ELISA gemessen wurde, und auf der horizontalen Achse die DPD-Aktivität, die mit der DC-Methode gemessen wurde, wie in Fig. 4 gezeigt. Eine hohe Korrelation zwischen den Ergebnissen für den Akti vitätstest und den ELISA der vorliegenden Erfindung wurde bestätigt sowohl für Tumorgewebe als auch für normale Gewebe.

Beispiel 5 Anwendung des erfindungsgemäßen ELISA, um die Wirksamkeit von Antitumorarzneimitteln in der Reihe der 5-Fluoruracil-(5-FU)-Deri vate, wie FURTULON, zu messen

Einer der Repräsentanten der Antitumorarzneimittel in der Reihe der 5-Fluoruracil-(5-FU)-Derivate, nämlich FURTULON (5'-Desoxy-5-fluoruridin (5'-dFUrd)) ist ein Proarzneimittel oder Prodrug, das durch Einwirkung von Pyrimidinnucleo sidphosphorylase (PyNPase), d. h. Thymidinphosphorylase in menschlichen Zellen, in 5-FU umgewandelt wird.

Ein geeignetes Testsystem wurde entwickelt, zur Auswertung des Verhältnisses von PyNPase/DPD in Tumorgewebe. Dieses System umfaßt eine Kombination von ELISA-System für den Nach weis von PyNPase, wie von M. Nishida et al., 1996, Biol. Pharm. Bull. 19 (11), 1407 bis 1411 beschrieben, und dem ELISA-System der Erfindung, wie im obigen Beispiel 3 beschrieben.

Um zu untersuchen, ob das Verhältnis PyNPase/DPD ein Marker für die Wirksamkeit von FURTULON ist, wurde dieses Verhältnis für eine Anzahl von Tumorgeweben bestimmt, von denen bereits bekannt war, daß sie für FURTULON empfindlich sind, und für eine Anzahl von Tumorgeweben, von denen bereits bekannt war, daß sie refraktär für FURTULON sind. Die Zellinien, die als beispielhaft für FURTULON-empfindliche Gewebe verwendet wur den, sind die folgenden neun Humantumorxenotransplantat- Zellinien: Scaber (schuppenförmiges Karzinom (ATCC HTB-3), ZR-75 (Brustkarzinom), MCF-7 (Brustadenokarzinom, ATCC HTB- 22), LoVo (Kolorektalkrebs, ATCC CCL-229), MEN45 (Magen krebs), SIHA (schuppenförmiger Krebs), ME-180 (Epidermalkar zinom), HCT116 (Kolorektalkrebs) und COLO205 (Kolorektal krebs, ATTCC CCL-222). Die als beispielhaft für FURTULON-re fraktäre Gewebe verwendeten Zellinien sind die folgenden sieben xeno-Transplantat-Zellinien: SK-OV-3 (Eierstocktumor, ATCC HTB-77), MAD-MB-231 (Brustkarzinom), HT-29 (Kolorektal krebs, ATCC HTB-38), T-24 (Blasenkrebs, ATCC HTB-4), PC-3 (Prostataadenokarzinom), WiDr-1 (Kolorektalkrebs, ATCC CCL-218) und MKN28 (Magenkrebs).

Die auf Basis des erfindungsgemäßen ELISA-Systems bestimmten Verhältnisse sind in dem Diagramm von Fig. 5 aufgetragen.

Wie in dieser Figur gezeigt, zeigten die FURTULON-empfind lichen Zellinien wesentlich höhere Verhältnisse von PyNPase/DPD, als die refraktären Zellinien.

Dieses Ergebnis zeigt, daß das Verhältnis von PyNPase/DPD in Tumorgeweben geeignet ist, um die Wirksamkeit von FURTULON bei der Behandlung von Patienten, die unter einem Tumor leiden, zu messen.

Beispiel 6 Immunpräzipitationstest unter Verwendung von erfindungs gemäßen monoklonalen Antikörpern

Ein Xenotransplantat-Homogenisat der Tumorzellinie HT-3 wurde als biologische Probe, die DPD enthielt, verwendet. Das Xenotransplantat-Homogenisat (8,6 mg/ml) wurde zweimal über eine Protein-G-Sepharose-4B-Säule laufen gelassen, um Anti körper zu absorbieren, die von dem Wirt stammten, und wurde folgenden Immunpräzipitationsassay unterzogen.

In die Röhrchen, die 150 µl HT-3-Xenotransplantat-Homogenisat enthielten, wurden 5 µg erfindungsgemäße monoklonale Antikör per, die getestet werden sollten, gegeben und die Röhrchen wurden 2 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Dann wurden jeweils 20 µl 50% Protein G-Sepharose 4B (Sigma, St. Louis, MO, USA) den Röhrchen zugegeben und die Mischungen wurden weitere 2 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Nach der Reaktion wurden die Mischungen zentrifugiert, um sie in Kugelfraktionen und Über stände aufzutrennen. Die gesammelten Kugelfraktionen wurden mit 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) fünfmal gewaschen und dann mit 60 µl 0,1 M Glycin-HCl-Puffer (pH 3,0) eluiert; die Eluate wurden mit 3 µl 1 M Tris-HCl (pH 8,0) neutrali siert, um die Präparate der Immunpräzipitation zu erhalten.

Die Proben der Überstände und die Eluate der Kugelfraktionen, die im folgenden als Kugeleluate bezeichnet werden, wurden mit SDS-PAGE und Western-Blotting analysiert.

Fig. 6 zeigt die Ergebnisse des Immunpräzipitationsassays unter Verwendung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikör per Mab-2B6-11-1, Mab-2E2-B3-1-3, Mab-4B9-12-1 und Mab-9C7-30-1.

Die Fig. 6-1(a) und (b) zeigen das elektrophoretische Muster der SDS-PAGE, wobei (a) die Überstände betrifft und (b) die Kugeleluate der Immunpräzipitate betrifft, wobei die Banden sichtbar gemacht wurden durch Anfärbung mit Silber (2D-Silberfärbung Daiichi, Daiichi Pure Chemicals, Tokio, Japan).

Fig. 6-2(a), (b) und (c) zeigt die Ergebnisse des Western- Blottings, wobei (a) das Ergebnis ist, das mit dem Überstand erhalten wurde, der unter Verwendung des Anti-DPD-1-Polypep tidantikörpers nachgewiesen wurde, (b) das Ergebnis ist für die Kugeleluate der Immunpräzipitate, die unter Verwendung Anti-DPD-1-Polypeptidantikörper nachgewiesen wurden und (c) das Ergebnis zeigt für die gleichen Kugeleluate, wie (b), wobei der monoklonale Antikörper 3A5-6-1 der vorliegenden Erfindung zum Nachweis verwendet wurde. Die jeweiligen Bahnen entsprechen den Ergebnissen des Immunpräzipitationsassays unter Verwendung der folgenden Proben: Bahn 1: Maus IgG; Bahn 2: 2B6-11-1; Bahn 3: 2E2-B3-1-3; Bahn 4: 4B9-12-1 und Bahn 5: 9C7-30-1. Die Bahn c in Fig. 6-2(b) ist der Durchlauf des Homogenisats von HT-3 als positive Kontrolle.

Wie in Fig. 6-1(b) gezeigt, wurde die Immunpräzipitation beobachtet bei den Banden, die etwa 120 kDa entsprechen, im Fall der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung, Mab-2E2-B3-1-3 (Bahn 3) und Mab-4B9-12-1 (Bahn 4). Auf dem PAGE-Gel entsprechen die Banden, die bei etwa 50 kDa und 25 kDa zu sehen sind, der schweren Kette und der leichten Kette der verwendeten Antikörper.

Gleichzeitig wurde ein Western-Blotting durchgeführt unter Verwendung des Überstands und des Kugeleluats. Entweder Kaninchen-Anti-DPD-Peptid-1-Antikörper oder Mab-3A5-6-1 wurde zum Nachweis von DPD verwendet. Wie in Fig. 6-1(a) gezeigt, wurde die DPD entsprechende Bande nicht beobachtet bei den Proben des Überstandes (siehe Bahnen 3 und 4), während die einzelnen Banden rund um 120 kDa beobachtet wurden unter Ver wendung von Anti-DPD-1-Antikörper oder Mab-3A5-6-1 in den Proben, die aus den Kugeln eluiert wurden, die aus der Immun präzipitation mit Mab-4B9-12-1 und Mab-2E2-B3-1-3 entstanden, wie in Fig. 6-2(b) und (c) gezeigt, was darauf hindeutet, daß die einzelne Bande, die bei 120 kDa auf SDS-PAGE beobach tet wurde, DPD entsprach. Weiterhin wurden die DPD-Aktivitä ten in den Proben der Kugeleluate aus den Immunpräzipitaten mit Mab-4B9-12-1 und dem entsprechenden Überstand untersucht und es wurde nur bei den Kugeleluaten der Immunpräzipitate DPD-Aktivität gefunden, wie in Tabelle 2 unten gezeigt.

Tabelle 2

[DPD-Aktivität: pmol/min/ml]

HT-3-Homogenisat/Mab + Kügelchen

Diese Ergebnisse zeigen, daß die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung, d. h. Mab-4B9-12-1 und Mab-2E2-B3-1-3 das aktive DPD-Molekül mit der nativen Konformation erkennen und daß die Spezifität dieser Antikörper für DPD sehr hoch ist, da ihre Immunpräzipitate als einzelne Banden gezeigt werden.

Außerdem wurde bestätigt, daß Mab-3A5-6-1 spezifisch das DPD-Molekül erkennt, das auch von Mab-4B9-12-1 spezifisch erkannt wurde, was die Verläßlichkeit des Sandwich-ELISA-Systems unter Verwendung dieser monoklonalen Antikörper der vorlie genden Erfindung sicherstellt.

Wie der Fachmann auf diesem Gebiet leicht sehen kann, sind erfindungsgemäße monoklonale Antikörper auch geeignet zur Herstellung einer Affinitätssäule für die Reinigung von DPD.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Monoklonaler Antikörper, der Dihydropyrimidindehydro genase (DPD) spezifisch erkennt.

2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß er humane Dihydropyrimidindehydrogenase spezifisch erkennt.

3. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er eine starke Reaktivität mit einem Homogenisat der Humantumorzellinie HT-3 (ATCC HTB-32), aber eine geringe oder keine Reaktivität mit einem Homogenisat der Humantumorzellinie MCF-7 (ATCC HTB-22) zeigt.

4. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 3, dadurch gekenn zeichnet, daß das Immunpräzipitat, das mit einem Homoge nisat der Humantumorzellinie HT-3 (ATCC HTB-32) erhalten wird, eine einzige Bande zeigt, wenn mit SDS-PAGE analy siert wird.

5. Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der mit einer Hybridomazellinie erzeugt werden kann, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Hybridoma zellinien 2B6-11-1, 9C7-30-1, 5E6-19-1, 3A5-6-1 (FERM BP-6015), 6H5-42-1, 4B9-12-1 (FERM BP-6016), 2E2-B3-1-3 (FERM BP-6014) und 3B12-B1-56-1-2.

6. Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er an DPD in äquivalenter Weise bindet, wie ein monoklonaler Antikörper nach Anspruch 5.

7. Hybridomazellinie, die einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erzeugt.

8. Hybridomazellinie nach Anspruch 7, dadurch gekennzeich net, daß sie ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hybridomazellinien 2B6-11-1, 9C7-30-1, 5E6-19-1, 3A5-6-1, 6H5-42-1, 4B9-12-1, 2E2-B3-1-3 und 3B12-B1-56-1-2.

9. Paar monoklonaler Antikörper umfassend einen ersten monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen zweiten monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der erste monoklonale Antikör per und der zweite monoklonale Antikörper verschiedene Epitope erkennen.

10. Paar nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der erste monoklonale Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mab-3A5-6-1, Mab-6H5-42-1 und Mab-3B12-B1-56-1-2, und der zweite Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mab-4B9-12-1, Mab-2E2-B3-1-3, Mab-9C7-30-1, Mab-2B6-11-1 und Mab-5E6-19-1.

11. Paar nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der erste monoklonale Antikörper Mab-3A5-6-1 ist und der zweite monoklonale Antikörper Mab-4B9-12-1 ist.

12. Paar nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der erste monoklonale Antikörper Mab-3A5-6-1 ist und der zweite Antikörper Mab-2E2-B3-1-3 ist.

13. Kit zum Nachweis und/oder zur Bestimmung der Menge von Dihydropyrimidindehydrogenase in einer biologischen Probe, der

(a) mindestens einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und
(b) eine Markierung zum qualitativen und/oder quantita tiven Nachweis des Immunkonjugats aus monoklonalem Antikörper und Dihydropyrimidindehydrogenase umfaßt.

14. Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Paar monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 9 bis 11 und eine Markierung zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis des Immunokonjugats aus mono klonalem Antikörper und Dihydropyrimidindehydrogenase umfaßt.

15. Verwendung eines Kits nach Anspruch 13 oder Anspruch 14 zum Nachweis und/oder zur Bestimmung der Menge von Dihydropyrimidindehydrogenase in einer biologischen Probe.

16. Immunoassay zum Nachweis und/oder zur Bestimmung der Menge von Dihydropyrimidindehydrogenase in einer biologischen Probe, der umfaßt, daß man

(a) die Probe mit mindestens einem monoklonalen Anti körper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 behandelt, um ein Immunokonjugat von Antikörper und Dihydro pyrimidindehydrogenase herzustellen und
(b) das Immunokonjugat mit Hilfe einer Markierung qua litativ oder quantitativ nachweist.

17. Assay nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Immunpräzipitationsassay ist.

18. Assay nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ist.

19. Verfahren zur Bestimmung eines DPD-Mangelzustandes bei einem Patienten, das umfaßt, daß man

(a) eine biologische Probe des Patienten mit einem monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 2 bis 6 behandelt und
(b) das Immunkonjugat aus monoklonalem Antikörper und Dihydropyrimidindehydrogenase quantitativ nach weist.

20. Verfahren zur Abschätzung der Empfindlichkeit von Patienten, die unter Krebs leiden, für eine Behandlung mit Antitumorarzneimitteln der Reihe der 5-Fluorura cil(5-FU)-Derivate, das umfaßt, daß man

(a) eine biologische Probe des Patienten mit einem monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 2 bis 6 behandelt und
(b) das Immunokonjugat aus monoklonalem Antikörper und Dihydropyrimidindehydrogenase quantitativ nach weist, um den Gehalt an Dihydropyrimidindehydro genase in der biologischen Probe des Patienten zu bestimmen, um ein Maß der Empfindlichkeit zu erhal ten.

21. Verfahren, um die Empfindlichkeit von Patienten, die unter Krebs leiden, für eine Behandlung mit Antitumor arzneimitteln der Reihe der 5-Fluoruracil(5-FU)-Derivate abzuschätzen, das umfaßt, daß man

(a) eine biologische Probe des Patienten mit einem monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 2 bis 6 behandelt,
(b) das Immunokonjugat aus monoklonalem Antikörper und Dihydropyrimidindehydrogenase quantitativ nach weist, um den Gehalt an Dihydropyrimidindehydro genase in der biologischen Probe des Patienten zu bestimmen,
(c) den Gehalt an Pyrimidinnucleosidphosphorylase in der biologischen Probe des Patienten bestimmt und
(d) das Verhältnis des Gehalts von Pyrimidinnucleo sidphosphorylase und des Gehalts von Dihydropyrimi dindehydrogenase berechnet, um ein Maß für die Empfindlichkeit zu erhalten.