NO341439B1 - Innretninger og fremgangsmåter for integrert, kontinuerlig fremstilling av biologiske molekyler - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse gjelder en forbedret fremgangsmåte og et forbedret system for rensing av et molekyl av interesse fra en heterogen blanding av molekyler. Nærmere bestemt er foreliggende oppfinnelse rettet mot fremgangsmåter for fremstilling av et protein av interesse i en vevsdyrkningsvæske levert fra en kontinuerlig perfusjonsfermenteringsprosess.

Foreliggende oppfinnelse er definert i kravene. Innhold som ikke omfattes av kravenes omfang er ikke en del av foreliggende oppfinnelse.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Det er velkjent for folk som kjenner faget at det i løpet av de senere år har blitt etablert flere kontinuerlige celledyrkingsprosesser, også betegnet kontinuerlige perfusjons-prosesser, med stor kommersiell suksess. Isoleringsprosessen som følger etter den kontinuerlige perfusjonsfermenteringen er imidlertid generelt en satsvis prosess og fysisk og logistisk separert fra den kontinuerlige oppstrømsprosessen. I disse prosessene er hovedformålet med isoleringstrinnet å innfange produktet fra store volumer av relativt fortynnet dyrkningssupernatant. Konsentrasjonen av produktet må vektlegges når det gjelder prosesslogistikk og plassbehov, mens samtidig fjerning av kontaminanter (rensing) er viktig for å minimalisere det nødvendige antall videre, nedstrøms rensetrinn.

US 5490937 A vedrører rensing og separering av deler av biologisk interesse, fra blandinger som inneholder slike under anvendelse av en forbedret fremgangsmåte for tangentialstrømningsfiltrering og apparater for dette.

US 2004139864 Al beskriver apparat og fremgangsmåte for separasjon av melk og melkeprodukter ved krysstrømningsfiltrering.

US 2004167320 Al angir fremgangsmåter og apparater for å separere molekyler av interesse fra en blanding som inneholder dem som omfatter å utsette blandingen for en forbedret fremgangsmåte for tangentialstrømningsfiltrering.

Fig. 1 viser skjematisk en typisk isoleringsprosess ifølge teknikkens stand fra kontinuerlig perfusjonsfermentering, som velkjent blant fagfolk. Det kontinuerlige perfusjonsfermenteringssystem omfatter en celleretensjonsinnretning 1, som holder de fleste av cellene som danner produktet tilbake i fermenteringssystemet. En kontinuerlig høstestrøm fra det kontinuerlige perfusjonssystem, som fortsatt inneholder noen celler, cellerester og andre partikler, pumpes ved anvendelse av en festepumpe 2 over i store oppsamlingskar 3, for eksempel tanker av rustfritt stål. Disse lagringskarene må vanligvis avkjøles for å holde produkttapet grunnet degradering innen et gjennomførbart område.

Når først et angitt volum har blitt oppsamlet, typisk etter 1-4 dager eller mer, kobles oppsamlingskarene fra det sterile fermenteringskar, og det oppsamlede materialet betegnes som en høstet sats. Neste trinn er å fjerne celler, cellerester og partikler (trinn 2). I industriell skala utføres dette typisk ved anvendelse av sentrifugering 4, fulgt av dead-end membranfiltrering 5, eller ved dead-end dybdefiltrering 6 fulgt av dead-end membranfiltrering 7. En annen teknikk som noen ganger anvendes er tangentiell strøm (eller "krysstrøm"-mikrofiltrering). I alle tilfeller er produktet fra partikkelfjerningsprosessen en sats med klarnet vevsvirkningsvæske eller cTCF 8. Ytterligere detaljer vedrørende partikkelseparasjon for bioteknologiske produkter kan finnes i standard lærebøker, for eksempel Biotechnology, bind 3, Bioprocessing, Wiley-VCH, 2. utgave

(1996), ISBN: 3527283137.

I neste trinn (trinn 3) videre behandles satsen med klarnet vevsdyrkningsvæske for å oppkonsentrere og, om mulig, rense produktet. Dette utføres typisk ved krysstrøm-ultrafiltrering eller ved packed bed-kromatografi.

Når det gjelder krysstrøm-ultrafiltrering, pumpes cTCF over i resirkuleringstanken 9 i systemet. En pumpe anvendes 10 for å presse materialet gjennom et krysstrøm-ultrafilter. Produktet tilbakeholdes av membranen og resirkuleres som tilbakeholdt materiale over i resirkuleringstanken, mens vann og mindre kontaminanter presses gjennom membranen over i permeatet 11, grunnet trans-membrantrykket som oppstår ved trykkfallet i ultrafiltreringsmodulen. Ved hver passasje gjennom filteret blir følgelig cTCF mer konsentrert, og det totale cTCF-volum reduseres inntil en ønsket oppkonsentreringsfaktor oppnås. Når først den ønskede oppkonsentreringsfaktor er nådd, stoppes prosessen, og det gjenværende konsentratvolumet (isolatet) tømmes fra systemet og oppsamles. Flere detaljer vedrørende krysstrøm-ultrafiltrering for oppkonsentrering av bioteknologiske produkter kan finnes i standard lærebøker, for eksempel Biotechnology, bind 3, Bioprocessing, Wiley-VCH, 2. utgave (1996), ISBN: 3527283137.

Når det gjelder packed bed-kromatografi, pumpes cTCF over en kromatografikolonne 12 som inneholder et pakket resin. Produktet bindes til resinet og elueres så, vanligvis i konsentrert og renset form (isolat, 13) ved anvendelse av en egnet elueringsbuffer 14, hvoretter kolonnen vaskes og regenereres ved anvendelse av egnede buffere og vaskeløsninger 14.

Andre kromatografivarianter som har blitt foreslått for oppkonsentrering/rensing av cTCF er expanded bed-kromatografi og membrankromatografi. Expanded bed-kromatografi kan prosesserer partikkelholdige løsninger. Filtrering av isolatet etter kromatografien er imidlertid fortsatt nødvendig selv om filtreringsarealene reduseres. Membrankromatografi benytter stabler av modifiserte mikrofiltreringsmembraner i stedet for pakket resin. Fordelen er at masseoverføringen hovedsakelig skjer ved konveksjon snarere enn diffusjon, noe som tillater hurtigere separasjon. Ellers tilsvarer prosessen typisk standard packed bed-kromatografi. Flere detaljer vedrørende kromatografi for oppkonsentrering og rensing av bioteknologiske produkter kan finnes i standard lærebøker, for eksempel Protein Purification, Principles, High-Resolution Methods, and Applications, Wiley-VCH, 2. utgave (1998), ESBN 0-471-18626-0.

Ofte nedfryses porsjonen med isolat og lagres for senere anvendelse i videre nedstrøms rensetrinn.

Som beskrevet ovenfor, er isoleringsprosessen følgelig generelt en satsvis prosess og er fysisk og logistisk separert fra den kontinuerlige oppstrøms prosessen. Selv om fermenteringen må utføres sterilt, utføres videre isoleringen (dvs. partikkelfjerningen og oppkonsentreringen/rensingen) i det vesentlige rent, men ikke sterilt.

Prosessene ifølge teknikkens stand som beskrevet ovenfor byr på en rekke problemer: Pl. Tapt utbytte og mulig kvalitetsreduksjon grunnet høy residenstid for produktet. Høstet materiale fra den kontinuerlige perfusjonsfermenteringen må oppsamles og lagres over vesentlige tidsrom, som skissert ovenfor, før en isolert sats kan prosesseres. Oppsamlet høstet materiale utgjør, selv om det er avkjølt, fortsatt et skadelig miljø for komplekse og proteinprodukter med en iboende ustabilitet. Følgelig skjer det et signifikant tap av produkt, noe som reduserer produksjonskapasiteten og forhøyer produktets pris. Videre kan produktkvaliteten påvirkes på uheldig måte.

P2. Store kjøleromsfasiliteter eller avkjølte kar er nødvendig for midlertidig lagring av store høstede volumer, noe som fører til høye kapitalkostnader og motvirker de angitte fordeler vedrørende kompakthet og mobilitet forventet med perfusjonsfermentorer.

P3. Konvensjonelle oppkonsentrerings/renseteknologier (for eksempel ultrafiltrering, packed bed-kromatografi) har relativt lav volumetrisk kapasitet, signifikant omløpstid og er relativt arbeidsintensive. Som en følge av dette, utføres typisk ikke mer enn 1 satsvis prosess pr. dag.

P4. Videre byr dagens isoleringsprosesser og fremgangsmåter på logistiske problemer når det gjelder håndtering av de forskjellige prosessvolumene i fermenteringsfabrikker som omfatter mer enn en fermentor. I anlegg for kontinuerlig perfusjon i stor skala er et varierende antall fermentorer i drift.

P5. Videre utføres isoleringsprosesser ifølge teknikkens stand rent, men kan ikke utføres sterilt. Dette fører ofte til et signifikant antall avviste satser grunnet problemer med mikrobiell kontaminering.

P6. Benyttelse av éngangsutstyr, for eksempel éngangsfiltre, filteroppstigninger, poser osv. er svært kostbart, om enn svært ønskelig for fremstilling av parenterale midler for anvendelse på mennesker (for eksempel for å unngå vask, validering av vask og andre faktorer), og faktisk ofte ikke økonomisk.

Det er følgelig et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en integrert, kontinuerlig proteinseparasjonsprosess som kan være i drift over lengere tidsrom og under sterile betingelser.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Det beskrives et apparat og ny prosess for rensing av molekyler fra en heterogen væskeblanding. Nærmere bestemt beskrives en prosess for å rense et molekyl av interesse fra en heterogen, klarnet væskeblanding fra hvilken partikkelformede kontaminanter har blitt fjernet. Prosessen omfatter trinnet å filtrere en heterogen, klarnet væskeblanding ved kontinuerlig ultrafiltrering ved en spesifikk

gjennomstrømningshastighet som ligger under transisjonspunktet for molekylet av interesse i det trykkavhengige området av kurven for gjennomstrømning som funksjon

av TMP, og i den spesifikke gjennomstrømningshastighet holdes i det vesentlige konstant gjennom hele den kontinuerlige ultrafiltreringen.

I spesielle utførelser omfatter prosessen å filtrere den klarnede væskeblanding gjennom en ultrafiltreringsmembran med et areal i kvadratmeter som er tilnærmet lik mellom 0,1 og 2 ganger den volumetriske gjennomstrømningshastighet for den klarnede væskeblanding i liter/time. I en annen utførelse omfatter prosessen ifølge oppfinnelsen å filtrere den klarnede væskeblanding gjennom en ultrafiltreringsmembran med et areal i kvadratmeter som er tilnærmet lik mellom 0,3 og 1 ganger den volumetriske gjennomstrømningshastighet for den klarnede væskeblanding i liter/time.

Prosessen tillater på en fordelaktig måte filtrering av den klarnede blanding ved en spesifikk gjennomstrømningshastighet som gir en veggkonsentrasjon som er lavere enn tilnærmet 20%, lavere enn 15% eller lavere enn 10% høyere enn konsentrasjonen av det tilbakeholdte materialet, uten vesentlig polarisering av konsentrasjonen.

I en mer spesifikk utførelse beskrives en integrert, kontinuerlig og steril prosess for kontinuerlig perfusjonsfermentering, fjerning av partikler og rensing/oppkonsentrering. Det beskrives at prosessen omfatter å filtrere vevskulturblandingen ved en separasjonsprosess som selektivt separerer proteinet av interesse fra blandingen ved et operasjonelt innstillingspunkt under transisjonspunktet for proteinet i det trykkavhengige området av kurven for gjennomstrømningshastighet som funksjon av TMP for erholdelse av et sterilt, partikkelfritt, oppkonsentrert og delvis produktisolat, hvor den spesifikke gjennomstrømningshastighet under separasjonsprosessen holdes i det vesentlige konstant på et nivå som er lavere enn transisjonspunktet for proteinet.

I et aspekt vedrører oppfinnelsen en kontinuerlig prosess for rensing av et protein av interesse fra en heterogen vevskulturvæskeblanding som omfatter: (a) fremstilling av en heterogen vevskulturvæskeblanding som inneholder et

protein av interesse ved en kontinuerlig perfusjonsfermenteringsprosess,

(b) overføring av vevskulturvæskeblandingen til en kontinuerlig prosess for partikkelfjerning som er integrert med den kontinuerlige perfusjonsfermenteringsprosess, (c) fjerning av partikkelformede kontaminanter fra vevskulturvæsken i prosessen for kontinuerlig partikkelfjerning for erholdelse av en klarnet vevskulturvæske som inneholder proteinet av interesse, (d) overføring av den klarnede vevskulturvæske til en kontinuerlig renseprosess som er integrert med den kontinuerlige prosess for partikkelfjerning, hvori den kontinuerlige renseprosess er ultrafiltrering og den klarnede vevskulturvæske filtreres ved en spesifikk gjennomstrømningshastighet som gir en veggkonsentrasjon som er lavere enn 20% høyere enn en konsentrasjon av tilbakeholdt materiale, og (e) rensing av proteinet av interesse fra den klarnede vevskulturvæske i den kontinuerlige renseprosessen,

hvori den spesifikke gjennomstrømningshastighet for blandingen gjennom den kontinuerlige perfusjonsfermenteringsprosess, den kontinuerlige prosess for partikkelfjerning og den kontinuerlige renseprosess holdes i det vesentlige konstant.

Det beskrives at prosessen kan være en semi-kontinuerlig prosess for rensing av et protein av interesse fra en heterogen vevskulturvæskeblanding som omfatter: (a) fremstilling av en heterogen vevskulturvæskeblanding som inneholder et protein av interesse ved en kontinuerlig perfusjonsfermenteringsprosess, (b) overføring av vevskulturvæskeblandingen til en kontinuerlig prosess for partikkelfjerning som er integrert med det kontinuerlige perfusjonsfermenteringssystem, (c) fjerning av partikkelformede kontaminanter fra vevskulturvæsken i den kontinuerlige prosess for partikkelfjerning for erholdelse av en klarnet vevskulturvæske som inneholder proteinet av interesse, (d) overføring av den klarnede vevskulturvæske til et svingekar som er integrert

med den kontinuerlige prosess for partikkelfjerning,

(e) regelmessig overføring av den klarnede vevskulturvæske til en renseprosess

som er integrert med svingekaret, og

(f) rensing av proteinet av interesse fra den klarnede vevskulturvæske i rensesystemet for erholdelse av et sterilt, partikkelfritt, oppkonsentrert og delvis renset produktisolat som inneholder proteinet av interesse,

hvori den spesifikke gjennomstrømningshastighet for blandingen gjennom den kontinuerlige perfusjonsfermenteringsprosess og den kontinuerlige prosess for partikkelfjerning holdes i det vesentlige konstant.

Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot et apparat for separasjon av et protein av interesse fra en heterogen vevskulturvæskeblanding. I et aspekt av oppfinnelsen omfatter apparatet: (a) et kontinuerlig perfusjonsfermenteringssystem, (b) et system for kontinuerlig partikkelfjerning som er integrert med perfusjonsfermenteringssystemet, og (c) et kontinuerlig rensesystem som er ultrafiltrering integrert med partikkelfjerningssystemet, hvori apparatet er tilpasset for opprettholdelse av sterile betingelser.

Det beskrives at apparatet kan omfatte: (a) et kontinuerlig

perfusjonsfermenteringssystem, (b) et system for kontinuerlig partikkelfjerning som er integrert med perfusjonsfermenteringssystemet, og (c) et periodisk rensesystem som er ultrafiltrering integrert med partikkelfjerningssystemet, hvori apparatet er tilpasset opprettholdelse av sterile betingelser.

Rensesystemet kan for eksempel være et ultrafiltreringssystem eller et konvektivt adsorpsjons/desorpsjonssystem eller hvilket som helst annet system som kan rense eller delvis rense et protein av interesse fra en heterogen blanding i et integrert, kontinuerlig eller semi-kontinuerlig, sterilt system som beskrevet heri.

Prosessen og apparatet ifølge oppfinnelsen er tilpasset kontinuerlig prosessering av en heterogen væskeblanding, for eksempel en cellekulturvæske, ved en i det vesentlige konstant gjennomstrømningshastighet. Det beskrives at prosessen og apparatet er tilpasset kontinuerlig prosessering av en heterogen celle- eller vevskulturvæskeblanding ved en i det vesentlige konstant gjennomstrømningshastighet som ligger under transisjonspunktet for proteinet i det trykkavhengige området i kurven for gjennomstrømningshastighet som funksjon av TMP over et sammenhengende tidsrom og gjennom renseprosessen.

Disse og andre aspekter av oppfinnelsen beskrives i detalj nedenfor i den påfølgende, detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

De vedlagte figurer, som er inkorporert i og utgjør en del av beskrivelsen, illustrerer utførelser av oppfinnelsen og bidrar sammen med den detaljerte beskrivelse av utførelsen til å forklare prinsippene bak oppfinnelsen og dens fordeler.

Fig. 1: Skjematisk fremstilling av en konvensjonell, kontinuerlig perfusjonsprosess fulgt av 3 fysisk og logistisk adskilte isoleringsprosesstrinn (oppsamling av høstet sats, partikkelfjerning i satsen og oppkonsentrering/rensing av satsen). Fig. 2: Skjematisk fremstilling av to utførelser av innretning A ifølge oppfinnelsen for kontinuerlig, integrert og steril fremstilling. Utførelse Al er vist skjematisk på venstre side og utførelse A2 vist skjematisk på høyre side. Fig. 3: Skjematisk fremstilling av to utførelser av innretning B ifølge oppfinnelsen for kontinuerlig, integrert og steril fremstilling. Utførelse Bl er vist skjematisk på venstre side og utførelse B2 vist skjematisk på høyre side. Fig. 4: Skjematisk fremstilling av en utførelse av et integrert, kontinuerlig system for partikkelfjerning ifølge oppfinnelsen (100), et element i både innretning A ifølge oppfinnelsen og innretning B ifølge oppfinnelsen. Fig. 5: Skjematiske fremstillinger av ytterligere utførelser av innretning A ifølge oppfinnelsen som kombinerer flere elementer for enten å øke den totale kapasitet av anlegget (A3) eller yteevnen når det gjelder oppkonsentrering og separasjon (A4). Fig. 6: Skjematiske fremstillinger av ytterligere utførelser av innretning B ifølge oppfinnelsen. Fig. 7: Ytterligere utførelse av innretninger ifølge oppfinnelsen som kombinerer elementene i innretning A og innretning B i serie for å øke den totale yteevne når det gjelder oppkonsentrering og separasjon. Fig. 8: Eksempel på en sammenligning av den totale belastningskapasitet pr. 10" filterkapsler for en konvensjonell satsvis prosess og en utførelse av innretningen ifølge oppfinnelsen og en fremgangsmåte for kontinuerlig fjerning av partikler (integrert kontinuerlig filtreringsprosess) ved anvendelse av identiske, kommersielle filterkapsler. Et eksempel på en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant blodkoagulasjonsfaktor Vm vises. Fig. 9: Eksempel på trykk-gjennomstrømningshastighetskurve (spesifikk gjennom-strømningshastighet for permeat i LMH = liter/time/m<2>som funksjon av transmembrantrykket) og bestemmelse av operasjonspunkt. Sirkelen viser det typiske operasjonspunkt som vil justeres via TMP for konvensjonelle satsvise prosesser. Rektangelet viser det foretrukne operasjonsområdet som vil justeres ved hjelp av permeatpumpen ifølge fremgangsmåten for anvendelse av innretning A ifølge oppfinnelsen. Fig. 10: Eksempel på residenstidfordelingen og den gjennomsnittlige residenstid for et integrert, kontinuerlig UF-system (300) ifølge fremgangsmåten for anvendelse av innretning A ifølge oppfinnelsen. Målt for et kontinuerlig éngangssystem med 290 cm<2>modul (62,5 cm lengde), 120 LMH krysstrøm, 0,2 LMH gjennomstrømningshastighet for tilbakeholdt materiale, 2 LMH permeatgjennomstrømningshastighet. Fig. 11: Eksempel på isolering av rFVin fra plasma-proteinfritt, kontinuerlig perfusjonsfermentering ved anvendelse av en utførelse av innretning A ifølge oppfinnelsen. En sammenligning av det gjennomsnittlige isoleringsutbyttet fra den kontinuerlige fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og gjennomsnittlig utbytte ved satsvis isolering, innbefattet et standardavviks spredning. 3 på hverandre følgende satser ble anvendt for bestemmelse av satsutbytte, mens 3 på hverandre følgende punkter (dager) ble anvendt i den kontinuerlige prosessen. Fig. 12: Eksempler på yteevnen til innretning A ifølge oppfinnelsen. Transmembrantrykk og spesifikk gjennomstrømningshastighet for et integrert, kontinuerlig ultrafiltreringssystem (300) som en funksjon av tiden for den kontinuerlige prosess for 3 forskjellige eksempler vises. Trekanter = 100 kD membran, rekombinant blodkoagulasjonsfaktor VIII (rFVTII); firkanter =10 kD membran, rekombinant interleukin-2, sirkler = 50 kD membran, genetisk modifisert glykoprotein (Mr > 100 kD). Alle de viste eksempler er fra plasmaproteinfri kontinuerlig perfusjonsfermentering. Fig. 13: Eksempler på yteevnen over lang tid av innretning A ifølge oppfinnelsen, direkte koblet til kontinuerlig perfusjonsfermentering av cellelinje som kouttrykker 2 proteinprodukter (grønt fluorescerende protein, GFP og IL-2SA). Transmembrantrykket og den spesifikke gjennomstrømningshastighet for det kontinuerlige ultrafiltreringssystem ifølge oppfinnelsen (300) som tiden den kontinuerlige prosess viser. En 10 kD membran ble anvendt. Fig. 14: Eksempel på langtids yteevne av innretning A ifølge oppfinnelsen, direkte koblet til kontinuerlig perfusjonsfermentering av en cellelinje som uttrykker 2 proteinprodukter (grønt fluorescerende protein, GFP og IL-2SA). En 10 kD membran ble anvendt. Konsentreringsfaktoren for de to proteinproduktene, bestemt ved spesifikke analyser, og den volumetriske oppkonsentreringsfaktor vises som funksjon av tiden i den kontinuerlige prosess. Fig. 15: Eksempel på yteevne for innretning B ifølge oppfinnelsen. Utbytte og trykkfall over nær 100 på hverandre følgende adsorpsjons/desorpsjonscykluser med konvektivt adsorpsjonsmiddel (målprotein: genetisk modifisert blodkoagulasjonsfaktor FVIII-variant, konvektivt adsorpsjonsmiddel: kommersielt adsorpsjonsmiddel, Mustang Q, Pall Corporation). Fig. 16: Eksempel på yteevne for innretning B ifølge oppfinnelsen. UV- og konduktivitetsprofil under en typisk adsorpsjons/desorpsjonscyklus med konvektivt adsorpsjonsmiddel (målprotein: genetisk modifisert blodkoagulasjonsfaktor FVffl-variant, konvektivt adsorpsjonsmiddel: kommersielt adsorpsjonsmiddel, Mustang Q, Pall Corporation). Fig. 17: Eksempel på yteevne for innretning B ifølge oppfinnelsen. SDS-Page-gel (sølvfarget) av Load = klarnet høstet materiale som kontinuerlig kommer ut av partikkelfjerningssystemet (100) og som semi-kontinuerlig overføres til det konvektive adsorpsjonsmiddelsystemet (400) og et typisk adsorpsjons/desorpsjonseluat vises. Målprotein: genetisk modifisert blodkoagulasjonsfaktor FVffl-variant, konvektivt adsorpsjonsmiddel: kommersielt adsorpsjonsmiddel, Mustang Q, Pall Corporation). Eluatet ble fortynnet tilbake til konsentrasjonen i load-materialet før fraksjonering i gelen.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Definisjoner

Med mindre annet spesifikt defineres heri, er terminologien som anvendes i den foreliggende patentsøknad standard terminologi innen faget. De påfølgende definisjoner av visse begreper gis heri for å sikre en klarhet og tydelighet når det gjelder kravenes betydning.

Enheter, forstavelser og symboler kan være angitt i sin SI-aksepterte form. Numeriske områder som angis heri omfatter tallene som definerer området og omfatter og understøtter hvert heltall innenfor det definerte området. Med mindre annet er angitt, skal begrepene "en" eller "et" oppfattes til å bety "minst en av".

Begrepet "klarning" og "klarnet" betyr fjerning av partikkelformet materiale fra en løsning slik at den gjenværende løsning passerer gjennom en 0,2 um membran.

Begrepet "kontinuerlig perfusjonsfermentering" viser til et fermenteringssystem eller en fermenteringsprosess i likevekt som drives uten avbrytelse, og hvori celler eller mikroorganismer holdes i kultur i eksponentiell vekstfase ved kontinuerlig tilsetning av friskt medium, ballansert ved fjerning av cellesuspensjon fra bioreaktoren.

Begrepene "dyrking", "dyrke", "gro", "opprettholde", "understøtte" og "ekspandere" er synonymer med betydningen at celler holdes levedyktige og i stand til å danne avkom.

Begrepet "konsentrering" i verbformen, betyr fjerning av vann fra en løsning, slik at mengden av et molekyl av interesse pr. volumenhet av den gjenværende løsning øker.

Begrepet "konsentrasjonspolarisering" betyr akkumulering av tilbakeholdte molekyler (gellag) på overflaten av membranen, grunnet en kombinasjon av faktorer: transmembrantrykk, krysstrømhastighet, prøvens viskositet og konsentrasjonen av oppløst materiale.

Begrepet "kontinuerlig" betyr uavbrutt i tid, rekkefølge og/eller drift over lenger tidsrom. Anvendt ved henvisning ved fermenterings-, klarnings- og filtreringsprosessene ifølge foreliggende oppfinnelse betyr "kontinuerlig" at prosessene er fysiske og logistisk integrert, slik at det tillates drift uten avbrudd over et lenger tidsrom som er tilstrekkelig til å gi et sterilt, partikkelfritt, oppkonsentrert og delvis renset produktisolat som inneholder proteinet av interesse. Begrepet kontinuerlig anvendt ved henvisning til prosessene ifølge oppfinnelsen skal også forstås å bety at en prosess ikke utføres på satsvis måte eller på en virkelig kontinuerlig måte. Prosessene ifølge foreliggende oppfinnelse er i stand til kontinuerlig drift, for eksempel over lenger tidsrom i området fra 1 dag til flere måneder, uten at driften eller rekkefølgen av prosessene avbrytes. Som anvendt i foreliggende oppfinnelse, drives prosessene over et kontinuerlig tidsrom som er større enn 2, 3, 4, 5, 6 eller 7 dager, 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 8 uker eller 3, 4, 5, 6 eller flere måneder.

Begrepene "semi-kontinuerlig" og "periodisk" betyr at en eller flere prosesser eller et eller flere elementer i et integrert system drives på en diskontinuerlig eller satsvis måte, mens andre prosesser eller elementer i det integrerte system drives på en kontinuerlig måte. I noen utførelser av oppfinnelsen er for eksempel renseprosessen en konvektiv adsorpsjons/desorpsjonsprosess som typisk krever adsorpsjon av den heterogene blandingen til et adsorpsjonsstøttemiddel, noe som til syvende og sist fører til metting av støttemidlet, og som krever avbryting av adsorpsjonsprosessen og desorpsjon eller frigjøring av den bundne fraksjon. En slik prosess er i seg selv periodisk, om enn i stand til å kunne integreres med oppstrømsprosesser som er kontinuerlige.

Begrepet "konvektiv adsorpsjon/desorpsjon" betyr en kromatografisk prosess i hvilken masseoverføringen hovedsakelig skjer ved konveksjon. Konvektiv adsorpsjon/desorpsjon er en prosess hvori en fraksjon av en blanding som inneholder et molekyl av interesse separeres fra en annen fraksjon i blandingen ved hjelp av adsorpsjon av en fraksjon til et støttemiddel, fulgt av desorpsjon av denne fraksjonen fra støttemidlet.

Begrepet "krysstrøm" eller "væskekrysstrøm" betyr strømning av væsken langs toppen av membranoverflaten.

Begrepet "integrert", anvendt ved henvisning til flere systemer og/eller prosesser, betyr at systemene og/eller prosessene er fysisk og logistisk sammenkoblet, slik at de utgjør et enhetlig system som kan drives kontinuerlig. I forbindelse med systemet ifølge foreliggende oppfinnelse, som er rettet mot et integrert, kontinuerlig eller semi-kontinuerlig system for fremstilling av et partikkelfritt, oppkonsentrert og delvis renset protein av interesse, vil et integrert system sammenkoble forskjellige bestanddeler direkte og på en måte som er tilstrekkelig til at sterile betingelser opprettholdes mellom de forskjellige bestanddeler av systemet.

Begrepene "medier" (flertall) og "medium" (entall) er synonymer og benyttes om hverandre heri, og anvendelse av en form av begrepet betyr ikke at den andre form er utelukket.

Begrepet "blanding" betyr en heterolog kombinasjon av molekyler og forbindelser som inneholder et molekyl av interesse, for eksempel et protein, og forskjellige kontaminanter. En foretrukket blanding ifølge foreliggende oppfinnelse er en vevskulturvæske som består av en heterogen blanding av proteiner, innbefattet et eksogent protein av interesse, i utgangspunktet er holdt fra en kontinuerlig perfusjonsfermenteringsprosess.

Begrepet "gelsjikt" betyr det mikroskopisk tynne sjikt av molekyler som kan dannes på toppen av en membran. Gelsjiktet kan påvirke retensjonen av molekylet ved at membranoverflaten tettes slik at gjennomstrømningshastigheten for filtratet reduseres, eller, i drift med konstant gjennomstrømningshastighet, forhøye TMP.

Begrepet "molekyl av interesse" betyr partikler eller andre utgaver av molekylet som skal separeres fra en løsning eller suspensjon i et fluidum (for eksempel en væske). Partiklene eller molekylene av interesse separeres fra væsken, og i de fleste tilfeller fra andre partikler eller molekyler i væsken. Størrelsen av molekylet av interesse som skal separeres vil bestemme porestørrelsen i membranen som skal benytte. Fortrinnsvis er molekylene av interesse av biologisk eller biokjemisk opphav eller fremstilt ved transgene prosesser eller in vitro-prosesser, og omfatter proteiner, peptider, polypeptider, antistoffer eller antistoffragmenter. Eksempler på foretrukne opphav for materialet omfatter styrking av pattedyrceller eller mikroorganismer, for eksempel bakterier, sopp og gjær. Det bør også bemerkes at molekylene som skal frafiltreres omfatter ikke-ønskede polypeptider, proteiner, cellulære bestanddeler, DNA, kolloider, mykoplaster, endotoksiner, virus, karbohydrater og andre molekyler av biologisk interesse, enten glykosylerte eller ikke.

Begrepet "permeat" anvendes synonymt med filtrat.

Begrepet "produktisolat" betyr et partikkelfritt, oppkonsentrert og delvis renset produkt som inneholder et protein av interesse. Et produktisolat er et produkt som har oppnådd en rensegrad og oppkonsentreringsgrad som er sammenlignbar med hva som oppnås med en ultrafiltreringsprosess eller konvektiv adsorpsjons/desorpsjonsprosess. Et produktisolat er ikke nødvendigvis homogent, men vil være vesentlig renset relativt til det opprinnelige masseprodukt dannet ved fermenteringsprosessen.

Begrepet "spesifikk gjennomstrømningshastighet" benyttes om hverandre med begrepet "gjennomstrømningshastighet for filtratet" når det gjelder filtratet. Den spesifikke gjennomstrømningshastighet for tilbakeholdt materiale er gjennomstrømningshastig-heten for det tilbakeholdte materialet, normalisert relativt til det benyttede membranareal.

Som anvendt ved henvisning til gjennomstrømningshastig, betyr begrepet "i det vesentlige konstant" at gjennomstrømningshastigheten holdes på et generelt konstant nivå over et vesentlig tidsrom under filtreringsforløpet.

Begrepet "vevskulturvæske" betyr en heterogen blanding av bestanddeler erholdt fra et vevsdyrkningsmedium. I foretrukne aspekter av oppfinnelsen er vevskulturvæsken erholdt fra en kontinuerlig perfusjonsfermenteringsprosess. En "klarnet" vevskulturvæske er en vevskulturvæske som på forhånd er filtrert for fjerning av cellerester og andre store makromolekyler.

Begrepet "transmembrantrykk" og akronymet "TMP" betyr det gjennomsnittlige påførte trykk fra tilføringssiden til filtratsiden av membranen. TMP beregnes ved TMP [bar] =

[(PF + PR)/2] - Pf hvori PF er tilføringstrykket, PR er trykket i det tilbakeholdte materialet, og Pf er filtrattrykket.

Begrepet "gjenvinning" betyr den mengde av et molekyl av interesse som kan erholdes etter prosessering. Vanligvis uttrykt som en prosentandel av utgangsmaterialet eller utbyttet.

Begrepet "tilbakeholdt materiale" betyr den del av prøven som ikke passerer membranen, også betegnet konsentratet.

Begrepet "ultrafiltrering" betyr en form for filtrering som benytter mikroporøse eller semi-permeable membraner for preferensiell separasjon av væsker eller ioner basert på forskjeller i størrelse eller molekylvekt. Ultrafiltrering anvendes typisk for frafiltrering av molekyler med en molekylvekt som er større enn tilnærmet 10.000 dalton.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot integrert, kontinuerlig og steril prosess som omfatter kontinuerlig perfusjonsfermentering, fjerning av partikler og rensing/oppkonsentrering. Prosessen kan omfatte filtrering av vevskulturblandingen ved en separasjonsprosess som selektivt separerer proteinet av interesse fra blandingen ved et operasjonelt innstillingspunkt som ligger under transisjonspunktet for proteinet i den trykkavhengige del av kurven for gjennomstrømningshastighet som funksjon av TMP for dannelse av et sterilt, partikkelfritt, oppkonsentrert og delvis renset produktisolat, hvori den spesifikke gjennomstrømningshastighet gjennom separasjonsprosessen holdes i det vesentlige konstant på et nivå som er lavere enn transisjonspunktet for proteinet.

I et aspekt av oppfinnelsen er prosessen en kontinuerlig prosess som omfatter: (a) kontinuerlig fremstilling ved kontinuerlig perfusjonsfermentering av en heterogen vevskulturvæskeblanding som inneholder et protein av interesse; (b) kontinuerlig overføring av vevskulturvæskeblandingen til en prosess for partikkelfjerning som er integrert med det kontinuerlige perfusjonsfermenteringssystem, (c) kontinuerlig fjerning av partikkelformede kontaminanter fra vevskulturvæsken i prosessen for partikkelfjerning for kontinuerlig fremstilling av en klarnet vevskulturvæske som inneholder proteinet av interesse, (d) kontinuerlig overføring av den klarnede vevskulturvæsken til en renseprosess som er integrert med systemet for partikkelfjerning hvori den kontinuerlige renseprosess er ultrafiltrering og den klarnede vevskulturblanding filtreres ved en spesifikk gjennomstrømningshastighet som gir en veggkonsentrasjon som er lavere enn 20% høyere enn en konsentrasjon av tilbakeholdt materiale, og (e) kontinuerlig separasjon av proteinet av interesse fra den klarnede vevskulturvæsken i rensesystemet for kontinuerlig fremstilling av et sterilt, partikkelfritt, oppkonsentrert og delvis renset produktisolat som inneholder proteinet av interesse.

Det beskrives at prosessen kan være en semi-kontinuerlig prosess som omfatter: (a) kontinuerlig fremstilling av en heterogen vevskulturvæskeblanding som inneholder et protein av interesse ved kontinuerlig perfusjonsfermentering; (b) kontinuerlig overføring av vevskulturvæskeblandingen til en prosess for partikkelfjerning som er integrert med det kontinuerlige perfusjonsfermenteringssystem, (c) kontinuerlig fjerning av partikkelformede kontaminanter fra vevskulturvæsken i prosessen for partikkelfjerning for kontinuerlig fremstilling av en klarnet vevskulturvæske som inneholder proteinet av interesse, (d) kontinuerlig overføring av den klarnede vevskulturvæsken til et svingekar som er integrert med partikkelfjerningsprosessen, (e) periodisk overføring av den klarnede vevskulturvæsken til en renseprosess som er integrert med svingekaret, og (f) separasjon av proteinet av interesse fra den klarnede vevskulturvæsken i rensesystemet for kontinuerlig fremstilling av et sterilt, partikkelfritt, oppkonsentrert og delvis renset produktisolat som inneholder proteinet av interesse, hvori den spesifikke gjennomstrømningshastighet for blandingen gjennom den kontinuerlige perfusjonsfermenteringsprosess og den kontinuerlige prosess for partikkelfjerning holdes i det vesentlige konstant, og gjennomsnittlig tilsvarer den gjennomsnittlige produksjonshastighet forbundet med den integrerte, semi-kontinuerlige grenseprosess.

Innretninger for utførelse av fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot et apparat for separasjon av et protein av interesse fra en heterogen vevskulturvæskeblanding. Generelt omfatter apparatet: (a) et kontinuerlig perfusjonsfermenteringssystem, (b) et kontinuerlig system for partikke-fjerning som er integrert med perfusjonsfermenteringssystemet, og (c) et kontinuerlig rensesystem som er ultrafiltrering integrert med systemet for partikkelfjerning, hvori apparatet er tilpasset opprettholdelse av sterile betingelser. Det beskrives at apparatet kan omfatte: (a) et kontinuerlig perfusjonsfermenteringssystem, (b) et kontinuerlig system for partikkelfjerning som er integrert med perfusjonsfermenteringssystemet, og (c) et periodisk rensesystem som er ultrafiltrering integrert med systemet for partikkelfjerning, hvori apparatet er tilpasset opprettholdelse av sterile betingelser. Prosessen og apparatet ifølge oppfinnelsen er tilpasset for muliggjørelse av kontinuerlig prosessering av en heterogen vevskulturvæskeblanding ved en i det vesentlige konstant gjennomstrømningshastighet. I et spesielt aspekt av oppfinnelsen er prosessen og apparatet ifølge oppfinnelsen tilpasset kontinuerlig prosessering av en heterogen vevskulturvæskeblanding ved en i det vesentlige konstant gjennomstrømningshastighet som ligger under transisjonspunktet for proteinet i det trykkavhengige området i kurven for gjennomstrømningshastighet som funksjon av TMP over et kontinuerlig tidsrom og gjennom renseprosessen.

I spesifikke utførelser tilveiebringer oppfinnelsen to nye innretninger (A, B) som hver består av tre separate, men fullt integrerte elementer, som alle spiller en essensiell rolle og sammen danner en unikt effektiv, kontinuerlig proteinisoleringssystemplattform som løser problemene innen teknikkens stand som er beskrevet ovenfor.

De tre separate elementene i hver innretning er for det første et integrert, kontinuerlig partikkelfjerningssystem 100, for det andre et sterilt svingekar 200 og for det tredje et integrert oppkonsentrerings/rensesystem 300 henholdsvis 400. Alle de tre elementene, og derved de utviklede, nye innretningene og fremgangsmåtene for anvendelse av disse innretningene beskrives i detalj nedenfor.

For å oppnå integrert, kontinuerlig eller semi-kontinuerlig oppkonsentrering/rensing av proteinproduktet, omfatter innretningen A ifølge oppfinnelsen (for hvilke to utførelser er vist i fig. 2) et integrert, kontinuerlig, sterilt ultrafiltreringssystem 300, mens innretning B ifølge oppfinnelsen (for hvilke to utførelser er vist i fig. 3) omfatter et integrert, semi-kontinuerlig, konvektivt adsorpsjons/desorpsjonssystem 400.

Innretningene ifølge oppfinnelsen er direkte integrert med en eller flere kontinuerlige perfusjonsfermentorer og utgjør således en ny, kontinuerlig integrert fremstillingsplatt-form.

INNRETNING A

Integrert system for kontinuerlig partikkelfjerning 100

Fig. 2 viser 2 utførelser av innretning A ifølge oppfinnelsen. Det integrerte system for kontinuerlig partikkelfjerning 100 er direkte koblet til uttakssiden av det kontinuerlige perfusjonsfermenteringssystem 1. Fig. 4 viser en mer detaljert skjematisk fremstilling av en utførelse av det integrerte system for kontinuerlig partikkelfjerning ifølge oppfinnelsen 100, som består av en pumpe 101, en trykkmåler henholdsvis en trykkoverfører 107, en tilkoblingsmanifold 102 og en sammensetning av flere filterpatroner 103. Alle bestanddeler er sammenkoblet med fleksible rør og/eller faste rør.

Pumpen 101 er en konvensjonell peristaltisk pumpe som tillater forsiktig pumping av celledyrkingsmaterialet uten roterende deler eller segl som kommer i kontakt med det sterile produkt. Pumpen og pumperøret er en størrelse som er tilpasset for tilførsel av den ønskede gjennomstrømningshastighet av høstet materiale fra cellekulturfermen-teringssystemet, som er opp til 15 bioreaktorvolumer pr. dag, for eksempel opp til 9,4 liter/time for en 15 liter fermentor og opp til 125 liter/time for en 200 liter fermentor.

Trykkmåleren eller trykkoverføreren 107 er utformet slik at den kan steriliseres ved autoklavering eller bestråling. I den foreliggende utformingen anvendes enten en gjenbrukbar piezoresistiv transmitter i et hus av rustfritt stål eller en gjenbrukbar trykkmåler av rustfritt stål. Fremtidige forbedringer kan imidlertid omfatte anvendelse av éngangstransmittere som lett kan steriliseres ved bestråling.

I en foreliggende utførelse består tilkoblingsmanifolden 102 av fleksible rør med rørklemmer (eller ventiler) og egnede sterile tilkoblere som tillater tilkobling av ytterligere filterpatronoppbygginger uten at systemets sterilitet forstyrres. Rørdiameteren er fortrinnsvis av en størrelse som gir en lineær væskehastighet på tilnærmet 2 m/s eller mindre ved de ønskede gjennomstrømningshastigheter, slik at det unngås høyt mottrykk og skjærkrefter. I en annen foreliggende utførelse anvendes i stedet for de sterile tilkoblerne spesielle, fleksible rørbiter som kan sveises med kommersielle rørsveiser uten å forstyrre steriliteten. Slike rørbiter er fremstilt av PVC eller andre egnede polymerer.

Filterpatronoppbyggingen 103 består av minst tre, fortrinnsvis flere identiske filterpatroner (som vist skjematisk), hvor kun en av filterpatronene er åpen på et gitt tidspunkt, som vist som et eksempel i fig. 4 105.

Hver filterpatron består av minst et filter, fortrinnsvis et forfilter og et sluttfilter i serie (som vist i fig. 4). Om nødvendig for å øke kapasiteten for en gitt anvendelse, kan hver filterpatron 105, 106 osv. i seg selv bestå av flere filtre eller filterpatroner i parallell (ikke vist).

I en utførelse av oppfinnelsen som er vist i fig. 4 lukkes den andre filterpatronen i oppbyggingen 106 av en trykkfølsom bruddskive henholdsvis bruddpinne 104.1 drift er funksjonen til bruddskiven eller bruddpinnen å automatisk åpne innstrømmingsveien til den andre filterpatronen 107 når trykket i den første filterpatronen 105 når en angitt grense, slik at det sikres uforstyrret fortsettelse av filtreringsprosessen. Kommersielt tilgjengelige bruddskiver eller bruddpinner benyttes i systemet ifølge oppfinnelsen, og slike anvendes ellers som et sikkerhetssystem for trykk. I en foreliggende utførelse anvendes bruddskiver eller bruddpinner med en angitt trykkgrense for brudd på ikke mer enn 16 PSI, noe som har vist seg svært nyttig. Imidlertid er det mulig med et område for den angitte trykkgrense.

Hver videre filterpatron i filterpatronoppbyggingen er også separert ved en manuell eller automatisk ventil og en annen bruddskive eller bruddpinne. Når først den andre filterpatron 106 er i drift, åpnes ventilen til den neste bruddskive eller bruddpinne, slik at den neste filterpatronen kan fungere som et reservesystem osv.

I en alternativ utførelse anvendes utelukkende automatisk aktiverte ventiler, og i drift aktiverer et kontrollsystem ventilene basert på målinger fra en piezoresistiv trykkføler 107, som også kan steriliseres ved autoklavering. Imidlertid har søkerne funnet at den her beskrevne utforming med bruddskive henholdsvis bruddpinne gir en enestående robusthet ved drift over lenger tid.

Den endelige filterverdi er minst 3 um eller mindre, fortrinnsvis 0,45 um og ytterligere mer foretrukket 0,2 um. Filterpatronen som er i drift 6 tilbakeholder følgelig alle gjenværende celler så vel som relevante cellerester og andre partikler, noe som fører til en partikkelfri utstrømming 9 av den klarnede vevskulturvæske (cTCF).

Forskjellige kommersielt tilgjengelige filtermaterialer kan anvendes. I den foreliggende utforming benyttes éngangsfilterkapsler, for eksempel Sartopure eller Sartoclear forfilterkapsler (Sartorius, Goettingen) og Sartobran sluttfilterkapsler (Sartorius, Goettingen), som kan steriliseres ved autoklavering eller bestråling.

Som et eksempel på en foreliggende utførelse av innretningen ifølge oppfinnelsen, utformet for en gjennomstrømningshastighet på 1 liter/minutt, består hver filterpatron 105, 106 etc. i sammensetningen 103 av 3 30" forfilterkapsler (Kleenpak Ultipleat, Pall Corp., 4,5 um angitt, hver på 0,75 m<2>) fulgt av 3 20" sluttfilterkapsler (Sartobran P, Sartorius, 0,45 um/0,2 um angitt, hver på 1,3 m<2>). Denne spesielle utformingen har vist seg spesielt anvendbar for fremstilling i stor skala av rekombinant blodkoagulasjonsfaktor VIE, så vel som genetisk modifiserte FVHI-varianter, innbefattet FVin med deletert B-domain.

Søkerne har imidlertid funnet at ved anvendelse av innretningen og fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er effektiviteten av partikkelfjerningen med en rekke tilgjengelige filtermaterialer og konfigurasjoner fra forskjellige produsenter (Pall, Sartorius, Cuno) konsistent og signifikant forbedret sammenlignet med de angjeldende konvensjonelle satsvise prosesser.

Følgelig vil den nye innretning og prosess ifølge oppfinnelsen også være gunstig for anvendelse med nye filtertyper og geometrier, for eksempel med filtertyper som forhøyer det tilgjengelige filterareal pr. kapsel så vel som med filtertyper som gir et krysstrømmønster eller har andre midler for minimalisering av oppbygningen av materialet på filteret, for eksempel vibrering eller filterelementrotasjon.

I en annen utførelse av prosessen ifølge oppfinnelsen omfatter filterpatronoppbyggingen 103 kun en steril reservefilterpatron som er lukket med en bruddskive eller en bruddpinne, men fortsatt med flere filterpatroner for drift. Den første filterpatronen i oppbyggingen benyttes inntil et angitt, på forhånd bestemt tilført volum har blitt prosessert, hvoretter driften overføres (manuelt eller automatisk) til neste filterpatron i oppbyggingen. Det spesifikke tilførte volum er angitt slik at trykkgrensen for bruddskiven eller bruddpinnen ikke overskrides under normale driftsbetingelser. Hvis derimot trykket øker mer enn vanlig under filtrering, for eksempel grunnet en uvanlig lav filtrerbarhet av det høstede materialet, sikrer reservefilterpatronen igjen uforstyrret, kontinuerlig filtrering ved at den åpnes når det angitte trykk overskrides. Etter åpning av reservefilterpatronen overføres filtreringen til en annen filterpatron i oppbyggingen, og en annen reservefiltreringspatron med bruddskive eller bruddpinne installeres uten at systemets sterilitet forstyrres.

Det er velkjent blant fagfolk at for å holde både filterkostnader og prosesseringstid for satsvise prosesser for partikkelfjerning på et minimum, må satsvise filterpatroner ha en størrelse som gir det lavest mulige filterareal som er nødvendig for å gi den ønskede absolutte gjennomstrømningshastighet (i liter/time) og maksimalt trykk. Den ønskede absolutte gjennomstrømningshastighet må i sin tur være tilstrekkelig høy til å gi brukbare prosesseringstider for det ønskede porsjonsvolum. Dette nødvendiggjør en høy spesifikk gjennomstrømningshastighet (i liter/time/m<2>filterareal).

I motsetning til et sammenlignbart, optimalisert satsvis filtreringssystem er innretningen ifølge oppfinnelsen utformet for flere ganger lavere spesifikk

gjennomstrømningshastighet, og gjennomstrømningshastigheten holdes konstant (i liter/time/m<2>installert filterareal) slik at den absolutte gjennomstrømningshastighet er lik utstrømmingshastigheten for høstet materiale fra den kontinuerlige perfusj onsfermenteringen.

Søkerne har uventet oppdaget at ved slike lave spesifikke gjennomstrømningshastig-heter er volumet som kan prosesseres gjennom et filter uproporsjonalt høyere enn ved de innstilte gjennomstrømningshastigheter i satsvise prosesser.

Det er viktig å bemerke at for konvensjonelle satsvise isoleringsprosesser vil slike lave spesifikke gjennomstrømningshastigheter ikke være oppnåelige, grunnet enten ekstreme filtreringsarealer (og følgelig kostnader) eller en for lav absolutt gjennomstrømnings-hastighet. Dette skyldes primært at det satsvise utstyr for partikkelfjerning det meste av tiden ikke benyttes, mens materialet oppsamles for neste porsjon. Videre tillater den overraskende, uproporsjonale økning av den oppnåelige filterkapasitet i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen en signifikant reduksjon av filterforbruket, og følgelig fremstillingskostnadene.

Svingekar 200

Utløpet fra det integrerte system for kontinuerlig partikkelfjerning er direkte og konstant koblet til et svingekar 201, som vist i fig. 2. Dette svingekaret er et sterilt kar, for eksempel en éngangspose eller et kar av rustfritt stål med minst en innløpsåpning og en utløpsåpning, hvor den siste fortrinnsvis foreligger i bunnen av karet. Et bredt område av karstørrelser og utforminger kan benyttes. Imidlertid er størrelsen av svingekaret fortrinnsvis slik at det er lite sammenlignet med den volumetriske gjennomstrømmingen i systemet, slik at residenstiden av produktet i karet holdes på et minimum, dvs. under 24 timer, fortrinnsvis under 8 timer, og ytterligere mer foretrukket under 4 timer.

Søkerne har oppdaget at slike lave residenstider for produktet, noe som utelukkende er mulig grunnet innretningene ifølge oppfinnelsen, tillater en signifikant økning av utbyttet for proteinprodukter med iboende ustabilitet, slik at et av problemene innen teknikkens stand løses.

I noen utførelser av innretningene ifølge oppfinnelsen er svingekaret plassert på en vekt eller belastningscelle 202, som vist for innretning Bl og B2 i fig. 3. Denne vekten eller belastningscellen overfører et vektsignal til et datamaskinbasert kontrollsystem (ikke vist).

I tillegg, i en utførelse av innretningen ifølge oppfinnelsen (B2), et bufferkar 204 koblet via en peristaltisk pumpe 203 til svingekaret. I drift benyttes dette oppsettet for å justere egenskapene til den partikkelfrie strøm av høstet materiale, for eksempel når det gjelder ledningsevne (ionestyrke) eller pH, ved tilsetning av en egnet buffer eller et fortynningsmiddel. I dette tilfellet anvendes et valgfritt sammenblandingssystem 205 og sensorer for måling av den ønskede tilstand 206, for eksempel pH eller ledningsevne. I den foreliggende utforming benyttes et magnetkoblet røreverk, imidlertid kan andre sammenblandingssystemer, for eksempel ristemaskiner eller pulserende innretninger, også anvendes.

Integrert kontinuerlig oppkonsentrering/rensing 300

Innretning A, for hvilken 2 utførelser er vist i fig. 2, omfatter et integrert, kontinuerlig, sterilt ultrafiltreringssystem 300. Utførelser av det kontinuerlige, sterile ultrafiltreringssystem omfatter en resykleringspumpe 301 og resirkuleringsløkke 306, en eller flere sterile krysstrøm-ultrafiltreringsmoduler 303, en permeatpumpe 305, et sterilt mottakerkar for permeat 307 på en vekt eller belastningscelle 309 og en pumpe for tilbakeholdt materiale 311. Den omfatter videre instrumentering i form av en innløpstrykkmåler eller transmitter 302, en permeattrykkmåler eller transmitter 304, en utløpstrykkmåler eller transmitter 308 så vel som en resirkuleringsflytmåler 310.1 drift leverer utløpet 312 i systemet en kontinuerlig strøm av oppkonsentrert og delvis renset proteinprodukt, som kan oppsamles kontinuerlig, nedfryses eller prosesseres videre.

Utførelse A2 av oppfinnelsen omfatter i tillegg et bufferkar eller fortynningsmiddelkar 314, en peristaltisk pumpe for tilsetning av buffer/fortynningsmiddel 313, så vel som gjennomstrømmingssensorer for måling av konsentratets tilstand i resirkuleringsløkken, for eksempel sensorer for pH og ledningsevne 315, 316.1 drift anvendes dette oppsettet for justering av egenskapene til strømmen av partikkelfritt høstet materiale, for eksempel ledningsevne (ionestyrke) eller pH, ved tilsetning av en egnet buffer eller et fortynningsmiddel. Dette oppsettet kan også anvendes for tilsetning av proteinstabilisa-torer. Selv om resirkuleringsløkken i utførelse A2 ifølge oppfinnelsen selv fungerer som blandekammer, kan justeringen også eventuelt utføres ved anvendelse av et svingekar-oppsett som vist for innretning B (utførelse B2), som omfatter bestanddeler (203, 204, 205, 206) som diskutert senere i den foreliggende beskrivelse (se beskrivelse av innretning B).

Utførelser av innretningen ifølge oppfinnelsen omfatter også et system for dataopp-samling og programmerbar kontroll som oppsamler innkommende datasignaler fra instrumenteringen (som for eksempel, men ikke begrenset til, forskjellige trykk, gjennomstrømningshastighet, karvekt, pH, ledningsevne) og kontrollerer pumpehastig-hetene ifølge en på forhånd definert kontrollalgoritme.

Alle pumper 301, 305, 311, 313 er peristaltiske pumper som tillater pumping av de angjeldende væskestrømmer uten at noen roterende deler eller forseglinger kommer i kontakt med den sterile produktstrømmen. Søkerne har oppdaget at dette er å foretrekke for erholdelse av robust, steril drift over lenger tid. Andre sterile pumpeutforminger kan imidlertid i prinsippet anvendes. Recykleringspumpen 301 og pumpeslangene er dimensjonert for å tillate robust justering av de ønskede krysstrømhastigheter mellom 80 og 800 liter/time pr. m<2>installert membranareal, avhengig av masseoverføringsegen-skapene til den benyttede ultrafiltreringsmodul. Permeatpumpen er dimensjonert for å tillate robust og nøyaktig justering av en spesifikk gjennomstrømningshastighet for permeatet på mellom 90% og 99% av gjennomstrømningshastigheter for høstet materiale fra den kontinuerlige perfusjonsfermenteringen. Pumpen for tilbakeholdt materiale er dimensjonert for å tillate robust og nøyaktig justering av strømningshastig-heten for tilbakeholdt materiale mellom 1% og 10% av strømningshastigheten for høstet materiale fra den kontinuerlige perfusjonsfermenteringen.

Innkapslede ultrafiltreringsmoduler 303 anvendes for å muliggjøre robust, steril drift og steriliseres ved autoklavering eller bestråling. Den optimale nominelle molekylvekts- grenseverdi er utvalgt basert på molekylvekten av proteinproduktet av interesse og må bekreftes ved standard eksperimenter som er kjente blant fagfolk. En rekke forskjellige membranmaterialer, for eksempel polyetersulfon, hydrofilisert polyetersulfon eller regenerert cellulose, kan anvendes så lenge som hele membranmodulen kan steriliseres ved bestråling og/eller autoklavering uten å skade membranen. Det forventes at hydrofile materialer kan forhøye effektiviteten grunnet disses lavere tendens til å tiltettes.

Søkerne har funnet at innretning A er enestående effektiv dersom det installerte totale ultrafiltreringsmembranareal i kvadratmeter er likt et område mellom 0,1 til 2 ganger den volumetriske gjennomstrømningshastighet av det høstede materialet fra den kontinuerlige perfusjonsfermenteringen i liter/time. For for eksempel en gjennom-strømningshastighet på 1 liter/time for det perfusjonshøstede materialet, bør det installerte totale membranareal være mellom 0,1 og 2 kvadratmeter. Søkerne har oppdaget at innretning A er ytterligere mer effektiv dersom det installerte ultrafiltreringsmembranareal i kvadratmeter er likt et område mellom 0,3 og 1 ganger den volumetriske gjennomstrømningshastighet for det høstede materialet fra den kontinuerlige perfusjonsfermentering i liter/time.

I en utførelse av oppfinnelsen anvendes kommersielt tilgjengelige "éngangs" "hollow fiber"-membranmoduler (GE Healthcare, tidligere Amersham Biosciences). Imidlertid kan en rekke forskjellige innkapslede membraner og modulutforminger anvendes, for eksempel spiraltvunnede moduler, innkapslede kassetter eller kapsler med forbedret masseoverføring grunnet sekundære strømningsmønstre (for eksempel virvelstrømm-ing), roterende elementer (for eksempel dynamiske skivefiltre) eller vibrerende filtre. Det forventes at særlig innkapslede ultrafiltreringskassetter med fordel kan anvendes i innretningene ifølge oppfinnelsen, siden disse gir en høy masseoverføringskoeffisient ved relativt lav nødvendig krysstrømhastighet, noe som reduserer behovet for pumpe-kapasitet samtidig som systemets kompleksitet og investeringskostnader holdes lave.

Innretningen ifølge oppfinnelsen tillater ikke bare kontinuerlig, men også virkelig steril drift, i motsetning til bare aseptisk drift. Søkerne oppnådde dette ved å utforme alle systembestanddeler som er i kontakt med produkt slik at de ikke bare kunne vaskes, men også steriliseres ved autoklavering, dampbehandling på stedet eller gamma-stråling. I de foreliggende utførelser anvendes éngangs innkapslede moduler for kontinuerlig partikkelfjerning 100, så vel som kontinuerlig ultrafiltrering 300. Peristaltiske pumper unngås for å unngå enhver form for kontakt mellom produktet og roterende elementer og mekaniske forseglinger. I de foreliggende utførelser anvendes videre éngangsslanger og poseoppbygginger i stedet for faste rør. Éngangsbestanddeler som kommer i kontakt med produktet (for eksempel slanger, poser, moduler) eller grupper av komponenter, er på forhånd sammensatt og sterilisert sammen, noe som forenkler oppstar og drift. Systemene er utformet for å holde enhver mulig åpning av det sterile system overfor omgivelsene (for eksempel sterilbenk), for eksempel for prøveuttak eller bytte av poser eller instrumentering, til et minimum. I de foreliggende utførelser av innretningen er manifoldene utformet med overskuddskapasitet, slik at bytte fra en steril bestanddel (for eksempel en pose som mottar produktet) til den neste kan utføres uten at systemet åpnes. Ytterligere skifte av slanger, moduler eller poser utføres fortrinnsvis ved anvendelse av sterile slangesveisere snarere enn sterile sammenkoblere.

Andre fremtidige utførelser av innretninger ifølge oppfinnelsen kan også omfatte bestanddeler som kar av rustfritt stål, filterhus eller rør som kan steriliseres på stedet, alene eller i kombinasjon med éngangsbestanddeler, så lenge som robusthet og sterilitet ved lang tids drift sikres.

Ytterligere utførelser av innretning A ifølge oppfinnelsen er utformet for prosessering av materialet fra flere fermentorer i større fremstillingsanlegg (A3). Et eksempel er vist skjematisk i fig. 5. Videre utførelser er utformet for å øke den totale oppkonsentreringsfaktor og separasjonsevne ved å kombinere to stadier med kontinuerlige filtrerings-systemer 300 i serie (A4, vist skjematisk i fig. 5).

BESKRIVELSE AV FREMGANGSMÅTE FOR ANVENDELSE AV INNRETNING A

De kontinuerlige perfusjonsfermenteringene utføres over et langt tidsrom (en kampanje) typisk mellom 2 uker og 6 måneder eller mer. Den produktholdige vevskulturvæske (TCF), celler og cellerester prosesseres kontinuerlig ved anvendelse av innretning A. En steril, partikkelfri, oppkonsentrert og delvis renset produktstrøm ("produktisolatet") produseres og forlater kontinuerlig innretningen ved utløpet 312. Ved anvendelse av pumpen 101 i det sterile system for kontinuerlig partikkelfjerning 100 pumpes det høstede materialet kontinuerlig gjennom filtreringsoppbyggingen 103 ved den ønskede gjennomstrømningshastighet Qh for det perfusjonshøstede materialet fra fermenteringen.

Utløpsstrømmen fra det kontinuerlige filtreringssystem, dvs. den klarnede vevskulturvæske (cTCF), føres kontinuerlig over i svingekaret 201. Fra svingekaret prosesseres cTCF kontinuerlig via et kontinuerlig, sterilt ultrafiltreringssystem 300 ved en gjennom-strømningshastighet som er lik gjennomstrømningshastigheten for materialet som kommer fra den kontinuerlige perfusjonsfermenteringen. Grunnet svingekarets lille størrelse sammenlignet med de justerte gjennomstrømningshastighetene holdes den gjennomsnittlige residenstid for produktet i karet på et minimum, dvs. under 12 timer, fortrinnsvis under 4 timer og ytterligere mer foretrukket under 2 timer.

Tilstrekkelig krysstrøm og følgelig masseoverføring justeres i ultrafiltreringsmodulen via resykleringspumpen 301. Gjennomstrømningshastigheten for tilbakeholdt materiale justeres og kontrolleres ved anvendelse av pumpen for tilbakeholdt materiale 311, slik at det oppnås en konstant og kontinuerlig gjennomstrømningshastighet Qi for det konsentrerte produktisolat som forlater innretning A i utløpet 312. Permeatpumpen 305 anvendes for justering og kontroll av gjennomstrømningshastigheten Qp for permeatet, som tappes kontinuerlig fra permeattiden av ultrafiltreringsmodulen eller -modulene og som består av vann og bestanddeler av løsningene som er tilstrekklig små til å passere gjennom ultrafiltreringsmembranen (for eksempel salter, små proteiner).

Gjennomstrømningshastigheten for permeatet Qp og det tilbakeholdte materialet/isolatet Qi justeres nøye og kontrolleres slik at de er tilpasset gjennomstrømningshastigheten for Qh for det høstede materialet fra fermenteringen, slik at:

Samtidig justeres og kontrolleres gjennomstrømningshastighetene slik at en ønsket oppkonsentreringsfaktor cf oppnås ved at følgende ligning tilfredsstilles:

For, for eksempel, å oppnå en ønsket oppkonsentreringsfaktor for produktet på 10 ganger i isolatet sammenlignet med konsentrasjonen i det opprinnelig høstede materialet, kontrolleres Qi til Qi = 1/10<*>Qh ved anvendelse av pumpen for tilbakeholdt materiale/isolat 311, mens Qp justeres til Qp = 0,9<*>Qh ved anvendelse av permeatpumpen 305.

Siden gjennomstrømningshastighetene kontrolleres av pumpene 305 og 311, tapper ultrafiltreringssystemet automatisk en strøm tilsvarende Qp + Qi fra det lille svingekaret 201.

Når det gjelder anvendelse utforming A2 (se fig. 2, høyre side), tilsettes en kontinuerlig strøm av buffer eller vann for injeksjon fra karet 314 til det kontinuerlige ultrafiltreringssystemet ved en konstant innstrømmingshastighet Qb ved anvendelse av buffer-tilsetningspumpen 313. Isolatets egenskaper kan følgelig fritt og kontinuerlig justeres, for eksempel når det gjelder ionestyrke, pH, tilsetning av stabilisatorer osv. Gjennom-strømningshastighetene kontrolleres følgelig slik at

Videre kan det velges forhold mellom gjennomstrømningshastighetene slik at en ønsket oppkonsentreringsfaktor cf oppnås ved at ligningen Qi = l/cf<*>(Qh + Qb) tilfredsstilles. Alternativt kan denne prosessen anvendes for kun å endre egenskapene (for eksempel pH, ledningsevne) ved å sette Qi = Qh + Qb.

Den nye fremgangsmåten for anvendelse av innretning A står også i kontrast til de satsvise UF-prosesser (teknikkens stand) når det gjelder driftinnstillingen av selve ultrafiltreringen. Konvensjonelle satsvise UF-prosesser er utformet for en viss gjennomsending gjennom et lite membranareal i løpet av kort tid. Satsvis UF drives følgelig generelt ved transmisjonspunktet mellom det trykkavhengige og det masseoverførings-kontrollerte området (se fig. 9). Dette fører til en ønsket høy spesifikk gjennomstrømm-ing i utgangspunktet, som imidlertid faller signifikant og hurtig i løpet av sekunder til minutter, etter hvert som konsentrasjonspolarisering hurtig fører til osmotisk tilbake-trykk og dannelsen av et begrensende gelsjikt (sekundær membran). En slik høy veggkonsentrasjon av makromolekyler fører også til forhøyet adsorpsjon av forbindelser til den indre og ytre membranoverflate, dvs. til tiltetting av membranen. Denne tiltettingen vil ytterligere redusere permeatstrømmen med tiden.

Søkerne har overraskende oppdaget at med innretning A oppnås mange ganger høyere total ladningskapasitet for areal installert ultrafiltreringsmembran ved drift i den lave ende av trykk-strømkurven (se fig. 9):

Den normaliserte veggkonsentrasjon cwall for en fullt ut tilbakeholdt bestanddel, kan beskrives som følger:

hvori:

j = spesifikk permeatgjennomstrømming i liter/time/m<2>

kd = masseoverføringskoeffisient i liter/time/m<2>

Cbuik= konsentrasjon av bestanddelen i resten av løsningen

Som ved satsvis UF, drives den kontinuerlige UF ved en optimalisert masseover-føringskoeffisient for minimalisering av konsentrasjonspolarisering. I motsetning til satsvis ultrafiltrering justerer imidlertid søkerne permeatstrømmen J slik at den ligger i den lave del av trykk-strømkurven (se fig. 9). Som en følge av den eksponentielle ligningen, blir følgelig veggkonsentrasjonenCwaiipå membranoverflaten signifikant lavere enn den ville bli ved satsvis ultrafiltrering. Den foreliggende utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen justerer for eksempel en ønsket spesifikk gjennomstrømningshastighet for permeatet til tilnærmet 1/10 av den oppnåelige masseoverføringskoeffisient, slik at det oppnås en veggkonsentrasjon som kun er 10% høyere enn den justerte konsentrasjon i resten av løsningen (eller det tilbakeholdte materialet).

Den påfølgende tabell 1 viser et eksempel på en fremgangsmåte for anvendelse av innretning A (utførelse Al) for kontinuerlig isolering av et proteinprodukt fra en fermentor i utviklingsskala:

TABELL 1

Eksempel på fremgangsmåte for anvendelse av en foreliggende utførelse av innretning A for kontinuerlig isolering av et proteinprodukt fra kontinuerlig perfusj onsfermentering

For hvert enkelt produktmolekyl kan et levetids kriterium defineres for det sterile, kontinuerlige ultrafiltreringsoppsett, for eksempel basert på transmembrantrykk. Når først trans-membrantrykkgrensen overskrides, utskiftes det kontinuerlige, sterile ultrafiltreringsoppsett med et annet, identisk oppsett uten at systemets integritet og sterilitet kompromitteres. Dette kan utføres på tilsvarende måte som for det kontinuerlige, sterile filtreringsoppsett ved anvendelse av enten manifolder og sterile sammenkoblere eller ved anvendelse av fleksible éngangsslanger og sterile slangesveisere.

INNRETNING B

Integrert system for kontinuerlig partikkelfjerning 100

Fig. 3 viser 2 utførelser av innretning B ifølge oppfinnelsen. Det integrerte system for kontinuerlig partikkelfjerning 100 er direkte koblet til utløpssiden av det kontinuerlige perfusjonsfermenteringssystem 1. Denne delen av innretning B er identisk med innretning A (se detaljert beskrivelse av innretning A og fig. 4 ovenfor).

Svingekar 200

Utløpet fra det integrerte system for kontinuerlig partikkelfjerning er direkte og konstant koblet til et svingekar 201, som vist i fig. 3. Dette svingekaret er et sterilt kar, for eksempel en éngangspose eller et kar av rustfritt stål med minst et innløp og et utløp, hvor det siste fortrinnsvis foreligger i bunnen av karet. Et bredt utvalg av karstørrelser og utforminger kan benyttes. Imidlertid har svingekaret fortrinnsvis en størrelse som er liten sammenlignet med systemets volumetriske gjennomstrømming, slik at produktets residenstid i karet holdes lav, dvs. under 26 timer, fortrinnsvis under 12 timer og ytterligere mer foretrukket under 4 timer.

I innretning B er svingekaret plassert på en vekt eller en belastningscelle 202, som vist for utførelsene Bl og B2 i fig. 3. Denne vekten eller belastningscellen overfører et vektsignal til et datamaskinstyrt kontrollsystem (ikke vist).

I en utførelse av innretningen ifølge oppfinnelsen B2 er i tillegg et bufferkar 204 til-koblet via en peristaltisk pumpe 203 til svingekaret. I drift anvendes dette oppsett for justering av egenskapene til det partikkelfrie høstede materialet, for eksempel når det gjelder ledningsevne (ionestyrke) eller pH, ved tilsetning av bestanddeler for modifiser-ing av egenskapene til den klarnede vevskulturvæske som mottas fra partikkelfjernings systemet, for eksempel en egnet buffer eller et egnet fortynningsmiddel, eller et egnet proteinstabiliserende middel. I dette tilfellet omfatter en foreliggende utførelse også et sammenblandingssystem 205 og sensorer for måling av den ønskede egenskap 206, for eksempel pH eller ledningsevne. I den foreliggende utførelse benyttes et magnetkoblet røreverk, imidlertid kan andre sammenblandingssystemer, for eksempel ristemaskiner eller pulserende innretninger, også anvendes.

I en annen utførelse av innretningen ifølge oppfinnelsen anvendes to svingekar. På hvilket som helst tidspunkt er et svingekar direkte koblet til systemet for kontinuerlig partikkelfjerning 100 og mottar klarnet væske, mens det andre er koblet til det semi-kontinuerlige oppkonsentrerings/rensesystem 400 og tilfører materialet til en konvektiv adsorpsjons/desorpsjonscyklus. Bytte mellom de to karene oppnås via et kontrollsystem som benytter vekten av mottakerkaret for å utløse et bytte når det maksimale oppfyllingsvolum er nådd.

Integrert semi-kontinuerlig oppkonsentrerings/rensing 400

Innretning B, for hvilken 2 utførelser er vist i fig. 3, omfatter et integrert, semi-kontinuerlig, konvektivt adsorpsjons/desorpsjonssystem 400.

Det integrerte, semi-kontinuerlige, konvektive adsorpsjons/desorpsjonssystem er utformet og dimensjonert slik at strømningshastigheten for ladning (Qload) er signifikant høyere enn gjennomstrømningshastigheten for den kontinuerlige perfusjonshøsting og den kontinuerlige filtreringsprosess Qh, dvs. Qload » Qh.

Utførelser av det integrerte, semi-kontinuerlige oppkonsentrerings/rensesystem 400 omfatter en ladepumpe 401, en ventilsammensetning med flere utganger 402 og flere bufferkar 404, en 3-veis ventil 403 koblet til et sterilt mottakerkar for avfall 413, og en eller flere moduler for konvektiv adsorbsjon 406, innløps- og utløpstrykkmålere eller transmittere 405, 408, ytterligere instrumentering, for eksempel en UV-måler 409, pH-og ledningsevnemålere 409, 410, en strømningsmåler 412 så vel som ytterligere en 3-veis ventil 407, også koblet til avfallskaret 413 og til utløpet for produkteluatet 414.

Utførelser av innretningen ifølge oppfinnelsen omfatter også et dataoppsamlingssystem og et programmerbart kontrollsystem (ikke vist), som oppsamler innkommende datasignaler fra instrumenteringen (for eksempel, men ikke begrenset til, trykk, UV, pH, ledningsevne, strømningshastighet, vekten av svingekaret) og kontrollerer de automatiske ventilene og pumpen ut fra programmerte fremgangsmåter.

Ladepumpen 401 er fortrinnsvis en peristaltisk pumpe, slik at det unngås direkte kontakt mellom produkt eller sterile buffere og eventuelle forseglinger eller mekaniske deler. Søkerne har funnet at dette er å foretrekke for å oppnå robust, steril drift over lenger tid. Andre sterile pumpeutforminger kan imidlertid i prinsippet også anvendes. Ladepumpen er dimensjonert avhengig av det installerte støttemiddelvolum av det konvektive adsorpsjonsmiddel 406, slik at det oppnås en robust justering på minst 12 kolonnevolumer/minutt. I en foreliggende utførelse anvendes for eksempel Mustang membran-adsorpsjonskapsler (Pall Corp.) med et støttemiddelvolum på tilnærmet 0,3 liter. Ladepumpen er følgelig dimensjonert slik at den tillater ladestrømmingshastigheter på opp til 3,6 liter/minutt.

Funksjonen til ventilsammensetningen med flere utganger 402 er å muliggjøre skifte mellom det produktholdige materialet som tappes fra svingekaret 201 og de forskjellige sterile bufferne og vaskeløsningene fra de sterile bufferkarene 404. Foreliggende utførelser av innretning B benytter en serie av automatisk aktiverte klemmeventiler, som sammenklemmer den fleksible slangen som er koblet til hvert av bufferkarene fra ut-siden, slik at de enkelte linjene åpnes og lukkes. Søkerne har funnet at disse klemme-ventilene utgjør en spesielt fordelaktig løsning for innretning B, siden de unngår enhver kontakt med produktet og følgelig ikke må renses eller steriliseres. Imidlertid kan et bredt utvalg av kommersielle ventiler som er egnet for steril prosessering og som er kjente blant fagfolk anvendes, for eksempel aktiverte membranventiler.

I den foreliggende utførelse er 3-veis ventilene 403, 407 autoklaverbare, aktiverte membranventiler. Et bredt utvalg av kommersielle ventiler som er egnet for steril prosessering kan imidlertid i prinsippet anvendes, innbefattet for eksempel klemmeventiler.

Den konvektive adsorpsjonsmodul 406 inneholder et kromatografisk støttemiddel med hovedsakelig konvektiv masseoverføring av produktet til den adsorberende overflate og steriliseres i motsetning til konvensjonell kromatografi før driften ved autoklavering, dampbehandling eller bestråling. Den i det vesentlige konvektive masseoverføring tillater i motsetning til konvensjonell packed bed-kromatografi svært korte adsorpsjons/ eluerings/regenerasjonscyklustider, noe som søkerne utnytter i innretningen ifølge oppfinnelsen for å oppnå semi-kontinuerlig drift.

I den foreliggende utførelse av innretningen ifølge oppfinnelsen består det konvektive adsorpsjonsmaterialet 406 av en eller flere kommersielt tilgjengelige membranadsorp-sjonskapsler med ionebytterkjemi (Mustang, Pall Corporation eller Sortobind, Sartorius). Innretningen kan imidlertid benytte andre membranadsorpsjonsmaterialer og geometrier, og også mye konvektive støttemidler, for eksempel monolittiske støtte-midler, siden man i motsetning til konvensjonell kromatografi unngår pakking av resin, og støttemidlene kan generelt være innkapslet i moduler som er klare til bruk.

Videre kan andre former for kjemi, innbefattet konvektive affinitetsstøttemidler som omfatter ligander som spesifikt binder produktet, også gi en enestående gunstig yteevne i innretningen ifølge oppfinnelsen.

I en utførelse av innretningen ifølge oppfinnelsen anvendes flere konvektive adsorpsjonsmoduler i innretningen i form av en sammensetning av konvektive adsorpsjonsmoduler i parallell, på tilsvarende måte som i systemet for kontinuerlig partikkelfjerning 100. Hele sammensetningen med alle adsorpsjonsmoduler steriliseres sammen, noe som i drift tillater bytte fra en adsorpsjonssammensetning til en ny dersom den første når slutten av sin anvendbare levetid, for eksempel bestemt ut fra et på forhånd definert kriterium, for eksempel tilbaketrykket under lading eller et maksimalt antall utførte driftscykluser. Hver adsorpsjonssammensetning består av enten en enkelt modul eller flere konvektive adsorpsjonsmoduler i parallell og/eller i serie for å forhøye bindingskapasiteten og/eller forbedre utnyttelsen av kapasiteten.

Det er viktig å understreke at innretningen ifølge oppfinnelsen ikke bare tillater kontinuerlig, men også virkelig steril drift, i motsetning til bare aseptisk drift. Søkerne oppnådde dette ved å utforme alle systembestanddeler som kommer i kontakt med produktet slik at de ikke bare kan renses, men også steriliseres ved autoklavering, dampbehandling på stedet eller gamma-stråling. I de foreliggende utførelser anvendes innkapslede moduler for éngangsbruk for kontinuerlig partikkelfjerning 100, så vel som for semi-kontinuerlig, steril konvektiv adsorpsjons/desorpsjon 400. Peristaltiske pumper anvendes for å unngå enhver kontakt mellom produktet og roterende elementer og mekaniske forseglinger. I de foreliggende utførelser anvendes videre éngangs slanger og posesammensetninger i stedet for faste rør. Bestanddeler eller grupper av bestanddeler for éngangsbruk som kommer i kontakt med produktet (for eksempel slanger, poser, moduler) er sammensatt på forhånd og sterilisert sammen, noe som forenkler oppstart og drift. Systemene er utformet slik at enhver mulig åpning av det sterile system overfor omgivelsene (for eksempel i en steril benk), for eksempel for prøveuttak, bytte av poser eller instrumentering, holdes på et minimum. I de foreliggende utførelser av innretningen er manifolder utformet med overkapasitet, slik at man kan skifte fra en steril bestanddel (for eksempel en pose for produktmottak) til den neste uten at systemet åpnes. Ytterligere utbytting av slanger, moduler eller poser utføres fortrinnsvis ved anvendelse av sterile slangesveisere snarere enn sterile sammenkoblere.

Andre fremtidige utførelser av innretninger ifølge oppfinnelsen kan også omfatte bestanddeler som kar av rustfritt stål, filterhus eller rør som kan steriliseres på stedet, alene eller i kombinasjon med éngangsbestanddeler, så lenge som robusthet og sterilitet ved langtids drift er sikret.

Ytterligere utførelser av innretning B ifølge oppfinnelsen er utformet for prosessering av materiale fra flere fermentorer i større produksjonsanlegg B3. Et eksempel er vist skjematisk i fig. 6. Ytterligere utførelser av innretning B ifølge oppfinnelsen er utformet for å forhøye den totale oppkonsentreringsfaktor og separasjonsyteevne ved å kombinere flere konvektive adsorpsjons/desorpsjonssystemer 400 i serie, med sterile svingekar mellom hvert system 200 (se fig. 6, B4).

Ytterligere andre utførelser av innretninger ifølge oppfinnelsen er utformet for å øke den totale oppkonsentreringsfaktor og separasjonsyteevne ved å kombinere et kontinuerlig ultrafiltreringssystem 300 i serie med et semi-kontinuerlig konvektivt adsorpsjons/ desorpsjonssystem 400 via ytterligere et svingekar. Et eksempel på en utførelse er vist skjematisk i fig. 7.

BESKRIVELSE AV FREMGANGSMÅTE FOR ANVENDELSE AV INNRETNING B

De kontinuerlige perfusjonsfermenteringene drives over et lenger tidsrom (en kampanje), typisk mellom 2 uker og 6 måneder eller mer. Vevskulturvæsken (TCF) som inneholder produkt, celler og cellerester prosesseres kontinuerlig ved anvendelse av innretning B. En steril, partikkelfri, oppkonsentrert og delvis renset produktstrøm ("produktisolatet") produseres og forlater kontinuerlig innretningen i utløpet 414. Ved anvendelse av pumpen 101 i det sterile system for kontinuerlig partikkelfjerning 100 pumpes det høstede materialet kontinuerlig gjennom filtreringssammensetningen 103 ved den ønskede gjennomstrømningshastighet Qh for det perfusjonshøstede materialet fra fermenteringen.

Utløpsstrømmen fra det kontinuerlige filtreringssystem, dvs. den klarnede vevskulturvæske (cTCF) overføres kontinuerlig til svingekaret 201.

Når svingekaret er fylt til et på forhånd definert nivå, utløser et vekt- eller nivåsignal automatisk en adsorpsjons/desorpsjonscyklus for det integrerte, sterile, semi-kontinuerlige oppkonsentrering/rensesystem. Materialet som er oppsamlet i svingekaret lades hurtig inn i adsorpsjosoppsettet, for eksempel i løpet av 4 timer, fortrinnsvis i løpet av 2 timer, og ytterligere mer foretrukket i løpet av 1 time eller mindre, slik at svingekaret tømmes.

I de foreliggende utførelsene som er vist i fig. 3 fortsetter oppsamlingen av partikkelfri, klarnet vevskulturvæske (cTCF) til alle tider i det samme, lille svingekar. Volumet i det lille svingekaret varierer følgelig mellom en minimal verdi og en maksimal verdi. I en annen utførelse som er beskrevet i teksten ovenfor skifter oppsamlingen frem og tilbake mellom 2 identiske svingekar.

Mens cTCF fortsettes å oppsamles i svingekaret, gjennomgår det ladede adsorpsjonsmiddel flere trinn ifølge en på forhånd definert kromatografifremgangsmåte, utformet for desorpsjon av målproduktet i oppkonsentrert, renset form og for å klargjøre adsorp-sjonsmidlet for neste ladecyklus. Den totale cyklus omfatter følgelig lading, vask, eluering, regenerering og reekvilibrering, hver med en eller flere egnede buffere.

Siden igjen gjennomstrømningshastigheten i disse trinnene kan være høy grunnet de konvektive adsorpsjonsmidlenes egenskaper, holdes den totale cyklustid lav, dvs. under 6 timer, fortrinnsvis under 3 timer og ytterligere mer foretrukket under 1,5 timer. Det integrerte system er følgelig utformet slik at adsorpsjonsoppsettet er klart for neste ladecyklus før svingekaret igjen er fylt, noe som tillater semi-kontinuerlig drift.

Den påfølgende tabell 2 viser et eksempel på en fremgangsmåte for anvendelse av en foreliggende utførelse av innretning B ifølge oppfinnelsen for isolering av rekombinant human blodkoagulasjonsfaktor Vin (resultater for isolering i stor skal vist). Fremgangsmåten viste seg enestående gunstig. Utbyttet og yteevnen i hver adsorpsjons/desorp-sjonscyklus tilsvarte satsvis drift, mens det totale produktutbyttet økte med mer enn 10% grunnet produktets kortere residenstid og følgelig minimalisert degradering av produktet. Den samme fremgangsmåten har også vist seg svært gunstig for isolering av genetisk modifiserte FVm-varianter, innbefattet FVffl med deletert B-domain som er signifikant forskjellig fra fullengde FVin når det gjelder størrelse og andre egenskaper. Fremgangsmåten forventes også å være anvendbar for fremstilling av andre proteiner og biomolekyler.

Den kromatografiske fremgangsmåten i seg selv (bufferkjemi og rekkefølge, ladevolum og elueringshastigheter) kan utvikles i satsvise kromatorgrafieksperimenter for hvert enkelt molekyl og kan så lett overføres til anvendelse med utførelser av innretningen ifølge oppfinnelsen.

TABELL 2

Eksempel på fremgangsmåte for anvendelse av en foreliggende utførelse av innretning B for kontinuerlig isolering av FVTfl og FVIII-varianter fra kontinuerlig perfusj onsfermentering

For hvert enkelt produktmolekyl defineres et livstidskriterium for det konvektive

adsorpsjonsoppsett, for eksempel basert på trykk under ladingen eller gjenvinning. Et maksimalt antall cykluser nmaks er typisk spesifisert og validert. Etter at adsorpsjonsoppsettet har blitt anvendt i semi-kontinuerlig drift gjennom nmaks cykluser, utbyttes det med et annet, identisk adsorpsjonsoppsett uten at systemets integritet og sterilitet

kompromitteres. I foreliggende utførelser utføres det på tilsvarende måte som for det kontinuerlige, sterile filtreringsoppsett ved anvendelse av enten manifolder og sterile sammenkoblere eller ved anvendelse av fleksible éngangsslanger og sterile slangesveisere.

Ved anvendelse av den utførelse av innretningen ifølge oppfinnelsen som er vist i fig. 3, høyre side, tilsettes en steril strøm av buffer, pH-justerende løsning, stabilisatorløsning eller vann for injeksjon enten kontinuerlig eller periodisk fra et sterilt kar 204 ved anvendelse av en buffertilsetningspumpe 203. Egenskapene til cTCF kan følgelig justeres fritt, for eksempel når det gjelder ionestyrke, pH, tilsetning av stabilisatorer osv.

Fordeler ved oppfinnelsen

Innretningene ifølge oppfinnelsen og de angjeldende fremgangsmåter for anvendelse av innretningene løser problemene forbundet med konvensjonelle isoleringsprosesser som er skissert ovenfor (se oppfinnelsens generelle bakgrunn).

I alle utførelser av innretningene A og B og de angjeldende fremgangsmåter for anvendelse av innretningene er produktets residenstid i mulig skadelige miljøer minimalisert på en enestående måte som i signifikant grad forhøyer utbyttet og kvaliteten av kompliserte biologiske produkter med iboende ustabilitet. Produksjonskapasiteten kan forhøyes og

materialkostnader reduseres.

Videre fjerner innretningene og de angjeldende fremgangsmåter behovet for store kjøleromsanlegg eller avkjølte kar for midlertidig lagring av store høstede volumer, noe som reduserer investeringskostnadene for anlegget og fullt ut realiserer perfusjonsfer-menteringens fordeler når det gjelder kompakthet og mobilitet.

Utførelser av både innretninger ifølge oppfinnelsen og de angjeldende fremgangsmåter reduserer arbeidskostnadene sammenlignet med konvensjonell, arbeidskrevende satsvis prosessering, grunnet den iboende høye automatiseringsgrad. De nye innretningene tillater kontinuerlig drift 24 timer daglig over lenger tidsrom, noe som maksimaliserer det behandlede volum og utnyttelsen av utstyret.

Videre fjerner innretninger ifølge oppfinnelsen logistiske problemer i anlegg med en eller flere fermentorer. Utførelsene kan prosessere materiale fra enten en eller flere kontinuerlige perfusj onsfermenteringer.

Det er viktig at siden de nye innretningene og fremgangsmåtene tillater fullstendig steril drift, fjernes problemer med mikrobiell kontaminering så vel som entotoksiner, noe som ikke kan oppnås ved aseptisk prosessering fulgt av enkel steril filtrering. 1 tillegg muliggjør innretninger ifølge oppfinnelsen en unngåelse eller minimalisering av behovet for validering av rensing, grunnet benyttelsen av éngangsenheter. Grunnet de unike egenskapene til innretningene og fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan éngangsmoduler så vel som slanger, poser og sammensetninger for éngangs bruk anvendes over lenger tidsrom, opptil hele kampanjens varighet, noe som på dramatisk måte reduserer kostnadene og gjør benyttelsen av enheter for éngangs bruk svært attraktiv fra et økonomisk synspunkt.

Foreliggende utførelser av innretningene A og B ifølge oppfinnelsen og de angjeldende fremgangsmåter har vist seg spesielt anvendbare for fremstilling av rekombinant blodkoagulasjonsfaktor Vin, så vel som genetisk modifiserte versjoner av F Vin, innbefattet, men ikke begrenset til, FVm med deletert B-domain. Oppfinnelsen kan imidlertid klart forventes å være tilsvarende anvendbar for fremstilling av andre proteiner og biologiske molekyler, særlig kompliserte proteiner med iboende ustabilitet, for eksempel faktor VH, faktor EX, faktor X og andre.

Fordeler ved innretning A og den angjeldende fremgangsmåte

Fig. 8 viser et eksempel på den overraskende økning av filterkapasiteten som søkerne oppdaget for det integrerte element for kontinuerlig partikkelfjerning 100. Fig. 10 viser en typisk fordeling av residenstiden og den gjennomsnittlige residenstid for produktet i det kontinuerlige UF-system 300 i en utførelse av innretning A ifølge oppfinnelsen, bestemt ved UV-adsorpsjonen av det tilbakeholdte materialet ved 280 nm, med et modellprotein under typiske betingelser. Som man kan se, er den gjennomsnittlige residenstid for produktet i systemet kun tilnærmet 40 minutter. Følgelig holdes den totale residenstid for produktet i denne foreliggende utførelse av innretning A fra formentorutløpet til det endelige, oppkonsentrerte tilbakeholdte materialet (isolat) på 1-2 timer eller mindre. Dette er mindre enn 1/10 av residenstiden på 28 timer eller mer i en konvensjonell satsvis isoleringsprosess, hvori produktet (høstet materiale) oppsamles i minst 24 timer (opp til flere dager), hvoretter produktet prosesseres i typisk i minst 4-10 timer. Fig. 11 viser en sammenligning mellom det resulterende, totale isolasjonsutbyttet for rekombinant blodkoagulasjonsfaktor (rFVIII) fra plasma-proteinfri, kontinuerlig perfusjonsfermentering, både for en konvensjonell satsvis isoleringsprosess (satsvis filtrering pluss satsvis UF) og for anvendelse av innretning A ifølge oppfinnelsen og den angjeldende fremgangsmåte. Som figuren viser, oppnår den kontinuerlige prosess ifølge oppfinnelsen et signifikant høyere produktutbytte, noe som kan føre til forhøyet produksjonskapasitet og reduserte produksjonskostnader.

Under fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for anvendelse av innretning A vil transmembrantrykket for den integrerte, kontinuerlige ultrafiltreringen øke med tiden, mens den spesifikke membranfluks (i liter/time/mVbar) reduseres ved en konstant volumetrisk gjennomsending. Dette er felles for alle ultrafiltreringsprosesser og skyldes faktorer som konsentrasjonspolarisering, gelsjiktdannelse og tiltetting. I motsetning til satsvis ultrafiltrering er, i motsetning til satsvis ultrafiltrering, som kan ses fra eksempelet som er vist i fig. 12, endringene i trykk og spesifikk fluks ekstremt lang-somme med innretning A, noe som tillater kontinuerlig drift i flere uker ad gangen før membranene må renses eller erstattes. I tillegg er endringshastigheten og systemets totale yteevne relativt lite følsom overfor det fremstilte produkt eller cellelinjen som anvendes i den kontinuerlige perfusjonsfermenteringen (fig. 12). Innretning A ifølge oppfinnelsen og den tilhørende fremgangsmåt er følgelig også ideelt egnet som en generisk plattform for hurtig fremstilling av forskjellige proteiner, siden den fungerer robust og forutsigbar med forskjellige målproteiner fra forskjellige cellelinjer.

Overraskende har søkerne oppdaget at de negative virkningene ned gelsjiktdannelse og tiltetting faktisk minimaliseres i så stor grad med innretning A at et mye større totalvolum pr. installert ultrafilterareal kan prosesseres før det blir nødvendig med rensing eller erstatning av filtrene. Fig. 13 viser den robuste yteevne til innretning A ifølge oppfinnelsen i en langstidskjøring. Etter tilnærmet 25 så transmembrantrykket overraskende nok til å stabilisere seg i en kvasi-likevekt, noe som antyder en enda høyere yteevne over lenger tid. På dag 27 ble gjennomstrømningshastigheten for tilbakeholdt materiale med vilje fordoblet for å analysere virkningen av høyere gjennomstrømming. Etter 34 dager ble en kort skylling utført med steril 0,5 M NaOH uten åpning av systemet, og følgelig med fullstendig opprettholdelse av systemets integritet og sterilitet. Etter dette stabiliserte TMP seg igjen, eller økte i det minste kun med en ekstremt lav hastighet. Etter 70 dager med kontinuerlig, steril drift ble recykleringsgjennomstrømningshastigheten med vilje redusert til det halve for å analysere virkningen på systemets yteevne. Som forventet begynte TMP å øke med en noe høyere hastighet, grunnet den reduserte masseoverføringen og følgelig forhøyde veggkonsentrasjon ved membranoverflaten. 95 dagers drift ble imidlertid med hell og robust fullført før systemet ble avskrudd. I alt nær 4500 liter har blitt prosessert pr. m<2>membranareal med minimalt manuelt arbeid (kun daglig prøveuttak). Til sammenligning har den optimaliserte, konvensjonelle satsvise ultrafiltreringsprosess for samme anvendelse 45 ganger lavere ladningskapasitet, tilnærmet 100 l/m<2>, og krever minst 1-2 operatører på full tid.

Også overraskende viste det seg at selektiviteten til innretning A ifølge oppfinnelsen, særlig dens integrerte, kontinuerlige ultrafiltreringssystem 300, var signifikant høyere enn selektiviteten for en konvensjonell satsvis prosess. Det er velkjent blant fagfolk at ved konvensjonell satsvis ultrafiltrering dannes en sekundær membran av tilbakeholdte makromolekyler under prosessens innledende stadium (gelsjikt), noe som reduserer den tilsynelatende grenseverdi for molekylvekten. Resultatet er at både målmolekylet og kontaminerende mindre proteiner tilbakeholdes, noe som gjør signifikant samtidig rensing praktisk talt umulig. Med konvensjonell satsvis ultrafiltrering er det følgelig sjeldent mulig å separere proteiner som ligger mindre enn en faktor på 10 fra hverandre når det gjelder molekylvekt. Som fig. 14 viser, er det imidlertid med den integrerte, kontinuerlige ultrafiltreringsprosess ifølge oppfinnelsen mulig å justere betingelsene slik at man effektivt separerer IL-2SA (tilnærmet 16 kD) og grønt fluorescerende protein GFP (27-30 kD). Denne høyere enn forventede separasjonsevne tillater samtidig oppkonsentrering og rensing.

Fordeler ved innretning B og den tilhørende fremgangsmåte

Fig. 15 illustrerer yteevnen til innretning B ifølge oppfinnelsen. Ved anvendelse av en kommersiell konvektiv adsorpsjonsmodul (Mustang Q, Pall Corporation, 15 lags modul), har nær 100 på hverandre følgende adsorpsjons/desorpsjonscykluser blitt utført, hvorved en rekombinant FVIII-variant fra kontinuerlig perfusjonskultur har blitt oppkonsentrert og renset. Det gjennomsnittlige oppnådde utbyttet var tilnærmet 95%

(spredning i resultatene grunnet analysevariasjon), mens trykket forble relativt konstant over hele det utførte antall cykluser. Det kan følgelig angis at minst 100 på hverandre følgende cykluser kan utføres før adsorpsjonsoppsettet må utbyttes.

Som det har blitt vist i den detaljerte beskrivelse av fremgangsmåten for anvendelse av innretning B ifølge oppfinnelsen, er den totale gjennomsnittlige residenstid for produktet i den foreliggende utførelse mindre enn 3 timer før produktet elueres i konsentrert, renset og stabilisert form i en egnet buffer. Dette er signifikant kortere enn residenstiden på mer enn 24 timer i en konvensjonell satsvis isoleringsprosess utført en gang daglig, og fører følgelig til et signifikant høyere utbytte av de i seg selv labile proteinproduktene. I en foreliggende utførelse som er beskrevet tidligere utføres tilnærmet 13 cykluser pr. dag, noe som i forbindelse med fig. 15 betyr at det semi-kontinuerlige adsorpsjonsoppsett kun må utbyttes hver 7-8 dag, noe som kan gjøres uten å kompromittere steriliteten og kontinuerlig drift. Fig. 16 viser et eksempel på UV- og ledningsevneprofilen over en enkelt, typisk adsorpsjons/desorpsjons- og regenerasjonscyklus med innretning B. Det kan ses at mer enn 450 kolonnevolumer (CV) kan lades, mens produktet elueres i en svært skarp topp. Kontaminanter fjernes i signifikant grad i materialet som renner gjennom modulen under ladefasen, så vel som under vask og rensing (regenerasjonsfasen). Fig. 17 illustrerer renseyteevnen til prosessen ifølge oppfinnelsen som omfatter semi-kontinuerlig konvektiv adsorpsjon/desorpsjon. Et eksempel på en SDS-page-gel av et FVIII-variantisolat vises. Som man kan se, inneholder eluatfraksjonene, som inneholder 95% av den påsatte FVIII-variant (bestemt ved en separat aktivitetsanalyse) signifikant mindre protein enn det påsatte materialet og er følgelig renset. Ingen ekstra degrader-ingsbånd kan ses i eluatet (isolatet), noe som viser utmerket produktkvalitet.

I oppsummering kan innretning B ifølge oppfinnelsen oppnå en tilsvarende yteevne når det gjelder rensing som sammenlignbare satsvise prosesser, samtidig som tap av utbytte for proteinprodukter med iboende ustabilitet minimaliseres, og likeså spørsmål vedrørende produktkvaliteten, grunnet minimaliseringen av produktets residenstid. Samtidig reduseres arbeidskostnadene dramatisk, grunnet den iboende høye grad av automatisering i prosessen ifølge prosessen, som krever minimal innblanding fra operatørens side.