ES2570006T3

ES2570006T3 - Dispositivos y métodos de preparación continua integrada de moléculas biológicas

Info

Publication number: ES2570006T3
Application number: ES05800224.7T
Authority: ES
Inventors: Jens Vogel; Roberto Giovannini; Konstantin B. Konstantinov; Huong Nguyen; Peng Wu
Original assignee: Bayer Healthcare LLC
Current assignee: Bayer Healthcare LLC
Priority date: 2004-09-30
Filing date: 2005-09-30
Publication date: 2016-05-13
Anticipated expiration: 2025-09-30
Also published as: US20130345402A1; CN102794109B; IL205228A0; IL181775A; HUE032538T2; JP2012213772A; US20080269468A1; NO20072174L; KR20070092949A; KR101335936B1; NZ588616A; RU2390526C2; PL1807101T3; NO341439B1; UA99249C2; DK2550971T3; HRP20070097A2; EP1807101A2; HK1110519A1; EP1807101B1

Abstract

Un proceso de purificación de una proteína de interés a partir de una mezcla de fluido de cultivo de tejido heterogénea, que comprende: (a) producir por un proceso de fermentación por perfusión continua una mezcla de fluido de cultivo de tejido heterogénea que contiene una proteína de interés; (b) transferir la mezcla de fluido de cultivo de tejido a un proceso de eliminación de partículas continuo integrado con el proceso de fermentación por perfusión continua; (c) eliminar contaminantes en partículas del fluido de cultivo de tejido en el proceso de eliminación de partículas continuo para producir un fluido de cultivo de tejido clarificado que contiene la proteína de interés; (d) transferir el fluido de cultivo de tejido clarificado a un proceso de purificación continuo integrado con el proceso de eliminación de partículas continuo, en el que el proceso de purificación continuo es ultrafiltración y el fluido de cultivo de tejido clarificado se filtra a una velocidad de flujo específica que produce una concentración de pared inferior al 20 % superior a una concentración de retenido; y (e) purificar la proteína de interés del fluido de cultivo de tejido clarificado en el proceso de purificación continuo; en el que la velocidad de flujo específica de la mezcla a través del proceso de fermentación por perfusión continua, el proceso de eliminación de partículas continuo y el proceso de purificación continuo se mantiene sustancialmente constante.

Description

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actúa de cámara de mezcla, el acondicionamiento también puede realizarse alternativamente usando una configuración de recipiente amortiguador como se muestra para el dispositivo B (realización B2), que comprende los componentes (203, 204, 205, 206) como se trata después en la presente divulgación (véase la descripción del dispositivo B).

Las realizaciones del dispositivo inventivo también comprenden un sistema de control de registro de datos y programable que registra las señales de datos de entrada de la instrumentación (tales como, pero no se limitan a, presiones, velocidad de flujo, peso del recipiente, pH, conductividad) y controla las velocidades de la bomba según un algoritmo de control predefinido.

Todas las bombas (301, 305, 311, 313) son bombas peristálticas, que permiten el bombeo de las corrientes de fluido respectivas sin ninguna parte giratoria o junta puesta en contacto con la corriente de producto estéril. Los solicitantes descubrieron que esto es preferible para proporcionar operación a largo plazo estéril robusta. Sin embargo, en principio pueden usarse otros diseños de bomba estéril. La bomba de recirculación (301) y su tubería de bomba están diseñadas para permitir el robusto ajuste de las velocidades de flujo cruzado deseadas de entre 80 y 800 litros/hora por m2 de área de membrana instalada, dependiendo de las características de transferencia de masa del módulo de ultrafiltración usado. La bomba de permeado está dimensionada para permitir el robusto y preciso ajuste de un flujo de permeado específico de entre el 90 % y el 99 % de la velocidad de flujo de cosecha de la fermentación por perfusión continua. La bomba de retenido está dimensionada para permitir un robusto y preciso ajuste del flujo de retenido de entre el 1 % y el 10 % de la velocidad de flujo de cosecha de la fermentación por perfusión continua.

Se usan módulos de ultrafiltración encapsulados (303) para permitir la robusta operación estéril, y se esterilizan por estilización en autoclave o irradiación. El corte de peso molecular nominal óptimo se elige basándose en el peso molecular del producto de proteína de interés y tiene que confirmarse por experimentos estándar conocidos para aquellos expertos en la materia. Puede usarse una variedad de materiales de membrana, tales como poliétersulfona, poliétersulfona hidrofilizada o celulosa regenerada, en tanto que el módulo de membrana entero pueda esterilizarse por irradiación y/o esterilización en autoclave sin dañar la membrana. Se espera que los materiales hidrófilos puedan aumentar la eficiencia debido a sus menores tendencias a la incrustación.

Los solicitantes descubrieron que el dispositivo A es únicamente eficaz si el área de membrana de ultrafiltración total instalada en metros cuadrados es igual a un intervalo de entre 0,1 y 2 veces la velocidad de flujo volumétrica de la cosecha de la fermentación por perfusión continua en litros/hora. Por ejemplo, para una velocidad de flujo de cosecha de perfusión de 1 litro/hora, el área de membrana total instalada debe estar entre 0,1 y 2 metros cuadrados. Los solicitantes descubrieron que el dispositivo A es todavía más eficaz si el área de membrana de ultrafiltración instalada en metros cuadrados es igual a un intervalo de entre 0,3 y 1 veces la velocidad de flujo volumétrica de la cosecha de la fermentación por perfusión continua en litros/hora.

En una realización de la invención se usan módulos de membrana de fibra hueca “desechables” comercialmente disponibles (GE Healthcare, anteriormente Amersham Biosciences). Sin embargo, puede usarse una variedad de membranas encapsuladas y diseños de módulo, tal como módulos enrollados en espiral, casetes encapsulados o cápsulas con transferencia de masa potenciada debido a patrones de flujo secundario (por ejemplo, flujo de vórtex), elementos giratorios (por ejemplo, filtros de disco dinámico) o filtros vibratorios. Se espera que especialmente puedan usarse beneficiosamente casetes de ultrafiltración encapsulados en los dispositivos inventivos, ya que proporcionan altos coeficientes de transferencia de masa a velocidad de flujo cruzado requerida relativamente baja, reduciendo así la capacidad de la bomba, mientras que la complejidad del sistema y los costes de inversión se mantienen bajos.

El dispositivo inventivo permite no solo operación continua, sino también perfectamente estéril, a diferencia de solo operación aséptica. Los solicitantes lograron esto diseñando todos los componentes del sistema en contacto con el producto para resistir no solo a la limpieza, sino también a la esterilización por esterilización en autoclave, tratamiento con vapor en su sitio o irradiación gamma. En las presentes realizaciones se usan módulos encapsulados desechables para la eliminación de partículas continua (100), además de la ultrafiltración continua (300). Las bombas peristálticas se usan para evitar cualquier contacto del producto con elementos giratorios y juntas mecánicas. Además, en las presentes realizaciones se usan tubería desechable y ensamblajes de bolsa en lugar de tubería dura. Los componentes que se ponen en contacto con el producto desechables (por ejemplo, tubería, bolsas, módulos) o grupos de componentes se pre-ensamblan y se esterilizan juntos, simplificándose así la puesta en marcha y operación. Los sistemas se diseñan para mantener cualquier posible abertura del sistema estéril al entorno (por ejemplo, campana de flujo laminar), como para muestreo, intercambio de bolsa o de instrumentación a un mínimo. En las presentes realizaciones del dispositivo, los colectores están diseñados redundantes para permitir la conmutación de un componente estéril (por ejemplo, bolsa receptora de producto) al siguiente sin abertura. El intercambio adicional de tuberías, módulos o bolsas se realiza preferentemente usando soldadores de tubería estéril en vez que conectores estériles.

Otras realizaciones futuras de dispositivos inventivos también podrían comprender componentes tales como recipientes de acero inoxidable, carcasas de filtro o tubería que pueden esterilizarse en su sitio, solos o en

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convencionales se diseñan para un cierto caudal a través de un área de membrana baja en un corto periodo de tiempo. La UF discontinua es así generalmente operada en el punto de transición de región dependiente de la presión a controlada por la transferencia de masa (véase la Figura 9). Esto conduce a un flujo específico inicial deseablemente alto, que sin embargo disminuye significativamente y rápidamente durante el transcurso de

5 segundos a minutos, a medida que la polarización por concentración conduce rápidamente a contrapresión osmótica y formación de una capa de gel limitante (membrana secundaria). Una alta concentración de pared de macromoléculas tal también conduce a una elevada adsorción de compuestos a la superficie de la membrana interna y externa, es decir, a incrustación de la membrana. Esta incrustación reduciría adicionalmente el flujo de permeado con el tiempo.

10 Los solicitantes descubrieron sorprendentemente que con el dispositivo A se logran capacidades de carga global muchas veces mayores por área de membrana de ultrafiltración instalada operando en el extremo inferior de la curva de presión-flujo (véase la Figura 9):

15 La concentración de pared normalizada cpared de un componente completamente retenido puede describirse del siguiente modo:

J

d

c  ek ·c

pared masa

20 con

J = flujo de permeado específico en litros/hora/m2 kd = coeficiente de transferencia de masa en litros/hora/m2 cmasa = concentración del componente en la masa de disolución

25 Al igual que la UF discontinua, la UF continua opera a coeficiente de transferencia de masa optimizado para minimizar la polarización por concentración. Sin embargo, a diferencia de la ultrafiltración discontinua, los solicitantes ajustan el flujo de permeado J para que esté en el extremo bajo de la curva de presión-flujo (véase la Figura 9). Como resultado de la relación exponencial, la concentración de pared cpared en la superficie de la membrana es, por

30 tanto, significativamente menor que la que sería en la ultrafiltración discontinua. Por ejemplo, la presente realización del método inventivo ajusta un flujo de permeado específico objetivo de aproximadamente 1/10 del coeficiente de transferencia de masa alcanzable, ajustando así una concentración de pared de solo el 10 % por encima de la concentración de masa ajustada (o retenido).

35 La siguiente Tabla 1 muestra un ejemplo de un método de uso del dispositivo A (realización Al) para el aislamiento continuo de un producto de proteína de un fermentador a escala de desarrollo:

Tabla 1

Ejemplo de método de uso de una presente realización del dispositivo A para el aislamiento continuo de un producto de proteína de fermentación por perfusión continua

Parámetro operacional: Objetivo

Velocidad de flujo de cosecha Qh de perfusión continua (controlada con bomba 101): 5 litros/hora (120 litros/día)

Velocidad de flujo del permeado QP (controlada con la bomba 305): 4,75 litros/hora

Velocidad de flujo del retenido (aislado de producto) Qi (controlada con la bomba 311): 0,25 litros/hora

Flujo de permeado específica J: 2 litros/hora/m2

Factor de concentración cf: 20 veces

40 Para cada molécula de producto individual, un criterio de vida puede definirse para la configuración de ultrafiltración continua estéril, por ejemplo, basándose en la presión transmembrana. Una vez se supera el límite de presión transmembrana, la configuración de ultrafiltración estéril continua se intercambia a otra configuración idéntica sin comprometer la integridad y esterilidad del sistema. Esto puede hacerse en analogía a la configuración de filtración estéril continua usando tanto colectores como conectores estériles, o usando tubería flexible desechable y

45 soldadores de tubería estériles.

Dispositivo B

Sistema de eliminación de partículas continuo integrado (100)

50 La Figura 3 muestra 2 realizaciones del dispositivo inventivo B. El sistema de eliminación de partículas continuo integrado (100) está directamente conectado con el lado de cosecha del sistema de fermentación por perfusión

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continua (1). Esta parte del dispositivo B es idéntica al dispositivo A (véase la descripción detallada del dispositivo A y la Figura 4, anteriormente).

Recipiente amortiguador (200)

La salida del sistema de eliminación de partículas continuo integrado está directamente y constantemente conectada a un recipiente amortiguador (201), como se muestra en la Figura 3. Este recipiente amortiguador es un recipiente estéril, tal como una bolsa desechable o un recipiente de acero inoxidable con al menos un puerto de entrada y un puerto de salida, el último preferentemente en el fondo del recipiente. Puede utilizarse un amplio intervalo de tamaños y diseños del recipiente. Sin embargo, el recipiente amortiguador está preferentemente dimensionado para ser pequeño en comparación con el caudal volumétrico del sistema para mantener el tiempo de residencia del producto en el recipiente bajo, es decir, por debajo de 26 horas, preferentemente por debajo de 12 horas y todavía preferentemente por debajo de 4 horas.

En el dispositivo B, el recipiente amortiguador está localizado sobre una balanza o celda de carga (202), como se muestra para las realizaciones B1 y B2 en la Figura 3. Esta balanza o celda de carga proporciona una señal de peso a un sistema de control computerizado (no mostrado).

Además, en una realización de los dispositivos inventivos (B2), un recipiente de tampón (204) está conectado mediante una bomba peristáltica (203) al recipiente amortiguador. En operación, esta configuración se usa para ajustar las propiedades de la corriente de cosecha libre de partículas, tales como la conductividad (fuerza iónica) o el pH, añadiendo componentes para modificar las propiedades del cultivo de tejido clarificado recibido del sistema de eliminación de partículas, tal como un tampón o diluyente adecuado, o un estabilizador de proteína adecuado. En este caso, una presente realización también comprende un sistema de mezcla (205) y se usan sensores para monitorizar la condición deseada (206), tal como el pH o la conductividad. En esta presente realización se usa un agitador magnéticamente acoplado; sin embargo, también podrían usarse otros sistemas de mezcla, tales como agitadores o dispositivos de pulsación.

En otra realización del dispositivo inventivo 2 se usan recipientes amortiguadores. En cualquier momento dado, un recipiente amortiguador se conecta directamente con el sistema de eliminación de partículas continuo (100), recibiendo así fluido clarificado, mientras que el otro se conecta al sistema de concentración/purificación semicontinuo (400), alimentando así a un ciclo de adsorción/desorción convectiva. La conmutación entre ambos se realiza mediante un sistema de control, usando el peso del recipiente receptor para desencadenar un cambio una vez se alcanza su volumen de llenado máximo.

Concentración/purificación semi-continua integrada (400)

El dispositivo B, del que se muestran 2 realizaciones en la Figura 3, comprende un sistema de adsorción/desorción convectiva semi-continua integrada (400).

El sistema de adsorción/desorción convectiva semi-continua integrada está diseñado y dimensionado de manera que su velocidad de flujo de carga (Qcarga) sea significativamente superior a la velocidad de flujo del proceso de cosecha por perfusión continua y de filtración continua (Qh), es decir, Qcarga >> Qh.

Las realizaciones del sistema de concentración/purificación semi-continua integrada (400) comprenden una bomba de carga (401), un ensamblaje de válvula multi-puerto (402) y varios recipientes de tampón (404), una válvula de 3 vías (403) conectada a un recipiente receptor de residuos (413) y uno o más módulo(s) de adsorbente convectivo (406), manómetros o transmisores de entrada y salida (405, 408), adicionalmente instrumentación tal como sensor de UV (409), sensores de pH y de conductividad (409, 410), medidor de flujo (412), además de otra válvula de 3 vías

(407) conectada también al recipiente de residuos (413) y la salida del eluato producto (414).

Las realizaciones del dispositivo inventivo también comprenden un sistema de control de registro de datos y programable (no mostrado) que registra las señales de datos de entrada de la instrumentación (tales como, pero no se limitan a, presiones, UV, pH, conductividad, velocidad de flujo, peso del recipiente amortiguador) y controla las válvulas automatizadas y la bomba según protocolos programados.

La bomba de carga (401) es preferentemente una bomba peristáltica para evitar el contacto directo del producto o tampones estériles con cualquier junta o parte mecánica. Los solicitantes descubrieron que esto es preferible para proporcionar una operación a largo plazo estéril robusta. Sin embargo, en principio pueden usarse otros diseños de bomba estéril. La bomba de carga se dimensiona dependiendo del volumen de matriz instalada del adsorbente convectivo (406) para permitir el robusto ajuste de al menos 12 volúmenes de matriz/minuto. Por ejemplo, en una presente realización se usan cápsulas de adsorbente de membrana Mustang (Pall Corp.) que tienen un volumen de matriz de aprox. 0,3 litros. Por tanto, la bomba de carga se dimensiona para permitir velocidades de flujo de carga de hasta 3,6 litros/minuto.

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Sin embargo, puede esperarse claramente que las invenciones sean similarmente útiles para la producción de otras proteínas y moléculas biológicas, en particular proteínas complejas inherentemente inestables tales como factor VII, factor IX, factor X, y otras.

Beneficios del dispositivo A y método respectivo

La Figura 8 muestra un ejemplo del sorprendente aumento de capacidad del filtro que los solicitantes descubrieron para el elemento de eliminación de partículas continua integrada (100).

La Figura 10 muestra una distribución del tiempo de residencia típico y tiempo de residencia medio del producto en el sistema de UF continua (300) de una realización del dispositivo inventivo A, como se ha determinado por adsorción de UV del retenido a 280 nm, con una proteína modelo bajo condiciones normales. Como puede apreciarse, el tiempo de residencia medio del producto en el sistema es solo aproximadamente 40 minutos. Por tanto, el tiempo de residencia total del producto en esta presente realización del dispositivo A, desde la línea de cosecha del fermentador hasta el retenido concentrado final (aislado), se mantiene en el plazo de 1-2 horas o menos. Esto es menos de 1/10 del tiempo de residencia de 28 horas o más en un proceso de aislamiento discontinuo convencional, en el que el producto (cosecha) se recoge durante al menos 24 horas (a varios días), después de que el producto se procese durante normalmente al menos 4-10 horas.

La Figura 11 muestra una comparación de los rendimientos de aislamiento total resultantes del factor de coagulación de la sangre recombinante (rFVIII) de fermentación por perfusión continua libre de proteína del plasma para tanto un proceso de aislamiento discontinuo convencional (filtración discontinua más UF discontinua) como usando el dispositivo inventivo A y método respectivo. Como puede apreciarse de la figura, el proceso continuo inventivo logra significativamente mayor rendimiento de producto, que puede conducir a capacidades de fabricación elevadas y costes de fabricación reducidos.

Durante el método de uso inventivo del dispositivo A, la presión transmembrana de la ultrafiltración continua integrada va a aumentar con el tiempo, mientras que el flujo de membrana específico (en litros/hora/m2/bar) está disminuyendo a caudal volumétrico constante. Esto es común a todos los procesos de ultrafiltración y es debido a efectos como la polarización por concentración, formación de capa de gel e incrustación. Sin embargo, a diferencia de la ultrafiltración discontinua, como puede apreciarse del ejemplo mostrado en la Figura 12, los cambios de presión y flujo específico son extremadamente bajos con el dispositivo A, permitiendo la operación continua durante semanas enteras, antes de que las membranas necesiten ser limpiadas o sustituidas. Adicionalmente, la tasa de cambio y el rendimiento global del sistema es bastante insensible al producto producido o la línea celular usada en la fermentación por perfusión continua (Figura 12). Por tanto, el dispositivo inventivo A y el método respectivo también son idealmente adecuados como plataforma genérica para la rápida producción de diversas proteínas, ya que se lleva a cabo de forma robusta y predictiblemente con diversas proteínas diana de diferentes líneas celulares.

Sorprendentemente, los solicitantes descubrieron que los efectos negativos de la formación de capa de gel e incrustación se minimizan de hecho mucho con el dispositivo A, que puede procesar un volumen total mucho mayor por área de ultrafiltro instalada, antes de que sea necesaria la limpieza o sustitución de filtros. La Figura 13 muestra el robusto rendimiento del dispositivo inventivo A en una ejecución a largo plazo. Después de aproximadamente 25 días pareció sorprendentemente que la presión transmembrana se estabilizaba en un estado cuasi-estacionario, sugiriendo incluso mayor rendimiento a largo plazo. En el día 27, la velocidad de flujo del retenido se duplicó intencionadamente para probar el efecto de mayor caudal. Después de 34 días, se realizó un lavado corto con NaOH estéril 0,5 M, sin abrir el sistema, y así mientras que se mantenía la integridad y esterilidad del sistema completo. Después de esto, la TMP se estabilizó de nuevo, o al menos aumentó solo a una velocidad extremadamente baja. Después de 70 días de operación estéril continua, la velocidad de flujo de recirculación se redujo intencionadamente a la mitad para probar el efecto sobre el rendimiento del sistema. Como era de esperar, la TMP empezó a aumentar con una velocidad algo mayor debido a la reducida transferencia de masa y así aumentó la concentración de pared en la superficie de la membrana. Sin embargo, se completaron satisfactoriamente y robustamente 95 días de operación antes de que el sistema se apagara. Se han procesado un total de cerca de 4500 litros por m2 de área de membrana, con trabajo manual mínimo (muestreo diario solo). En comparación, el proceso de ultrafiltración discontinua convencional optimizado para la misma aplicación tiene 45 veces menos capacidad de carga, a aprox. 100 l/m2, y requiere al menos 1-2 operarios a tiempo completo.

También sorprendentemente, la selectividad del dispositivo inventivo A, en particular su sistema de ultrafiltración continua integrada (300), demostró ser significativamente mayor que la selectividad de un proceso discontinuo convencional. Es muy conocido para aquellos familiarizados con el campo que en la ultrafiltración discontinua convencional se forma una membrana secundaria de macromoléculas retenidas durante la etapa inicial del proceso (capa de gel), que reduce el corte de peso molecular aparente. El resultado es que se retienen tanto la molécula diana como proteínas más pequeñas contaminantes, que hace prácticamente imposible la significativa purificación simultánea. Por tanto, con ultrafiltración discontinua convencional es raramente posible separar proteínas que están separadas menos de un factor de 10 en términos de su peso molecular. Sin embargo, como puede apreciarse de la Figura 14, con el proceso de ultrafiltración continua integrada inventivo es posible ajustar condiciones para separar

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eficazmente IL-2SA (aprox. 16 kD) y proteína verde fluorescente GFP (27-30 kD). Este rendimiento de separación superior al esperado permite concentración y purificación simultáneas. Beneficios del dispositivo B y método respectivo

La Figura 15 ilustra el rendimiento del dispositivo inventivo B. Usando un adsorbente convectivo comercial (Mustang Q, Pall Corporation, módulo de 15 capas) se han realizado cerca de 100 ciclos de adsorción/desorción consecutivos, concentrando y purificando así una variante de FVIII recombinante de cultivo de perfusión continua. El rendimiento promedio logrado fue de aproximadamente el 95 % (resulta dispersión de la variación del ensayo), mientras que la presión se mantuvo relativamente constante durante el número de ciclos entero realizado. Por tanto, puede especificarse que pueden realizarse al menos 100 ciclos consecutivos antes de intercambiar la configuración de adsorbente.

Como se ha mostrado en la descripción en detalle del método de uso del dispositivo inventivo B, el tiempo de residencia medio total del producto en una presente realización es inferior a 3 horas, antes de eluirse en forma concentrada, purificada y estabilizada en un tampón apropiado. Esto es significativamente menos que el tiempo de residencia de más de 24 horas en un proceso de aislamiento discontinuo convencional realizado una vez al día y, por tanto, produce rendimiento significativamente mayor de los productos de proteína inherentemente lábiles. En una presente realización descrita antes, se realizan aproximadamente 13 ciclos por día, que significa en el contexto de la Figura 15 que el ensamblaje de adsorbente semi-continuo necesitaría intercambiarse solo cada 7-8 días, que se hace sin comprometer la esterilidad y continuidad de la operación.

La Figura 16 muestra un ejemplo del perfil de UV y de conductividad durante un único ciclo de adsorción/desorción y de regeneración típico con el dispositivo B. Puede observarse que pueden cargarse más de 450 volúmenes de adsorbente (CV), mientras que el producto eluye en un pico muy afilado. Los contaminantes se eliminan significativamente en el flujo a través durante la fase de carga, además de durante el lavado y el arrastre (fase de regeneración).

La Figura 17 ilustra el rendimiento de purificación del proceso inventivo que comprende adsorción/desorción convectiva semi-continua. Se muestra un gel de SDS-PAGE de ejemplo de un aislado de variante de FVIII. Como puede apreciarse, las fracciones de eluato, que incluyen 95 % de la variante de FVIII cargada (como se determina por ensayo de actividad separado), contienen significativamente menos proteína que la carga y así se purifican. No son visibles bandas de degradación adicionales en el eluato (aislado), que indica excelente calidad del producto.

En resumen, el dispositivo inventivo B es capaz de lograr rendimiento de purificación similar como procesos discontinuos comparables, mientras que se minimizan al mismo tiempo las pérdidas de rendimiento para productos de proteína inherentemente inestables, además de problemas de la calidad del producto, debido a la minimización del tiempo de residencia del producto. Al mismo tiempo, los costes de laboratorio se reducen espectacularmente debido al grado de automatización inherentemente alto del proceso inventivo, que requiere mínima intervención del operario.

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