ES2634323T3 - Dispositivos y procedimientos para la fabricación continua integrada de moléculas biológicas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la purificación de una proteína de interés a partir de una mezcla de fluidos de cultivo tisular heterogénea, que comprende: (a) producir mediante un procedimiento de fermentación de perfusión continua una mezcla de fluidos de cultivo tisular heterogénea que contiene una proteína de interés; (b) transferir la mezcla de fluidos de cultivo tisular a un procedimiento de eliminación de partículas continuo integrado con el sistema de fermentación de perfusión continua; (c) eliminar los contaminantes particulados del fluido de cultivo tisular en el procedimiento de eliminación de partículas continuo para producir un fluido de cultivo tisular clarificado que contiene la proteína de interés; (d) transferir el fluido de cultivo tisular clarificado a un vaso de compensación integrado con el procedimiento de eliminación de partículas continuo; (e) transferir de forma intermitente el fluido de cultivo tisular clarificado a un procedimiento de purificación integrado con el vaso de compensación; y (f) purificar la proteína de interés a partir del fluido de cultivo tisular clarificado en el procedimiento de purificación para producir un aislado de producto estéril, sin partículas, concentrado y parcialmente purificado que contiene la proteína de interés; en el que el caudal específico de la mezcla a través del procedimiento de fermentación de perfusión continua y el procedimiento de eliminación de partículas continuo se mantiene sustancialmente constante.

Description

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DESCRIPCION

Dispositivos y procedimientos para la fabricacion continua integrada de moleculas biologicas Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un procedimiento y sistema mejorados para purificar una molecula de interes a partir de una mezcla heterogenea de moleculas. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a procedimientos para la purificacion de una protema de interes en una corriente de alimentacion de fluido de cultivo tisular a partir de un procedimiento de fermentacion de perfusion continua.

Antecedentes de la invencion

Es bien conocido por los expertos en el campo que en los ultimos anos se han establecido con gran exito comercial varios se han establecido varios procedimientos de cultivo celular continuo, tambien llamados procedimientos de perfusion continua. Sin embargo, el procedimiento de aislamiento tras la fermentacion de perfusion continua es generalmente un procedimiento discontinuo y esta, ffsica y logfsticamente, separado del procedimiento continuo aguas arriba. En estos procedimientos, el proposito principal de la etapa de aislamiento es capturar el producto desde grandes volumenes de sobrenadante de cultivo relativamente diluido. La concentracion del producto tiene que enfatizarse con respecto a la logfstica de procedimiento y los requisitos de espacio, mientras que la eliminacion simultanea de contaminantes (purificacion) es importante para minimizar el numero requerido de etapas de purificacion adicionales aguas abajo.

La figura 1 muestra un esquema de un ffpico procedimiento de aislamiento del estado de la tecnica de la fermentacion de perfusion continua, ya que es bien conocido por los expertos en la materia. El sistema de fermentacion de perfusion continua comprende un dispositivo de retencion celular (1), que mantiene la mayoffa de las celulas que producen el producto en el sistema de fermentacion. Una corriente de cosecha continua desde el sistema de perfusion continua, que contiene todavfa algunas celulas, restos y otras parffculas, se bombea mediante una bomba de cosecha (2) en grandes vasos de recogida (3), tales como depositos de acero inoxidable. Estos vasos de almacenamiento de cosecha por lo general tienen que enfriarse con el fin de mantener las perdidas de producto causadas por la degradacion dentro de unos valores factibles.

Una vez que se ha recogido un volumen especificado, que es ffpicamente despues de 1-4 dfas o mas, los vasos de recogida de la cosecha se desconectan del vaso de fermentacion esteril y el material recogido se designa como un lote de cosecha. La siguiente etapa es eliminar celulas, restos y parffculas (etapa 2). A escala industrial, esto se realiza normalmente usando centrifugacion (4), seguida de filtracion de membrana frontal (5), o mediante filtracion profunda frontal (6), seguido de filtracion de membrana frontal (7). Otra tecnica utilizada a veces es la microfiltracion de flujo tangencial (o "de flujo cruzado"). En cualquier caso, el producto del procedimiento de eliminacion de parffculas es un lote de fluido de cultivo tisular clarificado, o FCTc (8). Mas detalles sobre la separacion de parffculas para productos biotecnologicos se pueden encontrar en libros de texto estandar, tales como Biotechnology, Vol. 3, Bioprocessing, Wiley-VCH, 2a edicion (1996), ISBN: 3527283137.

En la siguiente etapa (etapa 3), el lote de fluido de cultivo tisular clarificado se procesa adicionalmente para concentrar y, si es posible, purificar el producto. Esto normalmente se realiza mediante ultrafiltracion de flujo cruzado o por cromatograffa de lecho relleno.

En el caso de la ultrafiltracion de flujo cruzado, el FCTc se bombea en el deposito de reciclado (9) del sistema. Se utiliza una bomba (10) para empujar el material a traves de un ultrafiltro de flujo cruzado. El producto queda retenido por la membrana y se recicla como material retenido al deposito de reciclaje, mientras que el agua y los contaminantes mas pequenos son empujados a traves de la membrana en el permeado (11) debido a la presion transmembrana generada por la disminucion de presion en el modulo de ultrafiltracion. En cada paso a traves del filtro, el FCTc, por lo tanto, se vuelve mas concentrado y el volumen de FCTc total se reduce hasta que se alcanza un factor de concentracion deseado. Una vez que se alcanza el factor de concentracion deseado, el procedimiento se detiene y el volumen de concentrado restante (aislado) se drena del sistema y se recoge. Mas detalles sobre la ultrafiltracion de flujo cruzado para la concentracion productos biotecnologicos se pueden encontrar en libros de texto estandar, tales como Biotechnology, Vol. 3, Bioprocessing, Wiley-VCH, 2a edicion (1996), ISBN: 3527283137.

En el caso de la cromatograffa de lecho relleno, el FCTc se bombea sobre una columna de cromatograffa (12) que contiene un lecho de resina compacta. El producto se une a la resina y luego se eluye de forma generalmente concentrada y purificada (aislado, 13) utilizando un tampon de elucion (14) adecuado, despues de lo cual se limpia la columna y se regenera usando tampones y soluciones de limpieza (14) adecuados.

Otras variantes de cromatograffa que se han propuesto para la concentracion/purificacion de FCTc son cromatograffa de lecho expandido y cromatograffa de membrana. La cromatograffa de lecho expandido puede procesar soluciones de que contienen parffculas. Sin embargo, aun se requiere la filtracion del aislado despues de la cromatograffa, aunque se reducen las zonas de filtracion. La cromatograffa de membrana utiliza pilas de membranas de microfiltracion modificadas en vez de lechos de resina compacta. La ventaja es que la transferencia de masa es, en gran parte, por conveccion en vez de por difusion, que permite una separacion mas rapida. Por lo demas, el

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procedimiento es tipicamente equivalente a la cromatograffa de lecho relleno estandar. Mas detalles sobre la cromatograffa para la concentracion y purificacion de productos biotecnologicos se pueden encontrar en libros de texto estandar, tales como Protein Purification, Principles, High-Resolution Methods, and Applications, Wiley-VCH, 2. Edition (1998), ISBN 0-471-18626-0.

A menudo, el grueso del aislado se congela a continuacion y se almacena para su uso posterior en otras etapas de purificacion aguas abajo.

Por tanto, como se ha descrito anteriormente, el procedimiento de aislamiento tras la fermentacion de perfusion continua es generalmente un procedimiento discontinuo y esta, ffsica y logfsticamente, separado del procedimiento continuo aguas arriba. Asimismo, mientras que la fermentacion ha de realizarse en esterilidad, el aislamiento (es decir, la eliminacion de partfculas y la concentracion/purificacion) se realiza esencialmente en condiciones de limpieza, pero no esteriles.

Los procedimientos del estado de la tecnica como los descritos anteriormente tienen una serie de problemas:

P1. Perdidas de rendimiento y potencial educcion de la calidad debido el elevado tiempo de residencia del producto. La cosecha de la fermentacion de perfusion continua tiene que recogerse y almacenarse durante penodos de tiempo significativos, como se ha describe anteriormente, antes de que se pueda procesar un lote de aislamiento. La cosecha recogida, aunque enfriada, todavfa proporciona un medio perjudicial para los productos proteicos complejos e inherentemente inestables. Por lo tanto, se producen perdidas significativas de productos, lo que reduce la capacidad de la planta y aumenta el coste de los productos. Por otra parte, la calidad del producto puede verse afectada negativamente.

P2. Se requieren instalaciones con cuartos fnos o vasos refrigerados grandes para el almacenamiento intermedio de grandes volumenes de cosecha, lo que conduce a elevados costes de capital y anulan la ventaja citada de compacidad y movilidad de los fermentadores de perfusion.

P3. Las tecnologfas de concentracion/purificacion convencionales (por ejemplo, ultrafiltracion, cromatograffa de lecho relleno) tienen un rendimiento volumetrico relativamente bajo, tiempos de respuesta significativos y son relativamente laboriosos. Como resultado, por lo general no se realizan mas de 1 procedimiento discontinuo al dfa.

P4. Por otra parte, los procedimientos y procedimientos de aislamiento actuales tienen dificultades logfsticas para tratar con los variables volumenes del procedimiento en plantas de fermentacion que implican mas de un fermentador. En las plantas de perfusion continua a gran escala, un numero variable de fermentadores son operativos.

P5. Ademas, los procedimientos de aislamiento del estado de la tecnica se efectuan en condiciones de limpieza, pero no pueden ser manejar en esterilidad. Esto a menudo conduce a un numero significativo de lotes rechazados debido a problemas con la carga microbiana.

P6. La utilizacion de materiales desechables, tales como filtros, ensamblajes, bolsas etc. desechables, aunque muy deseables en la produccion de productos parenterales humanos (por ejemplo, para evitar la limpieza y validacion de la limpieza y otros aspectos) es muy costosa y, de hecho, a menudo no es economico.

Por consiguiente, es un objeto de la presente invencion proporcionar un procedimiento de separacion de protemas integrado y continuo que es capaz de funcionar durante penodos prolongados de tiempo en condiciones de esterilidad.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a un nuevo aparato y procedimiento para purificar moleculas a partir de una mezcla de fluidos heterogenea. Mas particularmente, la invencion se refiere a un procedimiento para purificar una molecula de interes a partir de una mezcla de fluidos clarificada heterogenea de la que se han eliminado los contaminantes particulados. El procedimiento comprende la etapa de filtracion de una mezcla de fluidos clarificada heterogenea mediante ultrafiltracion continua a un caudal espedfico por debajo del punto de transicion de la molecula de interes en la region dependiente de la presion de la curva del flujo frente a la PTM, en la que el caudal espedfico se mantiene sustancialmente constante durante toda la ultrafiltracion continua.

En realizaciones particulares, el procedimiento de la invencion comprende filtrar la mezcla de fluidos clarificada a traves de una membrana de ultrafiltracion que tiene un area en metros cuadrados aproximadamente igual a entre 0,1 y 2 veces el caudal volumetrico de la mezcla de fluidos clarificada en litros/hora. En realizaciones particulares, el procedimiento de la invencion comprende filtrar la mezcla de fluidos clarificada a traves de una membrana de ultrafiltracion que tiene un area en metros cuadrados aproximadamente igual a entre 0,3 y 1 veces el caudal volumetrico de la mezcla de fluidos clarificada en litros/hora.

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El procedimiento de la invencion permite ventajosamente filtrar la mezcla clarificada a un caudal espedfico que produce una concentracion de la pared de menos de aproximadamente 20 %, menos de 15 % o menos del 10 % mayor que la concentracion de la fraccion retenida, sin polarizacion apreciable de la concentracion.

En una realizacion mas espedfica, la invencion se refiere a un procedimiento integrado, continuo y esteril para la fermentacion de perfusion continua, la eliminacion de partmulas y la purificacion/concentracion. En un aspecto de la invencion, el procedimiento comprende filtrar la mezcla de cultivo tisular mediante un procedimiento de separacion que separa selectivamente la protema de interes de la mezcla en un punto de ajuste operativo por debajo del punto de transicion de la protema en la region dependiente de la presion de la curva del flujo frente al PTM para producir un aislado de producto concentrado, sin partmulas y parcialmente purificado, en el que el caudal espedfico a traves del procedimiento de separacion se mantiene sustancialmente constante a un nivel menor que el punto de transicion de la protema.

En otro aspecto de la invencion, el procedimiento es un procedimiento continuo para la purificacion de una protema de interes a partir de una mezcla de fluido de cultivo tisular heterogenea, que comprende:

(a) producir mediante un procedimiento de fermentacion de perfusion continua una mezcla de fluidos de cultivo tisular heterogenea que contiene una protema de interes;

(b) transferir la mezcla de fluidos de cultivo tisular a un procedimiento de eliminacion de partmulas continuo integrado con el procedimiento de fermentacion de perfusion continua;

(c) eliminar los contaminantes particulados del fluido de cultivo tisular en el procedimiento de eliminacion de partmulas continuo para producir un fluido de cultivo tisular clarificado que contiene la protema de interes;

(d) transferir el fluido de cultivo tisular clarificado a un procedimiento de purificacion continuo integrado con el procedimiento de eliminacion de partmulas continuo; y

(e) purificar la protema de interes a partir del fluido de cultivo tisular clarificado en el procedimiento de purificacion continuo;

en el que el caudal espedfico de la mezcla a traves del procedimiento de fermentacion de perfusion continua, el procedimiento de eliminacion de partmulas continuo y el procedimiento de purificacion continuo se mantiene sustancialmente constante.

En aun otro aspecto de la invencion, el procedimiento es un procedimiento semicontinuo para la purificacion de una protema de interes a partir de una mezcla de fluido de cultivo tisular heterogenea, que comprende:

(a) producir mediante un procedimiento de perfusion de fermentacion continua una mezcla de fluidos de cultivo tisular heterogenea que contiene una protema de interes;

(b) transferir la mezcla de fluidos de cultivo tisular a un procedimiento de eliminacion de partmulas continuo integrado con el sistema de fermentacion de perfusion continua;

(c) eliminar los contaminantes particulados del fluido de cultivo tisular en el procedimiento de eliminacion de partmulas continuo para producir un fluido de cultivo tisular clarificado que contiene la protema de interes;

(d) transferir el fluido de cultivo tisular clarificado a un vaso de compensacion integrado con el procedimiento de eliminacion de partmulas continuo;

(e) transferir de forma intermitente el fluido de cultivo tisular clarificado a un procedimiento de purificacion integrado con el vaso de compensacion; y

(f) purificar la protema de interes a partir del fluido de cultivo tisular clarificado en el procedimiento de purificacion para producir un aislado de producto sin partmulas, concentrado, parcialmente purificado y esteril que contiene la protema de interes;

en el que el caudal espedfico de la mezcla a traves del procedimiento de fermentacion de perfusion continua y el procedimiento de eliminacion de partmulas continuo se mantiene sustancialmente constante.

La presente invencion tambien se refiere a un aparato para separar una protema de interes a partir de una mezcla de fluido de cultivo tisular heterogenea. En un aspecto de la invencion, el aparato comprende: (a) a un sistema de fermentacion de perfusion continua; (b) un sistema de eliminacion de partmulas continuo integrado con el sistema de fermentacion de perfusion; y (c) un sistema de purificacion continuo integrado con el sistema de eliminacion de partmulas, en el que el aparato esta adaptado para mantener las condiciones esteriles.

En otro aspecto de la invencion, el aparato comprende: (a) a un sistema de fermentacion de perfusion continua; (b) un sistema de eliminacion de partmulas continuo integrado con el sistema de fermentacion de perfusion; y (c) un sistema de purificacion intermitente integrado con el sistema de eliminacion de partmulas, en el que el aparato esta adaptado para mantener las condiciones esteriles.

El sistema de purificacion puede ser, por ejemplo, un sistema de ultrafiltracion o un sistema de adsorcion/desorcion por conveccion o cualquier otro sistema capaz de purificar o purificar parcialmente una protema de interes a partir de una mezcla heterogenea en un sistema integrado, continuo o semicontinuo, esteril, como se describe en el presente documento.

El procedimiento y aparato de la invencion estan adaptados para permitir el procesamiento continuo de una mezcla de fluidos heterogenea, tal como un fluido de cultivo celular, a un caudal sustancialmente constante. En un aspecto

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particular de la invencion, el procedimiento y aparato de la invencion estan adaptados para permitir el procesamiento continuo de una mezcla heterogenea de fluidos de cultivo celular o tisular a un caudal sustancialmente constante por debajo del punto de transicion de la protema en la region dependiente de la presion de la curva del flujo frente al PTM durante un penodo continuo y durante todo el procedimiento de purificacion.

Estos y otros aspectos de la invencion se describen con detalle a continuacion en la siguiente descripcion detallada de la invencion.

Breve descripcion de los dibujos

Los dibujos adjuntos ilustran realizaciones de la invencion y, junto con la descripcion detallada de la realizacion, sirven para explicar los principios de la invencion y sus beneficios.

FIG. 1: esquema de un procedimiento de perfusion continua convencional seguido de 3 etapas del procedimiento de aislamiento segregadas ffsica y logfsticamente (recoleccion de la cosecha por lotes, eliminacion de partmulas discontinua y concentracion/purificacion discontinua).

FIG. 2: Representacion esquematica de 2 realizaciones del dispositivo A de invencion para la fabricacion continua, integrada y esteril. Esquema de la realizacion de A1 mostrada en el lado izquierdo y esquema de la realizacion A2 mostrado en el lado derecho.

FIG. 3: Representacion esquematica de 2 realizaciones del dispositivo B de invencion para la fabricacion continua, integrada y esteril. Esquema de la realizacion de B1 mostrada en el lado izquierdo y esquema de la realizacion B2 mostrado en el lado derecho.

FIG. 4: Esquema de una realizacion del sistema de eliminacion de partmulas continuo e integrado (100) de la invencion, un elemento del dispositivo A de la invencion y del dispositivo B de la invencion.

FIG. 5: representaciones esquematicas de realizaciones adicionales de dispositivo A de la invencion que combinan multiples elementos para aumentar la capacidad global de la planta (A3) o el rendimiento de concentracion y separacion (A4).

FIG. 6: representaciones esquematicas de realizaciones adicionales de dispositivo B de la invencion.

FIG. 7: realizacion adicional de dispositivos de la invencion que combina los elementos del dispositivo A y del dispositivo B en serie para aumentar el rendimiento global de la concentracion y la separacion.

FIG. 8: ejemplo comparativo de las capacidades de carga total por 10" de capsula de filtro para el procedimiento por lotes convencional y el dispositivo de la realizacion de la invencion para la eliminacion continua de partmulas (procedimiento de filtracion continuo integrado) utilizando capsulas de filtro comerciales identicas. Se muestra un procedimiento de ejemplo de produccion del Factor VIII de la coagulacion sangumea.

FIG 9: Ejemplo de curva de presion-flujo (flujo del permeado espedfico en LMH= litros/hora/m2 sobre la presion transmembrana) y determinacion del punto de operacion. El drculo muestra el punto de operacion tfpica que se ajustara a traves de la PTM para procedimientos discontinuos convencionales. El rectangulo muestra la region de funcionamiento preferida que se ajustara a traves de la bomba de perneado segun el procedimiento de uso del dispositivo A de la invencion.

FIG. 10: Ejemplo de distribucion del tiempo de residencia y el tiempo de residencia medio del sistema de UF continua integrado (300) segun el procedimiento de uso del dispositivo A de la invencion. Medido para el sistema continuo desechable con el modulo de 290 cm2 (62,5 cm de longitud), 120 LMH de flujo cruzado, 0,2 LMH de flujo de la fraccion retenida, 2 LMH de lujo del perneado.

FIG. 11: Ejemplo de aislamiento del rFVIII a partir de fermentacion de perfusion continua libre de protemas plasmaticas usando una realizacion del dispositivo A de la invencion. Comparacion del rendimiento de aislamiento promedio del procedimiento continuo de la invencion en comparacion con el rendimiento promedio del aislamiento discontinuo, incluida una desviacion estandar. Se usaron 3 lotes consecutivos para determinar el rendimiento del lote, mientras que se usaron 3 puntos consecutivos (dfas) para el procedimiento continuo.

FIG. 12: Ejemplos del rendimiento del dispositivo A de la invencion. Presion transmembrana y flujo espedfico del sistema de ultrafiltracion continuo integrado (300) como una funcion del tiempo de procedimiento continuo para 3 ejemplos diferentes mostrados. Triangulos = membrana de 100 kDa, factor VIII de coagulacion sangumea recombinante (rFVIII); cuadrados = membrana de 10 kDa, interleucina-2 recombinante; drculos = membrana de 50 kDa, glicoprotema de ingeniena genetica (Mr> 100 kDa). Todos los ejemplos mostrados son de fermentacion de perfusion continua libre de protemas plasmaticas.

FIG. 13: Ejemplo de rendimiento a largo plazo del dispositivo A de la invencion acoplado directamente a la fermentacion de perfusion continua de la lmea celular que coexpresa 2 productos proteicos (protema fluorescente verde GFP e IL-2SA). Presion transmembrana y flujo espedfico del sistema de ultrafiltracion (300) continuo de la invencion como una funcion del tiempo de procedimiento continuo mostrado. Se uso una membrana de 10 kDa.

FIG. 14: Ejemplo de rendimiento a largo plazo del dispositivo A de la invencion acoplado directamente a la fermentacion de perfusion continua de la lmea celular que coexpresa 2 productos proteicos (protema fluorescente verde GFP e IL-2SA). Se uso una membrana de 10 kDa. Factor de concentracion de ambos productos proteicos, como se determina mediante ensayos espedficos y factor de concentracion volumetrica se muestran como una funcion del tiempo de procedimiento continuo.

FIG. 15: Ejemplo del desempeno del dispositivo B de la invencio. Rendimiento y descenso de la presion en cerca de 100 ciclos de adsorcion/desorcion consecutivos con adsorbente de conveccion (protema diana: variante del factor FVIII de la coagulacion sangumea modificado geneticamente; adsorbente de conveccion: adsorbente

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comercial, Mustang Q, Pall Corporation).

FIG. 16: Ejemplo de desempeno del dispositivo B de la invencion. Perfil UV y de conductividad durante un ciclo de adsorcion/desorcion tipico con adsorbente de conveccion (protema diana: variante del factor FVIII de la coagulacion sangumea modificado geneticamente; adsorbente de conveccion: adsorbente comercial, Mustang Q, Pall Corporation).

FIG. 17: Ejemplo de desempeno del dispositivo B de la invencion. Gel de SDS-PAGE (tenido con plata) de la carga= cosecha clarificada que sale de forma continua del sistema de eliminacion de partmulas (100) y cargado de forma semicontinua sobre el sistema adsorbente conectivo (400) y eluato de adsorcion/desorcion tipico mostrados. Protema diana: variante del factor FVIII de la coagulacion sangumea modificado geneticamente; adsorbente de conveccion: adsorbente comercial, Mustang Q, Pall Corporation). El eluato se diluyo de nuevo a la concentracion de carga antes de la carrera en el gel.

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones

Excepto como se define expresamente en el presente documento, la terminologfa utilizada en esta aplicacion es estandar en la tecnica. Las siguientes definiciones de ciertos terminos se proporcionan en el presente documento para asegurar la claridad y capacidad de definicion al significado de las reivindicaciones.

Las unidades, prefijos y sfmbolos pueden indicarse en su forma aceptada del SI. Los intervalos numericos citados en el presente documento incluyen los numeros que definen el intervalo e incluyen y apoyan cada numero entero dentro del intervalo definido. A menos que se indique lo contrario, los terminos "un/uno" o "una" se han de interpretar en el sentido de "al menos uno de". Los tttulos de las secciones usadas en el presente documento son solo para propositos de organizacion y no deben interpretarse como una limitacion del objeto descrito.

El termino "clarificacion" y "clarificado" significa la eliminacion de materia particulada a partir de una solucion para que la solucion restante pase a traves de una membrana de 0,2 pm.

La expresion "fermentacion de perfusion continua" se refiere a un sistema de fermentacion en estado estacionario o procedimiento que funciona sin interrupcion y en el que las celulas o los microorganismos se mantienen en cultivo en fase de crecimiento exponencial mediante la adicion continua de medio fresco que se equilibra mediante la eliminacion de la suspension de celulas del biorreactor.

Los terminos "cultivar", "cultivo", "crecimiento", "mantenef', "soportar" y "expandir" son sinonimos en el sentido de que las celulas permanecen viables y capaces de producir progenie.

El termino "concentracion", en su forma de verbo, significa la eliminacion de agua de una solucion de forma que la cantidad de una molecula de interes por volumen de solucion restante aumenta.

El termino "polarizacion de la concentracion" significa la acumulacion de moleculas retenidas (capa de gel) en la superficie de la membrana causada por una combinacion de factores: la presion transmembrana, la velocidad del flujo cruzado, la viscosidad de la muestra y la concentracion de soluto.

El termino "continuo" significa secuencia y/o funcionamiento ininterrumpido en el tiempo durante penodos prolongados de tiempo. Tal como se utiliza en referencia a los procedimientos de fermentacion, clarificacion y filtracion de la presente invencion, "continuo" significa que los procedimientos estan integrados ffsicamente y logfsticamente a fin de permitir el funcionamiento sin interrupcion durante un penodo prolongado de tiempo suficiente para producir un aislado de producto esteril, libre de partmulas, concentrado y parcialmente purificado que contiene la protema de interes. El termino continuo, tal como se utiliza en referencia a los procedimientos de la invencion, tambien se entiende que significa que un procedimiento no se realiza de una manera discontinua o de una manera verdaderamente continua. Los procedimientos de la presente invencion son capaces de un funcionamiento continuo, por ejemplo, durante penodos prolongados que van desde 1 dfa a varios meses sin interrumpir la operacion o secuencia de los procedimientos. Tal como se utiliza en la presente invencion, los procedimientos se ejecutan durante un penodo continuo mayor de 2, 3, 4, 5, 6, o 7 dfas, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas, o 3, 4, 5, 6 o mas meses.

Los terminos "semicontinuo" e "intermitente" significan que uno o mas procedimientos o elementos de un sistema integrado funcionan de una manera discontinua o por lotes, mientras que otros procedimientos o elementos del sistema integrado funcionan de una manera continua. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la invencion, el procedimiento de purificacion es un/procedimiento de adsorcion/desorcion por conveccion, que normalmente requiere la adsorcion de la mezcla heterogenea de un sustrato de adsorcion, que, en ultima instancia, produce la saturacion del sustrato, y que requiere la terminacion del procedimiento de adsorcion y desorcion o la liberacion de la fraccion unida. Tal procedimiento es inherentemente intermitente, aunque capaz de integrarse con los procedimientos aguas arriba que son continuos.

El termino "adsorcion/desorcion por conveccion" significa un procedimiento cromatografico en el que la transferencia de masa se produce principalmente por conveccion. Adsorcion/desorcion por conveccion es un

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procedimiento en el que una fraccion de una mezcla que contiene una molecula de interes se separa de otra fraccion de la mezcla por medio de la adsorcion de una fraccion a un sustrato seguido de la desorcion de la fraccion del sustrato.

El termino "flujo cruzado" o "flujo cruzado del fluido" significa el flujo del fluido a traves de la parte superior de la superficie de la membrana.

El termino "integrado", como se usa en referencia a varios sistemas y/o procedimientos, significa que los sistemas y/o procedimientos estan conectados ffsica y log^sticamente a fin de constituir un sistema unificado capaz de funcionar de forma continua. En el contexto del sistema de la presente invencion, que se refiere a un sistema continuo o semicontinuo integrado para producir una protema de interes libre de partmulas concentrado y purificada parcialmente, un sistema integrado conectara diferentes componentes directamente y de una manera suficiente para mantener condiciones de esterilidad entre los diferentes componentes del sistema.

Los terminos "medios" (plural) y "medio" (singular) son sinonimos y se usan indistintamente en el presente documento, y el uso de una forma del termino no implica la exclusion de la otra forma.

El termino "mezcla" se refiere a una combinacion heterogenea de moleculas y compuestos que contienen una molecula de interes, tal como una protema, y diversos contaminantes. Una mezcla preferida de la presente invencion es un fluido de cultivo tisular compuesto por una mezcla heterogenea de protemas que incluye una protema exogena de interes, que se obtiene inicialmente a partir de un procedimiento de fermentacion de perfusion continua.

El termino "capa de gel" significa la capa microscopicamente fina de moleculas que se puede formar en la parte superior de una membrana. Puede afectar a la retencion de las moleculas por obstruccion de la superficie de la membrana y reducir asf el flujo del filtrado, o, en operacion de flujo constante, aumentar la PTM.

El termino "molecula de interes" significa partmulas u otras especies de molecula que se han de separar de una solucion o suspension en un fluido (por ejemplo, un lfquido). Las partmulas o moleculas de interes se separan del fluido y, en la mayona de los casos, de otras partmulas o moleculas en el fluido. El tamano de la molecula de interes que se ha de separar determinara el tamano de poro de la membrana que se ha de usar. Preferiblemente, las moleculas de interes son de origen biologico o bioqmmico o producidas mediante procedimientos transgenicos o in vitro e incluyen protemas, peptidos, polipeptidos, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. Ejemplos de ongenes de corriente de alimentacion preferentes incluyen el cultivo de celulas de mairnfero y el cultivo de celulas de microorganismos, tales como bacterias, hongos y levaduras. Tambien hay que senalar que las especies que se van a filtrar incluyen polipeptidos, protemas, componentes celulares, ADN, coloides, micoplasma, endotoxinas, virus, carbohidratos y otras moleculas de interes biologico, glicosiladas o no, no deseados.

El termino "permeado" se usa como sinonimo de filtrado.

El termino "aislado de producto" significa un producto libre de partmulas, concentrada y parcialmente purificado que contiene una protema de interes. Un aislado de producto es un producto que ha alcanzado un grado de purificacion y concentracion comparable al conseguido mediante una ultrafiltracion o procedimiento de adsorcion/desorcion por conveccion. Un aislado de producto no es necesariamente homogeneo, pero se purificara sustancialmente en relacion con el grueso del producto inicial producido mediante el procedimiento de fermentacion.

El termino "caudal espedfico" se usa indistintamente con la expresion "flujo filtrado" en lo que se refiere al filtrado. El caudal de la fraccion retenida espedfico es el caudal de la fraccion retenida normalizada en el area de la membrana utilizada.

Tal como se utiliza en referencia al flujo, el termino "sustancialmente constante" significa que el flujo se mantiene a un nivel generalmente constante durante un penodo sustancial durante el curso de la filtracion.

El termino "fluido de cultivo tisular" significa una mezcla heterogenea de componentes derivados de un medio de cultivo tisular. En aspectos preferidos de la invencion, el fluido de cultivo tisular deriva de un procedimiento de fermentacion de perfusion continua. Un fluido de cultivo tisular "clarificado" es un fluido de cultivo tisular que ha sido prefiltrado para eliminar los desechos celulares y otras macromoleculas grandes.

El termino "presion transmembrana" y sus siglas "PTM" significan la presion promedio aplicada desde la alimentacion al lado filtrado de la membrana. La PTM se calcula mediante PTM [bar] = [(PF + PR)/2] - Pf, en la que PF es la presion de alimentacion, PR es la presion de la fraccion retenida y Pf es la presion del filtrado.

El termino "recuperacion" significa la cantidad de una molecula de interes que puede recuperarse despues de procesar. Por lo general, expresada como un porcentaje de material de partida o del rendimiento.

El termino "fraccion retenida" significa la porcion de la muestra que no pasa a traves de la membrana, tambien conocida como el concentrado.

El termino "ultrafiltracion" significa una forma de filtracion que utiliza membranas microporosas o semipermeables para separar, preferentemente, fluidos o iones sobre la base del tamano o el peso molecular diferencial. La

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ultrafiltracion se utiliza normalmente para filtrar moleculas que tienen un peso molecular mayor que aproximadamente 10.000 dalton.

La presente invencion se refiere a un procedimiento integrado, continuo y esteril que comprende la fermentacion de perfusion continua, la eliminacion de partmulas y la purificacion/concentracion. En un aspecto de la invencion, el procedimiento comprende filtrar la mezcla de cultivo tisular mediante un procedimiento de separacion que separa selectivamente la protema de interes de la mezcla en un punto de ajuste operativo por debajo del punto de transicion de la protema en la region dependiente de la presion de la curva del flujo frente al PTM para producir un aislado de producto concentrado, sin partmulas y parcialmente purificado, en el que el caudal espedfico a traves del procedimiento de separacion se mantiene sustancialmente constante a un nivel menor que el punto de transicion de la protema.

En otro aspecto de la invencion, el procedimiento es un procedimiento continuo que comprende: (a) producir de forma continua mediante fermentacion de perfusion continua una mezcla de fluidos de cultivo tisular heterogenea que contiene una protema de interes; (b) transferir de forma continua la mezcla de fluido de cultivo tisular a un procedimiento de eliminacion de partmulas integrado con el sistema de fermentacion de perfusion continua; (c) eliminar de forma continua contaminantes particulados del fluido de cultivo tisular en el procedimiento de eliminacion de partmulas para producir continuamente un fluido de cultivo tisular clarificado que contiene la protema de interes; (d) transferir de forma continua el fluido de cultivo tisular clarificado a un procedimiento de purificacion integrado con el sistema de eliminacion de partmulas; y (e) separar de forma continua la protema de interes a partir del fluido de cultivo tisular clarificado en el sistema de purificacion para producir de forma continua un aislado de producto esteril libre de partmulas, concentrado y parcialmente purificado que contiene la protema de interes.

En aun otro aspecto de la invencion, el procedimiento es un procedimiento semicontinuo que comprende: (a) producir de forma continua mediante fermentacion de perfusion continua una mezcla de fluidos de cultivo tisular heterogenea que contiene una protema de interes; (b) transferir de forma continua la mezcla de fluido de cultivo tisular a un procedimiento de eliminacion de partmulas integrado con el sistema de fermentacion de perfusion continua; (c) retirar de forma continua los contaminantes particulados del fluido de cultivo tisular en el procedimiento de eliminacion de partmulas para producir de forma continua un fluido de cultivo tisular clarificado que contiene la protema de interes; (d) transferir de forma continua el fluido de cultivo tisular clarificado a un vaso de compensacion integrado con el procedimiento de eliminacion de partmulas; (e) transferir de forma intermitente el fluido de cultivo tisular clarificado a un procedimiento de purificacion integrado con el vaso de compensacion; y (e) separar la protema de interes del fluido de cultivo tisular clarificado en el sistema de purificacion para producir un aislado de producto esteril libre de partmulas, concentrado y parcialmente purificado que contiene la protema de interes, en el que el caudal espedfico de la mezcla a traves del procedimiento de fermentacion continua y el procedimiento de eliminacion de partmulas continuo se mantiene sustancialmente constante y, de promedio, es igual al rendimiento promediado en el tiempo del procedimiento de purificacion semicontinuo integrado.

Dispositivos para poner en practica los procedimientos de la invencion

La presente invencion tambien se refiere a un aparato para separar una protema de interes a partir de una mezcla de fluido de cultivo tisular heterogenea. En general, el aparato comprende: (a) un sistema de fermentacion de perfusion continua; (b) un sistema de eliminacion de partmulas continuo integrado con el sistema de fermentacion de perfusion; y (c) un sistema de purificacion continuo integrado con el sistema de eliminacion de partmulas, en el que el aparato esta adaptado para mantener las condiciones esteriles. En otro aspecto de la invencion, el aparato comprende: (a) a un sistema de fermentacion de perfusion continua; (b) un sistema de eliminacion de partmulas continuo integrado con el sistema de fermentacion de perfusion; y (c) un sistema de purificacion intermitente integrado con el sistema de eliminacion de partmulas, en el que el aparato esta adaptado para mantener las condiciones esteriles. El sistema de purificacion puede ser, por ejemplo, un sistema de ultrafiltracion o un sistema de adsorcion/desorcion por conveccion o cualquier otro sistema capaz de purificar o purificar parcialmente una protema de interes a partir de una mezcla heterogenea en un sistema integrado, continuo o semicontinuo, esteril, como se describe en el presente documento.

El procedimiento y aparato de la invencion estan adaptados para permitir el procesamiento continuo de una mezcla de fluidos de cultivo tisular heterogenea, a un caudal sustancialmente constante. En un aspecto particular de la invencion, el procedimiento y aparato de la invencion estan adaptados para permitir el procesamiento continuo de una mezcla heterogenea de fluidos de cultivo tisular a un caudal sustancialmente constante por debajo del punto de transicion de la protema en la region dependiente de la presion de la curva del flujo frente al PTM durante un penodo continuo y durante todo el procedimiento de purificacion.

En realizaciones espedficas, la invencion proporciona dos nuevos dispositivos (A, B) que estan cada uno compuesto por 3 elementos distintos pero totalmente integrados, todos los cuales tienen un papel esencial y en conjunto forman una plataforma de sistema de aislamiento de protemas continuo eficiente de forma unica que resuelve los problemas con la tecnica anterior descrita anteriormente.

Los tres elementos distintos de cada dispositivo son, en primer lugar, un sistema de eliminacion de partmulas continuo integrado (100), en segundo lugar, un vaso de compensacion (200) esteril y, en tercer lugar, un sistema de

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concentracion/purificacion integrado (300 400, respectivamente). Los tres elementos y, de este modo, los nuevos dispositivos y procedimientos desarrollados de uso de estos dispositivos se describen con detalle a continuacion.

Para proporcionar una concentracion/purificacion continua o semicontinua integradas del producto proteico, el dispositivo A de la invencion (del que se muestran dos realizaciones en la Figura 2) comprende un sistema de ultrafiltracion integrado continuo y esteril (300), mientras que el dispositivo B de la invencion (del que se muestran 2 realizaciones en la Figura 3) comprende un sistema integrado de adsorcion/desorcion por conveccion semicontinuo (400).

Los dispositivos de la invencion estan integrados directamente con uno o mas fermentador(es) de perfusion continua y, por tanto, forman una nueva plataforma de fabricacion continua integrada.

DISPOSITIVO A

Sistema de eliminacion de particulas continuo integrado (100)

La figura 2 muestra 2 realizaciones de dispositivo A de la invencion. El sistema de eliminacion de particulas continuo integrado (100) esta conectado directamente al lado de la cosecha del sistema de fermentacion de perfusion continua (1).

La figura 4 muestra una representacion esquematica mas detallada de una realizacion del sistema de eliminacion de particulas integrado continuo de la invencion (100), que consiste en una bomba (101), un manometro o transmisor, respectivamente (107), un colector de conexion (102) y un conjunto de varios trenes de filtro (103). Todos los componentes estan conectados con un tubo flexible y/o tubos ngidos.

La bomba (101) es una bomba peristaltica convencional, que permite el bombeo suave de la cosecha de cultivo celular sin ninguna parte o sello rotativo en contacto el producto esteril. La bomba los tubos de la bomba estan dimensionados para liberar el caudal de la cosecha deseado del sistema de fermentacion de cultivo celular, que es de hasta 15 volumenes de biorreactor por dfa, por ejemplo hasta 9,4 litros/hora para un fermentador de 15 litros y hasta 125 litros/hora para un fermentador de 200 litros.

El manometro o trasmisor de presion (107) esta disenado de tal manera que se puede esterilizar en autoclave o por irradiacion. En el diseno actual, se utiliza un transmisor piezorresitivo reutilizable en una carcasa de acero inoxidable o un manometro de acero inoxidable reutilizable. Sin embargo, las futuras mejoras pueden incluir el uso de trasmisores desechables que pueden ser facilmente esterilizados mediante irradiacion.

En la presente realizacion, el colector de conexion (102) consiste en tubos flexibles, con pinzas (o valvulas) y conectores esteriles adecuados para permitir la conexion de los conjuntos de tren de filtro adicionales sin comprometer la esterilidad del sistema. Preferiblemente, los diametros de los tubos estan dimensionados para producir velocidades de fluido lineales de aproximadamente 2 m/s o menos a los caudales deseados, evitando de este modo altas contrapresiones y cizallamiento. En otra realizacion presente, en lugar de los conectores esteriles se utilizan piezas especiales de tubos flexibles que se pueden soldar con soldadores de tubos comerciales sin comprometer la esterilidad. Tales piezas de tubos estan hechos de PVC u otros polfmeros adecuados.

El conjunto de tren de filtro (103) consiste en al menos dos, preferiblemente multiples trenes de filtro identicos (como se muestra en el esquema), con solo uno de los trenes de filtro abierto en cualquier momento dado, como se muestra como ejemplo en la figura 4 (105).

Cada tren de filtro consiste en al menos un filtro, preferiblemente un prefiltro y un ultimo filtro en serie (como se muestra en la Figura 4). Si es necesario aumentar la capacidad para una aplicacion espedfica, cada tren de filtro (105, 106 etc.) en sf tambien puede consistir en multiples filtros o trenes de filtro en paralelo (no mostrado).

En una realizacion de la invencion mostrada en la Figura 4, el segundo tren de filtro del conjunto (106) esta cerrado mediante un disco de rotura sensible a la presion, o pasador de rotura, respectivamente (104). En funcionamiento, la funcion del disco de ruptura, o pasador de ruptura, es abrir automaticamente la trayectoria de flujo para el tren segundo filtro (107) una vez que la presion en el tren primer filtro (105) alcanza un lfmite especificado, asegurando de esta manera ininterrumpida continuacion del procedimiento de filtracion. Los discos de rotura, o pasadores de rotura, disponibles comercialmente se utilizan en el sistema de la invencion, que, de otro modo, se usan para proporcionar alivio de presion de seguridad. En una realizacion presente, se utilizan discos de rotura pasadores de rotura con lfmite de presion de rotura especificado de no mas de 16 PSI, que se ha demostrado que son muy utiles. Sin embargo, es posible un intervalo del lfmite de presion especificado.

Cada tren filtro adicional del conjunto de tren de filtro tambien esta separado por una valvula manual o automatica y otro disco de rotura o pasador de rotura. Una vez que el segundo tren de filtro (106) esta en funcionamiento, la valvula al siguiente disco de rotura o pasador de rotura, respectivamente, se abre, de manera que el proximo tren filtro puede actuar como una copia de seguridad y asf sucesivamente.

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En una realizacion alternativa, se usan exclusivamente valvulas accionadas automaticamente, y en funcionamiento, un sistema de control acciona las valvulas en base a la entrada de un sensor de presion piezorresitivo (107), que tambien se puede esterilizar en autoclave. Sin embargo, los solicitantes descubrieron que el presente diseno que comprende el disco de rotura o pasador de rotura, respectivamente, proporciona una robustez excepcional en el funcionamiento a largo plazo.

La clasificacion del filtro final es de al menos 3 pm o menor, preferiblemente 0,45 pm y aun preferiblemente 0,2 pm. Por tanto, el tren de filtro de funcionamiento (6) conserva todas las celulas restantes, as^ como restos celulares relevantes y otras partfculas, que dan como resultado una corriente de salida libre de partmulas (9), el fluido de cultivo tisular clarificado (FCTc).

Se pueden usar diferentes materiales de filtro disponibles en el mercado. En el diseno actual, se utilizan capsulas de filtro desechables, tales como capsulas prefiltro Sartopure o Sartoclear (Sartorius, Goettingen) y capsulas de filtro finales Sartobran (Sartorius, Goettingen), que pueden esterilizarse mediante autoclave o por irradiacion.

Como ejemplo de una presente realizacion del dispositivo de la invencion, disenado para un caudal de 1 litro/min, cada tren de filtro (105, 106 etc.) del conjunto (103) consiste en 3 capsulas prefiltro 30" (Kleenpak Ultipleat, Pall Corp., clasificadas de 4,5 um, 0,75 m2 cada una) seguido de 3 capsulas de filtro finales de 20" (Sartobran P, Sartorius, clasificadas de 0,45 um/0,2 um, 1.3 m2 cada una). Se ha descubierto que esta realizacion particular es util para la fabricacion a gran escala de factor de coagulacion sangumea VIII recombinante, asf como variantes del FVIII modificado geneticamente, incluyendo el FVIII con el dominio B delecionado.

Sin embargo, los solicitantes han descubierto que cuando se utiliza el dispositivo y el procedimiento de la invencion, la eficiencia de eliminacion de partfculas con diversos materiales de filtro disponibles y configuraciones de diferentes fabricantes (Pall, Sartorius, Cuno) mejora de forma consistente y significativa en comparacion con los respectivos procedimientos discontinuos convencionales.

Por lo tanto, los nuevos dispositivo y procedimiento de la invencion tambien seran beneficiosos para su uso con nuevos tipos de filtros y geometnas, por ejemplo con tipos de filtro que aumentan el area de filtro disponible por capsula, asf como, con tipos de filtro que proporcionan un patron de flujo cruzado u otros medios para reducir al mmimo la acumulacion de torta, tales como la vibracion o la rotacion del elemento de filtro.

En otra realizacion del procedimiento del invento, el conjunto de tren de filtro (103) comprende solo un tren de filtro de seguridad esteril cerrado por un disco de rotura o pasador de rotura, respectivamente, pero aun multiples trenes de filtro para el funcionamiento. El primer tren de filtro del conjunto se hace funcionar hasta que se ha procesado un volumen de carga espedfico predeterminado, despues de lo cual se cambia la operacion (a manual o automatica) al proximo tren de filtro en el conjunto. El volumen de carga espedfico se especifica de manera que en condiciones de funcionamiento normales no se supere el lfmite de presion del disco de rotura o pasador rotura. Sin embargo, si la presion aumenta mas de lo normal durante la filtracion, por ejemplo debido a una inusualmente baja filtrabilidad de la cosecha, el tren filtro de seguridad asegura de nuevo la filtracion continua ininterrumpida mediante la abertura de una vez se excede la presion especificada. Despues de una abertura del tren de filtro de seguridad, la filtracion se cambia a otro tren de filtro del conjunto y se instala otro tren de filtracion de seguridad con disco de rotura o pasador de rotura sin comprometer la esterilidad del sistema.

Es bien conocido para los expertos en el campo que para mantener al mmimo los costes del filtro y los tiempos de procesamiento para los procedimientos de eliminacion de partmulas discontinuos, los trenes de filtro discontinuos tienen que dimensionarse de modo que tengan el area del filtro mas baja posible requerida para proporcionar el caudal absoluto deseado (en litros/hora) y la presion maxima. El caudal absoluto deseado, a su vez, tiene que ser lo suficientemente alto como para proporcionar tiempos de procesamiento factibles para el volumen del lote deseado. Esto requiere inherentemente un caudal espedfico alto (en litros/hora/m2 del area de filtro).

En contraste con un sistema de filtracion por lotes optimizado comparable, el dispositivo de la invencion esta disenado para un caudal espedfico varias veces menor, que se mantiene constante (en litros/hora/m2 de area de filtro instalado), de modo que el caudal absoluto es igual al caudal de cosecha de la fermentacion de perfusion continua.

Los solicitantes descubrieron inesperadamente que a tales caudales espedficos bajos, el volumen que puede procesarse a traves de un filtro es desproporcionadamente mas alto que a los caudales ajustadas en procedimientos discontinuos.

Es importante senalar que en los procedimientos de aislamiento discontinuos convencionales, dichos caudales espedficos bajos no senan factibles debido a areas de filtracion extremas (y, por tanto, costes) o un caudal absoluto demasiado bajo. Esto es principalmente porque la mayor parte del tiempo, el equipo de eliminacion de partmulas discontinuo se encuentra inactivo, mientras que se esta recogiendo la cosecha para el siguiente lote. Por otra parte, el aumento desproporcionado sorprendente en la capacidad del filtro que puede alcanzar el procedimiento de la invencion permite una reduccion significativa del consumo de filtro y, por tanto, de los costes de fabricacion.

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Vaso de compensacion (200)

La salida del sistema de eliminacion de partfculas continuo integrado esta directa y constantemente conectado a un vaso compensacion (201), como se muestra en la figura 2. Este vaso de compensacion es un vaso esteril, tal como, una bolsa desechable o un vaso de acero inoxidable con al menos un puerto de entrada y un puerto de salida, estando el ultimo, preferiblemente, en la parte inferior del vaso. Se puede usar una amplia gama de tamanos y disenos de vasos. Sin embargo, el vaso de compensacion esta dimensionado, preferiblemente, para que sea pequeno en comparacion con el rendimiento volumetrico del sistema para mantener el tiempo de residencia del producto en el vaso en un mmimo, es decir, por debajo de 24 horas, preferiblemente por debajo de 8 horas y aun mas preferentemente por debajo de 4 horas.

Los solicitantes descubrieron que los tiempos de residencia del producto tan bajos, unicamente posibles debido a los dispositivos de la invencion, permiten un aumento significativo del rendimiento para los productos de protema inherentemente inestables, resolviendo asf uno de los problemas de la tecnica anterior.

En algunas realizaciones de los dispositivos de la invencion, el vaso de compensacion esta situado en una celula de equilibrio o de carga (202), como se muestra para el dispositivo B1 y B2 en la Figura 3. Esta celula de equilibrio o de carga proporciona una senal de peso a un sistema de control computarizado (no mostrado).

Ademas, en una realizacion de los dispositivos de la invencion (B2), un vaso de tampon (204) esta conectado a traves de una bomba peristaltica (203) al vaso de compensacion. En funcionamiento, esta configuracion se utiliza para ajustar las propiedades de la corriente de cosecha libre de partfculas, tal como la conductividad (fuerza ionica) o el pH, mediante la adicion de tampon o diluyente adecuado. En este caso, se usa un sistema de mezcla (205) opcional y sensores para monitorizar la condicion deseada (206), tal como el pH o la conductividad. En el presente diseno, se utiliza un agitador acoplado magneticamente; sin embargo, tambien se podnan usar otros sistemas de mezcla, tales como agitadores o dispositivos pulsantes.

Concentracion/purificacion continuas integradas (300)

El dispositivo A, del que se muestran 2 realizaciones en la Figura 2, comprende un sistema de ultrafiltracion continuo integrado esteril (300). Las realizaciones del sistema de ultrafiltracion continuo esteril comprenden una bomba de reciclado (301) y bucle de reciclado (306), uno o mas modulos de ultrafiltracion de flujo cruzado (303) esteriles, una bomba de permeado (305), un vaso receptor del permeado (307) esteril en una celula de equilibrio o carga (309) y una bomba de fraccion retenida (311). Ademas, comprende instrumentacion en forma de un manometro o transmisor (302) de entrada, un manometro o transmisor de presion del perneado (304), un manometro o transmisor (308) de salida, asf como, un medidor de flujo de reciclado (310). En funcionamiento, la salida del sistema (312) proporciona una corriente continua del producto proteico concentrado y parcialmente purificado, que pueden recogerse de forma continua, congelarse o procesarse adicionalmente.

La realizacion de la invencion A2 comprende ademas un vaso de tampon o diluyente (314), una bomba peristaltica de adicion de tampon/diluyente (313), asf como, sensores de flujo continuo para monitorizar el acondicionado del concentrado en el bucle de reciclado, tales como sensores de pH y de conductividad (315, 316). En funcionamiento, esta configuracion se utiliza para ajustar las propiedades de la corriente de cosecha libre de partfculas, tal como la conductividad (fuerza ionica) o el pH, mediante la adicion de tampon o diluyente adecuado. Esta configuracion tambien se puede utilizar para anadir estabilizantes de protemas. Aunque en una realizacion de la invencion A2, el propio bucle de reciclado actua como una camara de mezcla, como alternativa, el acondicionamiento puede tambien llevarse a cabo utilizando una configuracion del vaso de compensacion como se muestra para el dispositivo B (realizacion B2), que comprende los componentes (203, 204, 205, 206) como se discute mas adelante en esta descripcion (vease, la descripcion del dispositivo B).

Las realizaciones del dispositivo de la invencion tambien comprenden un sistema de registro de datos y de control programable, que registra las senales de datos entrantes de la instrumentacion (tales como, pero sin limitaciones, presiones, caudales, el peso del vaso, el pH, la conductividad) y controla las velocidades de la bomba de acuerdo con un algoritmo de control predefinido.

Todas las bombas (301, 305, 311, 313) son bombas peristalticas, que permiten el bombeo de las respectivas corrientes de fluido sin que partes o sellos rotativos entren en contacto con la corriente de producto esteril. Los solicitantes descubrieron que esto es preferible proporcionar un funcionamiento solido esteril a largo plazo. Sin embargo, en principio se pueden usar otros disenos de bombas esteriles. La bomba de reciclado (301) y sus tubos de bomba esta dimensionada para permitir el ajuste solido de los caudales de flujo cruzado deseados de entre 80 y 800 litros/hora por m2 de area de membrana instalada, dependiendo de las caractensticas de transferencia de masa del modulo de ultrafiltracion utilizadas. La bomba de permeado esta dimensionada para permitir un ajuste solido y preciso de un flujo de permeado espedfico de entre 90 % y 99 % del caudal de la cosecha de la fermentacion de perfusion continua. La bomba de la fraccion retenida esta dimensionada para permitir un ajuste solido y preciso del flujo de la fraccion retenida de entre 1 % y 10 % del caudal de la cosecha de la fermentacion de perfusion continua.

Los modulos de ultrafiltracion encapsulados (303) se utilizan para permitir el funcionamiento solido esteril y se esterilizan en autoclave o por irradiacion. El valor de corte del peso molecular nominal optimo se elige basandose en

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el peso molecular del producto proteico de de interes y tiene que confirmarse mediante experimentos estandar conocidos por los expertos en la tecnica. Se pueden usar diversos materiales de membrana, tales como polietersulfona, polietersulfona hidrofilizada o celulosa regenerada, siempre y cuando todo el modulo de membrana se puede esterilizar por irradiacion y/o en autoclave sin danar la membrana. Se espera que los materiales hidrofflicos puedan aumentar la eficiencia debido a su menor tendencia a ensuciarse.

Los solicitantes descubrieron que el dispositivo A es singularmente eficiente si el area total de la membrana de la ultrafiltracion instalada en metros cuadrados es igual a un intervalo de entre 0,1 a 2 veces el caudal volumetrico de la cosecha de la fermentacion de perfusion continua en litros/hora. Por ejemplo, para un caudal de la cosecha de perfusion de 1 litro/hora, el area de membrana instalada total debe ser de entre 0,1 y 2 metros cuadrados. Los solicitantes descubrieron que el dispositivo A todavfa es mas eficiente, si el area de la membrana de ultrafiltracion instalada en metros cuadrados es igual a un intervalo de entre 0,3 a 1 veces el caudal volumetrico de la cosecha de la fermentacion de perfusion continua en litros/hora.

En una realizacion de la invencion, se utilizan modulos de membrana de fibra hueca "desechables" comercialmente disponibles (GE Healthcare, antes Amersham Biosciences). Sin embargo, se pueden usar diversas membranas encapsuladas y disenos de modulo, tales como modulos de enrollado en espiral, casetes o capsulas encapsulados con mayor transferencia de masa debido a los patrones de flujo secundario (por ejemplo, flujo de vortice), los elementos rotatorios (por ejemplo, filtros de disco dinamicos) o filtros vibrantes. Cabe esperar que se puedan usar casetes de ultrafiltracion especialmente encapsulados de forma beneficiosa en los dispositivos de la invencion, ya que proporcionan altos coeficientes de transferencia de masa a un caudal de flujo cruzado requerido relativamente bajo, reduciendo de ese modo la capacidad de la bomba, manteniendo la complejidad del sistema y los costes de inversion bajos.

El dispositivo de la invencion permite un funcionamiento no solo continuo, sino tambien en esterilidad, en contraste con un funcionamiento apenas aseptico. Los solicitantes logran esto disenando todos los componentes del sistema de contacto con el producto para soportar no solo la limpieza, sino tambien la esterilizacion en autoclave, vapor en su lugar o irradiacion gamma. En las presentes realizaciones se usan modulos encapsulados desechables para la eliminacion continua de partmulas (100), asf como ultrafiltracion continua (300). Las bombas peristalticas se utilizan para evitar cualquier contacto del producto con elementos rotatorios y sellos mecanicos. Por otra parte, en las presentes realizaciones se usan conjuntos de tubos y bolsas desechables en lugar de tubos duros. Los componentes de contacto con el producto desechables (por ejemplo, tubos, bolsas, modulos) o grupos de componentes se preensamblan y esterilizan, simplificando de este modo la puesta en marcha y el funcionamiento. Los sistemas estan disenados para mantener al mmimo cualquier apertura potencial del sistema esteril al medio ambiente (por ejemplo, campana de flujo laminar), como para el muestreo o intercambio de bolsa o instrumentacion. En las presentes realizaciones del dispositivo, los colectores estan disenados redundantes para permitir el cambio de un componente esteril (por ejemplo, una bolsa receptora de producto) al siguiente sin abrir. El intercambio adicional de tubos, modulos o bolsas se realiza, preferiblemente, mediante el uso de soldadores de tubos esteriles en lugar de conectores esteriles.

Otras realizaciones futuras de dispositivos de la invencion tambien podnan comprender componentes, tales como vasos de acero inoxidable, carcasas de filtros o tubenas que pueden esterilizarse en su lugar, solos o en combinacion con componentes desechables, siempre que se asegure la robustez y la esterilidad en funcionamiento a largo plazo.

Las realizaciones adicionales de dispositivo A de la invencion estan disenados para procesar el material de multiples fermentadores en plantas de fabricacion mas grandes (A3). En la figura 5 se muestra un ejemplo esquematicamente. Otras realizaciones estan disenadas para aumentar el factor de concentracion global y el rendimiento de separacion mediante la combinacion de 2 etapas de los sistemas de ultrafiltracion continua (300) en serie (A4, que se muestra esquematicamente en la Figura 5).

Descripcion del procedimiento de uso de dispositivo A

Las fermentaciones de perfusion continua se realizan durante un largo penodo de tiempo (una campana), tipicamente entre 2 semanas y 6 meses o mas. El fluido de cultivo tisular (TCF) que contiene producto, celulas y residuos celulares se procesa de forma continua utilizando el dispositivo A. Se produce una corriente de producto esteril, libre de partmulas, concentrado y parcialmente purificado (el "aislado de producto") y sale de forma continua del dispositivo por su salida (312). Mediante el uso de la bomba (101) del sistema de eliminacion de partmulas (100) esteril continuo, se bombea la cosecha de forma continua a traves del conjunto de filtracion (103) al caudal de la cosecha de perfusion deseado Qh de la fermentacion.

La corriente de salida del sistema de filtracion continuo, es decir, el fluido de cultivo tisular clarificado (FCTc) entra de forma continua en el vaso de compensacion (201). Desde el vaso de compensacion, el FCTc se procesa de forma continua mediante un sistema de ultrafiltracion (300) continuo, esteril a un caudal igual al caudal procedente de la fermentacion de perfusion continua. Debido al pequeno tamano del vaso de compensacion con respecto a los caudales ajustados, el tiempo de residencia medio del producto en el vaso se mantiene en un mmimo, es decir, por debajo de 12 horas, preferiblemente por debajo de 4 horas y aun preferiblemente por debajo de 2 horas.

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El flujo cruzado adecuado y, por tanto, la transferencia de masa, se ajusta en el modulo de ultrafiltracion a traves de la bomba de reciclado (301). El caudal de la fraccion retenida se ajusta y se controla mediante el uso de la bomba de la fraccion retenida (311), produciendo de este modo un caudal constante y continuo Qi del aislado de producto concentrado que sale del dispositivo A por su salida (312). La bomba de permeado (305) se utiliza para ajustar y controlar el caudal Qp del permeado, que se extrae de forma continua desde el lado del permeado del modulo o modulos de ultrafiltracion y que consiste en agua y los componentes de las soluciones lo suficientemente pequenos para pasar a traves de la membrana de ultrafiltracion (por ejemplo, sales, protemas pequenas).

Los caudales del permeado (Qp) y la fraccion retenida/aislado (Qi) se ajustan y controlan cuidadosamente para que coincida con el caudal de la cosecha Qh de la fermentacion de manera que:

Qp + Qi = Qh

Al mismo tiempo, las caudales se ajustan y controlan, de manera que se alcanza un factor de concentracion cf deseado satisfaciendo:

Qi = 1/cf * Qh

Por ejemplo, para lograr un factor de concentracion de producto deseada de 10 veces en el aislado sobre la concentracion inicial de la cosecha, Qi se controla a Qi = 1/10 * Qh usando la bomba de la fraccion retenida/aislado (311), mientras que Qp se controla a Qp = 0,9* Qh usando la bomba del permeado (305).

Dado que los caudales de salida son controlados por las bombas (305) y (311), el sistema de ultrafiltracion extrae automaticamente un flujo de Qp + Qi desde el vaso de compensacion pequeno (201).

En caso de usar la realizacion A2 (vease la Figura 2 a la derecha), una corriente esteril de tampon o agua para inyeccion desde el vaso 314 se anade al sistema de ultrafiltracion continuo de forma continua a un caudal constante Qb utilizando la bomba de adicion de tampon (313). Por lo tanto, las condiciones del aislado pueden ajustarse libremente y de forma continua, por ejemplo, en terminos de fuerza ionica, pH, adicion de estabilizantes, etc. Por lo tanto, los caudales se controlan en

imagen1

Ademas, se pueden elegir relaciones del caudal de manera que se alcanza un factor de concentracion deseado cf satisfaciendo Qi = 1/cf * (Qh + Qb). Como alternativa, este procedimiento se puede utilizar solo para alterar las condiciones (por ejemplo, el pH, la conductividad), estableciendo Qi = Qh + Qb

El nuevo procedimiento de utilizar el dispositivo A tambien contrasta con los procedimientos de UF discontinuos (tecnica anterior) en terminos del punto de ajuste de la propia ultrafiltracion. Los procedimientos de UF discontinuos convencionales estan disenados para un determinado rendimiento a traves de un area de membrana baja en un corto periodo de tiempo. Por tanto, la UF discontinua generalmente se realiza en el punto de presion de transicion dependiente de la region controlada de transferencia de masa (vease la figura 9). Esto conduce a un flujo espedfico inicial deseablemente alto que, sin embargo, disminuye significativamente y rapidamente en el transcurso de segundos a minutos, a medida que la polarizacion de la concentracion conduce rapidamente a contrapresion osmotica y la formacion de una capa de gel limitante (membrana secundaria). Una concentracion de la pared tan alta de macromoleculas tambien conduce a un aumento de la adsorcion de compuestos a la superficie de la membrana interna y externa, es decir, a ensuciamiento de la membrana. Este ensuciamiento reduciria aun mas el flujo del permeado con el tiempo.

Los solicitantes descubrieron sorprendentemente que con el dispositivo A se consiguen capacidades de carga general por area de membrana de ultrafiltracion instalada muchas veces mas altas mediante el accionamiento en el extremo inferior de la curva de presion - flujo (vease la Figura 9):

La concentracion de la pared, cpared, normalizada de un componente totalmente retenido puede describirse de

la siguiente manera:

imagen2

con

J =flujo del permeado espedfico en Iitros/hora/m2

kd = coeficiente de transferencia de masa en litros/hora/m2

cvolumen = coeficiente del componente en el volumen de la solucion

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Al igual que en el lote de UF, la UF continua se hace funcionar a un coeficiente de transferencia de masa optimizada para minimizar la polarizacion de la concentracion. Sin embargo, en contraste con la ultrafiltracion discontinua, los solicitantes ajustan el flujo del permeado J en el lfmite inferior de la curva de presion-flujo (vease la Figura 9). Como resultado de la relacion exponencial, la concentracion de la pared cpared en la superficie de la membrana, por tanto, es significativamente menor de lo que sena en la ultrafiltracion discontinua. Por ejemplo, la presente forma de realizacion del procedimiento de la invencion ajusta un flujo de permeado espedfico objetivo de aproximadamente 1/10 del coeficiente de transferencia de masa alcanzable, ajustando de ese modo una concentracion de pared de solo el 10% por encima de la concentracion del volumen (o fraccion retenida) ajustada.

La siguiente Tabla 1 muestra un ejemplo de un procedimiento para utilizar el dispositivo A (realizacion A1) para el aislamiento continuo de un producto proteico a partir de un fermentador a escala de desarrollo:

Tabla 1

Ejemplo de procedimiento para usar una realizacion presente del dispositivo A para el aislamiento continuo de un producto proteico de la fermentacion de perfusion continua

Parametro opcional

Diana

Caudal de la cosecha Qh de perfusion continua (controlada con la bomba 101)

5 litros/hora (120 litros/dfa)

Caudal del perneado QP (controlado con la bomba 305)

4,75 litros/hora

Caudal de la fraccion retenida (aislado de producto) Qi (controlado con la bomba 311)

0,25 litros/hora

Flujo espedfico del perneado J

2 litros/hora/m2

Factor de concentracion cf

20 veces

Para cada molecula de producto individual, se puede definir un criterio duradero para la configuracion de la ultrafiltracion continua esteril, por ejemplo, basandose en la presion transmembrana. Una vez que se excede el lfmite de presion transmembrana, la configuracion de la ultrafiltracion continua esteril se intercambia contra otra configuracion identica sin comprometer la integridad y la esterilidad del sistema. Esto puede realizarse en analogfa con la configuracion de la filtracion continua esteril mediante el uso de cualquiera de colectores y conectores esteriles, o mediante el uso de soldadores de tubos flexibles desechable y de tubos esteriles.

DISPOSITIVO B

Sistema de eliminacion de particulas continuo integrado (100)

La figura 3 muestra 2 realizaciones de dispositivo B de la invencion. El sistema de eliminacion de partfculas continuo integrado (100) esta conectado directamente al lado de la cosecha del sistema de fermentacion de perfusion continua (1). Esta parte del dispositivo B es identica al dispositivo A (vease la descripcion detallada del dispositivo A y la Figura 4, anterior).

Vaso de compensacion (200)

La salida del sistema de eliminacion de partfculas continuo integrado esta directa y constantemente conectado a un vaso compensacion (201), como se muestra en la figura 3. Este vaso de compensacion es un vaso esteril, tal como, una bolsa desechable o un vaso de acero inoxidable con al menos un puerto de entrada y un puerto de salida, estando el ultimo, preferiblemente, en la parte inferior del vaso. Se puede usar una amplia gama de tamanos y disenos de vasos. Sin embargo, el vaso de compensacion esta dimensionado, preferiblemente, para que sea pequeno en comparacion con el rendimiento volumetrico del sistema para mantener bajo el tiempo de residencia del producto en el vaso, es decir, por debajo de 26 horas, preferiblemente por debajo de 12 horas y aun mas preferentemente por debajo de 4 horas.

En el dispositivo B, el vaso de compensacion esta situado en una celula de equilibrio o de carga (202), como se muestra en las realizaciones B1 y B2 en la Figura 3. Esta celula de equilibrio o de carga proporciona una senal de peso a un sistema de control computarizado (no mostrado).

Ademas, en una realizacion de los dispositivos de la invencion (B2), un vaso de tampon (204) esta conectado a traves de una bomba peristaltica (203) al vaso de compensacion. En funcionamiento, esta configuracion se utiliza para ajustar las propiedades de la corriente de cosecha libre de partfculas, tal como la conductividad (fuerza ionica) o el pH, mediante la adicion de componentes para la modificacion de las propiedades del tejido clarificado cultivado recibido del sistema de eliminacion de particulas, tal como un tampon o diluyente adecuado, o un estabilizante de protemas adecuado. En este caso, una presente realizacion tambien comprende un sistema de mezcla (205) opcional y sensores para monitorizar la condicion deseada (206), tal como el pH o la conductividad. En esta presente realizacion, se utiliza un agitador acoplado magneticamente; sin embargo, tambien se podnan usar otros sistemas de mezcla, tales como agitadores o dispositivos pulsantes.

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En otra realizacion de dispositivo de invencion, se utilizan 2 vasos de compensacion. En cualquier momento dado, un vaso de compensacion esta conectado directamente al sistema de eliminacion de parffculas continuo (100), recibiendo de ese modo fluido clarificado, mientras que el otro esta conectado al sistema de concentracion/purificacion semicontinuo (400), alimentando de este modo un ciclo de adsorcion/desorcion por conveccion. El cambio entre ambos se realiza a traves de un sistema de control, utilizando el peso del vaso de recepcion para activar un interruptor una vez que se alcanza su volumen maximo de llenado.

Concentracion/purificacion semicontinuas integradas (400)

El dispositivo B, del que se muestran 2 realizaciones en la Figura 3, comprende un sistema de adsorcion/desorcion semicontinuo integrado por conveccion (400).

El sistema de adsorcion/desorcion semicontinuo integrado por conveccion esta disenado y dimensionado de manera que su caudal de carga (Qcarga) es significativamente mayor que el caudal de el procedimiento de recoleccion de perfusion continua y de filtracion continua (Qh), es decir Qcarga » Qh.

Las realizaciones del sistema de concentracion/purificacion semicontinuo integrado (400) comprenden una bomba de carga (401), un conjunto de valvula de multiples puertos (402) y varios vasos de tampon (404), una valvula de 3 vfas (403) conectado a un vaso receptor de residuos esteril (413) y uno o mas modulos de adsorcion de conveccion (406), manometros o transmisores de entrada y de salida (405, 408), otra instrumentacion, tales como sensores de UV (409), de pH y de conductividad (409, 410), medidor de flujo (412), asf como otra valvula de 3 vfas (407) conectada tambien al vaso de residuos (413) y la salida del eluato de producto (414).

Las realizaciones del dispositivo de la invencion tambien comprenden un sistema de registro de datos y de control programable (no mostrado), que registra las senales de datos entrantes de la instrumentacion (tales como, pero sin limitaciones, presiones, UV, el pH, la conductividad, el caudal, el peso del vaso de compensacion) y controla los vasos automaticos y la bomba de acuerdo con protocolos programados.

La bomba de carga (401) es, preferentemente, una bomba peristaltica para evitar el contacto directo del producto o tampones esteriles con cualquier sello o partes mecanicas. Los solicitantes descubrieron que esto es preferible proporcionar un funcionamiento solido esteril a largo plazo. Sin embargo, en principio se pueden usar otros disenos de bombas esteriles. La bomba de carga se dimensiona en funcion del volumen de la matriz instalada del adsorbente de conveccion (406) para permitir el ajuste solido de al menos 12 volumenes de matriz/minuto. Por ejemplo, en una realizacion presente, se usan capsulas adsorbentes de membrana Mustang (Pall Corp.) que tienen un volumen de la matriz de aproximadamente 0,3 litros. Por lo tanto, la bomba de carga esta dimensionada para permitir caudales de carga de hasta 3,6 litros/minuto.

La funcion del conjunto de la valvula de multiples puertos (402) es permitir el cambio entre el producto que contiene la carga extrafdo del vaso de compensacion (201) y cada uno de los tampones esteriles y soluciones de limpieza de los vasos de tampon esteril (404). Las presentes realizaciones del dispositivo B utilizan una serie de valvulas de pinza accionadas automaticamente, que pinzan el tubo flexible conectado a cada vaso de tampon desde el exterior para cerrar y abrir cada lmea. Los solicitantes descubrieron que estas valvulas de pinza proporcionan una solucion particularmente beneficiosa para el dispositivo B, ya que evitan cualquier contacto con el producto y, por lo tanto, no necesitan limpiarse o esterilizarse. Sin embargo, se puede usar una amplia gama de valvulas comerciales adecuadas para el procesamiento esteril y conocidas por los expertos en el campo, tales como valvulas de membrana activadas.

En la presente realizacion, las valvulas de 3 vfas (403, 407) son valvulas de membrana activadas que se pueden esterilizar en autoclave. Sin embargo, en principio, se puede usar una variedad de valvulas comerciales adecuadas para el procesamiento esteril, incluidas las valvulas de, por ejemplo, pinza.

El modulo adsorbente de conveccion (406) contiene una matriz cromatografica con transferencia de masa predominantemente de conveccion del producto a la superficie de adsorcion y, en contraste con la cromatograffa convencional, se esteriliza antes de la operacion en autoclave, al vapor o de irradiacion. La transferencia de masa predominantemente de conveccion permite, en contraste con la cromatograffa de lecho relleno convencional, tiempos de ciclo de adsorcion/elucion/regeneracion muy bajos, que los solicitantes utilizan en el dispositivo de la invencion para realizar la operacion semicontinua.

En la presente realizacion del dispositivo de la invencion, el adsorbente de conveccion (406) consiste en una o mas capsula(s) adsorbentes de membrana disponibles comercialmente con qrnmica de intercambio ionico (Mustang, corporacion Pall o Sartobind, Sartorius). Sin embargo, el dispositivo puede utilizar otros materiales y geometffas adsorbentes de membrana y nuevas matrices de conveccion, tales como matrices monolfficas tambien, ya que, en contraste con la cromatograffa convencional, el relleno de la resina se elimina y, generalmente, las matrices se pueden encapsular en modulos listos para usar.

Por otra parte, otras qrnmicas, incluyendo matrices de afinidad de conveccion que comprenden ligandos espedficos de union al producto, tambien produciran un rendimiento excepcionalmente beneficioso en el dispositivo de la invencion.

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En una realizacion de dispositivo de la invencion, se usan multiples modulos adsorbentes de conveccion en el dispositivo en forma de un conjunto de trenes de adsorcion de conveccion en paralelo, similar al sistema de eliminacion de partmulas (100) continuo. Todo el conjunto con todos los trenes adsorbentes se esterilizan juntos, lo que permite durante el funcionamiento el cambio desde un tren adsorbente a uno fresco si el primero uno llegar al final de su vida util, tal como se determina, por ejemplo, mediante un criterio predefinido, tal como contrapresion durante la carga o el numero maximo de ciclos de funcionamiento realizados. Cada tren adsorbente consiste en un modulo individual o multiples modulos de adsorcion de conveccion en paralelo y/o en serie para aumentar la capacidad de union y/o mejorar la utilizacion de la capacidad.

Es importante destacar que el dispositivo de la invencion permite un funcionamiento no solo continuo, sino tambien en esterilidad, en contraste con un funcionamiento apenas aseptico. Los solicitantes logran esto disenando todos los componentes del sistema de contacto con el producto para soportar no solo la limpieza, sino tambien la esterilizacion en autoclave, vapor en su lugar o irradiacion gamma. En las presentes realizaciones se usan modulos encapsulados desechables para la eliminacion continua de partmulas (lOo), asf como la adsorcion/desorcion de conveccion (400) esteril semicontinua. Las bombas peristalticas se utilizan para evitar cualquier contacto del producto con elementos rotatorios y sellos mecanicos. Por otra parte, en las presentes realizaciones se usan conjuntos de tubos y bolsas desechables en lugar de tubos duros. Los componentes de contacto con el producto desechables (por ejemplo, tubos, bolsas, modulos) o grupos de componentes se preensamblan y esterilizan, simplificando de este modo la puesta en marcha y el funcionamiento. Los sistemas estan disenados para mantener al mmimo cualquier apertura potencial del sistema esteril al medio ambiente (por ejemplo, campana de flujo laminar), como para el muestreo o intercambio de bolsa o instrumentacion. En las presentes realizaciones del dispositivo, los colectores estan disenados redundantes para permitir el cambio de un componente esteril (por ejemplo, una bolsa receptora de producto) al siguiente sin abrir. El intercambio adicional de tubos, modulos o bolsas se realiza, preferiblemente, mediante el uso de soldadores de tubos esteriles en lugar de conectores esteriles.

Otras realizaciones futuras de dispositivos de la invencion tambien podnan comprender componentes, tales como vasos de acero inoxidable, carcasas de filtros o tubenas que pueden esterilizarse en su lugar, solos o en combinacion con componentes desechables, siempre que se asegure la robustez y la esterilidad en funcionamiento a largo plazo.

Las realizaciones adicionales de dispositivo B de la invencion estan disenadas para procesar el material de multiples fermentadores en plantas de fabricacion mas grandes (B3). En la figura 6 se muestra un ejemplo esquematico. Otras realizaciones del dispositivo B de la invencion estan disenados para aumentar el factor de concentracion global y el rendimiento de separacion mediante la combinacion de varios sistemas de adsorcion/desorcion por conveccion (400) en serie, con los respectivos vasos de compensacion esteriles entremedias (200) (vease la Figura 6, B4).

Otras realizaciones mas de dispositivos de la invencion estan disenadas para aumentar el factor de concentracion y rendimiento de separacion en general mediante la combinacion de un sistema de ultrafiltracion continua (300) en serie con un sistema de adsorcion/desorcion de conveccion semicontinuo (400) a traves de un vaso de compensacion adicional. Un ejemplo de una forma de realizacion se muestra esquematicamente en la Figura 7.

Descripcion del procedimiento de uso del dispositivo B

Las fermentaciones de perfusion continua se realizan durante un largo penodo de tiempo (una campana), tfpicamente entre 2 semanas y 6 meses o mas. El fluido de cultivo tisular (TCF) que contiene producto, celulas y residuos celulares se procesa de forma continua utilizando el dispositivo B. Se produce una corriente de producto esteril, libre de partmulas, concentrado y parcialmente purificado (el "aislado de producto") y sale de forma continua del dispositivo por su salida (414). Mediante el uso de la bomba (101) del sistema de eliminacion de partmulas (100) esteril continuo, se bombea la cosecha de forma continua a traves del conjunto de filtracion (103) al caudal de la cosecha de perfusion deseado Qh de la fermentacion.

La corriente de salida del sistema de filtracion continuo, es decir, el fluido de cultivo tisular clarificado (FCTc) entra de forma continua en el vaso de compensacion (201).

Cada vez que el vaso de compensacion se llena hasta un nivel predefinido, una senal de peso o nivel desencadena automaticamente un ciclo de adsorcion/desorcion del sistema de concentracion/purificacion semicontinuo esteril integrado. El material recogido en el vaso de compensacion se carga rapidamente sobre la configuracion del adsorbente, es decir, en un plazo de 4 horas, preferiblemente en un plazo de 2 horas, y aun mas preferiblemente en un plazo de 1 hora o menos, vaciando de este modo el vaso de compensacion.

En las presentes realizaciones mostradas en la Figura 3, la recogida del fluido de cultivo tisular (FCTc) libre de partmulas continua en todo momento, en el mismo vaso de compensacion pequeno. Por tanto, el volumen en el vaso de compensacion pequeno vana entre un valor mmimo y maximo. En otra realizacion descrita anteriormente en el texto, la coleccion se cambia hacia delante y hacia atras entre 2 vasos de compensacion identicos.

Mientras el FCTc se continua recogiendo en el vaso de compensacion, el adsorbente cargado se somete a mas pasos de un protocolo cromatografico predefinido, disenado para desorber el producto diana en forma concentrada, purificada y para preparar el adsorbente para el siguiente ciclo de carga. Por lo tanto, el ciclo global comprende la

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carga, lavado, elucion, regeneracion y reequilibrado, cada uno con uno o mas tampones adecuados.

De nuevo, ya que los caudales durante estas etapas pueden ser altas debido a la naturaleza de los adsorbentes de conveccion, el tiempo total del ciclo se mantiene bajo, es decir, por debajo de 6 horas, preferentemente por debajo de 3 horas y, todavfa preferiblemente, por debajo de 1,5 horas. Por lo tanto, el sistema integrado esta disenado para que la configuracion del adsorbente esta lista para el siguiente ciclo de carga antes de que el vaso de compensacion se llene de nuevo, permitiendo asf el funcionamiento semicontinuo.

La siguiente Tabla 2 muestra un ejemplo de un procedimiento de uso de una realizacion presente del dispositivo B para de la invencion para el aislamiento del factor de coagulacion sangumea VIII humano recombinante (datos de gran escala mostrados). El procedimiento resulto ser singularmente beneficioso. Los rendimientos y el desempeno de cada ciclo de adsorcion/desorcion fue similar al discontinuo, con el rendimiento global del producto aumentado en mas de 10 % debido al tiempo de residencia inferior del producto y, por tanto, la degradacion del producto se minimizo. Tambien se ha demostrado que el mismo procedimiento es muy beneficioso para el aislamiento de variantes de FVIII de ingeniena genetica, incluyendo el FVIII con delecion del dominio B, que es significativamente diferente del FVIII de longitud completa en tamano y otras caractensticas. Se espera que sea util para la produccion de otras protemas y biomoleculas tambien.

El propio protocolo cromatografico (qrnmicas y secuencia del tampon, los volumenes y caudales de carga) se puede desarrollar en experimentos de cromatograffa discontinuos para cada molecula individual y, a continuacion, se puede transferir facilmente para su uso con realizaciones del dispositivo de la invencion.

Tabla 2

Ejemplo de procedimiento para usar una realizacion presente del dispositivo B para el aislamiento continuo de FVIII y variantes del FVIII de la fermentacion de perfusion continua

Parametro

Diana

Caudal de la cosecha Qh de perfusion continua [1/d]

2000

Vaso de compensacion: volumen maximo de trabajo Vs [1]

200

Volumen de carga [volumenes de la matriz]

600

Volumen de la matriz del adsorbente instalado en el dispositivo B [ml]

260

Caudal de carga [volumenes de la matriz/min]

12

Volumen de carga [1]

156

Tiempo de carga [min]

50

Tiempo cromatografico total [h](protocolo que comprende carga, lavado, elucion y varias etapas de regeneracion/reequilibrado)

1,5

Tiempo de inactividad del adsorbente/ciclo [h]

0,372

Ciclos/periodo de 24 horas

12,8

Tiempo re recoleccion [h]

1,872

Tiempo medio aproximado de residencia del producto en el dispositivo (tiempo de recoleccion + tiempo de carga + tiempo de elucion)

2,7

Para cada molecula de producto individual, se define un criterio de vida util para la configuracion del adsorbente de conveccion, por ejemplo, basandose en la presion durante la carga, o la recuperacion. Tfpicamente, se especifica y valida un numero maximo de ciclos nmax. Una vez que se ha usado la configuracion del adsorbente en operacion semicontinua a traves de nmax ciclos, se intercambia contra otra configuracion del adsorbente identica sin comprometer la integridad y la esterilidad del sistema. En las presentes realizaciones, esto se realiza analogfa con la configuracion de la filtracion continua esteril mediante el uso de cualquiera de colectores y conectores esteriles, o mediante el uso de soldadores de tubos flexibles desechable y de tubos esteriles.

Cuando se utiliza la realizacion de dispositivo de la invencion mostrada en la Figura 3, lado derecho, una corriente esteril de tampon, solucion de ajuste del pH, solucion estabilizante o agua para inyeccion se anade de forma continua o de forma intermitente desde un vaso esteril (204) usando una bomba de adicion de tampon (203). Por lo tanto, las condiciones del FCTc se pueden ajustar libremente, por ejemplo, en terminos de fuerza ionica, pH, adicion de estabilizantes, etc.

Beneficios de la invencion

Los dispositivos y procedimientos respectivos de la invencion del uso de los dispositivos resuelven los problemas de los procedimientos de aislamiento convencionales descritos antes (veanse los antecedentes generales de la

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invencion).

En todas las realizaciones de los dispositivos A y B y los procedimientos respectivos de uso de los dispositivos, el tiempo de residencia del producto en medio potencialmente perjudicial se minimiza de forma unica, lo que aumenta significativamente el rendimiento y la calidad de los productos biologicos complejos inherentemente inestables. La capacidad de la planta se puede aumentar y los costes de los productos se pueden reducir.

Ademas, los dispositivos y procedimientos respectivos eliminan la necesidad de instalaciones con cuartos fnos y vasos refrigerados grandes para el almacenamiento intermedio de grandes volumenes de cosecha, reduciendo de este modo los costes de inversion en las plantas y la plena realizacion de la ventaja de compacidad y movilidad de la fermentacion de perfusion.

Las realizaciones de los dispositivos de la invencion y los procedimientos respectivos reducen los costes de mano de obra en comparacion con el laborioso procesamiento discontinuo convencional, debido al inherentemente alto grado de automatizacion. Los dispositivos novedosos permiten un funcionamiento continuo, 24 horas al dfa, durante largos penodos de tiempo, maximizando el rendimiento volumetrico y la utilizacion del equipo.

Ademas, los dispositivos de la invencion eliminan dificultades logfsticas en plantas de uno o varios fermentadores. Las realizaciones pueden procesar el material de uno o multiples fermentaciones de perfusion continua.

Es importante destacar que, puesto que los nuevos dispositivos y procedimientos permiten la operacion completamente esteril, se eliminan las cuestiones de la carga microbiana, asf como, las cuestiones de endotoxina, lo que podna no lograrse mediante el procesamiento aseptico, seguido de filtracion esteril simple.

Ademas, los dispositivos de la invencion permiten evitar o minimizar la necesidad de validacion de la limpieza debido a la utilizacion de productos desechables. A traves de las caractensticas unicas de los dispositivos y procedimientos de la invencion, se pueden usar modulos desechables, asf como, tubos, bolsas y conjuntos, cada uno durante un largo penodo de tiempo (hasta toda la longitud de la campana), con lo que se reducen drasticamente los costes y se hace uso de productos desechables de gran atractivo desde un punto de vista economico.

Las presentes realizaciones de los dispositivos A y B de la invencion y los procedimientos respectivos han demostrado ser especialmente util para la fabricacion del factor VIII de coagulacion sangumea recombinante, asf como, versiones de FVIII modificados geneticamente, pero sin limitaciones, el FVIII con dominio B delecionado. Sin embargo, claramente se puede esperar que las invenciones sean similarmente utiles para la produccion de otras protemas y moleculas biologicas, en particular complejas protemas inherentemente inestables, tales como el Factor VII, Factor IX, Factor X y otros.

Beneficios del dispositivo A y el respectivo procedimiento

La figura 8 muestra un ejemplo del sorprendente incremento de la capacidad del filtro descubierta para el elemento de eliminacion de partmulas continuo integrado (100).

La Figura 10 muestra una distribucion del tiempo de residencia tfpica y el tiempo medio de residencia del producto en el sistema de UF continua (300) de una realizacion del dispositivo A de la invencion, como se determina mediante adsorcion UV de la fraccion retenida a 280 nm, con una protema modelo en condiciones tfpicas. Como puede verse, el tiempo medio de permanencia del producto en el sistema es de solo aproximadamente 40 minutos. Por lo tanto, el tiempo total de residencia del producto en esta presente realizacion del dispositivo A, desde la lmea de cosecha del fermentador a la fraccion retenida concentrada final (aislado) se mantiene en 1-2 horas o menos. Esto es menos de 1/10 del tiempo de residencia de 28 horas o mas en un procedimiento de aislamiento discontinuo convencional, en el que el producto (la cosecha) se recoge durante al menos 24 horas (a varios dfas), despues de lo cual el producto se procesa durante, tfpicamente, al menos 4-10 horas.

La Figura 11 muestra una comparacion de los rendimientos de aislamiento total resultantes del factor de coagulacion sangumea recombinante (rFVIII) a partir de fermentacion de perfusion continua libre de protemas plasmaticas para un procedimiento de aislamiento discontinuo convencional (filtracion discontinua mas UF discontinua) y el uso del dispositivo Ay el procedimiento respectivo. Como puede verse en la figura, el procedimiento continuo de la invencion logra un rendimiento del producto significativamente mayor, que puede conducir a un aumento de las capacidades de fabricacion y costes de fabricacion reducidos.

Durante el procedimiento de la invencion del uso del dispositivo A, la presion de transmembrana de la ultrafiltracion continua integrada va a aumentar con el tiempo, mientras que el flujo de membrana espedfico (en Iitros/hora/m2/bar) disminuye a un rendimiento volumetrico constante. Esto es comun a todos los procedimientos de ultrafiltracion y se debe a efectos como la polarizacion de la concentracion, la formacion de gel-capa y el ensuciamiento. Sin embargo, en contraste con la ultrafiltracion discontinua, como se puede ver del ejemplo mostrado en la Figura 12, los cambios de presion y flujo espedfico son extremadamente lentos con el dispositivo A, lo que permite un funcionamiento continuo durante semanas a la vez, antes de que tengan que limpiarse las membranas o reemplazarse. Ademas, la velocidad de cambio y el rendimiento general del sistema es bastante insensible al producto producido o de la lmea celular utilizada en la fermentacion de perfusion continua (Figura 12). Por lo tanto, el dispositivo A de la invencion y

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el procedimiento respectivo tambien esta idealmente adecuado como una plataforma generica para la produccion rapida de varias protemas, ya que se realiza con firmeza y de manera predecible con diversas protemas diana de diferentes lmeas celulares.

Sorprendentemente, los solicitantes descubrieron que los efectos negativos de la formacion de gel-capa y el ensuciamiento de hecho, se minimizan tanto con el dispositivo A, que se puede procesar un volumen total mucho mas grande por area de ultrafiltro instalado, antes sea necesaria la limpieza o sustitucion de los filtros. La Figura 13 muestra el solido rendimiento del dispositivo A de la invencion en una carrera a largo plazo. Despues de aproximadamente 25 dfas, la presion transmembrana parecio, sorprendentemente, estabilizarse en un estado casi estacionario, lo que sugiere un rendimiento aun mayor a largo plazo. El dfa 27, el caudal de la fraccion retenida se duplico a proposito para analizar el efecto de un rendimiento mas alto. Despues de 34 dfas, se realizo a un corto lavado con NaOH 0,5 M esteril, sin abrir el sistema y, por lo tanto, mientras se mantiene la integridad y esterilidad del sistema completo. Despues de esto, la PTM se estabilizo de nuevo, o al menos solo aumento a una tasa extremadamente baja. Despues de 70 dfas de operacion continua, esteril, el caudal de reciclado se redujo a proposito a la mitad para analizar el efecto sobre el rendimiento del sistema. Como se esperaba, la PTM comenzo a aumentar con una velocidad algo mayor debido a la transferencia de masa reducida y, por tanto, al aumento de la concentracion de pared en la superficie de la membrana. Sin embargo, se realizaron 95 dfas de operacion con exito y con firmeza ante de apagar el sistema. Se ha procesado un total de cerca de 4.500 litros por m2 de area de membrana, con mano de obra manual minima (muestreo diario solamente). En comparacion, el procedimiento de ultrafiltracion discontinua convencional optimizado para la misma aplicacion tiene 45 veces menos capacidad de carga, en aproximadamente 100 1/m2, y requiere al menos 1-2 tecnicos a tiempo completo.

Tambien sorprendentemente, la selectividad del dispositivo A de la invencion, en particular su sistema de ultrafiltracion continua integrado (300), resulto ser significativamente mas alta que la selectividad de un procedimiento discontinuo convencional. Es bien conocido por los expertos en el campo que en la ultrafiltracion discontinua convencional, se forma una membrana secundaria a partir de macromoleculas retenidas durante la etapa inicial del procedimiento (capa de gel), lo que reduce el valor de corte de peso molecular aparente. El resultado es que tanto la molecula diana como las protemas contaminantes mas pequenas son retenidos, lo que hace que la purificacion simultanea importante se practicamente imposible. Por lo tanto, con la ultrafiltracion discontinua convencional rara vez es posible separar las protemas que estan a menos de un factor de 10 de separacion, en terminos de su peso molecular. embargo, como puede verse en la Figura 14, con el procedimiento de ultrafiltracion continua integrada de la invencion, es posible ajustar las condiciones para separar de manera eficiente IL-2SA (aproximadamente 16 kDa) y la protema verde fluorescente GFP (27-30 kDa). Este rendimiento de separacion mas alto de lo esperado sf permite concentracion y purificacion simultaneas.

Beneficios del dispositivo B y el respectivo procedimiento

La Figura 15 ilustra el rendimiento del dispositivo B de la invencion. Usando un adsorbente de conveccion comercial (Mustang Q, Pall Corporation, 15 modulo de la capa), se han realizado cerca de 100 ciclos de adsorcion/desorcion consecutivos, de modo que se concentra y purifica una variante de FVIII recombinante a partir de cultivo de perfusion continua. El rendimiento promedio obtenido fue de aproximadamente 95 % (resultados de calculo de la variacion del ensayo), mientras que la presion se mantuvo relativamente constante en todo el numero de ciclos realizados. Por lo tanto, se puede especificar que se pueden realizar al menos 100 ciclos consecutivos antes de intercambiar la configuracion del adsorbente.

Como se ha demostrado en la descripcion detallada del procedimiento de utilizacion el dispositivo B de la invencion, el tiempo medio de residencia total del producto en una realizacion presente es inferior a 3 horas, antes de que se eluya en forma concentrada, purificada y estabilizada en un tampon apropiado. Esto es significativamente menor que el tiempo de residencia de mas de 24 horas en un procedimiento de aislamiento convencional discontinuo realizado una vez al dfa y, por lo tanto, da lugar a rendimientos significativamente mayores de los productos proteicos inherentemente labiles. En una realizacion presente descrita anteriormente, se realizan aproximadamente 13 ciclos al dfa, lo que significa en el contexto de la Figura 15 que el conjunto de adsorbente semicontinuo tendna que cambiarse solo cada 7-8 dfas, que se realiza sin comprometer la esterilidad y la continuidad de la operacion.

La figura 16 muestra un ejemplo del perfil de UV y conductividad durante un unico ciclo de adsorcion/desorcion tfpico y el ciclo de regeneracion con dispositivo B. Se puede observar que se pueden cargar mas de 450 volumenes de adsorcion (CVS), mientras que el producto se eluye en un pico muy afilado. Los contaminantes se eliminan de manera significativa en el flujo continuo durante la fase de carga, asf como durante el lavado y raspado (fase de regeneracion).

La Figura 17 ilustra el rendimiento de purificacion del procedimiento de la invencion que comprende adsorcion/desorcion semicontinua de conveccion. Se muestra un ejemplo de gel de SDS page de un aislado variante de FVIII. Como puede verse, las fracciones de eluato, que incluyen 95 % de la variante del FVIII cargado (como se determina mediante un ensayo de actividad independiente), contienen significativamente menos protema que la carga y de este modo se purifican. No hay bandas de degradacion adicionales visibles en el eluato (aislado), lo que indica una excelente calidad del producto.

En resumen, el dispositivo B de la invencion es capaz de lograr un rendimiento de purificacion similar a los procedimientos discontinuos comparables, mientras que al mismo tiempo reduce al mmimo las perdidas de rendimiento para los productos proteicos inherentemente inestables, asf como los problemas de calidad del producto, debido a la minimizacion del tiempo de residencia del producto. Al mismo tiempo, los costes derivados de 5 la mano de obra se reducen drasticamente debido al elevado grado de automatizacion inherente al procedimiento de la invencion, lo que requiere una minima intervencion del tecnico.

Claims (5)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para la purificacion de una protema de interes a partir de una mezcla de fluidos de cultivo tisular heterogenea, que comprende:

   (a) producir mediante un procedimiento de fermentacion de perfusion continua una mezcla de fluidos de cultivo tisular heterogenea que contiene una protema de interes;

   (b) transferir la mezcla de fluidos de cultivo tisular a un procedimiento de eliminacion de partmulas continuo integrado con el sistema de fermentacion de perfusion continua;

   (c) eliminar los contaminantes particulados del fluido de cultivo tisular en el procedimiento de eliminacion de partmulas continuo para producir un fluido de cultivo tisular clarificado que contiene la protema de interes;

   (d) transferir el fluido de cultivo tisular clarificado a un vaso de compensacion integrado con el procedimiento de eliminacion de partmulas continuo;

   (e) transferir de forma intermitente el fluido de cultivo tisular clarificado a un procedimiento de purificacion integrado con el vaso de compensacion; y

   (f) purificar la protema de interes a partir del fluido de cultivo tisular clarificado en el procedimiento de purificacion para producir un aislado de producto esteril, sin partmulas, concentrado y parcialmente purificado que contiene la protema de interes;

   en el que el caudal espedfico de la mezcla a traves del procedimiento de fermentacion de perfusion continua y el procedimiento de eliminacion de partmulas continuo se mantiene sustancialmente constante.
2. 2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el procedimiento de purificacion es adsorcion/desorcion por conveccion.
3. 3. Un aparato para separar una protema de interes a partir de una corriente de fluido de cultivo tisular, que comprende:

   (a) un sistema de fermentacion de perfusion continua;

   (b) un sistema de eliminacion de partmulas continuo integrado con el sistema de fermentacion de perfusion; y

   (c) un sistema de purificacion intermitente integrado con el sistema de eliminacion de partmulas; en el que el

   aparato se mantiene en condiciones esteriles.
4. 4. El aparato de acuerdo con la reivindicacion 3, que comprende:

   (a) un sistema de fermentacion de perfusion adaptado para producir de forma continua un fluido de cultivo tisular que contiene una protema de interes;

   (b) un sistema de eliminacion de partmulas integrado con y adaptado para recibir de forma continua el fluido de cultivo tisular del reactor y para producir de forma continua un fluido de cultivo tisular clarificado;

   (c) un vaso de compensacion integrado con y adaptado para recibir de forma continua el fluido de cultivo tisular clarificado del sistema de eliminacion de partmulas y liberar de forma semicontinua el fluido de cultivo tisular clarificado, y

   (d) un sistema de purificacion integrado con y adaptado para recibir de forma semicontinua el fluido de cultivo

   tisular clarificado desde el vaso de compensacion; en el que el aparato esta adaptado para mantener

   condiciones de esterilidad.
5. 5. El aparato de la reivindicacion 3, en el que el sistema de purificacion comprende un sistema de adsorcion/desorcion por conveccion.