PT2550971T - Dispositivos e métodos para fabrico contínuo integrado de moléculas biológicas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"DISPOSITIVOS E MÉTODOS PARA FABRICO CONTÍNUO INTEGRADO DE MOLÉCULAS BIOLÓGICAS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método e sistema aprimorados para purificar uma molécula de interesse de uma mistura heterogénea de moléculas. Mais particularmente, a presente invenção é destinada a métodos para purificar uma proteína de interesse numa corrente de alimentação de fluido de cultura de tecido de um processo de fermentação de perfusão contínua.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO É bem conhecido por aqueles familiares com o campo em que, nos últimos anos, diversos processos de cultura de célula contínua, também chamados de processos de perfusão contínua, foram estabelecidos com muito sucesso comercial. No entanto, o processo de isolamento após fermentação de perfusão contínua é, de modo geral, um processo em lote, e é física e logicamente separado do processo a montante contínuo. Nesses processos, o propósito principal da etapa de isolar é capturar o produto de altos volumes de sobrenadante de cultura relativamente diluída. Concentração do produto deve ser enfatizada em relação a logística de processo e exigências de espaço, enquanto a remoção simultânea de contaminantes (purificação) é importante para minimizar o número exigido de etapas de purificação a jusante adicionais. A Figura 1 mostra uma representação esquemática de um processo do estado da técnica típico de isolamento da fermentação de perfusão contínua, conforme é bem conhecido por aqueles familiares com o campo. 0 sistema de fermentação de perfusão contínua compreende um dispositivo de retenção de células (1), que mantém a maioria das células que produzem o produto no sistema de fermentação. Uma corrente de colheita contínua do sistema de perfusão continua, que ainda contém algumas células, detritos e outras partículas são bombeados com a utilização de uma bomba de colheita (2) em vasos de recolha grandes (3), tais como tanques de aço inoxidável. Esses vasos de armazenamento de colheita normalmente precisam de ser arrefecidos a fim de manter perdas de produto devido à degradação numa faixa exequível.

Assim que um volume especificado tenha sido colhido, que é, tipicamente, após 1 a 4 dias ou mais, os vasos de recolha de colheita são desligados do vaso de fermentação estéril e o material recolhido é projetado como um lote de colheita. A próxima etapa é remover células, detritos e partículas (Etapa 2). Na escala industrial, isso é, tipicamente, feito com a utilização de centrifugação (4) seguida por filtração de membrana terminal (5) , ou por filtração de profundidade terminal (6) seguida por filtração de membrana terminal (7). Outra técnica algumas vezes utilizada é a microfiltração de fluxo tangencial (ou "fluxo cruzado"). Em qualquer caso, o produto do processo de remoção de partícula é um lote de fluido de cultura de tecido clarificado, ou cTCF (8). Mais detalhes sobre separação de partícula para produtos biotecnológicos podem ser encontrados em livros comuns, tais como Biotechnology, Volume 3, Bioprocessing, Wiley-VCH, 2o edição (1996), ISBN: 3527283137.

Na próxima etapa (Etapa 3) , o lote de fluido de cultura de tecido clarificado é processado adicionalmente para concentrar e, se possível, purificar o produto. Isso é tipicamente feito por ultrafiltração de fluxo cruzado ou por cromatografia de leito embalado.

No caso de ultraf iltração de fluxo cruzado, o cTCF é bombeado para o tanque de reciclagem (9) do sistema. Uma bomba é utilizada (10) para empurrar o material através de um ultrafiltro de fluxo cruzado. O produto é retido pela membrana e reciclado como retido para tanque de reciclagem, enquanto a água e contaminantes menores são empurrados através da membrana para o permeato (11) devido ao facto de a pressão de transmembrana gerada pela queda de pressão no módulo de ultrafiltração. Em cada passagem através do filtro, o cTCF, portanto, torna-se mais concentrado, e o volume de cTCF total é reduzido até que um fator de concentração desejado seja alcançado. Uma vez que o fator de concentração desejado seja alcançado, o processo é interrompido, e o volume concentrado restante (isolado) é drenado do sistema e recolhido. Mais detalhes sobre a ultrafiltração de fluxo cruzado para concentração de produtos biotecnológicos podem ser encontrados em livros comuns, tais como Biotechnology, Volume 3, Bioprocessing, Wiley-VCH, 2o edição (1996), ISBN: 3527283137.

No caso de cromatografia de leito embalado, o cTCF é bombeado através de uma coluna de cromatografia (12) que contém um leito de resina embalado. O produto liga-se à resina e é, então, eluido na forma concentrada e purificada habitual (isolado, 13) com a utilização de um tampão de eluição adequado (14), após o que a coluna é limpa e regenerada com a utilização de tampões adequados e soluções de limpeza (14).

Outras variantes de cromatografia que foram propostos para a concentração/purificação de cTCF são cromatografia de leito expandido e cromatografia de membrana. Cromatografia de leito expandido pode processar partícula que contém soluções. No entanto, filtragem do isolado após cromatografia é ainda exigido, embora as áreas de filtragem sejam reduzidas. Cromatografia de membrana utiliza pilhas de membranas de microfiltração modificada em vez de leitos de resina embalados. A vantagem é que a transferência de massa é amplamente convectiva em vez de difusiva, que permite a separação mais rápida. Por outro lado, o processo é, tipicamente, equivalente à cromatografia de leito embalado padrão. Mais detalhes sobre cromatografia para concentração e purificação de produtos biotecnológicos podem ser encontrados em livros comuns, tais como Protein Purification, Principies, High-Resolution Methods, and Applications, Wiley-VCH, 2o edição (1998), ISBN 0-471-18626-0.

Frequentemente, o isolado a granel é, então, congelado e armazenado para a utilização posterior nas etapas de purificação a jusante adicionais.

Desse modo, conforme descrito acima, o processo de isolamento é, de modo geral, um processo em lote, e é fisica e logicamente separado do processo a montante continuo. Ademais, ao mesmo tempo que a fermentação precisa de ser realizada estéril, o isolamento (isto é, remoção e concentração/purificação de partícula) é, essencialmente, realizado limpo, porém, não estéril.

Os processos de estado da técnica, conforme descrito acima, têm uma diversidade de problemas:

Pl. As perdas de rendimento e a redução de qualidade potencial devido ao alto tempo de residência de produto. A colheita da fermentação de perfusão continua precisa de ser recolhida e armazenada ao longo dos períodos de tempo significativos, conforme destacado acima, antes de um lote de isolamento poder ser processado. A colheita recolhida, embora tenha sida arrefecida, ainda fornece um meio prejudicial para produtos de proteína complexos e inerentemente instáveis. Portanto, perdas de produto significativas ocorrem, o que reduz a capacidade de usina e aumenta os custos de bens. Além disso, a qualidade de produto pode ser adversamente afetada. P2. Instalações de sala fria grandes ou vasos frios são exigidos para armazenamento intermediário de colheita volumes grandes, resultando em custos de capital altos e negando a vantagem de compacidade e mobilidade citada de fermentadores de perfusão. P3. Tecnologias de concentração/purificação convencionais (por exemplo, ultrafiltração, cromatografia de leito embalado) têm capacidade de produção volumétrica relativamente baixa, tempos de inversão significativos e são relativamente trabalhosos. Como resultado, tipicamente não mais que 1 processo em lote é realizado por dia. P4. Além disso, processos e métodos de isolamento atuais têm dificuldades logísticas em tratar os volumes de processo variantes em usinas de fermentação que envolvem mais que um fermentador. Em usinas de perfusão contínua de grande escala, um número variante de fermentadores são operacionais. P5. Além disso, processos de isolamento do estado da técnica são operados limpos, porém, não podem ser operados estéreis. Isso frequentemente resulta num número significativo de lotes rejeitados devido a problemas de carga microbiana. P6. A utilização de descartáveis, tais como filtros descartáveis, conjuntos, bolsas, etc., embora muito desejáveis na produção de parentais humanos (por exemplo, para evitar a limpeza e validação de limpeza e outros problemas) é muito custosa, e, de facto, frequentemente não é económica.

Consequentemente, é um objetivo da presente invenção fornecer um processo de separação de proteína contínuo e integrado que tenha a capacidade para operar por períodos de tempo constantes sob condições estéreis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é destinada a aparelho e processo inovadores para purificar moléculas de uma mistura fluida heterogénea. Mais particularmente, a invenção é destinada a um processo para purificar a molécula de interesse de uma mistura fluida clarificada heterogénea da gual os contaminantes de particulado foram removidos. 0 processo compreende a etapa de filtrar uma mistura fluida clarificada heterogénea por ultrafiltração continua numa taxa de corrente especifica abaixo do ponto de transição da molécula de interesse na região dependente de pressão do fluxo versus curva de TMP, em que a taxa de corrente especifica é mantida substancialmente constante por toda a ultrafiltração continua.

Nas formas de realização particulares, o processo da invenção compreende filtrar uma mistura fluida clarificada através de uma membrana de ultrafiltração que tem uma área em metros quadrados aproximadamente igual a entre 0,1 a 2 vezes a taxa de fluxo volumétrica da mistura fluida clarificada em litros/hora. Em outra forma de realização, o processo da invenção compreende filtrar a mistura fluida clarificada através de uma membrana de ultrafiltração que tem uma área em metros quadrados aproximadamente igual a entre 0,3 a 1 vez a taxa de fluxo volumétrica da mistura fluida clarificada em litros/hora. O processo da invenção vantajosamente permite filtrar a mistura clarificada numa taxa de corrente especifica que produz uma concentração de parede menor que cerca de 20%, menor que 15% ou menor que 10% maior que a concentração de retido, sem polarização de concentração observável.

Em uma forma de realização mais especifica, a invenção é destinada a um processo integrado, continuo e estéril para fermentação de perfusão continua, remoção e purificação/ concentração de particulado. Num aspeto da invenção, o processo compreende filtrar a mistura de cultura de tecido por um processo de separação que separa de modo seletivo a proteína de interesse da mistura num ponto de definição operacional abaixo do ponto de transição da proteína na região dependente de pressão do corrente versus curva de TMP para produzir um isolado de produto estéril, livre de partícula, concentrado e parcialmente purificado, em que a taxa de corrente específica através do processo de separação é mantida substancialmente constante num nível menor que o ponto de transição da proteína.

Em outro aspeto da invenção, o processo é um processo contínuo para purificar a proteína de interesse de uma mistura fluida de cultura de tecido heterogénea, que compreende: (a) produzir por um processo de fermentação de perfusão contínua a mistura fluida de cultura de tecido heterogénea que contém uma proteína de interesse; (b) transferir uma mistura fluida de cultura de tecido para um processo de remoção de partícula contínua integrada com o processo de fermentação de perfusão contínua; (c) remover contaminantes de particulado do fluido de cultura de tecido no processo de remoção de partícula contínua para produzir um fluido de cultura de tecido clarificado que contém a proteína de interesse; (d) transferir o fluido de cultura de tecido clarificado para um processo contínuo de purificação integrado com o processo de remoção de partícula contínua; e (e) purificar a proteína de interesse do fluido de cultura de tecido clarificado no processo contínuo de purificação; em que a taxa de corrente específica da mistura através do processo de fermentação de perfusão contínua, o processo de remoção de partícula contínua e o processo contínuo de purificação é mantido substancialmente constante.

Em ainda outro aspeto da invenção, o processo é um processo semicontínuo para purificar uma proteína de interesse a partir de uma mistura fluida de cultura de tecido heterogénea, que compreende: (a) produzir por um processo de fermentação de perfusão continua a mistura fluida de cultura de tecido heterogénea que contém uma proteína de interesse; (b) transferir uma mistura de fluido de cultura de tecido para um processo de remoção de partícula contínua integrada com o sistema de fermentação de perfusão contínua; (c) remover contaminantes de particulado do fluido de cultura de tecido no processo de remoção de partícula contínua para produzir um fluido de cultura de tecido clarificado que contém a proteína de interesse; (d) transferir o fluido de cultura de tecido clarificado para um vaso de transbordamento integrado com o processo de remoção de partícula contínua; (e) transferir de modo intermitente o fluido de cultura de tecido clarificado para um processo de purificação integrado com o vaso de transbordamento; e (f) purificar a proteína de interesse do fluido de cultura de tecido clarificado no sistema de purificação para produzir um isolado de produto estéril, livre de partícula, concentrado e parcialmente purificado que contém a proteína de interesse; em que a taxa de corrente específica da mistura através do processo de fermentação de perfusão contínua e o processo de remoção de partícula contínua é mantido substancialmente constante. A presente invenção também se destina a um aparelho para separar uma proteína de interesse de uma mistura fluida de cultura de tecido heterogénea. Num aspeto da invenção, o aparelho compreende: (a) um sistema de fermentação de perfusão contínua; (b) um sistema de remoção de partícula contínuo integrado com o sistema de fermentação de perfusão; e (c) um sistema de purificação contínuo integrado com o sistema de remoção de partícula, em que o aparelho é adaptado para manter condições estéreis.

Em outro aspeto da invenção, a aparelho compreende: (a) um sistema de fermentação de perfusão contínua; (b) um sistema de remoção de partícula contínuo integrado com o sistema de fermentação de perfusão; e (c) um sistema de purificação intermitente integrado com o sistema de remoção de partícula, em que o aparelho é adaptado para manter condições estéreis. 0 sistema de purificação pode, por exemplo, ser um sistema de ultrafiltração ou um sistema de adsorção/dessorção convectiva, ou qualquer outro sistema com a capacidade para purificar ou parcialmente purificar uma proteína de interesse de uma mistura heterogénea num sistema integrado, contínuo ou semicontínuo estéril, conforme descrito no presente documento. 0 processo e o aparelho da invenção são adaptados para permitir o processamento contínuo de uma mistura fluida heterogénea, tal como um fluido de cultura celular, numa taxa de fluxo substancialmente constante. Num aspeto particular da invenção, o processo e o aparelho da invenção são adaptados para permitir o processamento contínuo de uma célula heterogénea ou mistura fluida de cultura de tecido numa taxa de fluxo substancialmente constante abaixo o ponto de transição da proteína na região dependente de pressão do fluxo versus curva de TMP para um período contínuo e ao longo de todo o processo de purificação.

Esses e outros aspetos da invenção são descritos em detalhes abaixo na seguinte descrição detalhada da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos anexos, que são incorporados em e constituem uma parte do relatório especifico, ilustram formas de realização da invenção, e, junto com a descrição detalhada da forma de realização, serve para explicar os princípios da invenção e os seus benefícios.

Figura 1: Representação esquemática de processo de perfusão contínua convencional seguido por 3 etapas de processo de isolamento segredado física e logicamente (recolha de colheita em lote, remoção de partícula em lote e concentração/purificação em lote)

Figura 2 : Representação esquemática de 2 formas de realização de dispositivo inventivo A para fabrico contínuo, integrada e estéril. Representação esquemática da forma de realização AI mostrada no lado esquerdo e a representação esquemática da forma de realização A2 mostrada no lado direito.

Figura 3: Representação esquemática de 2 formas de realização de dispositivo inventivo B para fabrico contínuo, integrada e estéril. Representação esquemática da forma de realização BI mostrada no lado esquerdo e a representação esquemática da forma de realização B2 mostrada no lado direito.

Figura 4 : Representação esquemática de uma forma de realização de sistema de remoção de partícula contínuo e integrado inovador (100), um elemento de tanto o dispositivo inventivo A quanto o dispositivo inventivo B.

Figura 5: Representações esquemáticas de formas de realização adicionais de dispositivo inventivo A que combina múltiplos elementos para aumentar a capacidade de usina geral (A3) ou o desempenho de concentração e separação (A4).

Figura 6: Representações esquemáticas das formas de realização adicionais do dispositivo inventivo B.

Figura 7: Forma de realização adicional dos dispositivos inovadores que combinam os elementos do dispositivo A e dispositivo B em série para aumentar o desempenho de concentração e separação geral.

Figura 8: Comparação exemplificativa de capacidades de carga total por 10" de cápsula de filtro para processo em lote convencional e forma de realização de dispositivo e método inovadores para remoção de partícula contínua (processo de filtragem contínuo integrado) com a utilização de cápsulas de filtro comerciais. Método exemplificativo que produz Fator VIII de coagulação sanguínea recombinante mostrado. Figura 9: Exemplo de curva de corrente e pressão (corrente de permeado específica em LMH = litros/hora/m2 através de pressão transmembrana) e determinação de ponto de operação. O círculo mostra o ponto de operação típico que será ajustado por meio da TMP para processos em lote convencionais. O retângulo mostra a região operacional preferida que será ajustada por meio da bomba de permeado como pelo método para utilizar o dispositivo inventivo A.

Figura 10: Exemplo de distribuição de tempo de residência e distribuição de tempo de meio de sistema de UF contínuo integrado (300) como por método para utilizar dispositivo inventivo A. Medido para sistema contínuo descartável com módulo de 290 cm2 (62,5 cm de comprimento), fluxo cruzado de 120 LMH, fluxo de retido de 0,2 LMH, fluxo de permeado de 0,2 LMH.

Figura 11: Exemplo de isolamento de rFVIII da fermentação de perfusão contínua livre de proteína de plasma com a utilização de uma forma de realização do dispositivo inventivo A. Comparação de rendimento de isolamento médio do método contínuo inovador comparado ao rendimento médio de isolamento em lote, que inclui uma dispersão de desvio padrão. 3 lotes consecutivas foram utilizadas para determinar o rendimento de lote, enquanto 3 pontos consecutivos (dias) foram utilizados para o processo continuo.

Figura 12: Exemplos de desempenho de dispositivo inventivo A. Pressão de transmembrana e corrente especifica de sistema de ultrafiltração continua integrado (300) como uma função de tempo de processo continuo para 3 exemplos diferentes mostrados. Triângulos = membrana de 100 kD, Fator VIII de coagulação sanguínea recombinante (rFVIII); Quadrados = membrana de 10 kD, interleucina-2 recombinante; Círculos = membrana de 50 kD, glicoproteína geneticamente manipulada (Mr > 100 kD). Todos os exemplos mostrados são feitos de fermentação de perfusão continua livre de proteína de plasma.

Figura 13: Exemplo de desempenho a longo prazo do dispositivo inventivo A diretamente acoplado a fermentação de perfusão continua de linha celular que coexpressa 2 produtos de proteína (Proteína fluorescente verde GFP e IL-2SA). Pressão de transmembrana e corrente específica de sistema de ultrafiltração contínua inovador (300) como uma função de tempo de processo contínuo mostrada. Membrana de lOkD foi utilizada.

Figura 14: Exemplo de desempenho a longo prazo do dispositivo inventivo A diretamente acoplado a fermentação de perfusão contínua de linha celular que coexpressa 2 produtos de proteína (Proteína fluorescente verde GFP e IL-2SA). Membrana de lOkD foi utilizada. Fator de concentração de ambos os produtos de proteína, conforme determinado pelos ensaios específicos, e fator de concentração volumétrica mostrado como uma função de tempo de processo contínuo. A Figura 15: Exemplo para o desempenho de dispositivo inventivo B. Rendimento e queda de pressão próximos de 100 ciclos de adsorção/dessorção consecutivos com adsorvente convectivo (proteína-alvo: variante de fator FVIII de coagulação sanguínea geneticamente modificado; adsorvente convectivo: adsorvente comercial, Mustang Q, Pall Corporation).

Figura 16: Exemplo para desempenho de dispositivo inventivo B. Perfil de UV e condutividade durante um ciclo de adsorção/dessorção típico com adsorvente convectivo (proteína-alvo: variante de fator FVIII de coagulação sanguínea geneticamente modificado; adsorvente convectivo: adsorvente comercial, Mustang Q, Pall Corporation). A Figura 17: Exemplo para desempenho de dispositivo inventivo B. Gel SDS-Page (corado com prata) de Carga = colheita clarificada que deixa continuamente o sistema de remoção de partícula (100) e carregado semicontinuamente no sistema convectivo adsorvente (400) eluato de adsorção/dessorção típico. Proteína-alvo: variante de fator FVIII de coagulação sanguínea geneticamente modificado; adsorvente convectivo: adsorvente comercial, Mustang Q, Pall Corporation). Eluato foi diluído para carregar a concentração antes de ser passado no gel. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

Exceto quando definido expressamente no presente documento, a terminologia utilizada nesse pedido é padrão na técnica. As seguintes definições de determinados termos são fornecidas no presente documento para garantir a clareza e definição para o significado das reivindicações.

Unidades, prefixos e símbolos podem ser denotados nas suas formas aceites pelo SI. Faixas numéricas descritas no presente documento são inclusivas de números que definem a faixa e incluem e suportam cada número integral dentro da faixa definida. Salvo caso observado de outra forma, os termos "um" ou "um" devem ser interpretados como significando "pelo menos um(uma) dentre" Os cabeçalhos de seção utilizados no presente documento funcionam para propósitos organizacionais apenas e não são interpretados como limitantes da matéria descrita. Todos os documentos, ou porções de documentos, citados nesse pedido, incluindo, porém, sem limitação, patentes, pedidos de patente, artigos, livros e tratados, são expressamente incorporados por meio do presente documento a titulo de referência em suas totalidades para qualquer propósito. 0 termo "clarificação" e "clarificado" significa a remoção de matéria de particulado a partir de uma solução de modo que a solução restante passe através de uma membrana de 0,2 pm. O termo "fermentação de perfusão continua" refere-se a um sistema ou processo de fermentação de estado estável que opera sem interrupção e na qual as células ou micro-organismos são mantidos em cultura na fase de crescimento exponencial pela adição continua de meio fresco que é equilibrado pela remoção de suspensão de célula a partir do biorreator.

Os termos "cultivar", "cultura", "plantar", "manter", "suportar" e "expandir" são sinónimos que significam que as células permanecem viáveis e com a capacidade para produzir progénie. O termo "concentrar" nessa forma verbal, significa que a remoção de água de uma solução tal como a quantidade de uma molécula de interesse por volume de solução restante aumenta. O termo "polarização de concentração" significa que o acúmulo de moléculas retidas (camada de gel) na superfície da membrana causado por uma combinação de fatores: pressão transmembrana, velocidade de fluxo cruzado, viscosidade de amostra e concentração de soluto. 0 termo "contínuo", significa não interrompido no tempo, sequência e/ou operação para períodos de tempo prolongados. Conforme utilizado em referência aos processos de fermentação, clarificação e filtragem da presente invenção, "contínuo" significa que os processos são física e logicamente integrados de modo a permitir a operação sem interrupção por um período de tempo prolongado suficiente para produzir um isolado de produto estéril, livre de partícula, concentrado e parcialmente purificado que contém a proteína de interesse. 0 termo contínuo, conforme utilizado em referência aos processos da invenção, também é entendido como significando que um processo não é realizado de uma maneira em lote ou de uma maneira realmente contínua. Os processos da presente invenção têm a capacidade para a operação contínua, por exemplo, para períodos prolongados numa faixa de 1 dia a vários meses se interromper a operação ou sequência dos processos. Conforme utilizado na presente invenção, os processos são operados por um período contínuo maior que 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 semanas, ou 3, 4, 5, 6 ou mais meses.

Os termos "semicontinuo" e "intermitente" significam que um ou mais processos ou elementos de um sistema integrado operam de uma maneira descontínua ou em lote, enquanto outros processos ou elementos do sistema integrado operam de uma maneira contínua. Por exemplo, em algumas formas de realização da invenção, o processo de purificação é um processo de adsorção/dessorção convectiva, que tipicamente adquire adsorção da mistura heterogénea de um substrato de adsorção, eventualmente resultando na saturação do substrato, e que exige a terminação do processo de adsorção e a dessorção ou libertação da fração ligada. Um tal processo é inerentemente intermitente, embora tenha a capacidade para ser integrado com processos a montante que são contínuos. 0 termo "adsorção/dessorção convectiva" significativa de um processo cromatográfico no gual a transferência de massa ocorre primariamente por convecção. A adsorção/dessorção convectiva é um processo no gual uma fração de uma mistura gue contém uma molécula de interesse é separado de outra fração da mistura, por meio de adsorção de uma fração para um substrato seguido pela dessorção de tal fração a partir do substrato. 0 termo "fluxo cruzado" ou "fluxo cruzado de fluido" significa gue o fluxo do fluido ao longo da parte de topo da superfície de membrana. 0 termo "integrado", conforme utilizado em referência a múltiplos sistemas e/ou processos, significa que os sistemas e/ou processos são física e logicamente ligados de modo a constituir um sistema unificado com a capacidade para operar de modo contínuo. No contexto do sistema da presente invenção, que é destinado para um sistema contínuo ou semicontínuo integrado para produzir uma proteína de interesse livre de partícula, concentrada e parcialmente purificada, um sistema integrado se conectará a diferentes componentes diretamente e de uma maneira suficiente para manter condições estéreis entre os componentes diferentes do sistema.

Os termos "meios" (plural) e "meio" (singular) são sinónimos e são utilizados intercambiavelmente no presente documento, e a utilização de uma forma do termo não implica a exclusão da outra forma. 0 termo "mistura" significa uma combinação heterogénea de moléculas e compostos que contém uma molécula de interesse, tal como uma proteína, e vários contaminantes. Uma mistura preferida da invenção atual é um fluido de cultura de tecido composto de uma mistura heterogénea de proteínas que inclui uma proteína exogénea de interesse, que é obtida inicialmente a partir de um processo de fermentação de perfusão contínua. 0 termo "camada de gel" significa a camada microscopicamente fina de moléculas que pode se formar na parte de topo de uma membrana. Pode afetar a retenção de moléculas ao obstruir a superfície de membrana e, dessa forma, reduzindo o fluxo de filtrado, ou, em operação de fluxo constante, aumentar TMP. 0 termo "molécula de interesse" significa que partículas ou outras espécies de molécula que devem ser separadas de uma solução ou suspensão num fluido (por exemplo, um líquido). As partículas ou moléculas de interesse são separadas do fluido e, na maior parte dos exemplos, das outras partículas ou moléculas no fluido. 0 tamanho da molécula de interesse a ser separado determinará o tamanho de poro da membrana a ser utilizado. Preferencialmente, as moléculas de interesse são de origem biológica ou bioquímica ou produzidas por processos transgénicos ou in vitro e incluem proteínas, péptidos, polipéptidos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo. Exemplos de origens de corrente de alimentação preferidos incluem cultura celular de mamíferos e cultura celular de micro-organismo tais como bactéria, fungo e levedura. Deve-se observar que espécies a ser filtradas incluem polipéptidos, proteínas, componentes celulares, ADN, coloides, micoplasma, endotoxinas, vírus, hidratos de carbono não desejados e outras moléculas de interesse biológico, independente de ser glicosilado ou não. 0 termo "permeado" é utilizado como sinónimo do filtrado. 0 termo "produto isolado" significa um produto livre de partícula, concentrado e parcialmente purificado que contém uma proteína de interesse. Um produto isolado é um produto que obteve um grau de purificação e concentração comparável àquele alcançado por um processo de ultrafiltração ou adsorção/dessorção convectiva. Um produto isolado não é necessariamente homogéneo, porém, será substancialmente purificado em relação ao produto a granel inicial produzido pelo processo de fermentação. 0 termo "taxa de corrente específica" é utilizado intercambiavelmente com o termo "filtrado corrente" visto que se refere ao filtrado. A taxa de fluxo de retido especifica é a taxa de fluxo do retido normalizado na área de membrana utilizada.

Conforme utilizado em referência ao fluxo, o termo "substancialmente constante" significa que a corrente é mantida num nivel constante, de modo geral, durante um período substancial durante o curso da filtragem. 0 termo "fluido de cultura de tecido" significa uma mistura heterogénea de componentes derivados de um meio de cultura de tecido. Em aspetos preferidos da invenção, o fluido de cultura de tecido é derivado de um processo de fermentação de perfusão continua. Um fluido de cultura de tecido "clarificado" é um fluido de cultura de tecido que foi pré-filtrado para remover detritos celulares e outras macromoléculas grandes. 0 termo "pressão transmembrana" e seu acrónimo "TMP" significam a pressão média aplicada da alimentação para o lado de filtrado da membrana. TMP é calculada por TMP [bar] = [ (PF +PR) / 2] - Pf em que PF é a pressão de alimentação, PR é a pressão de retido, e Pf é a pressão de filtrado. 0 termo "recuperação" significa a quantidade de uma molécula de interesse que pode ser recuperada após o processamento. Habitualmente expressado como uma percentagem de material inicial ou rendimento. 0 termo "retido" significa a porção da amostra que não passa através da membrana, também conhecida como o concentrado. 0 termo "ultrafiltração" significa uma forma de filtragem que utiliza microporos ou membranas semipermeáveis para, preferencialmente, separar fluidos ou iões com base no tamanho diferencial ou peso molecular. A ultrafiltração é, tipicamente, utilizada para filtrar moléculas que tenham um peso molecular maior que cerca de 10.000 daltons. A presente invenção é destinada a um processo integrado, continuo e estéril que compreende a fermentação de perfusão continua, remoção e purificação/concentração de particulado. Num aspeto da invenção, o processo compreende filtrar a mistura de cultura de tecido por um processo de separação que separa de modo seletivo a proteína de interesse da mistura num ponto de definição operacional abaixo do ponto de transição da proteína na região dependente de pressão do corrente versus curva de TMP para produzir um isolado de produto estéril, livre de partícula, concentrado e parcialmente purificado, em que a taxa de corrente específica através do processo de separação é mantida substancialmente constante num nível menor que o ponto de transição da proteína.

Em outro aspeto da invenção, o processo é um processo contínuo que compreende: (a) produzir continuamente por fermentação de perfusão contínua uma mistura fluida de cultura de tecido heterogénea que contém uma proteína de interesse; (b) transferir continuamente a mistura fluida de cultura de tecido a um processo de remoção de partícula integrado com o sistema de fermentação de perfusão contínua; (c) remover continuamente contaminantes de particulado do fluido de cultura de tecido no processo de remoção de partícula para produzir continuamente um fluido de cultura de tecido clarificado que contém a proteína de interesse; (d) transferir continuamente o fluido de cultura de tecido clarificado para um processo de purificação integrado com o sistema de remoção de partícula; e (e) separar continuamente a proteína de interesse do fluido de cultura de tecido clarificado no sistema de purificação para produzir continuamente um isolado de produto estéril, livre de partícula, concentrado e parcialmente purificado que contém a proteína de interesse.

Em ainda outro aspeto da invenção, o processo é um processo semicontínuo que compreende: (a) produzir continuamente por fermentação de perfusão contínua uma mistura fluida de cultura de tecido heterogénea que contém uma proteína de interesse; (b) transferir continuamente a mistura fluida de cultura de tecido para um processo de remoção de partícula integrado com o sistema de fermentação de perfusão contínua; (c) remover continuamente os contaminantes de particulado do fluido de cultura de tecido no processo de remoção de partícula para produzir continuamente um fluido de cultura de tecido clarificado que contém a proteína de interesse; (d) transferir continuamente o fluido de cultura de tecido clarificado a um vaso de transbordamento integrado com o processo de remoção de partícula; (e) transferir de modo intermitente o fluido de cultura de tecido clarificado para um processo de purificação integrado com o vaso de transbordamento; e (e) separar a proteína de interesse do fluido de cultura de tecido clarificado no sistema de purificação para produzir um isolado de produto estéril, livre de partícula, concentrado e parcialmente purificado que contém a proteína de interesse, em que a taxa de corrente específica da mistura através do processo de fermentação de perfusão contínua e processo de remoção de partícula contínua é mantida substancialmente constante, e em medias iguais ao tempo médio ao longo do processo semicontínuo de purificação integrado.

Dispositivos para Praticar Métodos da Invenção A presente invenção também se destina a um aparelho para separar uma proteína de interesse de uma mistura fluida de cultura de tecido heterogénea. De modo geral, o aparelho compreende: (a) um sistema de fermentação de perfusão contínua; (b) um sistema de remoção de partícula contínuo integrado com o sistema de fermentação de perfusão; e (c) um sistema de purificação contínuo integrado com o sistema de remoção de partícula, em que o aparelho é adaptado para manter condições estéreis. Em outro aspeto da invenção, a aparelho compreende: (a) um sistema de fermentação de perfusão contínua; (b) um sistema de remoção de partícula contínuo integrado com o sistema de fermentação de perfusão; e (c) um sistema de purificação intermitente integrado com o sistema de remoção de partícula, em que o aparelho é adaptado para manter condições estéreis. 0 sistema de purificação pode, por exemplo, ser um sistema de ultrafiltração ou um sistema de adsorção/dessorção convectiva, ou qualquer outro sistema com a capacidade para purificar ou parcialmente purificar uma proteína de interesse de uma mistura heterogénea num sistema integrado, contínuo ou semicontínuo estéril, conforme descrito no presente documento. 0 processo e o aparelho da invenção são adaptados para permitir o processamento contínuo de uma mistura fluida de cultura de tecido heterogénea numa taxa de fluxo substancialmente constante. Num aspeto particular da invenção, o processo e o aparelho da invenção são adaptados para permitir o processamento contínuo de uma mistura fluida de cultura de tecido heterogénea numa taxa de fluxo substancialmente constante abaixo o ponto de transição da proteína na região dependente de pressão do fluxo versus curva de TMP para um período contínuo e ao longo de todo o processo de purificação.

Nas formas de realização específicas, uma invenção fornece dois dispositivos inovadores (A, B) que são compostos por 3 elementos distintos, porém, completamente integrados, em que todos têm um papel essencial e juntos formam uma plataforma de sistema de isolamento de proteína contínua e unicamente eficaz que soluciona os problemas com a técnica anterior descrita acima.

Os três elementos distintos de cada dispositivo são primeiramente um sistema de remoção de partícula contínuo integrado (100), em segundo lugar um vaso de transbordamento estéril (200) e em terceiro lugar um sistema de concentração/purificação integrado (300,400, respetivamente). Todos os três elementos e, dessa forma, os dispositivos e métodos inovadores desenvolvidos da utilização desses dispositivos são descritos em detalhes abaixo.

Para fornecer concentração/purificação contínua ou semicontínua integrada de produto de proteína, o dispositivo inventivo A (do qual duas formas de realização são mostradas na Figura 2) compreende um sistema de ultrafiltração contínuo e estéril integrado (300), enquanto o dispositivo inventivo B (do qual 2 formas de realização são mostradas na Figura 3) compreende um sistema de adsorção/dessorção convectiva semicontínuo integrado (400).

Os dispositivos da invenção são diretamente integrados com um ou mais fermentador de perfusão contínua (fermentadores de perfusão contínua) e, desse modo, forma uma plataforma de fabrico integrada contínua inovadora.

DISPOSITIVO A

Sistema Integrado de Remoção de Partícula Contínua (100) A Figura 2 mostra 2 formas de realização do dispositivo inventivo A. O sistema integrado de remoção de partícula contínuo (100) é ligado diretamente ao lado de colheita do sistema de fermentação de perfusão contínua (D · A Figura 4 mostra uma representação esquemática mais detalhada de uma forma de realização do sistema integrado de remoção de partícula contínuo inovador (100), que consiste numa bomba (101), um medidor de pressão ou transmissor, respetivamente (107), um distribuidor de conexão (102) e um conjunto de diversas filas de filtros (103). Todos os componentes são ligados com tubulação flexível e/ou tubagem rígida. A bomba (101) é uma bomba peristáltica convencional, que permite o bombeamento suave da colheita de cultura celular sem quaisquer partes giratórias ou vedações em contato com o produto estéril. A bomba e a tubulação de bomba são dimensionadas para distribuir a taxa de fluxo de colheita desejada do sistema de fermentação de cultura celular, que é de até 15 volumes de biorreator por dia, por exemplo, até 9,4 litros/hora para um fermentador 15 litros e até 125 litros/hora para um fermentador de 200 litros. O medidor de pressão ou o transmissor de pressão (107) é projetado de modo que possa ser esterilizado por autoclavagem ou irradiação. No projeto atual, um transmissor piezorresistivo reutilizável num alojamento de aço inoxidável ou um medidor de pressão de aço inoxidável reutilizável são utilizados. No entanto, aprimoramentos futuros podem incluir a utilização de transmissores descartáveis que podem ser facilmente esterilizados por irradiação.

Em uma forma de realização presente, o distribuidor de conexão (102) consiste na tubulação flexível, com grampos de tubulação (ou válvulas) e conectores estéreis adequados para permitir a conexão de conjuntos de filas de filtro adicionais sem comprometer a esterilidade de sistema. Preferencialmente, os diâmetros de tubulação são dimensionados para render velocidades de fluido lineares de cerca de 2 m/s ou menor nas taxas de fluxo desejadas, dessa forma, evitando contrapressão alta e cisalhamento. Em outra forma de realização presente, em vez de as peças de tubulação flexível especiais de conectores estéreis serem utilizadas, as quais podem ser soldadas com soldadores de tubulação comerciais sem comprometer a esterilidade. Tais peças de tubulação são feitas de PVC ou outros polímeros adequados . 0 conjunto de filas de filtro (103) consiste em pelo duas, preferencialmente múltiplas filas de filtros idênticas (conforme mostrado na representação esquemática), com apenas uma dentre as filas de filtros aberta num determinado momento, conforme mostrado como um exemplo na Figura 4 (105) .

Cada fila de filtros consiste em pelo menos um filtro, preferencialmente, um pré-filtro e um filtro final em série (conforme mostrado na Figura 4) . Se for exigido aumentar a capacidade para uma aplicação especifica, cada fila de filtros (105, 106 etc.) pode a própria também consistir em múltiplos filtros ou filas de filtros em paralelo (não mostrado) .

Em uma forma de realização da invenção mostrada na Figura 4, a segunda fila de filtros do conjunto (106) é fechada por um disco de rutura sensível à pressão, ou pino de rutura, respetivamente (104). Na operação, a função do disco de rutura, ou pino de rutura, é abrir automaticamente o trajeto de fluxo para a segunda fila de filtros (107) uma vez que a pressão na primeira fila de filtros (105) alcança um limite especificado, dessa forma, garantindo continuação ininterrupta do processo de filtragem. Discos e rutura e pinos de rutura comercialmente disponíveis são utilizados no sistema inventivo, que são, de outra forma, utilizados para fornecer alivio de pressão de segurança. Numa forma de realização presente, discos de rutura ou pinos de rutura com um limite de pressão de rutura específico não maior que 110,31 Pa (16 PSI) são utilizados, os quais provam ser muito úteis. No entanto, uma faixa de limite de pressão especificado é possível.

Cada fila de filtros adicional do conjunto de filas de filtro também é separada por uma válvula manual ou automática e outro disco de rutura ou pino de rutura. Uma vez que a segunda fila de filtros (106) seja operacional, a válvula para o próximo disco de rutura ou pino de rutura, respetivamente, é aberta, de modo que a próxima fila de filtros possa atuar como um suporte e assim em diante.

Em uma forma de realização alternativa, válvulas acionadas automaticamente são utilizadas exclusivamente, e na operação, um sistema de controlo aciona as válvulas com base na entrada de um sensor de pressão piezorresistivo (107) que também pode ser esterilizado por autoclavagem. No entanto, os requerentes constataram que o presente projeto que compreende o disco de rutura ou pino de rutura, respetivamente, fornece robustez extraordinária em operação a longo prazo. A faixa de filtro final é de pelo menos 3 pm ou menor, preferencialmente, 0,45 pm e ainda preferencialmente 0,2 pm. A fila de filtros de operação (6), portanto, retém todas as células restantes, bem como, detritos celulares relevantes e outras partículas, resultando numa corrente de saída livre de partícula (9), no fluido de cultura de tecido clarificado (cTCF).

Materiais de filtro comercialmente disponíveis podem ser utilizados. No projeto atual, cápsulas de filtro descartáveis são utilizadas, tais como cápsulas de pré-filtro de Sartopure ou Sartoclear (Sartorius, Goettingen) e cápsulas de filtro final de Sartobran (Sartorius, Goettingen), que pode ser esterilizado por autoclavagem ou irradiação.

Como exemplo de uma forma de realização presente do dispositivo inventivo, projetado para uma taxa de fluxo de 1 litro/minuto, em que cada fila de filtros (105, 106 etc.) do conjunto (103) consiste em 3 cápsulas de pré-filtro de 76,2 cm (30") (Kleenpak Ultipleat, Pall Corp., 4,5 pm taxadas, 0,75 m2 cada um) seguidas por 3 cápsulas de filtro final de 50,8 cm (20") (Sartobran P, Sartorius, 0,45 pm/0.2 pm taxadas, 1,3 m2 cada uma) . Essa forma de realização particular foi constatada como particularmente útil para fabrico em grande escala de Fator VIII de coagulação sanguínea recombinante, bem como, variantes de FVIII geneticamente modificadas gue incluem FVIII apagado de domínio B.

No entanto, os reguerentes constataram gue ao utilizar dispositivo e método inventivos, a eficácia de remoção de partícula com uma variedade de materiais de filtro e configurações disponíveis de fabricantes diferentes (Pall, Sartorius, Cuno) são consistentemente aprimorados em comparação aos respetivos processos em lote convencionais.

Portanto, os dispositivo e processo inventivos inovadores também serão benéficos para a utilização com tipos e geometrias de filtro inovadores, por exemplo, com tipos de filtro gue aumentam a área de filtro disponível por cápsula, bem como, com tipos de filtro gue fornecem um padrão de fluxo cruzado ou outros meios para minimizar crescimento de bolo, tal como vibração ou giro de elemento de filtro.

Em outra forma de realização do processo inventivo, o conjunto de filas de filtro (103) compreende apenas uma fila de filtros de suporte estéril fechada por um disco de rutura ou pino de rutura, respetivamente, porém, ainda múltiplas filas de filtros para a operação. A primeira fila de filtros do conjunto é operada até gue um volume de carga predeterminado especificado tenha sido processado, após o gue a operação é comutada (manual ou automaticamente) para a próxima fila de filtros no conjunto. O volume de carga específico é especificado de modo que sob condições normais de operação o limite de pressão do disco de rutura ou pino de rutura não seja excedido. Se, no entanto, a pressão aumentar mais que o habitual durante a filtragem, por exemplo, devido a uma capacidade de filtragem anormalmente baixa da colheita, a fila de filtros de suporte garante novamente a filtragem contínua ininterrupta abrindo-se uma vez que a pressão especificada seja excedida. Após uma abertura da fila de filtros de suporte, a filtragem é comutada para outra fila de filtros do conjunto e outra fila de filtragem de suporte com disco de rutura ou pino de rutura é instalada sem comprometer a esterilidade do sistema. É bem conhecido por aqueles peritos no campo, que para manter tanto os custos de filtro quanto os tempos de processamento para remoção de partícula em processos em lote num mínimo, filas de filtros em lote precisam de ser dimensionados para ter a menor área de filtro possível exigida para fornecer a taxa de fluxo absoluta desejada (em litros/hora) e a pressão máxima. A taxa de fluxo absoluta desejada, por sua vez, deve ser alta o suficiente para fornecer tempos de processamento viáveis para o volume de lote desejado. Isso necessita inerentemente de uma taxa de corrente específica alta (em litros/hora/m2 de área de filtro).

Por outro lado, para um sistema de filtragem de lote otimizado comparável, o dispositivo inventivo é projetado para taxa de corrente específica diversas vezes menor, que é mantida constante (em litros/hora/m2 de área de filtro instalada) de modo que a taxa de fluxo absoluta seja igual à taxa de fluxo de colheita da fermentação de perfusão continua.

Os requerentes constataram, inesperadamente, que em tal tais taxas de fluxo específicas baixas o volume que pode ser processado através de um filtro é desproporcionalmente maior que nas taxas de fluxo ajustadas nos processos em lote. É importante observar que nos processos em lote convencionais de isolamento, tais como taxas de fluxo específicas baixas, não seria viável devido a áreas de filtragem extremas (e, desse modo, custosas) ou muito baixas de uma taxa de fluxo absoluta. Isso se deve primariamente ao facto de que na maior parte do tempo, o equipamento de remoção de partícula em lote é mantido ocioso enquanto a colheita é recolhida para a próxima lote. Além disso, o aumento desproporcional surpreendente na capacidade de filtro alcançável do método inventivo permite uma redução significativa no consumo de filtro e, desse modo, nos custos de fabrico.

Vaso de Transbordamento (200) A saída do sistema integrado de remoção de partícula contínuo é ligada direta e constantemente a um vaso de transbordamento (201), conforme mostrado na Figura 2. Esse vaso de transbordamento é um vaso estéril, como, um saco descartável ou um vaso de aço inoxidável com pelo menos uma porta de entrada e uma porta de saída, sendo que a última está, de preferência, no fundo do vaso. Uma faixa ampla de projetos e tamanhos de vaso pode ser utilizada. No entanto, o vaso de transbordamento é dimensionado, preferencialmente, para ser menor em comparação ao rendimento capacidade de produção volumétrica do sistema para manter o tempo de residência do produto no vaso num mínimo, isto é, abaixo de 24 horas, preferencialmente, abaixo 8 horas, e ainda preferencialmente abaixo de 4 horas.

Os requerentes constataram que tais tempos de residência baixos, são unicamente possíveis devido aos dispositivos inovadores permitem o aumento significativo no rendimento para produtos de proteína inerentemente instáveis, portanto, solucionando um dentre os problemas da técnica anterior.

Em algumas formas de realização dos dispositivos inovadores, o vaso de transbordamento é localizado numa célula de balança ou de carga (202), conforme mostrado para o dispositivo BI e B2 na Figura 3. Essa célula de equilíbrio ou carga fornece um sinal de peso para um sistema de controlo computadorizado (não mostrado).

Além do mais, numa forma de realização dos dispositivos inventivos (B2), um vaso de tampão (204) é ligado por meio de uma bomba peristáltica (203) ao vaso de transbordamento. Em operação, essa configuração é utilizada para ajustar as propriedades da corrente de colheita isenta de partícula, como condutividade (força iónica) ou pH, ao adicionar tampão ou diluente adequado. Nesse caso, um sistema de mistura opcional (205) e sensores para monitorizar a condição desejada (206), como pH ou condutividade, são utilizados. No presente projeto, um agitador magneticamente acoplado é utilizado; no entanto, outros sistemas de mistura, como sacudidores ou dispositivos pulsantes também poderiam ser utilizados.

Concentração/purificação contínua integrada (300)

Dispositivo A, 2 formas de realização que são mostradas na Figura 2, compreende um sistema de ultrafiltração estéril contínua integrado (300). As formas de realização do sistema de ultrafiltração estéril contínua compreendem uma bomba de reciclagem (301) e circuito de reciclagem (306), um ou mais módulos de ultrafiltração de fluxo cruzado estéril (303), uma bomba de permeato (305), um vaso de recebimento de permeato estéril (307) numa célula de equilíbrio ou carga (309) e uma bomba de retido (311) . Além do mais, compreende instrumentação na forma de um transmissor ou calibre de pressão de entrada (302), transmissor ou calibre de pressão de permeato (304), transmissor ou calibre de pressão de saída (308), bem como, a medidor de fluxo de reciclagem (310) . Em operação, a saída de sistema (312) fornece uma corrente contínua de produto de proteína parcialmente purificado e concentrado, que pode ser continuamente recolhido, congelado ou adicionalmente processado. A forma de realização inventiva A2 compreende, adicionalmente, um vaso de diluente ou tampão (314), uma bomba de adição de diluente/tampão peristáltica (313), bem como, sensores de fluxo atravessante para monitorizar o condicionamento do concentrado no circuito de reciclagem, como sensores para pH e condutividade (315, 316). Em operação, essa configuração é utilizada para ajustar as propriedades da corrente de colheita isenta de partícula, como condutividade (força iónica) ou pH, ao adicionar tampão ou diluente adequado. Essa configuração também pode ser utilizada para adicionar estabilizadores de proteína. Embora na forma de realização inventiva A2 o próprio circuito de reciclagem atua como uma câmara de mistura, o condicionamento pode, alternativamente, também ser realizado ao utilizar uma configuração de vaso de transbordamento como mostrado para o dispositivo B (forma de realização B2), que compreende componentes (203, 204, 205, 206) conforme discutido posteriormente nessa revelação (veja-se a descrição do dispositivo B).

As formas de realização do dispositivo inventivo também compreendem um sistema de controlo programável e de registro de dados, que grava os sinais de dados chegantes da instrumentação (como, sem limitação, pressões, taxa de fluxo, peso de vaso, pH, condutividade) e controla as velocidades de bomba de acordo com um algoritmo de controlo predefinido.

Todas as bombas (301, 305, 311, 313) são bombas peristálticas, que permitem o bombeamento das respetivas correntes de fluido sem quaisquer partes giratórias ou vedações entrarem em contato com a corrente de produto estéril. Os requerentes constaram que isso é preferencial para fornecer operação de longo prazo estéril e robusta. No entanto, outros projetos de bomba estéril podem, em princípio, ser utilizados. A bomba de reciclagem (301) e sua tubulação de bomba é dimensionada para permitir o ajuste robusto das taxas de fluxo cruzado entre 80 e 800 litros/hora por m2 de área de membrana instalada, dependendo das características de transferência de massa do módulo de ultrafiltração utilizado. A bomba de permeato é dimensionada para permitir o ajuste robusto e preciso de um fluxo de permeato especifico entre 90% e 99% da taxa de fluxo de colheita da fermentação de perfusão continua. A bomba de retido é dimensionada para permitir o ajuste robusto e preciso do fluxo de retido entre 1% e 10% da taxa de fluxo de colheita da fermentação de perfusão continua.

Os módulos de ultrafiltração encapsulada (303) são utilizados para permitir a operação estéril robusta, e são esterilizados por autoclavagem ou irradiação. O corte de peso molecular nominal ideal é escolhido com base no peso molecular do produto de proteína de interesse e deve ser confirmado por experimentos padrão conhecidos por aqueles na técnica. Uma variedade de materiais de membrana, como poliétersulfona, poliétersulfona hidrofilizada ou celulose regenerada podem ser utilizados, desde que o módulo de membrana inteiro possa ser esterilizado por irradiação e/ou autoclavagem sem danificar a membrana. Espera-se que os materiais hidrofílicos possam aumentar a eficácia devido às suas tendências de incrustação inferiores.

Os requerentes constataram que o dispositivo A é unicamente eficaz se a área de membrana de ultrafiltração total instalada em metros quadrados for igual a uma faixa entre 0,1 a 2 vezes a taxa de fluxo volumétrico da colheita da fermentação de perfusão continua em litros/hora. Por exemplo, para uma taxa de fluxo de colheita de perfusão de 1 litro/hora, a área de membrana total instalada deve estar entre 0,1 e 2 metros quadrados. Os requerentes constataram que o dispositivo A é ainda mais eficaz se a área de membrana de ultrafiltração instalada em metros quadrados for igual a uma faixa entre 0,3 a 1 vez a taxa de fluxo volumétrico da colheita da fermentação de perfusão continua em litros/hora.

Em uma forma de realização da invenção, módulos de membrana de fibra oca "descartáveis" comercialmente disponíveis (GE Healthcare, antiga Amersham Biosciences) são utilizados. No entanto, uma variedade de projetos de módulo e membranas encapsuladas podem ser utilizados, como módulos espiralados, cassetes encapsulados ou cápsulas com transferência de massa melhorada devido a padrões de fluxo secundário (por exemplo, fluxo de vórtice), elementos giratórios (por exemplo, filtros de disco dinâmicos) ou filtros vibratórios. Espera-se que as cassetes de ultrafiltração especialmente encapsulados possam ser utilizados beneficamente nos dispositivos inventivos visto que os mesmos fornecem coeficientes de transferência de massa altos em taxa de fluxo cruzado necessária relativamente baixa, a reduzir assim a capacidade de bomba, enquanto mantém a complexidade de sistema e custos de investimento baixos. 0 dispositivo inventivo permite não apenas contínua, mas uma operação realmente estéril, em contraste à operação apenas asséptica. Os requerentes alcançaram isso ao projetar todos os componentes de sistema que contatam produto para suportar não apenas a limpeza, mas também a esterilização por autoclavagem, vaporização no local ou irradiação gama. Nas presentes formas de realização os módulos encapsulados descartáveis são utilizados para remoção de partícula contínua (100), bem como, ultrafiltração contínua (300). As bombas peristálticas são utilizadas para evitar qualquer contato de produto com os elementos giratórios e vedações mecânicas. Além do mais, nas presentes formas de realização os conjuntos de saco e tubulação descartáveis são utilizados ao invés de tubulação rígida. Os componentes que contatam produto descartáveis (por exemplo, tubulação, sacos, módulos) ou grupos de componente são pré-montados e esterilizados juntos, simplificando assim a inicialização e operação. Os sistemas são projetados para manter qualquer abertura potencial do sistema estéril para o ambiente (por exemplo, capa de fluxo laminar), em relação à amostragem, saco permuta de instrumentação a um mínimo. Nas presentes formas de realização do dispositivo, distribuidores são projetados redundantes para permitir a comutação de um componente estéril (por exemplo, saco de recebimento de produto) para o próximo sem abertura. A permuta adicional de tubulação, módulos ou sacos é, de preferência, realizada ao utilizar soldadores de tubulação estéreis ao invés de conectores estéreis .

Outras formas de realização futuras dos dispositivos inventivos também poderiam compreender componentes como vasos de aço inoxidável, alojamentos de filtro ou tubulação que pode ser esterilizada no local, sozinha ou em combinação com componentes descartáveis, desde que a robustez e esterilidade na operação de longo prazo sejam asseguradas.

As formas de realização adicionais do dispositivo inventivo A são projetadas para processar o material a partir de múltiplos fermentadores em usinas de fabrico maiores (A3) . Um exemplo é mostrado esquematicamente na Figura 5. Formas de realização adicionais são projetadas para aumentar o fator de concentração geral e desempenho de separação ao combinar 2 estágios de sistemas de ultrafiltração continua (300) em série (A4, mostrado esquematicamente na Figura 5).

DESCRIÇÃO DO MÉTODO PARA UTILIZAÇÃO DO DISPOSITIVO A

As fermentações de perfusão continua são operadas ao longo de um período de tempo (uma campanha) , tipicamente entre 2 semanas e 6 meses ou mais. O fluido de cultura de tecido (TCF) que contém produto, células e detritos celulares é continuamente processado com a utilização do dispositivo A. Uma corrente de produto parcialmente purificado, concentrado isento de partícula e estéril (o "produto isolado") é produzida e deixa continuamente o dispositivo em sua saida (312). Através da utilização da bomba (101) do sistema estéril de remoção de partícula continua (100) a colheita é bombeada continuamente através do conjunto de filtração (103) na taxa de fluxo de colheita de perfusão desejada Qh da fermentação. A corrente de emissão do sistema de filtração continua, isto é, o fluido de cultura de tecido clarificado (cTCF), entra continuamente no vaso de transbordamento (201). A partir do vaso de transbordamento o cTCF é continuamente processado por um sistema de ultrafiltração estéril continua (300) numa taxa de fluxo igual à taxa de fluxo proveniente da fermentação de perfusão continua. Devido ao dimensionamento pequeno do vaso de transbordamento em relação às taxas de fluxo ajustadas, o tempo de residência médio do produto no vaso é mantido num mínimo, isto é, abaixo de 12 horas, de preferência abaixo de 4 horas e com ainda mais preferência abaixo de 2 horas. O fluxo cruzado adequado e, portanto, a transferência de massa é ajustada no módulo de ultrafiltração por meio da bomba de reciclagem (301) . A taxa de fluxo de retido é ajustada e controlada ao utilizar a bomba de retido (311), rendendo assim uma taxa de fluxo constante e contínua Qi do produto isolado concentrado deixando o dispositivo A em sua saída (312) . A bomba de permeato (305) é utilizada para ajustar e controlar a taxa de fluxo Qp do permeato, que é extraído continuamente do lado de permeato do módulo (ou módulos) de ultrafiltração, e que consiste em água e componentes de soluções pequenos o suficiente para passar através da membrana de ultrafiltração (por exemplo, sais, proteínas pequenas).

As taxas de fluxo de permeato (Qp) e retido/isolado (Qi) são cuidadosamente ajustadas e controladas para corresponder a taxa de fluxo de colheita Qh da fermentação para que:

Ao mesmo tempo, as taxas de fluxo são ajustadas e controladas de modo que um fator de concentração desejado cf seja alcançado ao satisfazer:

Por exemplo, para alcançar um fator de concentração de produto desejável de 10 vezes no isolado em relação à concentração de colheita inicial, Qi é controlado em Qi = 1/10 * Qh com a utilização da bomba de ret ido/isolado (311), enquanto Qp é controlado em Qp = 0,9 * Qh com a utilização da bomba de permeato (305).

Visto que as taxas de fluxo são controladas pelas bombas (305) e (311), o sistema de ultrafiltração extrai automaticamente um fluxo de Qp + Qi do vaso de transbordamento pequeno (201).

No caso da utilização da forma de realização A2 (veja-se a Figura 2 lado direito), uma corrente estéril de tampão ou água para injeção do vaso 314 é adicionada ao sistema de ultrafiltração contínua continuamente numa taxa de fluxo constante Qb com a utilização da bomba de adição de tampão (313). Portanto, as condições do isolado podem ser livre e continuamente ajustadas, por exemplo, em termos de força iónica, pH, adição de estabilizadores, etc. As taxas de fluxo são, portanto, controladas em

Além do mais, as razões de taxa de fluxo podem ser escolhidas de modo que um fator de concentração desejado cf seja alcançado ao satisfazer Qi = 1/cf * (Qh + Qb) . Alternativamente, esse processo pode ser utilizado para apenas alterar as condições (por exemplo pH, condutividade), ao estabelecer Qi = Qh + Qb. O método inovador para utilização do dispositivo A também contrasta com os processos de lote de UF (técnica anterior) no que diz respeito ao ponto de ajuste

operacional da própria ultrafiltração. Os processos de UF de lote convencionais são projetados para uma determinada vazão através de uma área de membrana baixa num período curto de tempo. A UF de lote é, portanto, operada, em geral, no ponto de transição de pressão dependente da região controlada de transferência de massa (veja-se a Figura 9). Isso leva a um fluxo específico inicial desejavelmente alto, que, no entanto, cai significativamente e rapidamente ao longo do curso de segundos a minutos, à media que a polarização de concentração leva rapidamente à contrapressão osmótica e à formação de uma camada de gel limitadora (membrana secundária). Essa concentração de parede alta das macromoléculas também leva a uma maior adsorção dos compostos para a superfície de membrana interna e externa, isto é, à incrustação de membrana. Essa incrustação reduziria adicionalmente o fluxo de permeato ao longo do tempo.

Os requerentes surpreendentemente constataram que com o dispositivo A, capacidades de carregamentos gerais muitas vezes maiores por área de membrana de ultrafiltração instalada são alcançadas ao operar na extremidade baixa da curva de pressão-fluxo (veja-se a Figura 9): A concentração de parede normalizada cwall de um componente completamente retido pode ser descrita conforme a seguir:

com J = fluxo de permeato específico em litros/hora/m2 kd = coeficiente de transferência de massa em litros/hora/m2 cbulk = concentração do componente no volume de solução

Como em UF de lote, a UF contínua é operada em coeficiente de transferência de massa otimizado para minimizar a polarização de concentração. No entanto, em contraste à ultrafiltração de lote, os requerentes ajustam o fluxo de permeato J para estar na extremidade baixa da curva de pressão-fluxo (veja-se a Figura 9). Como um resultado da relação exponencial, a concentração de parede cwall na superfície da membrana é, portanto, significativamente menor do que seria em ultrafiltração de lote. Por exemplo, a presente forma de realização do método inventivo ajusta um fluxo de permeato específico alvo de aproximadamente 1/10 do coeficiente de transferência de massa alcançável, ajustando assim uma concentração de parede de apenas 10% acima da concentração de volume ajustada (ou retido). A seguinte Tabela 1 mostra um exemplo de um método para utilizar o dispositivo A (forma de realização Al) para isolamento contínuo de um produto de proteína de um parâmetro de escala de desenvolvimento:

Tabela 1

Para cada molécula de produto individual, um critério de vida pode ser definido para a configuração de ultrafiltração continua estéril, por exemplo, com base na pressão de transmembrana. Uma vez que o limite de pressão de transmembrana é excedido, a configuração de ultrafiltração estéril continua é permutada em relação a outra configuração idêntica sem comprometer a integridade e esterilidade do sistema. Isso pode ser feito em analogia à configuração de filtração estéril continua ao utilizar distribuidores e conectores estéreis, ou ao utilizar tubulação flexível descartável e soldadores de tubulação estéreis.

DISPOSITIVO B

Sistema Integrado de Remoção de Partícula Contínua (100) A Figura 3 mostra 2 formas de realização do dispositivo inventivo B. O sistema integrado de remoção de partícula contínua (100) é diretamente ligado ao lado de colheita do sistema de fermentação de perfusão continua (1) . Essa parte do dispositivo B é idêntica ao dispositivo A (veja-se a descrição detalhada do dispositivo A e da Figura 4, acima).

Vaso de Transbordamento (200) A saída do sistema integrado de remoção de partícula contínua está direta e constantemente ligada a um vaso de transbordamento (201), conforme mostrado na Figura 3. Esse vaso de transbordamento é um vaso estéril, como, um saco descartável ou um vaso de aço inoxidável com pelo menos uma porta de entrada e uma porta de saída, sendo que a última está, de preferência, no fundo do vaso. Uma faixa ampla de projetos e tamanhos de vaso pode ser utilizada. No entanto, o vaso de transbordamento é, de preferência, dimensionado para ser pequeno em comparação à vazão volumétrica do sistema para manter o tempo de residência do produto no vaso baixo, isto é, abaixo de 26 horas, de preferência abaixo de 12 horas e com ainda mais preferência abaixo de 4 horas.

No dispositivo B, o vaso de transbordamento está localizado numa célula de equilíbrio ou carga (202), conforme mostrado para as formas de realização BI e B2 na Figura 3. Essa célula de equilíbrio ou carga fornece um sinal de peso para um sistema de controlo computadorizado (não mostrado).

Além do mais, numa forma de realização do dispositivo inventivo (B2), um vaso de tampão (204) é ligado por meio de uma bomba peristáltica (203) ao vaso de transbordamento. Em operação, essa configuração é utilizada para ajustar as propriedades da corrente de colheita isenta de partícula, como condutividade (força iónica) ou pH, ao adicionar componentes para modificar as propriedades da cultura de tecido clarificado recebida do sistema de remoção de partícula, como um tampão ou diluente adequado, ou um estabilizador de proteína adequado. Nesse caso, uma presente forma de realização também compreende um sistema de mistura (205) e sensores para monitorizar a condição desejada (206), como pH ou condutividade, são utilizados. Nessa presente forma de realização, um agitador magneticamente acoplado é utilizado; no entanto, outros sistemas de mistura, como sacudidores ou dispositivos pulsantes também poderiam ser utilizados.

Em outra forma de realização do dispositivo inventivo, 2 vasos de transbordamento são utilizados. Em qualquer dado momento, um vaso de transbordamento é diretamente ligado ao sistema de remoção de partícula contínua (100), recebendo, assim, fluido clarificado, enquanto o outro é ligado ao sistema de concentração/purificação semicontínua (400), alimentando assim um ciclo de adsorção/dessorção convectiva. A comutação entre ambos é realizada através de um sistema de controlo, com a utilização do peso do vaso de recebimento para acionar um comutador uma vez que o volume de enchimento máximo for atingido.

Concentração/purificação semicontínua integrada (400)

Dispositivo B, 2 formas de realização gue são mostradas na Figura 3, compreende um sistema de adsorção/dessorção convectiva semicontínua integrado (400). O sistema de adsorção/dessorção convectiva semicontínua integrado é projetado e dimensionado para gue sua taxa de fluxo de carregamento (Qload) seja significativamente maior do gue a taxa de fluxo do processo de filtração contínua e colheita de perfusão contínua (Qh), isto é, Qload >> Qh.

As formas de realização do sistema de concentração/purificação semicontínua integrado (400) compreendem uma bomba de carga (401), um conjunto de válvula de múltiplas portas (402) e vários vasos de tampão (404), uma válvula de 3 vias (403) ligada a um vaso de recebimento de resíduo estéril (413) e um ou mais módulos adsorvedores conectivos (406), calibres ou transmissores de pressão de entrada e saída (405, 408), instrumentação adicional como sensor de UV (409), sensores de pH e condutividade (409, 410), medidor de fluxo (412), bem como, outra válvula de 3 vias (407) ligada também ao vaso de resíduo (413) e a saída de eluato de produto (414) .

As formas de realização do dispositivo inventivo também compreendem um sistema de controlo programável e de registro de dados (não mostrado), gue grava sinais de dados chegantes da instrumentação (como, sem limitação, pressões, UV, pH, condutividade, taxa de fluxo, peso de vaso de transbordamento) e controla as válvulas automatizadas e bomba de acordo com protocolos programados. A bomba de carga (401) é, de preferência, uma bomba peristáltica para evitar o contato direto do produto ou tampões estéreis com quaisquer vedações ou partes mecânicas. Os requerentes constaram que isso é preferencial para fornecer operação de longo prazo estéril e robusta. No entanto, outros projetos de bomba estéril podem, em princípio, ser utilizados. A bomba de carga é dimensionada dependendo do volume de matriz instalada do adsorvedor conectivo (406) para permitir o ajuste robusto de pelo menos 12 volumes de matriz/minuto. Por exemplo, numa presente forma de realização, as cápsulas adsorvedoras de membrana Mustang (Pall Corp.) são utilizadas, as guais têm um volume de matriz de aproximadamente 0,3 litro. Portanto, a bomba de carga é dimensionada para permitir taxas de fluxo de carregamento de até 3,6 litros/minuto. A função do conjunto de válvula de múltiplas portas (402) é permitir a comutação entre o produto gue contém carga extraída do vaso de transbordamento (201) e cada um dos tampões estéreis e soluções de limpeza dos vasos de tampão estéril (404). As presentes formas de realização do dispositivo B utilizam uma série de válvulas de manga flexível acionadas automaticamente, gue apertam a tubulação flexível ligada a cada vaso de tampão a partir de fora para fechar e abrir cada linha. Os requerentes constaram que essas válvulas de manga flexível fornecem uma solução particularmente benéfica para o dispositivo B visto que as mesmas evitam qualquer contato de produto e, portanto, não precisam de ser limpas ou esterilizadas. No entanto, uma faixa ampla de válvulas comerciais adequadas para processamento estéril e conhecidas por aqueles familiares com o campo podem ser utilizadas, como válvulas de membrana atuada.

Na presente forma de realização, a válvulas de 3 vias (403, 407) são válvulas de membrana atuada autoclaváveis. No entanto, uma variedade de válvulas comerciais adequadas para processamento estéril pode em princípio ser utilizadas, a incluir, por exemplo, válvulas de manga flexível. O módulo adsorvedor conectivo (406) contém uma matriz cromatográfica com transferência de massa predominantemente convectiva do produto para a superfície adsortiva e, em contraste à cromatografia convencional, é esterilizado antes da operação por autoclavagem, vaporização ou irradiação. A transferência de massa predominantemente convectiva permite, em contraste à cromatografia de leito embalado convencional, tempos de ciclo de adsorção/eluição/regeneração muito baixos, gue os requerentes utilizam no dispositivo inventivo para realizar a operação semicontínua.

Na presente forma de realização do dispositivo inventivo, o adsorvedor conectivo (406) consiste numa ou mais cápsulas adsorvedoras de membrana comercialmente disponíveis com química de troca iónica (Mustang, Pall Corporation ou Sartobind, Sartorius). No entanto, o dispositivo pode utilizar outros materiais adsorvedor de membrana e geometrias e matrizes conectivas inovadoras como matrizes monolíticas também, visto que em contraste à cromatografia convencional a embalagem de resina convencional é eliminada e as matrizes podem, em geral, ser encapsuladas em módulos de pronta utilização.

Além do mais, outras químicas, a incluir as matrizes de afinidade convectivas que compreendem ligantes de ligação de produto específico também renderão desempenho unicamente benéfico no dispositivo inventivo.

Em uma forma de realização do dispositivo inventivo, múltiplos módulos de adsorvedor conectivo são utilizados no dispositivo na forma de um conjunto de filas de adsorvedor conectivo em paralelo, semelhante ao sistema de remoção de partícula contínua (100) . O conjunto inteiro com todas as filas de adsorvedor é esterilizado em conjunto, permitir a comutação em operação de uma fila de adsorvedor para uma fresca deveria ser a primeira a atingir o fim de sua vida útil, como determinado, por exemplo, por um critério predefinido como contrapressão durante o carregamento ou número máximo de ciclos operacionais realizados. Cada fila de adsorvedor consiste num módulo individual ou múltiplos módulos de adsorvedor conectivo em paralelo e/ou em série para aumentar a capacidade de ligação e/ou aprimorar a utilização de capacidade. É importante enfatizar que o dispositivo inventivo permite não apenas continua, mas uma operação realmente estéril, em contraste à operação apenas asséptica. Os requerentes alcançaram isso ao projetar todos os componentes de sistema que contatam produto para suportar não apenas a limpeza, mas também a esterilização por autoclavagem, vaporização no local ou irradiação gama. Nas presentes formas de realização os módulos encapsulados descartáveis são utilizados para remoção de partícula continua (100), bem como, adsorção/dessorção convectiva estéril semicontinua (400). As bombas peristálticas são utilizadas para evitar qualquer contato de produto com os elementos giratórios e vedações mecânicas. Além do mais, nas presentes formas de realização os conjuntos de saco e tubulação descartáveis são utilizados ao invés de tubulação rígida. Os componentes que contatam produto descartáveis (por exemplo, tubulação, sacos, módulos) ou grupos de componente são pré-montados e esterilizados juntos, simplificando assim a inicialização e operação. Os sistemas são projetados para manter qualquer abertura potencial do sistema estéril para o ambiente (por exemplo, capa de fluxo laminar), em relação à amostragem, saco permuta de instrumentação a um mínimo. Nas presentes formas de realização do dispositivo, distribuidores são projetados redundantes para permitir a comutação de um componente estéril (por exemplo, saco de recebimento de produto) para o próximo sem abertura. A permuta adicional de tubulação, módulos ou sacos é, de preferência, realizada ao utilizar soldadores de tubulação estéreis ao invés de conectores estéreis .

Outras formas de realização futuras dos dispositivos inventivos também poderiam compreender componentes como vasos de aço inoxidável, alojamentos de filtro ou tubulação que pode ser esterilizada no local, sozinha ou em combinação com componentes descartáveis, desde que a robustez e esterilidade na operação de longo prazo sejam asseguradas.

As formas de realização adicionais do dispositivo inventivo B são projetadas para processar o material a partir de múltiplos fermentadores em usinas de fabrico maiores (B3) . Um exemplo é mostrado esquematicamente na Figura 6. Outras formas de realização do dispositivo inventivo B são projetadas para aumentar o fator de concentração e desempenho de separação geral ao combinar múltiplos sistemas de adsorção/dessorção (400) em série, com respetivos vasos de transbordamento estéreis entre os mesmos (200) (veja-se a Figura 6, B4).

Ainda outras formas de realização dos dispositivos inventivos são projetadas para aumentar o fator de concentração geral e desempenho de separação ao combinar um sistema de ultrafiltração contínua (300) em série com um sistema de adsorção/dessorção convectiva semicontínua (400) por meio de um vaso de transbordamento adicional. Um exemplo de uma forma de realização é mostrado esquematicamente na Figura 7.

DESCRIÇÃO DO MÉTODO PARA UTILIZAÇÃO DO DISPOSITIVO B

As fermentações de perfusão contínua são operadas ao longo de um período de tempo (uma campanha), tipicamente entre 2 semanas e 6 meses ou mais. O fluido de cultura de tecido (TCF) que contém produto, células e detritos celulares é continuamente processado com a utilização do dispositivo B. Uma corrente de produto parcialmente purificado, concentrado isento de partícula e estéril (o "produto isolado") é produzida e deixa continuamente o dispositivo em sua saída (414) . Através da utilização da bomba (101) do sistema estéril de remoção de partícula contínua (100) a colheita é bombeada continuamente através do conjunto de filtração (103) na taxa de fluxo de colheita de perfusão desejada Qh da fermentação. A corrente de emissão do sistema de filtração contínua, isto é, o fluido de cultura de tecido clarificado (cTCF), entra continuamente no vaso de transbordamento (201) .

Sempre que o vaso de transbordamento é enchido até um nível pré-definido, um sinal de peso ou nível aciona automaticamente um ciclo de adsorção/dessorção do sistema de concentração/purificação semicontínua estéril integrado. O material colhido no vaso de transbordamento é carregado rapidamente na configuração de adsorvedor, isto é, dentro de 4 horas, de preferência dentro de 2 horas, e com ainda mais preferência dentro de 1 hora ou menos, esvaziando assim o vaso de transbordamento.

Nas presentes formas de realização mostradas na Figura 3, a colheita do fluido de cultura de tecido clarificado isento de partícula (cTCF) continua em todos os momentos, no mesmo vaso de transbordamento pequeno. O volume no vaso de transbordamento pequeno varia, portanto, entre um valor mínimo e máximo. Em outra forma de realização descrita no texto anteriormente, a colheita é comutada alternadamente entre 2 vasos de transbordamento idênticos.

Embora o cTCF esteja continuando a acumular no vaso de transbordamento, o adsorvedor carregado experimenta mais etapas de um protocolo cromatográfico predefinido, projetado para dessorver o produto alvo na forma purificada concentrada e para preparar o adsorvedor para o próximo ciclo de carregamento. Portanto, o ciclo geral compreende carregamento, lavagem, eluição, regeneração e reequilíbrio, cada uma com um ou mais tampões adequados.

Visto que novamente as taxas de fluxo durante essas etapas podem ser altas devido à natureza dos adsorvedores convectivos, o tempo de ciclo total é mantido baixo, isto é, abaixo de 6 horas, de preferência abaixo de 3 horas e com ainda mais preferência abaixo 1,5 horas. Portanto, o sistema integrado é projetado de modo que a configuração de adsorvedor esteja pronta para o próximo ciclo de carregamento antes de o vaso de transbordamento ser enchido novamente, permitindo assim a operação semicontínua. A seguinte Tabela 2 mostra um exemplo de um método para a utilização de uma presente forma de realização do dispositivo inventivo B para isolamento do Fator de coagulação sanguínea humano recombinante VIII (dados de grande escala mostrados). 0 método provou-se ser unicamente benéfico. Os rendimentos e desempenho de cada ciclo de adsorção/dessorção foi semelhante ao lote, com o rendimento de produto geral aumentado por mais de 10% devido ao tempo de residência inferior do produto e, portanto, degradação de produto minimizada. O mesmo método também provou ser muito benéfico para o isolamento de variantes de FVIII geneticamente modificados, incluindo FVIII de domínio B deletado, que é significativamente diferente do FVIII de comprimento completo em tamanho e outras características. Espera-se ser útil para a produção de outras proteínas e biomoléculas também. O próprio protocolo cromatográfico (químicas de tampão & sequência, volumes de carregamento e taxas de fluxo) pode ser desenvolvimento experimentos de cromatografia em lote para cada molécula individual e pode, então, ser prontamente transferido para ser utilizado com formas de realização do dispositivo inventivo.

Tabela 2

Para cada molécula de produto individual, um critério de vida é definido para a configuração de adsorvedor convectivo, por exemplo, com base na pressão durante o carregamento, ou recuperação. Tipicamente, um número máximo de ciclos nmax é especificado e validado. Uma vez que a configuração de adsorvedor foi utilizada na operação semicontínua operação através de nmax ciclos, é permutada em relação a outra configuração de adsorvedor idêntica sem comprometer a integridade e esterilidade do sistema. Nas presentes formas de realização isso é feito em analogia à configuração de filtração estéril contínua ao utilizar distribuidores e conectores estéreis, ou ao utilizar tubulação flexível descartável e soldadores de tubulação estéreis.

Quando se utiliza a forma de realização do dispositivo inventivo mostrado na Figura 3, lado direito, uma corrente estéril de tampão, solução de ajuste de pH, solução estabilizadora ou água para injeção é adicionada contínua ou intermitentemente a partir de um vaso estéril (204) ao utilizar uma bomba de adição de tampão (203) . Portanto, as condições do cTCF podem ser livremente ajustadas, por exemplo em termos de força iónica, pH, adição de estabilizadores etc.

Benefícios da Invenção

Os dispositivos inventivos e respetivos métodos para utilização dos dispositivos solucionam os problemas de processos de isolamento convencionais esboçados anteriormente (veja-se antecedentes gerais da invenção).

Em todas as formas de realização dos dispositivos A e B e respetivos métodos para utilização dos dispositivos, o tempo de residência de produto em meio potencialmente prejudicial é unicamente minimizado, o que aumenta significativamente o rendimento e qualidade dos produtos biológicos complexos inerentemente instáveis. A capacidade de usina pode ser aumentada e o custo das mercadorias reduzido.

Além do mais, os dispositivos e respetivos métodos eliminam a necessidade por grandes instalações de sala fria ou vasos arrefecidos para armazenamento intermediário de grandes volumes de colheita, a reduzir assim os custos de investimento da usina e concretizar completamente a vantagem de compacidade e mobilidade da fermentação perfusão.

As formas de realização de ambos os dispositivos inventivos e respetivos métodos reduzem os custos de trabalho em comparação a processamento de lote com trabalho intensivo devido ao grau inerentemente alto de automação. Os dispositivos inovadores permitem a operação continua, 24 horas por dia, ao longo de longos períodos de tempo, maximizando a vazão volumétrica e utilização de equipamento.

Além do mais, os dispositivos inventivos eliminam as dificuldades logísticas em usinas de um ou múltiplos fermentadores. As formas de realização podem processar material de uma ou múltiplas fermentações de perfusão continua.

Com importância, visto que os dispositivos e métodos inovadores permitem operação completamente estéril, os tecidos de carga microbiana, bem como, tecidos de endotoxina são eliminados, o que não poderia ser alcançado por processamento asséptico seguido por filtragem estéril simples.

Além do mais, os dispositivos inventivos possibilitam evitar ou minimizar a necessidade por validação de limpeza devido à utilização de descartáveis. Através das características únicas dos dispositivos inventivos e métodos, os módulos descartáveis, bem como, tubulação, sacos e conjuntos podem ser utilizados, cada um, por um longo período de tempo (até a extensão inteira da campanha), reduzindo, assim, dramaticamente os cursos e tornando a utilização de descartáveis altamente atraente a partir de um ponto de vista económico. [

As presentes formas de realização dos dispositivos inventivos A e B e respetivos métodos se provaram ser especialmente úteis para o fabrico de Fator de coagulação sanguínea recombinante VIII, bem como, versões geneticamente modificadas de FVIII que incluem, sem limitação, FVIII de domínio B deletado. No entanto, a invenções podem claramente ser esperadas para serem semelhantemente úteis para a produção de outras proteínas e moléculas biológicas, em particular, proteínas inerentemente instáveis complexas como Fator VII, Fator IX, Fator X, e outros.

Benefícios do Dispositivo A e Respetivo Método A Figura 8 mostra um exemplo do aumento de capacidade de filtro surpreendente que os requerentes constataram para o elemento de remoção de partícula contínua (100) . A Figura 10 mostra uma distribuição de tempo de residência e tempo de residência médio do produto no sistema de UF contínuo (300) de uma forma de realização do dispositivo inventivo A, conforme determinado por adsorção de UV do retido em 280 nm, com uma proteína de modelo sob condições típicas. Como pode ser visto, o tempo de residência médio do produto no sistema é apenas aproximadamente 40 minutos. Portanto, o total tempo de residência total do produto nessa presente forma de realização do dispositivo A, da linha de colheita de fermentador até o final, o retido concentrado (isolado) é mantido dentro de 1 a 2 horas ou menos. Isso é menor do que 1/10 do tempo de residência de 28 horas ou mais num processo de isolamento de lote convencional, em que o produto (colheita) é colhido por pelo menos 24 horas (a vários dias), após o qual o produto é processado por tipicamente pelo menos 4 a 10 horas. A Figura 11 mostra uma comparação dos rendimentos de isolamento total resultantes do fator de coagulação sanguínea recombinante (rFVIII) da fermentação de perfusão continua isenta de proteína de plasma tanto para um processo de isolamento de lote convencional (filtração de lote mais UF de lote) quanto ao utilizar o dispositivo inventivo A e respetivo método. Como pode ser visto a partir da figura, o processo contínuo inventivo alcança rendimento de produto significativamente maior, que pode levar a capacidades de fabrico maiores e custos de fabrico reduzidos.

Durante o método inventivo para utilização do dispositivo A, a pressão transmembranar da ultrafiltração contínua integrada irá aumentar com o tempo, enquanto o fluxo de membrana específico (em litros/hora/m2/bar) está diminuindo em vazão volumétrica constante. Isso é comum para todos os processos de ultrafiltração e é devido a efeitos como polarização de concentração, incrustação e formação de camada de gel. No entanto, em contraste à ultraf iltração de lote, como pode ser visto a partir do exemplo mostrado na Figura 12, as mudanças de pressão e fluxo especifico são extremamente baixas com o dispositivo A, permitindo a operação contínua por semanas de uma vez, antes de as membranas precisarem de ser limpas ou substituídas. Adicionalmente, a taxa de mudança e desempenho geral do sistema é bem insensível ao produto produzido ou à linha celular utilizada na fermentação de perfusão contínua (Figura 12). Portanto, o dispositivo inventivo A e respetivo método também é idealmente adequado como uma plataforma genérica para rápida produção de várias proteínas visto que funciona de forma robusta e previsível com várias proteínas alvo de diferentes linhas celulares.

Surpreendentemente, os requerentes constataram que os efeitos negativos da incrustação e formação de camada de gel são, na verdade, tão minimizados com o dispositivo A, que um volume total muito maior por área de ultrafiltrado instalada pode ser processado, antes de a limpeza ou substituição dos filtros se tornar necessária. A Figura 13 mostra o desempenho robusto do dispositivo inventivo A em longo prazo. Após aproximadamente 25 dias, uma pressão transmembranar surpreendentemente pareceu estabilizar num estado quase contínuo, sugerindo desempenho de longo prazo ainda maior. No dia 27, a taxa de fluxo de retido foi duplicada de propósito para testar o efeito de maior vazão. Após 34 dias, uma curta descarga foi realizada com NaOH a 0,5 M estéril, sem abrir o sistema, e assim ao mesmo tempo em que mantém a esterilidade e integridade de sistema completa. Após isso, a TMP estabilizou novamente, ou pelo menos aumentou apenas numa taxa extremamente baixa. Após 70 dias de operação contínua e estéril, a taxa de fluxo de reciclagem foi reduzida de propósito pela metade para testar o efeito sobre o desempenho de sistema. Como esperado, a TMP começou a aumentar com uma taxa de alguma forma superior devido à transferência de massa reduzida e, portanto, maior concentração de parede na superfície de membrana. No entanto, 95 dias de operação foram completados com sucesso e de modo robusto antes de o sistema ser desativado. Um total de quase 4.500 litros foram processados por m2 de área de membrana, com mínimo trabalho manual (apenas amostragem diária). Em comparação, o processo de ultrafiltração de lote convencional otimizado para a mesma aplicação tem 45-vezes menos capacidade de carregamento, em aproximadamente 100 L/m2, e requer pelo menos 1 a 2 operações em tempo integral.

Além disso, surpreendentemente, a seletividade do dispositivo inventivo A, em particular seu sistema de ultrafiltração contínua integrado (300), provou ser significativamente maior do que a seletividade de um processo de lote convencional. É bem conhecido para aqueles familiares com o campo que em ultrafiltração de lote convencional, uma membrana secundária é formada a partir de macromoléculas retidas durante o estágio inicial do processo (camada de gel), que reduz o corte de peso molecular aparente. 0 resultado é que tanto a molécula alvo quanto as proteínas menores contaminantes são retidas, o que torna a purificação simultânea praticamente impossível. Portanto, com a ultrafiltração de lote convencional é raramente possível separar as proteínas que estão separadas por menos do que um fator de 10 em termos de seu peso molecular. No entanto, como pode ser visto a partir da Figura 14, com o processo de ultrafiltração contínua integrada inventivo é possível ajustar as condições para separar de modo eficaz IL-2SA (aproximadamente 16 kD) e proteína fluorescente verde GFP (27 a 30 kD) . Esse desempenho de separação maior do que o esperado permite a concentração e purificação simultânea.

Benefícios do Dispositivo B e Respetivo Método A Figura 15 ilustra o desempenho do dispositivo inventivo B. Utilizando um adsorvedor conectivo comercial (Mustang Q, Pall Corporation, módulo de 15 camadas), quase 100 ciclos de adsorção/dessorção consecutivos foram realizados, a concentrar e purificar através dos mesmos uma variante FVIII recombinante de cultura de perfusão contínua. O rendimento médio alcançado foi aproximadamente 95% (resultados de dispersão da variação de ensaio), enquanto a pressão permaneceu relativamente constante ao longo do número inteiro de ciclos realizados. Portanto, pode ser especificado que pelo menos 100 ciclos consecutivos podem ser realizados antes de trocar a configuração de adsorvedor.

Como foi mostrado na descrição detalhada do método para utilização do dispositivo inventivo B, o tempo de residência médio total do produto numa presente forma de realização é menos do que 3 horas, antes de ser eluído na forma concentrada, purificada e estabilizada num tampão adequado. Isso é significativamente menos do que tempo de residência de 24 horas num processo de isolamento de lote convencional realizado uma vez por dia e, portanto, resulta em rendimentos significativamente maiores dos produtos de proteína inerentemente lábil. Numa presente forma de realização descrita anteriormente, aproximadamente 13 ciclos são realizados por dia, o que significa no contexto da Figura 15 que o conjunto de adsorvedor semicontínuo teria de ser permutado apenas a cada 7 a 8 dias, o que é feito sem comprometer a esterilidade e continuidade da operação. A Figura 16 mostra um exemplo da UV e perfil de condutividade ao longo de um único ciclo de regeneração e adsorção/ressorção típico com o dispositivo B. Pode ser visto que mais de 450 volumes de adsorvedor (CVs) podem ser carregados, enquanto o produto elui num pico muito agudo. Os contaminantes são removidos significativamente no fluxo durante a fase de carregamento, bem como, durante a lavagem e a eliminação (fase de regeneração). A Figura 17 ilustra o desempenho de purificação do processo inventivo que compreende adsorção/dessorção convectiva semicontínua. Um gel SDS page exemplificativo de um isolado de variante FVIII é mostrado. Como pode ser visto, as frações de eluato, que incluem 95% da variante FVIII carregado (conforme determinado por ensaio de atividade separada), contêm significativamente menos proteína do que a carga e são, portanto, purificadas. Nenhuma banda de degradação adicional está visível no eluato (isolado), indicando qualidade de produto excelente.

Em suma, o dispositivo inventivo B tem a capacidade de alcançar desempenho de purificação semelhante como processos de lote comparáveis, enquanto ao mesmo tempo minimiza as perdas de rendimento para produtos de proteína inerentemente instáveis, bem como, problemas de qualidade de produto, devido à minimização do tempo de residência de produto. Ao mesmo tempo, os custos de trabalho são dramaticamente reduzidos devido ao grau inerentemente alto de automação do processo inventivo, requerendo mínima intervenção do operador.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de não patente citados na descrição • Biotechnology. Bioprocessing. Wiley-VCH, 1996, vol. 3 [0004] [0006] • Protein Purification, Principies, High-Resolution Methods, and Applications. Wiley-VCH, 1998 [0008]

Lisboa, 12 de Maio de 2017

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo para purificar uma proteína de interesse de uma mistura de fluido de cultura de tecido heterogénea, caracterizado por compreender: (a) produzir por um processo de fermentação de perfusão continua a mistura de fluido de cultura de tecido heterogénea que contém uma proteína de interesse; (b) transferir uma mistura de fluido de cultura de tecido para um processo de remoção de partícula contínua integrada com o sistema de fermentação de perfusão contínua; (c) remover contaminantes de particulado do fluido de cultura de tecido no processo de remoção de partícula contínua para produzir um fluido de cultura de tecido clarificado que contém a proteína de interesse; (d) transferir o fluido de cultura de tecido clarificado para um vaso de transbordamento integrado com o processo de remoção de partícula contínua; (e) transferir de modo intermitente o fluido de cultura de tecido clarificado para um processo de purificação integrado com o vaso de transbordamento; e (f) purificar a proteína de interesse do fluido de cultura de tecido clarificado no sistema de purificação para produzir o isolado de produto estéril, livre de partícula, concentrado e parcialmente purificado que contém a proteína de interesse; em que a taxa de fluxo específica da mistura através do processo de fermentação de perfusão contínua e processo de remoção de partícula contínua é mantida substancialmente constante.
2. 2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, em que o processo de purificação consiste em adsorção/dessorção convectiva.
3. 3. Aparelho para separação de uma proteína de interesse de uma corrente de fluido de cultura de tecido, que compreende: (a) um sistema de fermentação de perfusão continua; (b) um sistema de remoção de partícula contínuo integrado com o sistema de fermentação de perfusão; e (c) um sistema de purificação intermitente integrado com o sistema de remoção de partícula; em que o aparelho é mantido sob condições estéreis.
4. 4. Aparelho, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender: (a) um sistema de fermentação de perfusão adaptado para produzir continuamente um fluido de cultura de tecido que contém uma proteína de interesse; (b) um sistema de remoção de partícula integrada com e adaptado para receber continuamente o fluido de cultura de tecido do reator e produzir continuamente um fluido de cultura de tecido clarificado; (c) um vaso de transbordamento integrado com e adaptado para receber continuamente o fluido de cultura de tecido clarificado do sistema de remoção de partícula e libertar de modo semicontínuo o fluido de cultura de tecido clarificado, e (d) um sistema de purificação integrado com e adaptado para receber de modo semicontínuo o fluido de cultura de tecido clarificado do vaso de transbordamento; em que o aparelho é adaptado para manter condições estéreis.
5. 5. Aparelho, de acordo com a reivindicação 3, em que o sistema de purificação compreende um sistema de adsorção/dessorção convectiva. Lisboa, 12 de Maio de 2017