CN101076347B - 用于集成连续生产生物分子的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从异质的澄清流体混合物中纯化目标分子的方法和设备。本发明的设备一般包括连续灌流发酵系统、与所述灌流发酵系统集成的连续颗粒去除系统；和维持在无菌条件下与所述颗粒去除系统集成的连续纯化系统。所述方法包括以比流速通过连续的超滤来过滤异质的澄清流体混合物，所述比流速低于流量对比TMP曲线的压力依赖性区域中目标分子的转变点，其中在整个连续超滤中维持所述比流速基本上恒定。

Description

用于集成连续生产生物分子的装置和方法
技术领域
本发明涉及用于从分子的异质混合物中纯化目标分子的改进的方法和系统。更具体地，本发明针对用于在来自连续灌流发酵过程的组织培养流体料流(feedstream)中纯化目标蛋白质的方法。
背景技术
熟悉本领域的人员公知的是，近年来已经建立的若干连续的细胞培养过程，也称为连续灌流过程(continuous perfusion process)，获得很大的商业成功。然而，连续灌流发酵之后的分离过程一般是分批的过程，并在物理上和计算上(logistically)与连续的上游过程分离。在这些过程中，分离步骤的主要目的是从大体积的相对稀释的培养物上清液中捕获产物。对于过程计算和空间要求，必须强调产物的浓度，而同时除去杂质(纯化)对于使所需的进一步下游纯化步骤数的最小化是重要的。
附图1显示了连续灌流发酵分离过程的典型现有技术的示意图，这是熟悉本领域的人员公知的。所述连续灌流发酵系统包括细胞滞留(cell retention)装置(1)，其将产生产物的大多数细胞保持在发酵系统中。来自所述连续灌流系统的连续的收获流仍然含有一些细胞、碎片和其他颗粒，使用收获泵(2)将它们泵送到大的收集容器(3)中，例如不锈钢罐。这些收获物保存容器通常必须被冷却以将由于降解引起的产物损失保持在可行的范围内。
一旦收集了特定的体积，其一般是1-4天或更久以后，将收获物收集容器从无菌发酵容器断开，收集的材料被称为一个收获物批次。下一个步骤是除去细胞、碎片和颗粒(步骤2)。在工业规模中，一般使用离心(4)继之以死端(dead-end)膜过滤(5)，或通过死端深度过滤(6)继之以死端膜过滤(7)来进行。有时使用的另一种技术是切向流(或“交叉流(crossflow)”)微滤。在任何情况下，颗粒去除过程的产物是澄清组织培养流体的批次，或cTCF(8)。对于生物技术产物的颗粒分离的更多细节可以在标准教科书，例如Biotechnology，Vol.3，Bioprocessing，Wiley-VCH，第2版(1996)，ISBN：3527283137中找到。
在下一个步骤(步骤3)中，将澄清的组织培养流体的批次进一步加工来浓缩和，如果可能的话，来纯化产物。这一般通过交叉流超滤或通过填充床层析来进行。
对于交叉流超滤来说，将cTCF泵入到系统的再循环罐(9)中。使用(10)泵来推动材料通过交叉流超滤器。通过膜保持产物并作为滞留物再循环到再循环罐中，而水和较小的杂质由于超滤模块中的压降产生的跨膜压力被推过膜进入渗透物(11)。在每次通过过滤器时，cTCF因此得到更多浓缩，总cTCF体积被降低直到达到期望的浓缩因数。一旦达到了期望的浓缩因数，将过程停止，并将保持的浓缩物体积(分离物)从系统中排出并收集。用于浓缩生物技术产物的交叉流超滤的更多细节可以在标准教科书中找到，例如，Biotechnology，Vol.3，Bioprocessing，Wiley-VCH，第2版(1996)，ISBN：3527283137。
对于填充床层析来说，将cTCF泵送到含有填充的树脂床的层析柱(12)上。产物与树脂结合，然后使用适合的洗脱缓冲液(14)以通常的浓缩和纯化的形式(分离物，13)洗脱，在这之后使用足量的缓冲液和清洗溶液(14)清洗和再生柱子。
被建议用于cTCF的浓缩/纯化的其他层析变体是膨胀床层析和膜层析。膨胀床层析可以处理含有颗粒的溶液。然而，虽然过滤面积降低了，层析之后仍然需要过滤分离物。膜层析使用了修饰的微滤膜的层叠来取代填充的树脂床。益处是，传质主要是对流的而不是扩散的，这容许更快的分离。此外，该过程通常等同于标准填充床层析。用于浓缩和纯化生物技术产物的层析的更多细节可以在标准教科书中找到，例如，Protein Purification，Principles，High-Resolution Methods，and Applications，Wiley-VCH，第2版(1998)，ISBN0-471-18626-0。
通常，然后冷冻和保存批量(bulk)分离物用于以后在其它下游纯化步骤中使用。
因而，如上所述，分离过程一般是分批的过程，并在物理上和计算上与连续的上游过程分离。并且，虽然发酵必须无菌地进行，但分离(即颗粒去除和浓缩/纯化)基本上是洁净地、而不是无菌地进行。
如上所述现有技术的过程具有许多难题：
P1.由于高的产物停留时间引起的产量损失和可能的质量下降。如上所述，在可处理分离物批次之前，需要将来自连续灌流发酵的收获物收集和保存相当的一段时间。收集的收获物虽然是冷却的，但仍为复杂的和天生不稳定的蛋白产物提供了有害的环境。因此，发生了显著的产物损失，这降低了工厂生产量并提高了商品成本。此外，可能不利地影响产品质量。
P2.大的冷藏室设备或冷却容器是大收获物体积的中间保存所需的，这产生了高的基建费用并消除了灌流发酵罐的所提到的紧凑性和移动性优势。
P3.常规的浓缩/纯化技术(例如，超滤、填充床层析)具有相对低的容积通过量、显著的周转时间，并且是相对劳动密集的。结果，一般每天进行不超过1个批次过程。
P4.此外，当前的分离过程和方法在应对包括多于一个发酵罐的发酵工厂中变化的处理体积时具有计算难题。在大规模的连续灌流工厂中，可以使用变化的数目的发酵罐。
P5.此外，现有技术的分离过程是干净地运行的，但不能无菌地运行。这通常由于微生物加载问题而导致显著数量的不合格批次。
P6.使用一次性物品，例如一次性过滤器、组合件、袋子等等，虽然在人类胃肠外用品的生产中是非常理想的(例如，以避免清洗和清洗验证和其他问题)，却是非常昂贵的，通常实际上并不经济。
因此，本发明的目的是提供集成的、连续的蛋白质分离方法，其能够在无菌条件下运行持续的一段时间。
发明内容
本发明涉及从异质的流体混合物中纯化分子的新的设备和方法。更具体地，本发明涉及从异质的澄清流体混合物中纯化目标分子的过程，所述异质的澄清流体混合物中已经除去了颗粒杂质。所述过程包括以比流速(specificflow rate)通过连续的超滤来过滤异质的澄清流体混合物的步骤，所述比流速低于流量对比TMP曲线的压力依赖性区域中目标分子的转变点，其中在整个连续超滤中维持所述比流速基本上稳定。
在具体的实施方式中，本发明的方法包括使澄清流体混合物过滤通过具有一定面积的超滤膜，所述面积按平方米计近似等于所述澄清流体混合物的体积流速按升/小时计的0.1到2倍之间。在另一个实施方式中，本发明的过程包括使澄清流体混合物过滤通过具有一定面积的超滤膜，所述面积按平方米计近似等于所述澄清流体混合物的体积流速按升/小时计的0.3到1倍之间。
本发明的过程有利地允许以比流速过滤澄清混合物，所述比流速产生的壁浓度比滞留物浓度高出不到约20％、不到15％或不到10％，没有可察觉的浓度极化(concentration polarization)。
在更具体的实施方式中，本发明涉及用于连续灌流发酵、颗粒去除和纯化/浓缩的集成的、连续的和无菌的过程。在本发明的一个方面，所述过程包括通过分离过程来过滤组织培养混合物，所述分离过程在操作设定点选择性地从混合物中分离目标蛋白，来产生无菌的、无颗粒的、浓缩和部分纯化的产物分离物，所述操作设定点低于流量对比TMP曲线的压力依赖性区域中蛋白质的转变点，其中将在分离过程中的比流速在低于蛋白的转变点的水平处维持基本上恒定。
在本发明另一个方面中，所述方法是用于从异质组织培养流体混合物中纯化蛋白质的连续方法，包括：
(a)通过连续灌流发酵过程生产含有目标蛋白的异质组织培养流体混合物；
(b)将组织培养流体混合物转移到与所述连续灌流发酵过程集成的连续颗粒去除过程；
(c)在连续颗粒去除过程中从组织培养流体除去颗粒杂质来产生含有目标蛋白的澄清的组织培养流体；
(d)将澄清的组织培养流体转移到与所述连续颗粒去除过程集成的连续纯化过程；和
(e)在连续纯化过程中从澄清的组织培养流体中纯化目标蛋白；
其中在连续灌流发酵过程、连续颗粒去除过程和连续纯化过程中维持混合物的比流速基本上恒定。
在本发明的又一个方面中，所述方法是用于从异质组织培养流体混合物中纯化蛋白质的半连续方法，包括：
(a)通过连续灌流发酵过程生产含有目标蛋白的异质组织培养流体混合物；
(b)将组织培养流体混合物转移到与所述连续灌流发酵系统集成的连续颗粒去除过程；
(c)在连续颗粒去除过程中从组织培养流体除去颗粒杂质来产生含有目标蛋白的澄清的组织培养流体；
(d)将澄清的组织培养流体转移到与所述连续颗粒去除过程集成的缓冲容器；
(e)将澄清的组织培养流体间歇地转移到与所述缓冲容器集成的纯化过程；和
(e)在纯化系统中从澄清的组织培养流体中纯化目标蛋白来产生无菌的、无颗粒的、浓缩和部分纯化的、含有目标蛋白的产物分离物；
其中在连续灌流发酵过程和连续颗粒去除过程中维持混合物的比流速基本上恒定。
本发明还涉及用于从异质组织培养流体混合物分离目标蛋白的设备。在本发明的一个方面中，所述设备包括：(a)连续灌流发酵系统；(b)与所述连续灌流发酵系统集成的连续颗粒去除系统；和(c)与所述颗粒去除系统集成的连续纯化系统，其中所述设备适合于维持无菌条件。
在本发明的另一个方面中，所述设备包括：(a)连续灌流发酵系统；(b)与所述连续灌流发酵系统集成的连续颗粒去除系统；和(c)与所述颗粒去除系统集成的间歇纯化系统，其中所述设备适合于维持无菌条件。
所述纯化系统可以是，例如，超滤系统或对流吸附/脱附系统，或能够在如本文所述集成的、连续或半连续的无菌系统中从异质混合物纯化或部分纯化目标蛋白的任何其他系统。
本发明的方法和设备适合于允许以基本上恒定的流速连续处理异质流体混合物，例如细胞培养流体。在本发明的特定方面，本发明的方法和设备适合于允许以基本上恒定的流速连续处理异质的细胞或组织培养流体混合物持续连续的一段时间并贯穿整个纯化过程，所述流速低于流量对比TMP曲线的压力依赖性区域中蛋白的转变点。
在以下本发明的详述中详细地描述了本发明的这些和其他方面。
附图说明
将附图并入本说明书并作为本说明书的一部分，其说明了本发明的实施方式，并与实施方式的详细说明一起用来解释本发明的原理和它的益处。
附图1：常规的连续灌流过程、继之以3个物理上和计算上隔离的分离过程步骤(分批收获物收集、分批颗粒去除和分批浓缩/纯化)的示意图。
附图2：用于连续、集成和无菌生产的本发明装置A的2个实施方式的示意图。实施例A1的示意图显示在左侧，实施例A2的示意图显示在右侧。
附图3：用于连续、集成和无菌生产的本发明装置B的2个实施方式的示意图。实施例B1的示意图显示在左侧，实施例B2的示意图显示在右侧。
附图4：本发明集成的、连续颗粒去除系统(100)、发明性装置A和本发明装置B的元件的实施方式的示意图。
附图5：本发明装置A的其他实施方式的示意图，其组合了多个元件来提高总体工厂生产量(A3)或浓缩和分离性能(A4)。
附图6：本发明装置B的其他的实施方式的示意图。
附图7：本发明装置的其他实施例，其串联地(in series)组合了装置A和装置B的元件来提高总体浓缩和分离性能。
附图8：使用相同的商业性过滤膜盒(filter capsule)对用于连续颗粒去除(集成的连续过滤过程)的常规分批过程和本发明装置和方法的实施方式中每10”过滤膜盒的总负载容量进行比较的实施例。显示了生产重组凝血因子VIII(blood coagulation Factor VIII)的实施例方法。
附图9：压力-流量曲线(以LMH＝升/小时/m2表示的比渗透流量相对于跨膜压力)和确定操作点的实施例。圆圈显示通常的操作点，其将通过用于常规分批过程的TMP来调整。矩形显示了优选的操作区，其将通过渗透泵根据使用本发明装置A的方法来调整。
附图10：根据使用本发明装置A的方法，集成的连续UF系统(300)的停留时间分布和平均停留时间的实施例。测量具有290cm2模块(62.5cm长)的一次性连续系统、120LMH交叉流、0.2LMH滞留物流(retentate flow)、2LMH渗透物流(permeate flow)。
附图11：使用本发明装置A的实施方案从无血浆-蛋白连续灌流发酵分离rFVIII的实施例。比较本发明连续方法的平均分离产量和分批分离的平均产量，包括一个标准偏差分布。3个连续的批次被用于测定分批产量，而3个连续点(天)被用于连续过程。
附图12：本发明装置A的性能的实施例。显示了3个不同实施例的作为连续处理时间的函数的集成连续超滤系统(300)的跨膜压力和比流量。三角形＝100kD膜，重组凝血因子VIII(rFVIII)；正方形＝10kD膜，重组白细胞介素-2；圆圈＝50kD膜，遗传工程化的糖蛋白(Mr>100kD)。显示的所有实施例都来自无血浆蛋白质的连续灌流发酵。
附图13：与共表达2种蛋白产物(绿色荧光蛋白GFP和IL-2SA)的细胞系的连续灌流发酵直接偶联的本发明装置A的长期性能的实施例。显示了作为连续处理时间的函数的本发明连续超滤系统(300)的跨膜压力和比流量。使用了10kD膜。
附图14：与共表达2种蛋白产物(绿色荧光蛋白GFP和IL-2SA)的细胞系的连续灌流发酵直接偶联的本发明装置A的长期性能的实施例。使用了10kD膜。通过特异性试验测定的两种蛋白产物的浓缩因数和体积浓缩因数显示为连续处理时间的函数。
附图15：本发明装置B的性能的实施例。使用对流吸附器的接近100个连续的吸附/脱附循环的产量和压降(目标蛋白：遗传工程化的凝血因子FVIII变体；对流吸附器：商业的吸附器，Mustang Q，Pall Corporation)。
附图16：本发明装置B的性能的实施例。使用对流吸附器在典型的吸附/脱附循环期间的UV和电导率分布(目标蛋白：遗传工程化的凝血因子FVIII变体；对流吸附器：商业的吸附器，Mustang Q，Pall Corporation)。
附图17：本发明装置B的性能的实施例。上样的SDS-Page凝胶(银染)＝连续离开颗粒去除系统(100)并半连续地加载到对流吸附器系统(400)上的澄清的收获物，并显示典型的吸附/脱附洗脱物。目标蛋白：遗传工程化的凝血因子FVIII变体；对流吸附器：商业的吸附器，Mustang Q，PallCorporation)。在凝胶上跑动之前将洗脱物稀释回加载浓度。
发明详述
定义
除了在本文明确定义的，在本申请中使用的术语是本领域标准的。在此提供某些术语的以下定义，来确保权利要求的含义的清楚和明确。
单位、前缀和符号可以按它们SI接受的形式来表示。在此叙述的数值范围包括定义该范围的数字，包括并且支持所定义的范围内的每个整数。除非另作说明，术语“a”或“an”被认为意味着“其中至少一个”。在此使用的小节标题仅是为了组织的目的，不能被认为是限制所描述的主题。在本申请中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书和论文，为了任何目的通过引用以其整体明确地并入本文。
术语“澄清”和“澄清的”意思是从溶液除去颗粒物质从而使剩余溶液通过0.2μm膜。
术语“连续灌流发酵”是指稳态发酵系统或过程，其不间断地运行，并且其中通过连续添加新鲜培养基将细胞或微生物维持在培养物中处于指数生长期，所述新鲜培养基通过从生物反应器中除去细胞悬液来平衡。
术语“培育”、“培养”、“生长”、“维持”、“支持”和“扩充”是同义的，意思指细胞保持存活并能够产生子代。
术语“浓缩”的动词形式，是指从溶液中除去水，从而使剩余溶液中每体积的目标分子的量增加。
术语“浓度极化”是指由于如下因素的组合在膜表面保留的分子(胶体层)的积累：跨膜压力、交叉流速度、样品粘度和溶质浓度。
术语“连续的”是指在时间、顺序和/或运行上不间断地持续延长的一段时间。如本发明的发酵、澄清和过滤过程中所使用的，“连续的”是指该过程是物理上和计算上集成的，以允许无间断地运行延长的一段时间，足以产生无菌的、无颗粒的、浓缩和部分纯化的、含有目标蛋白的产物分离物。如本发明的过程中所使用的，术语连续的还理解为意指过程不是以分批方式进行的、或是以真正连续的方式进行的。本发明的过程能够连续运行，例如，从1天到几个月的延长的时间，而不中断过程的运行或顺序。如本发明中使用的，所述过程运行大于2、3、4、5、6或7天，2、3、4、5、6、7或8周，或3、4、5、6或更多个月的连续时间。
术语“半连续的”和“间歇的”是指集成系统的一个或多个过程或元件以间断的或分批的方式运行，而所述集成系统的其他过程或元件以连续的方式运行。例如，在本发明的某些实施方式中，纯化过程是对流吸附/脱附过程，其一般需要吸附基质的异质混合物的吸附，最终引起基质的饱和，并且其需要吸附过程和脱附的终止或者结合级分的释放。这种过程天然是间歇性的，然而能够被集成到连续的上游过程。
术语“对流吸附/脱附”是指一种层析过程其中传质主要通过对流发生。对流吸附/脱附是一种过程，其中通过将一种级分吸附到基质上随后从该基质脱附该级分来将含有目标分子的混合物的级分从混合物的另一个级分中分离。
术语“交叉流”或“流体交叉流”是指流体穿过膜表面的顶部的流动。
如有关多个系统和/或过程所使用的术语“集成的”，是指所述系统和/或过程是物理上和计算上连接的，从而构成能够连续运行的统一的系统。本发明涉及用于生产无颗粒的、浓缩和部分纯化的目标蛋白的集成的连续或半连续的系统，在本发明的系统的上下文中，集成的系统将直接地、并且以足够维持系统的不同部分之间的无菌条件的方式连接不同的部分。
术语“培养基”(复数)和“培养基”(单数)是同义的，在此可互换地使用，使用一种形式的术语不意味着排除另一种形式。
术语“混合物”是指含有目标分子例如蛋白质和各种杂质的分子和化合物的异质组合。本发明的优选的混合物是包含蛋白质的异质混合物的组织培养流体，所述蛋白质的异质混合物包括外源的目标蛋白，其最初是从连续灌流发酵过程获得的。
术语“胶体层”是指可以在膜的上部形成的分子的显微薄层。通过闭合(clogging)膜表面可以影响分子的留存，从而降低滤液流，或在恒流运行中增加TMP。
术语“目标分子”是指在流体(例如，液体)中待从溶液或悬浮液中分离的颗粒或其他分子种类。目标颗粒或分子是从所述液体分离的，并且在大多数情况下，是从流体中其他颗粒或分子分离的。待分离的目标分子的大小将决定使用的膜的孔径大小。优选的，目标分子是生物学或生物化学来源的，或由转基因的或体外的过程产生，并包括蛋白、肽、多肽、抗体或抗体片段。优选的料流来源的实例包括哺乳动物细胞培养物和微生物细胞培养物，例如细菌、真菌和酵母。还应注意的是，要滤出的种类包括不希望的多肽、蛋白、细胞组分、DNA、胶质、菌质(mycoplasm)、内毒素、病毒、碳水化合物和生物学感兴趣的其他分子，无论是否是糖基化的。
术语“渗透物”与过滤物同义地使用。
术语“产物分离物”是指无颗粒的、浓缩和部分纯化的含有目标蛋白的产物。产物分离物是一种产物，其达到的纯度和浓缩程度可与通过超滤或对流吸附/脱附过程所达到的程度相比较。产物分离物不必是同质的，但其相对于通过发酵过程产生的原始批量产物是基本上纯化的。
当涉及滤液时，术语“比流速”与术语“过滤流量”可互换地使用。比滞留物流速是按使用的膜面积标准化的(normalized)滞留物的流速。
如涉及流量所使用的，术语“基本上恒定的”是指在过滤过程期间在相当的时段中将流量维持在大略恒定的水平。
术语“组织培养流体”是指来自组织培养基的成分的异质混合物。在本发明的优选的方面中，组织培养流体来自连续灌流发酵过程。“澄清的”组织培养流体是已经过预过滤以除去细胞碎片和其他大的大分子的组织培养流体。
术语“跨膜压力”和它的简称“TMP”是指由于向膜的过滤面进料而平均施加的压力。通过TMP[bar]＝[(PF+PR)/2]-Pf来计算TMP，其中PF是进料压力，PR是滞留物压力，Pf是过滤压力。
术语“回收率”是指在处理之后可以回收的目标分子的量。通常表示为起始材料的百分比或收率。
术语“滞留物”是指不通过膜的样品的部分，也称为浓缩物。
术语“超滤”是指一种形式的过滤，其使用微孔的或半透的膜来根据不同的大小或分子量优先地分离流体或离子。超滤一般用于滤出具有大于约10,000道尔顿的分子量的分子。
本发明涉及包含连续灌流发酵、颗粒去除和纯化/浓缩的集成的、连续的和无菌的方法。在本发明的一个方面，所述方法包括通过分离过程来过滤组织培养混合物，其在操作设定点选择性地从混合物中分离目标蛋白，来产生无菌的、无颗粒的、浓缩和部分纯化的产物分离物，所述操作设定点低于流量对比TMP曲线的压力依赖性区域中蛋白质的转变点，其中在分离过程中维持比流速基本上稳定在低于蛋白的转变点的水平。
在本发明的另一个方面中，所述方法是连续的方法，包括：(a)通过连续灌流发酵连续地生产含有目标蛋白的异质组织培养流体混合物；(b)将组织培养流体混合物连续地转移到与所述连续灌流发酵系统集成的连续颗粒去除系统；(c)在连续颗粒去除过程中从组织培养流体连续地除去颗粒杂质来连续地产生含有目标蛋白的澄清的组织培养流体；(d)将澄清的组织培养流体连续地转移到与所述颗粒去除系统集成的纯化过程；和(e)在所述纯化系统中连续地从澄清的组织培养流体分离目标蛋白质来连续地产生无菌的、无颗粒的、浓缩和部分纯化的含有目标蛋白的产物分离物。
在本发明的又一个方面中，所述方法是半连续的方法，包括：(a)通过连续灌流发酵连续地生产含有目标蛋白的异质组织培养流体混合物；(b)将组织培养流体混合物连续地转移到与所述连续灌流发酵系统集成的连续颗粒去除系统；(c)在连续颗粒去除过程中从组织培养流体连续地除去颗粒杂质来连续地产生含有目标蛋白的澄清的组织培养流体；(d)将澄清的组织培养流体混合物连续地转移到与所述颗粒去除过程集成的缓冲容器；(e)将澄清的组织培养流体间歇地转移到与所述缓冲容器集成的纯化过程；和(e)在纯化系统中从澄清的组织培养流体中分离目标蛋白来产生无菌的、无颗粒的、浓缩和部分纯化的、含有目标蛋白的产物分离物，其中在连续灌流发酵过程和连续颗粒去除过程中维持混合物的比流速基本上恒定，并且平均起来等于所述集成的半连续纯化过程的时间平均的处理量。
用于实施本发明的方法的装置
本发明还涉及用于从异质组织培养流体混合物分离目标蛋白的设备。一般地，所述设备包括：(a)连续灌流发酵系统；(b)与所述连续灌流发酵系统集成的连续颗粒去除系统；和(c)与所述颗粒去除系统集成的连续纯化系统，其中所述设备适合于维持无菌条件。在本发明的另一个方面中，所述设备包括：(a)连续灌流发酵系统；(b)与所述连续灌流发酵系统集成的连续颗粒去除系统；和(c)与所述颗粒去除系统集成的间歇纯化系统，其中所述设备适合于维持无菌条件。所述纯化系统可以是，例如，超滤系统或对流吸附/脱附系统，或能够在如本文所述集成的、连续或半连续的无菌系统中从异质混合物纯化或部分纯化目标蛋白的任何其他系统。
本发明的方法和设备适合于允许以基本上恒定的流速连续处理异质组织培养流体混合物。在本发明的特定方面，本发明的方法和设备适合于允许以基本上恒定的流速连续处理异质组织培养流体混合物持续连续的一段时间并贯穿纯化过程，所述流速低于流量对比TMP曲线的压力依赖性区域中蛋白的转变点。
在具体的实施方式中，本发明提供了两种新的装置(A，B)，它们各由3个独立的但完全集成的元件组成，所有元件都具有基本的作用，并且一同形成特别有效的、连续的蛋白分离系统平台，其解决了如上所述现有技术的难题。
每个装置的三种不同的元件首先是集成的、连续的颗粒去除系统(100)、第二是无菌的缓冲容器(200)，以及第三是集成的浓缩/纯化系统(分别为300，400)。以下详细描述了全部三种元件和由此开发的新装置以及使用这些装置的方法。
为了提供蛋白产物集成的连续的或半连续的浓缩/纯化，本发明装置A(它的两个实施方式在附图2中示出)包括集成的连续的无菌超滤系统(300)，而本发明装置B(它的两个实施方式在附图3中示出)包括集成的、半连续的对流吸附/脱附系统(400)。
将本发明的装置直接地与一个或多个连续灌流发酵罐集成，从而形成新的连续的、集成的生产平台。
装置A
集成的连续颗粒去除系统(100)
附图2显示了本发明装置A的2个实施方式。集成的连续颗粒去除系统(100)直接连接到连续灌流发酵系统(1)的收获面(harvest side)。
附图4显示了本发明集成的连续颗粒去除系统(100)的实施方式的更详细的示意图，其由泵(101)、分别的压力计或传感器(107)、连接支管(102)和几个过滤器串列(train)的组合(103)组成。所有部分用柔性管和/或硬管连接。
泵(101)是常规的蠕动泵，其容许柔和地泵送细胞培养收获物而没有任何旋转部分或封口接触到无菌产物。调整泵和泵管的大小来递送细胞培养发酵系统的所需的收获物流速，其高达每天15倍生物反应器体积，例如，对于15升发酵罐高达9.4升/小时和对于200升发酵罐高达125升/小时。
设计压力计或压力传感器(107)从而它可以通过高压蒸锅或照射来灭菌。在当前的设计中，使用在不锈钢壳(housing)内的可重复使用的压阻(piezoresitive)传感器，或可重复使用的不锈钢压力计。然而，将来的改进可以包括使用可容易地通过照射来灭菌的一次性传感器。
在当前实施方式中，连接支管(102)由具有管夹(或阀门)的柔性管和适当的无菌连接器组成，所述无菌连接器容许连接其他的过滤器串列组合而不损害系统无菌性。优选的，调整管道直径大小来产生期望流速约2m/s或更低的线性流体速度，从而避免高的背压(backpressure)和剪切。在另一个本实施方式中，使用特殊的柔性管零件来代替无菌连接器，其可以使用商业上的管子焊接机来焊接而不损害无菌性。这种管零件由PVC或其他适合的聚合物制成。
过滤器串列组合(103)由至少两个、优选多个相同的过滤器串列组成(如示意图所示)，在任何给定时间仅有一个过滤器串列开启，例如图4中的实施例所示(105)。
每个过滤器串列由至少一个过滤器组成，优选由串联的一个预过滤器和一个终过滤器组成(如附图4所示)。如果需要提高特殊应用的能力，每个过滤器串列(105，106等等)本身也可以由多个平行的过滤器或过滤器串列组成(未显示)。
在附图4所示的本发明的实施方式中，组合的第二过滤器串列(106)分别通过压力敏感的破裂片(rupture disc)或破裂栓(rupture pin)隔离(104)。在操作中，破裂片或破裂栓的功能是一旦第一过滤器串列(105)的压力达到规定极限自动地打开向第二过滤器(107)的流动路径，从而确保不中断的过滤过程延续。在本发明系统中使用商业上可获得的破裂片或破裂栓，其也被另外用于提供安全压力释放。在本实施方式中，使用具有不超过16PSI的指定破裂压力极限的破裂片或破裂栓，这被证明是非常有用的。然而，一定范围的指定压力极限是可能的。
过滤器串列组合的每个另外的过滤器串列也通过手动或自动阀以及另一个破裂片或破裂栓来隔离。一旦运行了第二个过滤器串列(106)，通向下一个破裂片或破裂栓的阀门分别被打开，从而下一个过滤器串列可以作为备用，并以此类推。
在可替换的实施方式中，专门地使用自动开动的阀门，在操作中，控制系统根据压阻压力传感器(107)的输入来开动阀门，所述压阻压力传感器也可以通过高压蒸锅灭菌。然而，申请人发现，分别包含破裂片或破裂栓的本设计提供了长期运行中的突出的鲁棒性(robustness)。
终过滤器等级是至少3μm或更小，优选0.45μm，再优选0.2μm。因此运行的过滤器串列(6)保留了所有残余细胞以及相关的细胞碎片和其他颗粒，这产生无颗粒的输出流(9)，澄清的组织培养流体(cTCF)。
可以使用不同的商业上可获得的过滤材料。在当前的设计中，使用一次性过滤器膜盒，例如Sartopure或Sartoclear预过滤器膜盒(Sartorius，Goettingen)和Sartobran终过滤器膜盒(Sartorius，Goettingen)，其可以通过高压蒸锅或照射来灭菌。
作为本发明装置的当前实施方式的实例，设计为1升/min的流速，组合(103)的每个过滤器串列(105，106等)由3个30＂预过滤器膜盒(KleenpakUltipleat，Pall Corp.，4.5um速率(额定的)，每个0.75m2)继之以3个20″终过滤器膜盒(Sartobran P，Sartorius，0.45um/0.2um(额定的)，每个1.3m2)组成。已经发现这个具体的实施方式对于重组凝血因子VIII以及包括删除B结构域的FVIII的遗传工程化的FVIII变体的大规模生产特别有用。
然而，申请人已经发现，当使用本发明装置和方法时，使用来自不同厂家(Pall，Sartorius，Cuno)的各种可用的过滤材料和结构的颗粒去除效果是一致的，与相应的常规分批方法相比显著地改善。
因此，新的本发明装置和方法对于使用新的过滤器类型和几何结构也有益处，例如使用增加了每个膜盒的可用过滤面积的过滤器类型，以及使用提供了交叉流模式或使块堆积(cake built-up)最小化的其他手段，例如振动或过滤器元件旋转的其他过滤器类型。
在本发明方法的另一个实施方式中，过滤器串列组合(103)仅包含一个分别由破裂片或破裂栓关闭的无菌备用过滤器串列，但仍有多个过滤器串列用于运行。组合的第一过滤器串列运行直到已经处理了指定的预定负载体积，在这之后运行被(人工地或自动地)切换到组合中的下一个过滤器串列。指定所述特定负载体积，从而在正常运行状态下不超过破裂片或破裂栓的压力极限。然而如果在过滤期间压力比平常增加更多，例如，由于收获物的不正常的低滤过率，一旦超过指定的压力，通过打开备用过滤器串列再次确保不中断的连续过滤。在打开备用过滤器串列之后，过滤被切换到组合的另一个过滤器串列，并安装具有破裂片或破裂栓的另一个备用过滤串列而不损害系统的无菌性。
本领域技术人员公知的是，为了保持分批颗粒去除过程的过滤器成本和处理时间最小，需要调整分批过滤器串列的大小来具有提供期望的绝对流速(以升/小时表示)和最大压力所需的最低可能的过滤面积。而期望的绝对流速必须足够高以提供对期望的分批体积的可行的处理时间。这天然地需要高的比流速(以升/小时/m2过滤面积表示)。
与可比较的优化的分批过滤系统相比，将本发明的装置设计为低几倍(several fold lower)的比流速，其保持恒定(以升/小时/m2安装的过滤面积表示)，从而绝对流速等于连续灌流发酵的收获物流速。
申请人出人意料地发现，在这种低的比流速下，可被处理通过过滤器的体积不成比例地高于分批过程中调整的流速。
重要的是注意到，在常规的分批分离过程中，由于极端的过滤面积(和因此的成本)或者过低的绝对流速，这种低的比流速不是可行的。这主要是因为大多数时候分批颗粒去除设备是空闲的而收获物正在被收集用于下一个分批。此外，本发明方法在可实现的过滤能力方面令人惊讶的不成比例的增加允许过滤器消耗和由此的生产成本的显著减少。
缓冲容器(200)
集成的连续颗粒去除系统的出口直接并时常地连接到缓冲容器(201)，如附图2所示。这个缓冲容器是无菌的容器，例如，具有至少一个入口和一个出口的一次性袋子或不锈钢容器，出口优选的位于容器的底部。可以使用范围宽广的容器大小和设计。然而，优选将缓冲容器的大小设为系统的体积通过量小，以保持产物在容器中的停留时间最小，即，低于24小时，优选低于8小时，更优选低于4小时。
申请人发现，由于本发明的装置才唯一可能实现的这种低的产物停留时间，容许天然不稳定的蛋白产物的产量方面的显著增加，从而解决了现有技术的难题之一。
在本发明装置的一些实施方式中，所述缓冲容器位于平衡或负载单元(loading cell)(202)上，如附图3中装置B1和B2所示。这种平衡或负载单元为计算机化的控制系统(未显示)提供了重量信号。
此外，在本发明装置(B2)的实施方式中，缓冲液容器(204)经由蠕动泵(203)连接到所述缓冲容器。在运行中，这种机构(set-up)被用于通过添加适合的缓冲液或稀释剂来调整无颗粒收获物流的性质，例如电导率(离子强度)或pH。在这种情况下，使用任选的混合系统(205)和传感器来监测期望的条件(206)，例如pH或电导率。在本设计中，使用磁性偶联的搅拌器；然而，也可以使用其他混合系统，例如摇动器或脉动装置。
集成的连续浓缩/纯化(300)
装置A，它的2个实施方式在附图2中示出，其包括集成的连续的、无菌的超滤系统(300)。连续的无菌超滤系统的实施方式包括循环泵(301)和循环回路(306)、一个或多个无菌交叉流超滤模块(303)、渗透物泵(305)、平衡或负载单元(309)上的无菌渗透物接受容器(307)和滞留物泵(311)。此外，它包括入口压力计或传感器(302)、渗透物压力计或传感器(304)、出口压力计或传感器(308)以及循环流量计(310)形式的检测设备。在运行中，系统出口(312)提供了浓缩和部分纯化的蛋白产物的连续流，其可以被连续地收集、冷冻或进一步处理。
本发明实施方式A2另外包括缓冲液或稀释剂容器(314)、蠕动的缓冲液/稀释剂添加泵(313)，以及流通传感器来监测再循环回路中浓缩物的调节，例如pH和电导率(315，316)。在运行中，这种机构被用于通过添加适合的缓冲液或稀释剂来调整无颗粒收获物流的性质，例如电导率(离子强度)或pH。这种机构也可以用于添加蛋白稳定剂。虽然在本发明实施方式A2中再循环回路本身作为混合室(mixing chamber)，可选地也可以通过使用装置B(实施方式B2)所示的缓冲容器机构来进行调节，其包括本公开中稍后讨论的部分(203、204、205、206)(参见装置B的说明)。
本发明装置的实施方式还包括数据记录和可编程控制系统，其记录来自检测设备的输入数据信号(例如，但不限于，压力、流速、容器重量、pH、电导率)并根据预定的控制算法控制泵速度。
所有的泵(301、305、311、313)都是蠕动泵，其容许泵送相应的流体流而没有任何旋转部分或封口接触到无菌产物流。申请人发现，这优选地提供了稳固的无菌长期运行。然而，原则上也可以使用其他的无菌泵设计。调节循环泵(recycle pump)(301)和它的泵管的大小来容许稳固地在80到800升/小时每m2安装膜面积之间调整期望的交叉流速率，这取决于所使用的超滤模块的传质特性。调整渗透泵的大小以容许在90％和99％的连续灌流发酵收获物流速之间稳固而精密地调整比渗透流量。调整滞留物泵的大小以容许在1％和10％的连续灌流发酵收获物流速之间稳固而精密地调整滞留物流动。
使用密封的超滤模块(303)以容许稳固的无菌运行，并通过高压蒸锅或照射来灭菌。根据目标蛋白产物的分子量来选择最佳的标称分子量截留(cut-off)，并且必须通过本领域技术人员已知的标准实验来证实。可以使用各种膜材料，例如，聚醚砜、亲水化的聚醚砜或再生纤维素，只要可以通过照射和/或高压蒸锅来灭菌完整的膜模块而不损伤膜。预期的是，亲水性材料因为它们更低的淤塞倾向可以提高效率。
申请人发现，如果安装的总超滤膜面积按平方米计等于连续灌流发酵的收获物的体积流速按升/小时计的0.1到2倍之间，则装置A是特别地有效的。例如，对于1升/小时的灌流收获物流速，安装的总膜面积应在0.1和2平方米之间。申请人发现，如果安装的超滤膜面积按平方米计等于连续灌流发酵的收获物的体积流速按升/小时计的0.3到1倍之间，装置A是更有效的。
在本发明的一个实施方式中，使用商业上可获得的“一次性”中空纤维膜模块(GE Healthcare，以前的Amersham Biosciences)。然而，可以使用各种密封的(encapsulated)膜和模块设计，例如螺旋卷绕模块、由于二次流型(例如涡流)具有增强的传质的密封的盒或膜盒、旋转元件(例如动力学圆盘过滤器)或振动过滤器。预期的是，在本发明装置中可以有益地使用特别密封的超滤盒，因为它们在相对低的所需交叉流速率下提供了高传质系数，从而降低泵能力，同时保持低的系统复杂性和投资成本。
与仅仅的无菌运行相比，本发明装置容许不仅是连续的而且是真正无菌的运行。通过将所有接触产物的系统部分设计为可经受不仅是清洗、而且是通过高压蒸锅、原地的(in place)蒸汽或γ照射的灭菌，申请人实现了这一点。在本实施方式中，使用一次性密封模块用于连续颗粒去除(100)以及连续超滤(300)。使用蠕动泵来避免任何产物与旋转元件和机械封口接触。此外，在本实施方式中，使用一次性的管和袋子组合来代替硬管。预装配且一起灭菌一次性接触产物的部分(例如，管、袋子、模块)或部分组，从而简化了启动和操作。设计系统以使无菌系统对环境(例如，层流罩)的任何可能的开放，如用于采样，袋子或检测设备交换保持为最小。在装置的本实施方式中，设计丰富的支管以容许从一个无菌部分(例如，产物接收袋子)切换到下一个而不打开。优选通过使用无菌的管子焊接机而不是无菌连接器来进行管、模块或袋子的其他交换。
本发明装置的其他将来的实施方式还包括部分(component)，例如不锈钢容器、过滤器外壳、或导管，其可以单独地或与一次性部分组合来就地灭菌，只要确保了长期运行的鲁棒性和无菌性。
设计本发明装置A的其他实施方式来处理来自更大的制造工厂中多个发酵罐的材料(A3)。在附图5中示意性地显示了一个实施例。通过串联组合2级连续超滤系统(300)，设计进一步的实施方式以提高总的浓缩因数和分离性能(A4，在附图5中示意性地显示)。
使用装置A的方法的描述
在长的时间段(一个炉期(campaign))，一般在2周到6个月或更久，运行连续灌流发酵。使用装置A连续地处理含有产物、细胞和细胞碎片的组织培养流体(TCF)。产生无菌的、无颗粒的、浓缩和部分纯化的产物流(“产物分离物”)并在装置的出口(312)连续地离开装置。通过使用连续的、无菌颗粒去除系统(100)的泵(101)，以期望的发酵的灌流收获物流速Qh将收获物连续地泵送通过过滤组合(103)。
连续过滤系统的输出流，即澄清的组织培养流体(cTCF)连续地进入缓冲容器(201)。从缓冲容器中，通过连续的、无菌超滤系统(300)以等于从连续灌流发酵到来的流速的流速连续地处理cTCF。由于缓冲容器尺寸相对于调准的流速较小，在容器中产物的平均停留时间被保持最小，即，低于12小时，优选低于4小时，更优选低于2小时。
在超滤模块中通过循环泵(301)来调节足够的交叉流和由此的物质转移。通过使用滞留物泵(311)来调节和控制滞留物流速，因而产生浓缩产物分离物离开装置A出口(312)的恒定而连续的流速Qi。使用渗透泵(305)来调节和控制渗透物的流速Qp，所述渗透物从超滤模块的渗透物面连续地抽出，并且其由小到足以通过超滤膜的水和溶液成分(例如，盐、小的蛋白)组成。
小心地调节和控制渗透物的流速(Qp)和滞留物/分离物的流速(Qi)以匹配发酵的收获物流速Qh，从而：
Qp+Qi＝Qh
同时，调节和控制流速从而通过满足以下来达到期望的浓缩因数cf：
Qi＝1/cf*Qh
例如，为了达到分离物对比最初的收获物浓缩物中10倍的期望产物浓缩因数，使用滞留物/分离物泵(311)将Qi控制在Qi＝1/10*Qh，而使用渗透物泵(305)将Qp控制在Qp＝0.9*Qh。
由于流出速率由泵(305)和(311)控制，超滤系统自动地从小缓冲容器(201)中抽出Qp+Qi的流动。
在使用实施方式A2(参见附图2右侧)的情况下，将来自容器314的缓冲液或注射用水的无菌流使用缓冲液添加泵(313)以恒定流速Qb连续地添加到连续超滤系统。因此，可以自由和连续地调节分离物的条件，例如，对于离子强度、pH、稳定剂的添加等等来说。因而流速被控制在
Qp+Qi＝Qh+Qb
此外，可以选择流速比例，从而通过满足Qi＝1/cf*(Qh+Qb)来达到期望的浓缩因数cf。可选择地，通过设置Qi＝Qh+Qb，这个过程可以仅用于改变条件(例如pH、电导率)。
对于超滤本身的操作设置点而言，使用装置A的新方法还与UF分批过程(现有技术)形成对比。常规的分批UF过程被设计用于在短时期内一定通过量穿过低的膜面积。因而分批UF一般在依赖于传质受控区的压力转变点处运行(参见附图9)。这产生了期望的高初始比流量，然而在数秒到数分钟的过程中它显著而快速地降低，因为浓度极化快速地引起了渗透背压和边界凝胶层(次级膜)的形成。大分子的这种高的壁浓度还引起了化合物对膜表面的内部和外部的吸附增加，即引起膜淤塞。这种淤塞将随着时间进一步降低渗透物流量。
申请人令人惊讶地发现使用装置A，通过在压力-流量曲线的低端运行实现了每份安装的超滤膜面积高许多倍的总体加载能力(参见附图9)：
完全保留的成分的标准化壁浓度cwall可以描述如下：
C wall = e J k d · C bulk
其中
J＝以升/小时/m2表示的比渗透流量
kd＝以升/小时/m2表示的传质系数
cbulk＝溶液本体中成分的浓度
像分批UF中一样，以优化传质系数运行连续UF以使浓度极化最小化。然而，与分批超滤相比，申请人将渗透物流量J调节到处于压力-流量曲线的低端(参见附图9)。作为指数关系的结果，膜表面上的壁浓度cwall因此显著地低于分批超滤中的情况。例如，本发明方法的本实施方式将目标比渗透物流量调节为可实现的传质系数的约1/10，从而将壁浓度调节到仅比调节的本体(或滞留物)浓度高10％。
以下表1显示了使用装置A(实施方式A1)用于连续分离来自改进的规模发酵罐的蛋白产物的方法的实施例。
表1
使用装置A的本实施方式用于连续分离
来自连续灌流发酵的蛋白产物的方法的实施例
 
运行参数 目标
来自连续灌流的收获物流速Qh(用泵101控制) 5升/小时(120升/天)
渗透物流速QP(由泵305控制) 4.75升/小时
 
滞留物(产物分离物)流速Qi(由泵311控制) 0.25升/小时
比渗透物流量J 2升/小时/m2
浓缩因数cf 20倍
对于每种独立的产物分子，例如根据跨膜压力，可以为无菌连续超滤机构定义寿命指标。一旦超过了跨膜压力极限，将连续无菌超滤机构交换为另一个同样的机构而不损害系统的完整性和无菌性。通过使用支管和无菌连接器、或通过使用一次性柔性管和无菌管焊接机，可以与连续无菌过滤机构类似地进行它。
装置B
集成的连续颗粒去除系统(100)
附图3显示了本发明装置B的2个实施方式。集成的连续颗粒去除系统(100)直接连接到连续灌流发酵系统(1)的收获面。装置B的这个部分与装置A相同(参见上述装置A和附图4的详细说明)。
缓冲容器(200)
集成的连续颗粒去除系统的出口直接而通常地连接到缓冲容器(201)，如附图3所示。这个缓冲容器是无菌的容器，例如，具有至少一个入口和一个出口的一次性袋子或不锈钢容器，出口优选的位于容器的底部。可以使用范围宽广的容器大小和设计。然而，优选将将缓冲容器的尺寸设为比系统的体积通过量小，以保持产物在容器中的停留时间很短，即，低于26小时，优选低于12小时，更优选低于4小时。
在装置B中，所述缓冲容器位于平衡或负载单元(202)上，如附图3中实施方式B1和B2所示。这种平衡或负载单元为计算机化的控制系统(未显示)提供了重量信号。
此外，在本发明装置(B2)的实施方式中，缓冲液容器(204)经由蠕动泵(203)连接到所述缓冲容器。在运行中，这个机构被用于调节无颗粒收获物流的性质，例如电导率(离子强度)或pH，通过添加用于修饰接受自颗粒去除系统的澄清组织培养物的性质的成分，例如，适合的缓冲液或稀释剂，或适合的蛋白稳定剂。在这种情况下，本实施方式也包括混合系统(205)并且使用传感器来监测期望的条件(206)，例如pH或电导率。在这个本实施方式中，使用磁性偶联的搅拌器；然而，也可以使用其他混合系统，例如摇动器或脉动装置。
在本发明装置的其他实施方式中，使用2个缓冲容器。在任何给定时间，将一个缓冲容器直接连接到连续颗粒去除系统(100)，从而接受澄清的液体，而另一个被连接到半连续的浓缩/纯化系统(400)，从而为对流吸附/脱附循环供料。两者之间的切换通过控制系统来实现，一旦达到它的最大填充体积就使用接受容器的重量来触发切换。
集成的半连续浓缩/纯化(400)
装置B，它的2个实施方式在附图3中示出，包括集成的半连续的、对流吸附/脱附系统(400)。
所述集成的半连续对流吸附/脱附系统被设计和调整大小，以使它的加载流速(Qload)显著地高于连续灌流收获和连续过滤处理的流速(Qh)，即，Qload>>Qh。
集成半连续浓缩/纯化系统(400)的实施方式包括加载泵(401)、多口阀门组合(402)和几个缓冲液罐(404)、连接到无菌废物接收容器(413)和一个或多个对流吸附器模块(406)的3通阀门(403)、入口和出口压力计或传感器(405，408)、进一步的检测设备例如UV感应器(409)、pH和电导感应器(409，410)、流量计(412)、以及也连接到废物容器(413)和产物洗脱液出口(414)的另一个3通阀门(407)。
本发明装置的实施方式还包括数据记录和可编程控制系统(未显示)，其记录来自检测设备(例如，但不限于，压力、UV、pH、电导率、流速、缓冲容器重量)的输入数据信号并根据编程的协议控制自动化阀门和泵。
加载泵(401)优选是蠕动泵以避免产物或无菌缓冲液与任何封口或机械部分的直接接触。申请人发现，优选提供了稳固的无菌长期运行。然而，原则上也可以使用其他的无菌泵设计。根据对流吸附器(406)的安装的基质体积调整加载泵的大小以容许稳固地调节至少12倍基质体积/分钟。例如，在一个当前的实施方式中，使用具有约0.3升基质体积的Mustang膜吸附器膜盒(Pall Corp.)。因此，调整加载泵的大小以容许多达3.6升/分钟的加载流速。
多口阀门组合(402)的功能是容许在抽自缓冲容器(201)的含产物的负载和来自无菌缓冲液容器(404)的每种无菌缓冲液和清洗溶液之间的切换。装置B的当前实施方式使用了一系列自动启动的夹阀(pinch valve)，其从外面夹住连接到每个缓冲液容器的柔性管以关闭和打开每条线路。申请人发现，这些夹阀提供了装置B的特别有益的解决方案，因为它们避免了任何产物接触并因而不需要清洗或灭菌。然而，可以使用范围广泛的适合于无菌处理且被本领域技术人员熟悉的商业性阀门，例如开启的膜片阀(membrane valve)。
在当前实施方式中，3通阀(403，407)是可自动开启的膜片阀。然而，原则上可以使用适合于无菌处理的各种商业性阀门，包括例如夹阀。
对流吸附器模块(406)含有层析基质，具有产物对吸附性表面的显著的对流传质，以及与常规的层析相比，在运行前通过高压蒸锅、蒸汽或照射来灭菌。与常规的填充床层析相比，显著的对流传质容许极低的吸附/洗脱/再生循环次数，申请人在本发明装置中利用它来实现半连续运行。
在本发明装置的当前实施方式中，对流吸附器(406)由具有离子交换化学作用的一个或多个商业上可获得的膜吸附器膜盒(Mustang，Pall corporation或Sartobind，Sartorius)组成。然而，该装置可以使用其他膜吸附器材料和结构和新的对流基质，例如单片基质，因为与常规层析树脂相比，取消了装填并且基质可以基本上密封在即可使用的(ready-to-use)模块中。
此外，其他化学作用，包括包含特异性结合产物的配体的对流亲合性基质在本发明装置中也将产生特别有益的性能。
在本发明装置的一个实施方式中，多个对流吸附器模块以类似于连续颗粒去除系统(100)的平行的对流吸附器串列的组合的形式用于该装置中。将具有所有吸附器串列的完整组合一同灭菌，如通过预先定义的指标，例如加载期间的背压或进行运行循环的最大次数所确定的，当第一个吸附器达到它使用寿命的末尾时，容许在运行中从一个吸附器串列切换到一个新的。每个吸附器串列由一个单独的模块或多个平行的和/或串联的对流吸附器模块组成，以提高结合力和/或改善容量利用。
重要的是要强调，与仅仅的无菌运行相比，本发明装置容许不仅是连续的而且是真正无菌的运行。通过将所有接触产物的系统部分设计为可经受不仅是清洗、而且是通过高压蒸锅、原地的蒸汽或γ照射的灭菌，申请人实现了这一点。在当前实施方式中，使用一次性密封模块用于连续的颗粒去除(100)以及半连续的无菌对流吸附/脱附(400)。使用蠕动泵来避免任何产物与旋转元件和机械封口接触。此外，在当前实施方式中，使用一次性的管和袋子组合来代替硬管。预装配且一起灭菌一次性接触产物的部分(例如，管、袋子、模块)或部分组，从而简化了启动和操作。设计系统以使无菌系统对环境例如，层流罩)的任何可能的开放(，如用于采样，袋子或检测设备交换保持为最小。在装置的当前实施方式中，设计丰富的支管以容许从一个无菌部分(例如，产物接收袋子)切换到下一个而不打开。优选通过使用无菌的管子焊接机而不是无菌连接器来进行管、模块或袋子的其他交换。
本发明装置的其他将来的实施方式还包括部分，例如不锈钢容器、过滤器外壳、或导管，其可以单独地或与一次性部分组合来就地灭菌，只要确保长期运行的鲁棒性和无菌性。
设计本发明装置B的其他实施方式来处理来自更大的制造工厂中多个发酵罐的材料(B3)。在附图6中示意地显示了一个实施例。通过串联组合多个对流吸附/脱附系统(400)，及之间各自的无菌缓冲容器(200)，来设计本发明装置B的进一步实施方式来提高总体浓缩因数和分离性能(参见附图6，B4)。
通过经由另外的缓冲容器来串联组合连续超滤系统(300)和半连续对流吸附/脱附系统(400)，来设计本发明装置的更进一步的实施方式来提高总体浓缩因数和分离性能。在附图7中示意地显示了一个实施方式的实施例。
使用装置B的方法的描述
在长的时间段(一个炉期)，一般在2周到6个月或更久之间，运行连续灌流发酵。使用装置B连续地处理含有产物、细胞和细胞碎片的组织培养流体(TCF)。产生无菌的、无颗粒的、浓缩和部分纯化的产物流(“产物分离物”)并在装置的出口(414)连续地离开装置。通过使用连续的、无菌颗粒去除系统(100)的泵(101)，以期望的发酵的灌流收获物流速Qh将收获物连续地泵送通过过滤组合(103)。
连续过滤系统的输出流，即澄清的组织培养流体(cTCF)连续地进入缓冲容器(201)。
每当缓冲容器被填充到预定水平时，重量或水平信号自动地触发集成的无菌半连续浓缩/纯化系统的吸附/脱附循环。缓冲容器中收集的材料被快速地加载到吸附器机构上，即，在4小时内、优选在2小时内、更优选在1小时内或更短，因而清空缓冲容器。
在附图3所示的当前实施方式中，在相同的小缓冲容器中，无颗粒澄清组织培养流体(cTCF)的收集持续全部时间。小缓冲容器中的体积因而在最小和最大值之间变化。在前文描述的另一个实施方式中，收集在2个相同的缓冲容器之间来回切换。
当cTCF继续被收集在缓冲容器中时，加载的吸附器经历了更多步骤的预定层析规程，所述规程被设计以将浓缩的、纯化形式的目标产物脱附，以及为下一个加载循环准备吸附器。因而，整个循环包括加载、洗涤、洗脱、再生和重新平衡，其中每一步使用一种或多种适合的缓冲液。
再次因为由于对流吸附器的性质而使这些步骤中的流速可以很高，总循环时间被保持很短，即，低于6小时，优选低于3小时，更优选低于1.5小时。因此，设计集成系统使得吸附器机构在缓冲容器被再次填满之前准备好下一个加载循环，从而容许半连续运行。
以下的表2显示了使用本发明装置B的当前实施方式用于分离重组人类凝血因子VIII的方法的实施例(显示了大规模数据)。该方法被证明是特别有益的。每个吸附/脱附循环的产率和性能与分批的类似，由于更低的产物保留时间，总体产物产率提高了超过10％并因而使产物降解最小化。相同的方法也被证明是对于遗传工程化的FVIII变体，包括缺失B结构域的FVIII的分离是非常有益的，所述缺失B结构域的FVIII在大小和其他特征方面显著不同于全长FVIII。预期它对于其他蛋白和生物分子的产生也是有用的。
可以在分批层析实验中为每个单独的分子开发层析规程本身(缓冲液化学作用&顺序、加载体积和流速)，因而可以容易地转换以用于本发明装置的实施方式。
表2
使用装置B的当前实施方式用于连续分离
来自连续灌流发酵的FVIII和FVIII变体的方法的实施例
 
参数 目标
连续灌流的收获物流速Qh[l/d] 2000
缓冲容器：最大工作体积Vs[l] 200
加载体积[基质体积] 600
装置B中安装的吸附器基质体积[ml] 260
加载流速[基质体积/min] 12
加载体积[l] 156
加载时间[min] 50
总层析时间[h](规程包括加载、洗涤、洗脱 1.5
 
和几个再生/重平衡步骤)
吸附器的空闲时间/循环[h] 0.372
循环/24小时周期 12.8
收集时间[h] 1.872
装置中的大约平均产物停留时间(收集时间+加载时间+洗脱时间) 2.7
对于每种独立的产物分子，可以为对流吸附器机构定义寿命指标，例如根据加载期间的压力或回收率。一般地，指定并验证循环的最大次数nmax。一旦吸附器机构已经在半连续运行中使用直到nmax个循环，它被交换为另一个相同的吸附器机构而不损害系统的完整性和无菌性。在当前实施方式中，通过使用支管和无菌连接器、或通过使用一次性柔性管和无菌管焊接机，可以与连续无菌过滤机构类似地进行它。
当使用附图3右侧所示的本发明装置的实施方式时，使用缓冲液添加泵(203)从无菌容器(204)连续地或者间歇地添加缓冲液、pH调节溶液、稳定剂溶液或注射用水的无菌流。因此，可以自由地调节cTCF的条件，例如，离子强度、pH、稳定剂的添加等等。
发明益处
本发明装置和使用装置的各种方法解决了先前描述的常规分离过程的难题(参见本发明的一般背景)。
在装置A和B的所有实施方式和使用这些装置的相应方法中，使产物在可能有害的环境中的停留时间特别地最小化，其显著地增加了天生不稳定的复杂生物产物的产量和质量。可以提高工厂生产量和降低产品成本。
此外，这些装置和各种方法消除了用于大的收获物体积的中间存储的大型冷藏室设备或冷却容器的需要，从而降低了工厂投资成本并完全实现了灌流发酵的紧凑性和移动性优势。
与常规的、劳动密集型分批处理相比，由于天然高程度的自动化，两个本发明装置的实施方式和相应的方法降低了劳动力成本。新的装置容许在长时间连续运行(一天24小时)，这使得体积通过量和设备利用率最大化。
此外，本发明装置消除了在一个或多个发酵罐的工厂中的计算难题。这些实施方式可以处理来自一个或多个连续灌流发酵的材料。
重要地，由于新的装置和方法容许完全无菌地运行，消除了微生物加载问题以及内毒素问题，这是通过防腐处理继之以简单无菌过滤所不能实现的。
此外，本发明装置允许避免或最小化由于利用一次性物品的清洗验证的需要。通过本发明装置和方法的独特特征，一次性模块以及管、袋子和组合都能长时间使用(直到炉期的完整长度)，从而显著地降低成本并使得一次性物品的利用从经济角度是高度吸引人的。
本发明装置A和B以及相应方法的当前实施方式已经被证明对于生产重组凝血因子VIII、以及FVIII的遗传工程化的形式，包括但不限于缺失B结构域的FVIII是特别有用的。然而，可以清楚地预计本发明对于生产其他蛋白和生物分子，特别是天然不稳定的蛋白，例如因子VII、因子IX、因子X等等，是同样有用的。
装置A和相应方法的益处
附图8显示了申请人所发现的集成连续颗粒去除元件(100)令人惊讶的过滤能力提高的实施例。
附图10显示了在本发明装置A的实施方式的连续UF系统(300)中产物的典型的停留时间分布和平均停留时间，如使用通常条件下的模型蛋白通过滞留物在280nm的UV吸收所测定。可以看出，产物在系统中的平均停留时间仅约40分钟。因此，装置A的当前实施方式中产物从发酵罐收获物线路到最终浓缩的滞留物(分离物)的总停留时间，被保持在1-2小时或更短之内。这低于常规分批分离过程中28小时或更长的停留时间的1/10，其中产物(收获物)被收集至少24小时(到几天)，之后产物被处理一般至少4-10小时。
附图11显示了用于常规的分批分离过程(分批过滤加分批UF)和使用本发明装置A和相应方法，从无血浆蛋白连续灌流发酵产生的重组凝血因子(rFVIII)得到的总分离收率的比较。从附图可以看出，本发明连续过程实现了显著更高的产物产率，其可以导致生产能力增加和生产成本减少。
在使用装置A的本发明方法中，集成的连续超滤的跨膜压力将随时间增加，而比膜流量(以升/小时/m2/巴表示)以恒定的体积通过量降低。这是所有超滤过程共有的，并且是由于如浓度极化、凝胶层形成和淤塞的影响。然而，与分批超滤相比，从图12的实施例可以看出，使用装置A时压力和比流量的变化是极其缓慢的，在膜需要清洗或更换之前容许一次连续运行数周。此外，系统的变化率和总体性能对于生产的产物或连续灌流发酵中使用的细胞系相当不敏感(图12)。因此，本发明装置A和相应方法理想地也适合作为各种蛋白的快速生产的一般性平台，因为它用来自不同细胞系的各种目标蛋白稳固且可以预见地运行。
令人惊讶地，申请人发现，使用装置A时凝胶层形成和淤塞的消极效果实际上被最小化到这样的程度，从而在过滤器的清洗和更换成为必需之前每安装的超滤器面积可以处理大得多的总体积。附图13显示了本发明装置A在长期运行中的鲁棒性能。在约25天之后，跨膜压力令人惊讶地看起来稳定在似稳状态，暗示了甚至更高的长期性能。在第27天，将滞留物流速有目的地加倍来测试更高通过量的影响。在34天之后，使用无菌的0.5M NaOH不打开系统进行短暂冲洗，因而维持整个系统的完整性和无菌性。此后，再次稳定TMP，或至少仅以非常低的速度提高。在连续的无菌运行70天后，有目的地将循环流速降低到一半来测试对系统性能的影响。如所预计的，由于降低的传质和因此在膜表面壁浓度的提高，TMP开始以稍微高一些的速率提高。然而，在系统关闭之前成功而稳固地完成了95天的运行。每m2的膜面积处理了总共接近4500升，使用最小的人工劳动(仅每天采样)。比较起来，优化的常规分批超滤过程对于相同的应用具有低45倍(45-fold less)的加载能力，约100l/m2，并且需要至少1-2位全时操作员。
同样令人惊讶地，本发明装置A、特别是它的集成连续超滤系统(300)的选择性被证明显著地高于常规分批过程的选择性。熟悉本领域的人员公知的是，在常规的分批超滤中，在处理的初始阶段中从滞留的大分子形成了次级膜(凝胶层)，其降低了表观分子量截留。结果是，目标分子和较小的污染蛋白被保留，这使得有意义的同时净化几乎不可能。因此，使用常规的分批超滤，几乎不能分离就其分子量而言低于10的因数间隔的蛋白。然而，从附图14可以看出，使用本发明的集成连续超滤过程，有可能调整条件来有效地分离IL-2SA(约16kD)和绿色荧光蛋白GFP(27-30kD)。这种高出预期的分离性能确实允许同时浓缩和纯化。
装置B和相应方法的益处
附图15说明了本发明装置B的性能。使用商业的对流吸附器(Mustang Q，Pall Corporation，15层模块)，已经进行了接近100次连续的吸附/脱附循环，从而从连续灌流培养物中浓缩和纯化重组FVIII变体。达到的平均产量是大约95％(分布由试验变动引起)，而压力在进行完整数目的循环期间保持相对恒定。因此，可以确定，在交换吸附器机构之前，可以进行至少100个连续循环。
在使用本发明装置B的方法的详细说明中已经显示，在将产物以浓缩的、纯化的和稳定的形式洗脱在合适的缓冲液中之前，在当前实施方式中产物的总平均停留时间低于3小时。这显著地低于一天进行一次的常规分批分离过程中超过24小时的停留时间，因而得到了天然不稳定蛋白产物的显著更高的产率。在之前描述的当前实施方式中，每天进行约13个循环，这意味着在附图15的环境(context)中，半连续吸附器组合仅需要每7-8天进行交换，这在不损害运行的无菌性和连续性的情况下完成。
附图16显示了使用装置B时单个典型的吸附/脱附和再生循环上UV和电导率分布的实施例。可以看出，可以加载超过450倍吸附器体积(CVs)，而产物在非常尖的峰中洗脱。在加载阶段中、以及在洗涤和清除(strip)(再生阶段)期间，在流过物(flow through)中显著地除去了杂质。
附图17说明了包含半连续的对流吸附/脱附的本发明过程的纯化性能。显示了FVIII变体的SDS page凝胶的实施例。可以看出，包括95％加载的FVIII变体(如通过独立的活性分析测定的)的洗脱物级分，含有比加载物显著更少的蛋白，因而得到纯化。在洗脱液(分离物)中没有看到其他的降解条带，表明了极好的产物质量。
总之，本发明装置B能够实现与分批过程可比较的相似纯化性能，而由于产物停留时间的最小化同时使天然不稳定的蛋白产物的产率损失，以及产品质量问题得到最小化。同时，由于本发明过程天然的高度自动化，劳动力成本被显著降低，需要最小的操作员介入。
虽然已经通过为理解目的的说明和实施例详细描述了上述发明，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以实施一些变化和修改。因此，说明和实施例不应被看作限制本发明的范围，本发明的范围通过所附的权利要求描述。
因此，要理解的是，在此提供本发明的实施方式作为过滤的改进方法来从给定的料流产生高产率的目标分子，仅仅是对本发明的原理的应用的说明。根据上述说明很明显的是，可以在所公开的形式、使用方法和元件的应用方面采取变化，而不脱离本发明的精神或所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种从异质组织培养流体混合物中纯化目标蛋白的方法，包括：
(a)通过连续灌流发酵过程生产含有目标蛋白的异质组织培养流体混合物；
(b)将组织培养流体混合物转移到与所述连续灌流发酵过程集成的连续颗粒去除过程；
(c)在连续颗粒去除过程中从组织培养流体除去颗粒杂质来产生含有目标蛋白的澄清的组织培养流体；
(d)将澄清的组织培养流体转移到与所述连续颗粒去除过程集成的连续纯化过程；和
(e)在连续纯化过程中从澄清的组织培养流体中纯化目标蛋白；
其中在连续灌流发酵过程、连续颗粒去除过程和连续纯化过程中维持混合物的比流速基本上恒定。
2.根据权利要求1的方法，其中所述连续纯化过程是超滤。
3.根据权利要求2的方法，进一步包括以比流速过滤澄清的组织培养混合物，所述比流速产生的壁浓度比滞留物浓度高出不到20％。
4.根据权利要求2的方法，进一步包括以比流速过滤澄清的组织培养混合物，所述比流速产生的壁浓度比滞留物浓度高出不到15％。
5.根据权利要求2的方法，进一步包括以比流速过滤澄清的组织培养混合物，所述比流速产生的壁浓度比滞留物浓度高出不到10％。
6.根据权利要求2的方法，进一步包括：使澄清的组织培养混合物过滤通过具有一定面积的超滤膜，所述面积按平方米计等于所述连续灌流发酵的体积流速按升/小时计的0.1到2倍之间。
7.根据权利要求2的方法，进一步包括：使澄清的组织培养混合物过滤通过具有一定面积的超滤膜，所述面积按平方米计等于所述连续灌流发酵的体积流速按升/小时计的0.3到1倍之间。
8.一种从异质组织培养流体混合物中纯化目标蛋白的方法，包括：
(a)通过连续灌流发酵过程生产含有目标蛋白的异质组织培养流体混合物；
(b)将组织培养流体混合物转移到与所述连续灌流发酵系统集成的连续颗粒去除过程；
(c)在连续颗粒去除过程中从组织培养流体除去颗粒杂质来产生含有目标蛋白的澄清的组织培养流体；
(d)将澄清的组织培养流体转移到与所述连续颗粒去除过程集成的缓冲容器；
(e)将澄清的组织培养流体间歇地转移到与所述缓冲容器集成的纯化过程；和
(f)在纯化过程中从澄清的组织培养流体中纯化目标蛋白来产生无菌的、无颗粒的、浓缩和部分纯化的、含有目标蛋白的产物分离物；
其中在连续灌流发酵过程和连续颗粒去除过程中维持混合物的比流速基本上恒定。
9.根据权利要求8的方法，其中所述纯化过程是对流吸附/脱附。
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