KR20060129530A

KR20060129530A - 고성능 접선 흐름 여과법을 이용한 단백질 분별 방법

Info

Publication number: KR20060129530A
Application number: KR1020067020867A
Authority: KR
Inventors: 마크 퍼라울트
Original assignee: 지티씨바이오쎄라퓨틱스,인크.
Priority date: 2004-03-04
Filing date: 2005-02-08
Publication date: 2006-12-15
Also published as: EP1732587A2; WO2005091801A2; CA2560930A1; EP1732587A4; IL177877A0; WO2005091801A3; AU2005227064A1; US20050197496A1; JP2007526302A

Abstract

본 발명에 따라 목적 분자들을 함유하는 혼합물로부터 목적 분자를 분리하기 위한 방법 및 장치가 제공되는데, 이것은 상기 혼합물을 고성능의 접선-흐름 여과(HPTFF, High Performance Tangential Flow Filtration) 처리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 HPTFF는 다양한 공급류를 정제하고 가공하여 대상 분자의 크기 및 전하에 따라 목적 분자를 제거하는 데 사용된다. 바람직한 구체화에 따르면, 트랜스제닉 밀크 공급류는 정제된 것으로서, 미립자 물질 예를 들면, 지방, 카세인 마이셀, 및 박테리아와 같은 것들이 제거되었다. 본 발명에 사용되는 HPTFF는 온도, 막간 차압, 분자 전하, 분자 크기, 교차 유속, 밀크 농도를 포함하는 최적화 공정 파라미터를 이용한다. 세정(클리닝) 및 보관 과정을 개발하여 오랜 기간 동안의 막 수명을 보장한다. 무균성 여과 단계를 개발하여 정제된 트랜스제닉 밀크 공급류에 남아 있는 임의의 세균을 제거한다.

Description

고성능 접선 흐름 여과법을 이용한 단백질 분별 방법{METHODS OF PROTEIN FRACTIONATION USING HIGH PERFORMANCE TANGENTIAL FLOW FILTRATION}

우선권 주장

본 출원은 2004년 3월 4일자 출원된 USSN 60/550,137에 대한 우선권을 주장하는 것으로서, 그 내용은 본원에 참고 문헌으로 인용되어 있다.

본 발명은 특정 표적 분자를 최초 공급류(initial feedstream)에 존재하는 오염 물질로부터 정제하는 개선된 방법 및 시스템을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 방법은 고성능 접선 흐름 여과법(tangential flow filtration)의 개선된 방법을 통해 시료 용액을 처리하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 방법은 소정의 공급류로부터 목적으로 하는 분자를 정제, 농축 및 분별하는 과정이 강화되었다.

본 발명은 소정의 공급류로부터 목적 분자를 분별하는 개선된 방법에 관한 것이다. 비교적 순수하고, 생물학적으로 활성인 분자를 다량으로 수득하는 것이 인간 및 동물의 약학 제제, 단백질, 효소, 항체 및 기타 특정 화학 물질의 제조에 있어서 경제적으로 중요하다는 점에 주목하여야 한다. 다수한 폴리펩티드, 항체 및 단백질의 생산에 있어서, 다양한 재조합 DNA 기술이 사용되고 있는데, 그 이유는 이와 같은 기술이 상기와 같은 단백질의 대량 생산을 가능하게 만들기 때문이다. 이러한 생산 방법에 사용될 수 있는 다양한 "플랫폼(platform)"으로서는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유 동물 세포 배양액 및 트랜스제닉 동물을 포함한다. 트랜스제닉 동물 시스템으로서 바람직한 유형의 동물은 포유 동물이지만, 이와 같은 플랫폼 생산 방법은 외인성 단백질, 항체 또는 이들의 단편이나 이들의 융합체를 생산하기 위하여 조류나 트랜스제닉 식물을 사용하는 방안까지도 고려해 볼 수 있다.

재조합 단백질의 생산 방법에는 단백질을 암호화하는 DNA로 숙주 세포를 형질 전환 시킨 후, 재조합 단백질 또는 기타 목적 분자의 발현이 유리한 조건 하에서 숙주 세포 즉, 트랜스제닉 동물 또는 식물을 성장시키는 과정을 포함한다. 원핵생물인 이.콜라이(E.Coli)는 재조합 단백질을 고수율로 얻어낼 수 있기 때문에 선호되는 숙주 시스템이다. 그러나, 이.콜라이로부터 소에 이르기까지 다수의 발현 플랫폼을 개발하기 위하여 단백질을 암호화하는 DNA를 일반적으로 발현시키는 다수의 미국 특허가 존재한다.

외인성 단백질 또는 생물 시스템으로부터 유래된 기타 목적 분자의 생산 방법을 개선함에 따라서, 생물 물질 및 이로써 제조된 약품의 정제 및 회수 과정을 강화하고 보다 효율적으로 만들기 위한 신규의 기술을 개발할 필요성이 증가하고 있다. 즉, 신규 생산물의 수송관이 증가함에 따라서, 치료제를 상업적 규모로 시장에 신속히 출시하는 방법을 고안할 필요성이 실질적으로 대두되었다. 이와 동시에, 다양한 체 생산 유체 예를 들어, 밀크(유즙), 혈액 및 소변으로부터 트랜스제닉 단백질 및 항체를 회수하는 신규의 방법을 개발한다는 관점에서 각 산업 분야는 새로운 국면을 맞이하고 있다. 생산 규모가 클수록 이러한 문제들은 종종 더 복잡해진 다. 뿐만 아니라, 생산물 순도 및 안전성에 부합시킨다는 관점에서 특히, 생물학적으로 유용한 약품 생산을 감독하는 다수의 정부 기관의 기준에 부합하여야 하는 숙주 세포 단백질 및 DNA 등의 잔류 오염 물질 및 바이러스 안전성이라는 관점에서 추가의 도전이 시도되어 왔다.

생물학적으로 유익한 분자 예를 들어, 단백질을 이 분자들의 혼합물로부터 분리할 수 있는 방법들이 몇 가지 존재한다. 이와 같은 기술중 하나는 친화성 크로마토그래피인데, 이 기술은 목적 분자들이 친화성 매트릭스 또는 겔에 특이적이고 선택적으로 결합하는 반면에, 원하지 않는 분자들은 결합하지 않은 상태로 남아서 이후 시스템 밖으로 배출되는 원리를 기초로 하여 분자들을 분리하는 기술이다. 친화성 겔은 통상적으로 겔 지지체에 고정되어 있는 리간드 결합부를 포함한다. 예를 들어, GB 2,178,742는 천연의 헤모글로빈이 다중 음이온 부의 특정 군에 특이적으로 결합한다는 사실을 기초로 하여 헤모글로빈 및 이의 화학적으로 변형된 유도체를 정제하는 친화성 크로마토그래피법을 사용하고 있다. 이러한 부분들을 붙잡아 두기 위해서는 이 부분들이 겔 자체에 고정되어 있어야 한다. 이 방법에서, 변형되지 않은 헤모글로빈은 친화성 겔에 의해 체류되는 반면에, 변형된 헤모글로빈 즉, 다중 음이온 결합 부위가 변형제에 의해 공유적으로 점유되어 있기 때문에 겔에 결합할 수 없는 헤모글로빈은 시스템으로부터 제거된다. 친화성 크로마토그래피 컬럼은 매우 특이적이어서, 매우 순수한 생산물을 얻을 수는 있으나; 친화성 크로마토그래피는 비교적 고가의 방법이므로 상업용으로 사용하기에는 큰 어려움이 따른다.

통상적으로 유전자 조작된 생의약은 다양한 숙주 세포 오염 물질을 함유하는 상등액으로부터 정제된다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)가 단백질 정제에 사용될 수 있는데, 왜냐하면 이 기술은 구조 또는 분자량에 있어서 예외적으로 서로 유사한 분자 종을 효율적으로 분리할 수 있기 때문이다. 다수의 분자에 대해서 RP-HPLC를 사용하는 방법이 공표되었다. 문헌[McDonald 및 Bidlingmeyer, "Strategies for Successful Preparative Liquid Chromatography", PREPARATIVE LIQUID CHROMATOGRAPHY, Brian A. Bidlingmeyer (New York:Elsevier Science Publishing, 1987), vol. 38, pp.1-104 ; Lee외 다수, Preparative HPLC. 8th Biotechnology Symposium, Pt.1, 593-610 (1988)]을 참조하시오.

더욱이, 상기와 동일한 도전 과제중 일부에 직면하는 다른 산업에 있어서도 새로운 해결책을 필요로 한다. 낙농업에서 유장을 농축 및 분별하고 폐수를 처리하기 시작하면서부터, 이러한 기술을 사용하여 분별, 정제 및 정화용 막 시스템을 사용하는 낙농업이 상기 해결책을 가장 필요로 하는 분야가 되었다. 1980년대에, 낙농업계에 종사하는 연구자들은 표준화되지 않은 치즈 생산법에 사용하기 위해 밀크를 농축시키는 막을 사용하기 시작하였다. 최근 들어, 기술이 발전하여 막 농축 밀크를 이전보다 더욱 우수하게 만들고 있다. 이와 동시에, 막 재료에 있어서도 기술적으로 진보하여 밀크 성분의 가공 조작 및 기능성은 밀크 처리 과정의 거의 모든 단계에서 막 분리 공정을 실용적이고 유용하게 만들었다. 비록 이러한 실현이 낙농업의 모든 측면에 적용될 수는 없지만, 그 잠재성은 무궁무진하다.

예를 들어, 막 분리법은 미래에 액상 밀크 가공자에게 특히 유용할 수 있는데, 그 이유는 상기 방법은 에너지 소모가 적고 처리중 어떠한 생산물도 파괴하지 않기 때문이다. 막 여과법의 4가지 기본적 유형(역삼투압법(PC), 나노 여과법(NF), 한외 여과법(UF) 및 정밀 여과법(MF))은 낙농업에 잠재적으로 응용 가능한데, 이들 각 기술들은 다른 목적으로 사용된다. 일부 응용 방법은 단일 막만을 포함하지만; 개선된 방법들은 소정의 용도에 따라서 2개 이상의 막 공정을 거친다. 그러나, 이러한 방법들이 유용하긴 하지만, 낙농업, 식품 제조업 및 트랜스제닉 동물을 이용한 생의약 생산의 일부 측면에 있어서는 여전히 한계가 있다.

생물공학 산업 및 낙농업 모두에 있어서, 한외 여과법은 통상적으로 크기를 기초로 하는 단백질 혼합물의 분리용으로 사용되는데, 이때 단백질 분자량의 비는 약 1∼10 이상이어야 한다. 이점이 산업 전반에 있어 다수의 분야 및 구체적으로 트랜스제닉 포유 동물의 밀크에서 생의약을 회수하는데 있어서 제한 인자가 되었다. 한외 여과 시스템의 최적화에 있어서 물리화학적 조건(즉, pH 및 이온 강도)을 변경함으로써 선택성을 더욱 높이기 위한 상당수의 연구가 행해졌다[Van Reis외 다수(1997)]. pH 및 이온 강도와 같은 조건을 최적화시켜서, 밀크를 포함하는 다양한 공급류에 대한 고성능 접선 흐름 여과법(HPTFF)을 개발할 수 있도록 본 발명의 방법은 개선되었다.

HPTFF는 여러 가지 현상을 개선하여 분리 성능을 최대화시킨다. 이러한 현상들로서는, 용질 유효 부피의 차이를 최대화시켜 용액 pH 및 이온 강도를 조절하는 것과 공극 크기가 다양한 막을 사용하는 것을 포함한다.

전술한 바와 같이, 현재의 산업 분야 및 생의약 공정 중 3가지의 독립적 단계 즉, 정제 단계, 농축 단계 및 완충액 교환 단계에서는 종종 이온 교환 크로마토 그래피, UF 및 크기별 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용한다. 그러나, 상기 단계들을 서로 통합시킬 때조차도 이 공정들이 분리할 수 있는 것이 무엇이냐에 따라서 한계가 있다. 한외 여과법(UF)은 일반적으로 크기가 10배 이상 차이가 나는 용질을 분리하는데에는 한계가 있다. 뿐만 아니라, 하전 상태가 유사한 분자 종도 또한 분리가 매우 어렵다. HPTFF는 2차원 정제 방법으로서, 생체 분자의 크기 및 하전 특성 모두에 따라서 달라지는 방법이다. 그러므로, 동일한 분자량을 갖는 생체 분자를 분리할 수 있다. 뿐만 아니라, 분자량이 보다 큰 화학종이 막을 통과할 때 생체 분자를 체류시킬 수도 있다.

크기에 있어서 3배 미만으로 차이가 나는 분자들은 매우 선택적으로 하전된 막을 사용하고 완충액 및 유체 동력학적 특성을 조심스럽게 최적화시킴으로써 분리될 수 있다. 목적 분자의 등전점(pI)에 관한 지식은 HPTFF에 있어서 주요 인자이다. 이로써 막 설정 및 막 고유의 하전 프로필, 공극 크기 및 유동 특성을 결정하게 될 것이다. 더욱이, HPTFF는 단일 공정 작동중 모든 단계들을 수행 가능하도록 만들어, 생산 비용을 절감시킬 수 있다. 또한, HPTFF는 UF에 대해서 이미 확립된 것과 동일한 비례 스케일-업(scale-up) 원리를 사용한다. HPTFF는 또한 막간 차압을 최적화함으로써 원조될 수 있다.

막 유형에 따라서, 정밀 여과 또는 한외 여과로 분별될 수 있다. 공극 크기가 0.1∼10 ㎛인 정밀 여과 막은 통상적으로 정제, 멸균, 미립자의 제거 또는 세포 수득용으로 사용된다. 공극 크기가 이보다 더 작은(0.001∼0.1 ㎛) 한외 여과 막은 완충액 교환 및 다량 분별시 용해된 분자(단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물 및 기타 생체 분자)를 분리 및 농축하는데에 사용된다.

그러나, 한외 여과법에서 얻을 수 있는 단백질 정제 정도에는 한계가 있다. 이러한 한계는 주로 농축 분극, 막힘 현상(fouling) 및 대부분의 막 공극 크기가 다양하게 분포되어 있는 점에 기인한다. 따라서, 종종 용질의 분별능이 떨어진다. 예를 들어 문헌[Porter, ed., HANDBOOK OF INDUSTRIAL MEMBRANE TECHNOLOGY (Noyes Publications, Park Ridge, N. J. , 1990), pp. 164-173]을 참조하시오. 용질의 분극 층은 추가의 여과재로서 작용하며 원래의 한외 여과재와 순차적으로 작용한다. 이러한 작용은 소정 용매의 여과에 대해 상당한 저항을 제공한다. 분극 정도는 공급액내에 체류하는 용질의 농도가 증가함에 따라 증가하고, 실제 시스템 내에서는 비정상적이거나 또는 예측 불가능한 다수의 효과를 초래할 수 있다. 예를 들어, 분극되지 않은 조건에서와는 대조적으로, 고도로 분극된 조건하에서, 여과 속도는 압력이 증가함에 따라서 약간 증가할 수 있으며, 이때 여과 속도는 보통 압력에 비례한다. 보다 개방적이고, 보다 고성능인 유동 막을 사용하더라도 여과 속도를 증가시킬 수는 없는데, 그 이유는 분극층이 여과를 제한하는 저항을 제공하기 때문이다. 체류 및 용출된 용질 사이의 상호 작용에 의해서 상황은 더욱 복잡해 진다. 농축 분극화 및 막힘 현상으로 인해 혈장 단백질과 같은 거대 분자 혼합물을 다량 분석함에 있어서 한외 여과막의 거대 분자 분별 능은 효과적으로 이용될 수 없게 된다. 예를 들어, 문헌[Michaels,"Fifteen Years of Ultrafiltration : Problems and Future Promises of an Adolescent Technology", in ULTRAFILTRATION MEMBRANES AND APPLICATIONS, POLYMER SCIENCE AND TECHNOLOGY, 13 (Plenum Press, N. Y. , 1979, Anthony R. Cooper, ed.,), pp.1-19]을 참조하시오.

TFF 및 HPTFF는 또한 분리될 성분들의 크기를 기초로 하여 여러 카테고리로 세분된다. 단백질 가공에 있어서, 이러한 기술은 원형 세포로부터 완충염의 크기에 따라서 분별될 수 있다. 이하 표 1은 막에 의해 체류되며 세분되는 막을 통과하는 통상의 성분들을 제시하고 있다. 또한, 이 표는 일반적으로 각각의 카테고리에 속하는 막 공극 크기 등급 또는 공칭 분자량 한계(NMWL) 범위를 나타낸다.

[표 1]

접선 흐름 여과법의 세분
	정밀 여과	바이러스 여과	고성능 여과	한외 여과 TFF	나노여과/ 역삼투압
막에 의해 체류되는 성분	원형 세포, 세포 조각	바이러스	단백질	단백질	항생 물질 당 염
막
막을 통과하는 성분	콜로이드 물질 바이러스 단백질 염	단백질 염	단백질 염	소 펩티드 염	(염) 물
대략적 막 차단 범위	0.05∼1 ㎛	100 kD-0.05 ㎛	10∼300 kD	1∼1000 kD	< 1 kD

물질 분리에 있어서 접선 흐름 여과법을 사용하는 것에 관하여는 공지되어 있다. Marinaccio외 다수의 미국 특허 제 4,888,115 호에는 생물학적 액체 예를 들어, 혈장 반출용 혈액 성분의 분리에 사용되는 방법("교류")에 관하여 개시되어 있다. 이 방법에서, 혈액은 유기 중합체 미소 공극 여과 막으로 수평 통과(즉, 횡방향 통과)하며, 이때 입자형 물질이 제거된다. 당 업계의 다른 실시예에서는, 맥주 용액의 여과 구체적으로, 효모 세포 및 기타 현탁된 고형물과 같은 입자들을 제거 하기 위한 여과에 사용되는 접선 흐름 여과법이 개시되어 있다[1987년 1월 14일자 발행된 Shackleton의 EP 0,208,450]. Kothe외 다수의 미국 특허 제4,644,056호(1987년 2월 17일자 출원)에는 이 방법을 밀크 또는 초유로부터 면역글로불린을 정제해내는 데에 사용하는 것에 관하여 개시되어 있고, Castino의 미국 특허 제4,420,398호(1983년 12월 13일자 발행)에는 항바이러스 물질 예를 들어, 인터페론을 이러한 물질과 바이러스 입자를 함유하는 발효액으로부터 분리해낸 다음 이 물질들이 유래된 세포 배양액을 유지하는 데에 사용하는 것에 관하여 개시되어 있다.

TFF 단위는 세포 조각으로부터 유래된 박테리아 효소의 분리에 사용되었다[Quirk외 다수, 1984, ENZYME MICROB. TECHNOL., 6(5):201]. Quirk외 다수는 이 기술을 사용하면 효소를 보다 높은 수율로 분리할 수 있고, 통상의 원심 분리 기술을 사용할 때보다 시간도 덜 든다고 하였다. 일부 제약 분야에서 접선 흐름 여과법을 사용하는 것은(예를 들어, 주사용 멸균수의 여과, 용매 시스템의 정화, 및 발효액 및 박테리아 배양액으로부터의 효소 여과) Genovesi에 의해 제안되었다[1983, J. PARENTER.Aci.TECHNOL. , 37 (3): 81].

그러나, 상기 기술을 상업적으로 이용하는데에 요구되는 입자의 크기를 정확히 조절하는 것은 어려워서 상기 기술의 상업화는 그다지 성공적이지 못하였다. 본 발명에 있어서 접선 흐름 여과법을 사용하면 상업적으로 유용하고 중요한 공정에서 크기 및 하전에 따라 입자를 분리하도록 개선된다. 궁극적인 HPTFF 시스템은 본 발명에서 정제 및 분별 작용 효능을 TFF에 의해 성취되는 정도보다 더 개선하는 데에 사용된다. 선택된 크기의 여과재를 사용하고, 또한 상이한 크기의 여과재(즉, 여과 시스템)를 연속적으로 사용하거나 또는 이를 일렬로 부착하여 사용하는 것은, 특히 바람직한 크기 범위의 입자를 얻기 위해 입자를 분리하기 위한 것이라고 개시되어 있다.

세포 배양액 또는 트랜스제닉 밀크 공급류로부터 정제될 수 있는 목적 분자로서는 인간 알파 태아 단백질(alphafetoprotein)이 있다. 기타 목적 분자로서는 인간 알부민, 항체, 항체의 Fc 단편 및 융합 분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 여기서 인간 알부민 또는 알파 태아 단백질의 단백질 단편은 담체 분자로서 작용한다.

본 발명의 방법은 또한 소정의 공급류로부터 얻은 목적 분자의 수율을 최적화할 수 있는 조건과 여과재를 정확히 조합 사용하는 방법을 제공한다. 이 방법에서 공정 매개 변수 예를 들어, pH 및 온도를 정확히 조절하는 것이 중요하다.

생물 산업은 생산물의 안전성 및 순도, 그리고 상품의 가격과 점점 더 깊은 관련성을 가지게 된다. 본 발명에 따라서 HPTFF를 사용하면 생체 분자 분리 방법은 신속해지며 더욱 효과적으로 된다. 생물학적 분야 예를 들어, 면역학, 단백질 화학, 분자 생물학, 생화학 및 미생물학 분야에 있어서도 광범위하게 사용될 수 있다.

도 1은 HPTFF를 통하여 공급류로부터 충전재 및 피니쉬재까지의 물질의 흐름에 대한 공정도를 나타내는 것이다.

도 2a는 정밀 여과용으로 설정된 방법 및 장치를 나타내는 것이다.

도 2b는 TFF용으로 설정된 방법 및 장치를 나타내는 것이다.

도 3은 상이한 TFF 및 HPTFF 모듈을 통한 유체의 소통 경로를 나타내는 것이다.

도 4는 여과 과정의 공정도를 나타내는 것이다.

도 5는 DNA 구조물로부터 목적 재조합 단백질을 함유하는 정제된 밀크를 생산하기까지의 트랜스제닉 특성의 개발 과정을 나타내는 것이다.

도 6은 본 발명의 방법에 대한 공정 장치의 개략도를 나타내는 것이다.

도 7은 HPTFF 모듈형에 있어서 개방형 공급 채널 및 난류 촉진형 공급 채널을 나타내는 것이다.

도 8은 본 발명의 HPTFF 시스템을 나타내는 것이다.

발명의 개요

본 발명의 목적을 간략하게 말하자면, HPTFF 기술을 사용하여 보다 효율적인 단백질을 분별하는 것이다. 즉, HPTFF를 이용하여 오염 단백질(contaminating protein)로부터 목적으로 하는 단백질을 분리해 내는 방법을 개선하기 위한 것이다. 실시예로서 사용된 목적 단백질중 하나인 재조합 인간 알파 태아 단백질은 분자량 약 66KD이고, 알부민과 구조가 유사한 단백질이다. 본 발명의 방법의 목적은, 가능한 한 가장 효율적인 방식으로 표적 단백질(rhAFP)을 체류시키고 주요 오염 밀크 단백질은 통과시키는 것이다. 본 발명에 따르면, 오염 밀크 단백질로서는 IgG, 락토페린, 알부민, 카세인, 락토글로불린 및 락탈부민을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 100 KD 접선 흐름 막 방법을 사용하므로 재조합 인간 알파 태아 단백질 및 염소 알부민만이 그 농도가 효과적으로 감소된다. 오염 단백질의 농도를 감소시킴으로써 체류하는 재조합 인간 알파 태아 단백질의 순도 및 안정성은 증가하고, 따라서 종래의 크로마토그래피를 사용하여도 보다 효율적으로 정제할 수 있다.

본 발명의 방법은 실시예로서 rhAFP를 사용하지만, 기타 목적 단백질을 사용할 수도 있다. 재조합 인간 알파 태아 단백질은 100KD MWCO 막을 사용하였을때 체류되며, 이후 기타 단백질은 용액이 20 mM 포스페이트 완충액과 함께 연속적으로 투석 여과(diafilter)됨에 따라서 막을 자유롭게 통과한다.

정제 밀크 중 최초 재조합 인간 알파 태아 단백질의 단백질의 순도는 SDS PAGE에 의하면 약 5∼7 순도 %였다. 단백질 분별 이후 상대적 순도는 약 30%, 수율은 85%까지 증가한다. 단백질이 다양한 공급류, 바람직하게는 트랜스제닉 포유 동물 밀크로부터 유래된 인간 치료 단백질, 단백질 단편 또는 항체의 처리를 가속화하는 반정제 상태(semi-purified state)에 도달함에 따라, 상기와 같은 본 발명의 최초 분별은 하류 공정 효율을 증가시킨다.

그러므로, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본원에 의해 개발 및 제공된 여과 기술은 천연 밀크 성분 또는 이의 오염 물질로부터 목적 재조합 단백질 또는 기타 목적 분자를 정제, 농축 및 분별하는 방법을 제공한다. 결과적으로 정제된 다량의 중간 물질은, 생산물을 그의 최종 제형 및 순도로 만드는 HPTFF 공정에서 스트림을 유출시키는데 사용되는 통상의 정제 기술 예컨대, 크로마토그래피에 적당한 공급 물질이다.

본 발명의 바람직한 방법은 목적 분자를 함유하는 소정 부피의 트랜스제닉 밀크로부터 생산물을 정제, 농축 및 분별시키는 3가지 여과 단위 작동에 사용된다. 정제 단계에서는 생산물로부터 거대한 입자 물질 예컨대, 지방구 및 카세인 교질 입자가 제거된다. 이후의 농축 및 분별 단계에서는 대부분의 소분자 예를 들어, 락토스, 무기물 및 물을 제거하여 순도를 높이고, 최종 생산 조성물 부피를 감소시킨다. HPTFF 공정의 생산물은 최적의 하류 정제 및 전반적인 생산물의 안정성에 적당한 수준으로 인위 농축된다. 이와 같이 농축된 생산물은 이후 멸균 여과되어, 오염 상태를 최소로 만들고 장기간 동안의 생산물의 안정성은 강화된다. 다량의 생산물의 순도는 65∼85%이며, 성분 예를 들어, 알부민, 유장 단백질(β 락토글로불린, α 락탈부민 및 BSA) 및 저농도의 잔류 지방 및 카세인을 함유할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 이와 같이 부분적으로 정제된 생산물은 종래의 하류 크로마토그래피 기술에 있어서 이상적인 출발 공급 물질이다.

처리하는데에 본 발명이 사용될 수 있는 통상의 생산물은 트랜스제닉 생산된 목적 단백질로서, 면역글로불린 단편에 연결된 펩티드 또는 폴리펩티드를 함유하는 알파 태아 단백질, IgG1 항체, 융합 단백질(예를 들어, 에리트로포이에틴-인간 알부민 융합체-"HEAP" 또는 인간 알부민-에리트로포이에틴; 베타 인터페론-알파 태아 단백질 융합체), 항트롬빈 III, 알파-1-항트립신, IgG4, IgM, IgA, Fc 부위, 융합 분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 의하여 처리될 수 있는 기타 단백질로서는 이후에 처리되어 생물학적 기능이 회수될 수 있는 재조합 단백질, 외인성 호르몬, 내인성 단백질 또는 생물학적으로 비활성인 단백질을 포함한다. 이와 같은 기타 단백질로서는 인간 성장 호르몬, 재조합 인간 알부민, 데코린, 인간 알파 태아 단백질 유로키나제, tPA 및 프로락틴을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

뿐만 아니라, 본 발명에 의하면 선행 기술과 상이한 염(NaCl) 농도 및 2개의 투석 여과 단계에 변형이 있으며, 이와 같이 변형을 가함으로써 본 발명의 방법을 사용함에 따라 얻어질 수 있는 순도가 증가한다.

본 발명의 제1 목적은 종(예를 들어, 입자 및 분자)를 크기별로 분리하는 방법으로서, 목적 종에 대하여 특이적이어서 보다 높은 정제 효율을 갖는, 보다 효율적인 고성능 접선 흐름 여과 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 제2 목적은 생물학적 거대 분자 예를 들어, 단백질을 분리하기 위한 개선된 여과 방법 예를 들어, 한외 여과법을 제공하는 것으로서, 여기서 상기 방법은 농도의 분극화는 최소화되고 플럭스(flux)는 증가시키지 않는다.

본 발명의 제3 목적은 크기에 있어서 10배 미만 정도 차이가 나고 여과 이전에 혼합물을 희석시킬 필요가 없는 화학종을 크기별로 분리할 수 있는 여과 방법을 제공하는 것이다.

상기 및 기타 목적들은 당업자에게는 명백할 것이다. 본 발명의 기타 특징 및 이점은 이하 본 발명의 바람직한 구체예의 상세한 기술과 첨부된 도면들을 참고로 하였을때 명확히 파악할 수 있을 것이다.

바람직한 구체예의 설명

이하 약어들은 본 명세서 중에서 특정의 의미들을 갖는다.

약어:

BSA = 소 혈청 알부민

CHO = 중국 햄스터 난소 세포

CV = 교류 유속

DFF = 직접 유동 여과법

DV = 투석 여과 부피

IEF = 등전점 전기 영동

GMH = 물질 플럭스 (g/㎡/시간) - 또는 J_M

LMH = 액체 플럭스(ℓ/㎡/시간) - 또는 J_L

LPM = 분당 리터

M = 몰

MF = 정밀 여과

NMWCO = 공칭 분자량 컷 오프(cut off)

NWP = 정규화된 물 투과도

PES = 폴리(에테르)-설폰

pH = 널리 공지된 과학적 매개 변수에 따른 화합물 또는 화학 물질의 수소 이온 활성을 나타내는 데 사용되는 용어

PPM = 백만분의 1부

SDS-PAGE = SDS(소듐 도데실 설페이트) 폴리-아크릴아미드 겔 전기 영동

SEC = 크기별 배제 크로마토그래피

TFF = 접선 흐름 여과법

PEG = 폴리에틸렌 글리콜

TMP = 막간 차압

UF = 한외 여과

용어의 설명:

정제

용액으로부터 입상 물질을 제거하여 이 용액이 0.2㎛ 막을 통과할 수 있도록 만드는 과정.

콜로이드

모세관 벽을 용이하게 통과하지 못하는 거대 분자. 이 화합물은 교질 삼투압(즉, 유체를 끌어당기는 압력)을 부여하며, 일반적으로 혈관 내 부피를 복구시키고 조직 침출성을 개선시키기 위해 투여된다.

농축

막을 이용해서 물과 소분자를 제거하여 체류 분자 : 소분자의 비율을 증가시키는 과정.

농축 분극화

여러 가지 요인들 예를 들어, 막간 차압, 교류 속도, 시료 점도 및 용질 농도의 조합에 의하여 발생하는, 막 표면상에 체류하는 분자(겔 층)의 축적.

교류 속도

막 표면 상부를 가로지르는 유체의 속도. CF = Pi - Po (여기서, Pi는 유입구에서의 압력을 말하고, Po는 유출구에서의 압력을 말하며, 이는 보유액 유속과 관련됨).

투석 여과

막을 통하여 씻겨나가서 보유액중 더욱 큰 목적 분자와 해리되는, 소분자의 분별 과정. 염의 제거 및 교환용, 세제 제거용, 결합 분자로부터의 분리용, 저분자량 물질 제거용, 또는 이온 환경 또는 pH 환경을 신속히 변경하는 기술로서 편리하고 효율적이다. 이 방법은 통상적으로 슬러리 농도는 일정하게 유지시키면서 슬러리로부터 목적으로 하는 생산물을 제거하는데 사용되는 정밀 여과 막을 사용한다.

공급류

공정 또는 방법에 제공되는 원료 물질 또는 원 용액으로서 목적 단백질을 포함하며, 또한 다양한 오염 물질 예를 들어, 미생물, 바이러스 및 세포 단편들을 함유할 수도 있다. 본 발명의 바람직한 공급류는 목적으로 하는 외인성 단백질을 함유하는 트랜스제닉 밀크가다.

여과물 플럭스(J)

막을 통과하는 일부 시료의 속도.

유속(V)

유체가 막 표면을 통과할 때의 속도를 유체 유속으로 간주한다. 생산물 플럭스는 그 유속이 변할때 측정될 것이다. 두 가지 변수 간 관계을 통하여 흐름에 대한 최적 작동 범위를 결정할 수 있다.

분별

물리적 또는 화학적 부분을 기초로 하는 분자의 선택적 분리 방법.

겔 층

막 상부에 형성될 수 있는 분자의 미세한 박층. 막 표면이 엉기게 만들어 분자의 체류에 영향을 주어 여과재 유동성을 감소시킬 수 있다.

고성능 접선 흐름 여과법

HPTFF는 고 해상도 방법으로서, 크기 및 하전을 기초로 하여 단백질-단백질 분리가 수행될 수 있으며, 그 결과 생산물 수율 및 정제 인자가 크로마토그래피의 그것들과 유사하다. HPTFF에 사용되는 막 NMWL은 10∼300 kD의 범위에 있다.

막 공극 크기 등급(MPSR)

막 공극 크기 등급(통상적으로 마이크론 값)은, 기준 등급보다 큰 입자가 막에 의해 체류 됨을 나타낸다.

공칭 분자량 컷 오프(NMWCO)

한외 여과막 용으로 지정된 크기(킬로달톤). 본 NMWCO는 막에 90% 체류하는 구형 단백질의 분자량으로 정의된다.

공칭 분자량 한계(NMWL)

분자량이 NMWL보다 큰 거대 분자 및 분자량이 NMWL보다 작은 거대 분자는 대부분 용해되어 미지의 막에 의해 잔류될 것임을 나타내는 막 등급 시스템이다.

정규화된 물 투과도(NWP)

TFF 장치를 처음 세정할 때 재순환 비속도에서 확립된 물의 여과 유속. 이 수치는 막 회수율을 계산하는데에 사용된다.

목적 분자

유체 예를 들어, 액체 상태의 용액 또는 현탁액으로부터 분리될 입자 또는 기타 분자종. 목적 입자 또는 분자는 이 유체로부터 분리되며, 대부분의 경우, 유체중 기타 입자 또는 분자로부터 분리된다. 분리될 목적 분자의 크기는 사용될 막의 공극 크기를 결정할 것이다. 바람직하게, 목적 분자는 생물학적 또는 생화학적 기원의 분자이거나, 또는 트랜스제닉 또는 시험관내 방법에 의해 제조되는 분자로서, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 바람직한 공급류 기원의 예로서는 포유 동물 밀크, 포유 동물 세포의 배양액 및 미생물 예를 들어, 박테리아, 곰팡이 및 효모 세포 배양액을 포함한다. 또한 여과되어 나올 화학 종으로서는 (글리코실화되었거나 또는 되지 않은), 목적으로 하지 않는 폴리펩티드, 단백질, 세포 성분, DNA, 콜로이드, 마이코플라스마, 내독소, 바이러스, 탄수화물 및 기타 생물학적 유용 분자를 포함한다.

접선 흐름 여과법

여과에 의하여 분리될 성분을 함유하는 유체 혼합물이 고속도로 재순환되는 방법으로서, 막 평면에 수평 방향으로 순환되어 역 확산에 대한 물질 전달 계수를 증가시킨다. 이러한 여과법에서는 막의 길이를 따라서 차압이 적용되어 유체 및 여과 가능한 용질이 여과재를 통과하여 흐르게 된다. 이러한 여과법은 유가식 공정으로서 뿐만 아니라, 연속 흐름 공정으로서 적절히 수행된다. 예를 들어, 여과재를 통과하는 유체가 분리 단위로 계속 흘러나오거나, 또는 용액이 막을 건너 한번 통과하고, 여과재를 통과하는 유체가 계속해서 하류로 진행하면서 용액은 막을 건너 반복적으로 통과될 수 있다.

막간 차압

여과 막의 길이를 따라서 적용되어 유체 및 여과 가능한 용질이 여과재를 통과하여 흐르게 만드는 차압 구배. 접선 흐름 시스템에서, 이 TMP는 유입구(유동 채널의 시작 부분)에서 가장 높고 유출구(유동 채널의 끝 부분)에서 가장 낮다. TMP는 유입구, 유출구 및 여액 출구의 평균 압력으로서 계산된다.

회수

처리후 회수될 수 있는 목적 분자의 양. 일반적으로 출발 물질의 백분율 또는 수율로서 표현된다.

보유액

막을 통과하지 않는 시료의 일부로서, 농축액이라고도 한다. 보유액은 TFF 동안 재순환된다.

접선 흐름 여과법의 기초

모든 접선 흐름 장치에는 2 가지의 중요 관련 변수가 존재한다: 막간 차압(TMP) 및 교류 속도(CF). 막간 차압(TMP)은 분자를 실제로 여과재의 공극으로 밀어넣는 힘이다. 교류 속도는 막을 통과하는 용액의 유속이다. 이는 막을 막히게 하여 공정의 효율을 감소시킬 수 있는 거대 분자를 쓸어내는 힘을 제공한다. 실제로, 유체 공급류는 여과재의 막 표면을 가로지르는(교류) 시료 공급 용기 소스로부터 펌핑되어, 보유액으로서 다시 시료 공급 용기로 되돌아간다. 클램프에 의해 보유액 튜브에 적용된 배압은 막 공극보다 작은 분자들이 여과재를 통과하여 여과물 (또는 투과물) 분별로 이동하도록 만드는 막간 차압을 형성한다. 교류는 보다 큰 분자들을 휩쓸어 가는데, 이때 상기 큰 분자는 막 표면에 체류하여, 다시 보유액으로서 공급물로 되돌아간다. TFF 과정의 성공적인 실행의 1차적 목적은 TMP 및 CF를 최적화하여, 겔이 막을 엉기게 만들지 않고 가장 큰 부피를 갖는 시료가 여과될 수 있도록 만드는 것이다. TMP가 막의 길이를 따라서 증가하거나 감소하지 않으면, TMP는 "실질적으로 일정"한 것이다[일반적으로 평균 TMP 약 10 psi 이상, 바람직하게는 약 5 psi 이상]. 전반적인 여과에 있어서의 TMP 수준과 같이, 고농도에서 선택성을 갖도록 하기 위해 농축 단계에서 TMP를 일정하게 유지시키거나 또는 감소시킨다. 그러므로, "실질적으로 일정한 TMP"란, TMP 대 막 길이의 관계를 나타내는 것이지, TMP 대 여과 시간을 나타내는 것은 아니다.

개요

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 처음에 정밀 여과법을 사용하여 트랜스제닉("TG") 밀크로부터 지방구 및 카세인 교질 입자를 제거한다. 정밀 여과로 얻어진 투과액을 30kD TFF 카세트 시스템을 통해 재순환시키는데, 이때 밀크 단백질이 잔류하게 되며 ; 염과 당은 이 막을 통과하여 투석 여과 완충액으로서 정밀 여과 보유액으로 재순환된다. 재조합 인간 알파 태아 단백질 생산물은 30 kD 막에 의해 체류되는 정제 밀크 중에 잔류하게 된다. 이렇게 되면, 상기 재조합 인간 알파 태아 단백질은 밀크 단백질의 복잡한 혼합물과 함께 용액중에 존재하며, 일부는 매우 풍부하게 존재한다. 100 kD 단백질 분별 단계에서는, 오염 밀크 단백질의 양을 감소시키고 크로마토그래피를 사용하여 정제하기 위해 재조합 인간 알파 태아 단백질을 준비한다.

100 kD 분별이 수행되기 이전에, 목적 단백질을 함유하는 정제 밀크는 완충액과 교환되어 밀크중에 존재하는 염이 제거될 수 있어야 한다. 따라서, 일단 정제가 완결되면 목적 단백질(예를 들어, 재조합 인간 알파 태아 단백질)은 이후 30 kD TFF 카세트 및 20 mM 포스페이트 완충액(pH 6.5)를 사용하여 5회 투석 여과될 수 있다. 이러한 최초 투석 여과는 정제 밀크중 염 농도를 감소시키는데에 필요하다. 염 농도를 감소시킴으로써 재조합 인간 알파 태아 단백질의 유체 역학적 반경은 증가되고, 따라서 단백질은 100 kD MWCO, HPTFF 막에 의해 용이하게 체류할 수 있다. 기타 밀크 단백질(염소 알부민 제외)은 재조합 인간 알파 태아 단백질과 동일한 방식으로 영향을 받지는 않는다. 그러므로 상기 단백질은 100 kD 막을 자유롭게 통과하여, 폐액으로서 제거 및 폐기된다.

상기 100 kD 단백질 분별의 목적은 크로마토그래피 실행 이전에 원하지 않는 밀크 단백질, 지질 및 저분자량 오염 물질을 제거하는 것이다. 투석 여과를 이용하여 오염 물질을 효과적으로 제거함으로써, 본 방법의 나머지 크로마토그래피 단계에 오염 물질을 보다 적게 남기는 것이다.

공급류로서의 밀크

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, HPTFF 방법은 밀크 공급류로부터 생산물을 정제, 농축 및 분별하는 3가지 여과 단위 작동을 실행하는 것이다. 상기 밀크는 생의약 또는 기타 목적 분자를 함유하는 트랜스제닉 포유 동물의 생산물일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 시스템은 목적 분자에 대한 선택성이 뛰어나도록 고안된다. 정제 단계는 큰 입상 물질 예컨대, 지방구 및 카세인 교질 입자를 밀크 공급류로부터 제거한다. 농축/분별 단계는 대부분의 소분자 예컨대, 락토스, 무기물 및 물을 제거하여 생산물의 순도를 높이고 부피를 감소시킨다. 이후 TFF 공정의 생산물은 최적 하류 정제 및 전체 생산물 안정성에 적당한 수준으로 농축된다. 목적 분자를 함유하는 농축 생산물은 이후 멸균 여과되어 생물 오염 물질(즉, 내독소)을 최소로 만들고, 장기간 목적 분자의 안정성을 강화시킨다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따라서, 다량의 생산물의 순도는 65∼85%가 될 것이고, 성분 예를 들어, 염소 항체(트랜스제닉 염소로부터 유래), 유장 단백질(β 락토글로불린, α 락탈부민 및 BSA), 그리고 잔류 지방 및 카세인을 소량 함유할 수 있다. 이와 같이 부분적으로 정제된 생산물은 종래의 하류 크로마토그래피 기술에 이상적인 출발 공급 물질이며, 여기서 상기 하류 크로마토그래피는 밀크중에 생산된 재조합 단백질, 밀크중에 생산된 면역글로불린 또는 융합 단백질을 포함할 수 있는(이에 한정되는 것은 아님) 목적 분자를 추가로 선택 및 분리하는 기술이다.

제1 단계(정제)

도 1에서와 같이, 트랜스제닉 포유 동물 밀크, 바람직하게는 염소 또는 소로부터 얻은 밀크는 유가식 정밀 여과법을 사용하여 정제된다. 밀크를 공급 탱크에 넣고 루프내에서 펌핑하여 밀크 보유액을 2배 농축시킨다(도 1의 공정도 참조). 일단 밀크 보유액이 농축된 후에는 생산물 및 소분자량 단백질, 당, 및 무기물이 적당한 크기의 막을 통과할 수 있도록 투석 여과된다. 본 발명에 따르면, 이러한 작동에는 2∼3 시간 정도 소요되며, 하루에 1000 ℓ의 밀크를 처리할 수 있다. 본 발명의 기술 및 방법은 스케일 업(scale-up)될 수 있으며, 생산될 수 있는 생산물의 총 부피는 목적으로 하는 특정 분자의 상업적 및/또는 치료적 요구에 따라서 달라진다.

제2 단계(농축/분별)

도 1에서와 같이, 제 1단계에서 얻은 정제 투과액을 한외여과법(UF)으로 농축 및 분별하였다. 정제된 투과액은 UF 공급 탱크로 들어가 루프내에서 펌핑되어 생산물을 2배 농축시킨다. 일단 농축 단계가 개시되면, UF로부터 얻은 투과액은 제1 단계의 정제 공급 탱크내 밀크 보유액으로 들어가게 된다. 제1 단계 및 제2 단계는 동시에 처리되도록 규모 및 시간이 설정된다. UF로부터 얻은 투과액은 막을 통과하는 소분자량 단백질, 당, 그리고 무기물을 함유한다. 일단 생산물의 95%가 UF 보유액중에 축적되면, 정제 과정을 중단하고 UF 물질의 농축/투석 여과를 시작한다. 생산물은 최초 밀크 부피의 5∼10배로 농축되고, 완충액을 UF 공급 탱크에 첨가한다. 이로써 대부분의 소분자량 단백질, 당 및 무기물이 씻겨나간다. 이러한 작동은 2시간 반 ∼ 3시간 반 정도 소요되며, 하루에 500 ℓ 이하의 정제 투과액을 처리한다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 기술 및 방법은 스케일-업 될 수 있으며, 생산될 수 있는 생산물의 총 부피는 이와 같은 농축/분별 과정에 따라서 달라지며, 이러한 농축/분별 과정은 목적으로 하는 특정 분자의 상업적 및/또는 치료적 요구에 따라서 달라진다.

제3 단계(멸균 여과)

도 1 및 본 발명에 따르면, 정제된 다량의 농축물은 이후 멸균적으로 정밀 여과된다. 결과로 생산된 50 ∼ 100 ℓ의 UF 보유액을 공급 탱크에 넣는데, 여기서 상기 보유액은 0.2 ㎛ MF 여과 시스템의 막힌 말단부로 펌핑되어 다량의 생물 오염 물질이 제거되고, 장기간 생산물의 안정성이 증가된다. 생산물은 본 발명의 여과 시스템을 통과하여 펌핑된 후, 최종 패키징 구조물에 직접 충전될 수 있다. 이는 멸균실 조건에 부합하는 GMP 설비내 목적 분자를 처리하는 조건(예를 들어, 100 군 조건)하에서 수행된다. 이 작동에는 0.5 ∼ 1 시간이 소요되며, 하루에 100 ℓ이하의 정제된 다량의 중간 물질을 처리하게 된다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 기술 및 방법은 스케일-업 될 수 있으며, 생산될 수 있는 생산물의 총 부피는 이와 같은 농축/분별 과정에 따라서 달라지며, 이러한 농축/분별 과정은 목적으로 하는 특정 분자의 상업적 및/또는 치료적 요구에 따라서 달라진다.

실시예 1

목적 분자의 정제를 위한 공급류로서의 밀크

이하 데이터는 원유 공급류로부터 트랜스제닉 방법으로 제조된 목적 단백질(예를 들어, 인간 재조합 알파 태아 단백질)을 정제, 농축 및 분별하기 위한 막계 방법을 제공하는 본 발명의 출원을 제공한다. 본 발명의 본 실시예에 따르면, 공정 수행을 위한 밀크를 제공하는 트랜스제닉 포유 동물로서는 염소를 사용할 수 있지만, 기타 포유 동물 예를 들어, 예를 들어, 소, 토끼, 마우스, 양 그리고 돼지도 사용될 수 있다.

단백질 분별을 위한 출발 물질은 정밀 여과법을 이용하여 이미 정제하였으며, 이후 최초 막 최적화 연구를 위해 별도로 준비하였다. 이와 같은 각각의 매개 변수의 효과를 평가하고, 오염 밀크 단백질로부터 재조합 인간 알파 태아 단백질을 분리하는데 최적인 조건을 지정하기 위해 실험군을 고안하였다. 우선 각 실험군을 최적화시켜 분별에 적당한 조건군이 될 때까지 하나의 변수를 동시에 변경시켰다. 분별 실험을 위해 다음과 같은 매개 변수 범위를 선택하였다:

I. 막 분자량 컷 오프(MWCO) 50∼100 kD

II. 막간 차압(TMP) 5∼30 psi

III. 정제 밀크 pH 및 이온 강도(20mM 포스페이트, pH 6.5) O∼1.0 M NaCl

IV. 정제 밀크 농축 인자(Clarified Milk Concentration Factor; CFac) 1∼4 X

V. 투석 여과 부피 수 12∼20 DV's

VI. 정제 밀크 할당(Clarified Milk Lot) (자료 참조)

VII. 막 회수 (섹션 VII 참조)

TFF 시스템을 0.1 M NaOH를 사용하여 위생 처리하고, 이를 USP 물로 씻어 낸 후에, 20 mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 6.5)으로 평형화시켰다. 초기 물 투과율을 측정하여 기록하였다. 우선 정제 밀크 4ℓ를 인수 배로 농축시키고 이의 부피를 1ℓ로 감소시켰다. 이후 20 mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 6.5)으로 농축 정제 밀크 를 투석 여과시켰다. 밀크를 일정 수치의 투석 여과 부피로 투석 여과 시키는 대신에, 280 ㎚ 및 O.D. 4.0에서 투석 여과시켰다. 이러한 흡광도는 대체적으로 총 단백질 6 g/ℓ와 관련있다. 총 단백질의 농도는 크로마토그래피 단계가 뒤따르는 과정에 존재하는 한계를 근거로 하여 선택되었다. 투석 여과가 완결되면, 이 시스템을 배수시키고 다시 포스페이트 완충액 1ℓ로 씻어낸 후, 이를 다시 최종 보유액과 합하였다. 이후 분별된 재조합 인간 알파 태아 단백질을 0.2 um 캡슐 여과재를 사용하여 멸균 여과시켰다.

이후 분별된 재조합 인간 알파 태아 단백질을 PRC를 이용하여 전체 단백질, AFP 농도 및 오염 단백질에 대해 분석하였다. 나머지 오염 단백질을 더욱 상세히 분석하기 위해 추가로 SDS 겔을 전개시켰다.

본 발명의 HPTFF 시스템은 2개의 연동식 펌프가 장착된 폴 센트라메이트(Pall Centramate) 4 게이지 시스템으로 이루어져 있다. 첫 번째 펌프는 보유액을 재순환시키는데 사용되며, 두 번째 펌프는 투과액을 재순환시키는데 사용된다. 이와 같은 펌핑 과정의 개략도(평행류라고도 함)를 도 1 및 도 2에 나타내었다. 이는 일반적으로 막의 전체 통로 길이를 따라서 TMP의 균형을 맞추어 분별 과정을 보다 균일하게 만드는 데에 사용된다.

결과

I.막 분자량 컷 오프(MWCO)

[그래프 A]

아미콘(Amicon) 76㎜ 교반 셀을 밀리포어(Millipore) 30 kD 재생 셀룰로즈 막과 함께 조립한 후 여기에 물을 가하여 씻어냈다. 이후 정제된 재조합 인간 알파 태아 단백질 밀크를 상기 교반 셀에 가한 후, 이를 PBS 완충액으로 5회 투석 여과시켰다. SDS-PAGE 결과, 레인 2∼7에 나타낸 바와 같이, 보유액의 단백질 조성은 본질적으로 변하지 않았음을 알 수 있다. 투과액중 체류하지 않는 단백질의 양은 레인 8∼12에 나타낸 바와 같이 최소였다.

[그래프 B]

아미콘 76㎜ 교반 셀을 밀리포어 50 kD PAN 막과 함께 조립한 후 여기에 물을 가하여 씻어냈다. 이후 상기 교반 셀에 정제된 재조합 인간 알파 태아 단백질 밀크를 가한 후, 이를 PBS 완충액으로 5회 투석 여과시켰다. SDS-PAGE 결과, 레인 2∼7에 나타낸 바와 같이, 보유액의 단백질 조성은 본질적으로 변하지 않았음을 알 수 있다. 투과액중 체류하지 않는 단백질의 양은 30kD을 초과하였지만, 레인 8∼12에 나타낸 바와 같이 여전히 최소였다.

[그래프 C]

아미콘 76㎜ 교반 셀을 폴(Pall) 70 kD PES 막과 함께 조립한 후 여기에 물을 가하여 씻어냈다. 이후 상기 교반 셀에 정제된 재조합 인간 알파 태아 단백질 밀크를 가한 후, 이를 PBS 완충액으로 5회 투석 여과시켰다. SDS-PAGE 결과, 레인 3과 8에 나타낸 바와 같이, 보유액의 단백질 조성은 약간 감소하였음을 알 수 있다. 투과액 중 체류하지 않는 단백질의 양은 50kD을 약간 초과하였지만, 레인 4∼7에 나타낸 바와 같이 여전히 최소였다.

[그래프 D]

아미콘 76㎜ 교반 셀을 밀리포어 100 kD 재생 셀룰로즈 막과 함께 조립한 후 여기에 물을 가하여 씻어냈다. 이후 상기 교반 셀에 정제된 재조합 인간 알파 태아 단백질 밀크를 가한 후, 이를 PBS 완충액으로 10회 투석 여과시켰다. SDS-PAGE 결과, 레인 3∼7에 나타낸 바와 같이 보유액의 단백질 조성은 감소하였음을 알 수 있다. 투과액 중 체류하지 않는 단백질의 양은 70kD을 약간 초과하였지만, 레인 8∼12에 나타낸 바와 같이 최적 값에는 약간 못미쳤다.

[그래프 E]

아미콘 76㎜ 교반 셀을 폴 100 kD PES 막과 함께 조립한 후 여기에 물을 가하여 씻어냈다. 이후 상기 교반 셀에 밀크중 정제된 재조합 인간 알파 태아 단백질을 가한 후, 이를 PBS 완충액으로 5회 투석 여과시켰다. SDS-PAGE 결과, 레인 3∼7에 나타낸 바와 같이, 보유액의 단백질 조성은 약간 감소하였음을 알 수 있다. 투과액 중 체류하지 않는 단백질의 양은 레인 8∼12에 나타낸 바와 같이 RC100kD을 약간 초과하였다. 추가로 투과액중 재조합 인간 알파 태아 단백질도 확인되었다.

II. 막간 차압(TMP)

단백질 분별 단계의 개발에 있어서는 100 KD HPTFF 막을 재순환 모드로 사용하는 최적화 방법을 포함하였다. 우선 이 방법의 조건은 TMP와 플럭스(이하 참조)을 비교하는 것을 특징으로 한다. 출발 물질은 20 mM 포스페이트 완충액(pH 6.5)으로 투석 여과된 정제 밀크였다. 저염 농도가 rhAFP 분자의 체류를 증가시키는 것과 같이 완충 조건은 이러한 분별 방법에 맞추었다. 최적화 결과, 최적 TMP는 12∼20 psi이었는데, 이는 막 조절 영역에서보다는 높았으며, 막이 일정 수준 층을 이루고 있는 변이 대역에 가하여지는 압력과 같았다. 교류 속도는 더 이상 최적화되지 않았으며, 0.6 ℓ/분/ft²으로서 이는 제조자에 의해 추천되는 수준이다.

[그래프 F]

일단 최적화가 완결되면, 작동 매개 변수 세트는 HPTFF에 대해 확립될 수 있었다. 단백질 분별에 대해 확립되는 작동 매개 변수는 재작동 가능한 공정을 유지하는데 중요하다. 모니터에 필요한 중요 매개 변수로서는 막간 차압, 교류 속도 및 완충 조건을 포함한다.

III. 정제 밀크 pH 및 이온 강도

[그래프 G]

실시 #1(1X) 이 그래프는 투석 여과 부피 대 플럭스와 투석 여과 부피 대 TMP의 관계를 나타내는 것이다. 이러한 경향을 통해 2M NaCl 1DV가 플럭스를 감소시키는데에 사용될 경우, TMP는 완충액이 20 mM 포스페이트로 되돌아갈 때까지 증가하게 된다는 것을 알 수 있다.

[그래프 H]

본 SDS PAGE는 출발 정제 밀크, 투석 여과를 거친 투과액 및 최종적으로 분별된 재조합 인간 알파 태아 단백질에 대한 결과이다. 여기에 2 M NaCl을 가하면 재조합 인간 알파 태아 단백질 투과량은 증가하고, 카세인 투과량은 감소한다(레인 6 참조). 완충 조건이 정상으로 회수됨에 따라서, 재조합 인간 알파 태아 단백질은 다시 한번 더 체류하게 된다.

[그래프 I]

전개 #1(1X) 이 그래프는 투석 여과 부피 대 플럭스와 투석 여과 부피 대 TMP의 관계를 나타내는 것이다. 이러한 경향을 통해 완충액이 2M NaCl로 스위칭되면 플럭스는 감소하고, TMP는 나머지 전개에 있어서 증가한다는 것을 알 수 있다.

[그래프 J]

본 SDS PAGE는 출발 정제 밀크, 투석 여과를 거친 투과액 및 최종적으로 분별된 재조합 인간 알파 태아 단백질에 대한 결과이다. 여기에 2 M NaCl을 가하면 재조합 인간 알파 태아 단백질 투과량은 증가하고, 이 재조합 인간 알파 태아 단백질은 투과액중에 수집될 수 있다. 레인 4는 투과액 중 수집된 최종 생산물을 나타낸다.

IV. 정제된 밀크 농축 인자(CFac)

단백질 분별 방법은 처음에 4배 농축시켜 부피를 줄인후 투석 여과에 필요한 완충액의 양을 유지시키는 단계로 이루어져 있다. 진행 과정중 처음에는 농축 단계가 수행되지 않지만, 1X에서의 투석 여과에 필요한 완충액 부피가 과다하게 증가함에 따라서, 이후에는 이 단계가 필요하다는 것이 입증되었다. 농축된 정제 밀크는 이후 10∼20 부피에서 투석 여과된다.

1X에서의 분별

처음에 정제 밀크를 20 mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 6.5)을 사용하여 12회 투석 여과시켰다. 일단 투석 여과를 개시하면, 오염 단백질이 보유액으로부터 제거됨에 따라서 플럭스는 증가하게 된다.

[그래프 K]

전개 #1(1X) 이 그래프는 투석 여과 부피 대 플럭스와 투석 여과 부피 대 TMP의 관계를 나타내는 것이다. 이러한 경향을 통해 TMP가 일정하게 유지될 때, 플럭스는 처음에는 증가하였다가 이후 시간이 경과함에 따라서 다시 감소하게 됨을 알 수 있다.

[그래프 L]

전개 #2(1X) 이 그래프는 투석 여과 부피 대 플럭스와 투석 여과 부피 대 TMP의 관계를 나타내는 것이다. 이러한 경향을 통해 TMP가 일정하게 유지될 때 플럭스는 처음에는 증가하였다가 이후 시간이 경과함에 따라서 다시 감소하게 됨을 알 수 있다.

[그래프 M]

본 SDS PAGE는 독립된 2회 전개에 있어서 출발 정제 밀크, 투석 여과를 거친 투과액 및 최종적으로 분별된 재조합 인간 알파 태아 단백질에 대한 결과이다.

[표 2]

방법	RPC	RPC
시료	농축 rhAFP(㎎/㎖)	농축 총 단백질(㎎/㎖)
MP 082003	0.61	1.8
MP 090803 최종 1X	0.57	1.4
MP 090303 최종 1X	0.56	1.4

전개 #1: 수율 93%

전개 #2: 수율 92%

[표 3]

HPTFF 작동 매개 변수
TMP	12 psi
교류	0.6 ℓ/분/ft²
보유액 압력 강하	15∼20 psi
투과액 압력 강하	15∼20 psi - 평행류
통상의 플럭스	80∼100 LMH

4배에서의 분별

우선 정제 밀크를 인수 배로 농축시켜 부피를 출발 부피의 25%까지 감소시켰다. 농축 과정 동안 플럭스의 최초 감소는 그래프의 DV 0인 시점에서 살펴볼 수 있다. 이후 20 mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 6.5)을 사용하여 농축 정제 밀크를 20회 투석 여과시켰다. 투석 여과가 개시되면 오염 단백질이 보유액으로부터 제거됨에 따라서 플럭스는 증가하기 시작한다. 이후 최종 4배 농축액을 TFF 시스템으로부터 동 부피의 완충액으로 플러싱(flushing)시켜, 최종 농도를 출발 물질의 2배 정도로 감소시켰다.

[그래프 N]

전개 #1(4X) 이 그래프는 투석 여과 부피 대 플럭스와 투석 여과 부피 대 TMP의 관계를 나타내는 것이다. 이러한 경향을 통해 최초 농축시 TMP는 증가하고 플럭스는 감소함을 알 수 있다. 이후 플럭스는 처음의 수준으로 증가하였다가 이후 다시 시간이 경과함에 따라서 감소한다.

[그래프 O]

[그래프 P]

본 SDS PAGE는 2회의 독립된 전개에 있어서 출발 정제 밀크, 투석 여과를 거친 투과액 및 최종적으로 분별된 재조합 인간 알파 태아 단백질에 대한 결과이다. 농도 인수에 대해 겔 부하를 보정하였다.

[표 4]

방법	RPC	RPC
시료	농축 rhAFP(㎎/㎖)	농축 총 단백질(㎎/㎖)
MP 082003	0.61	1.8
MP 090403 최종 2X	1.00	2.5
MP 090903 최종 2X	1.12	2.80

전개 #1: 수율 82%

전개 #2: 수율 92%

[표 5]

TFF 작동 매개 변수
TMP	12 psi
교류	0.6 ℓ/분/ft²
보유액 압력 강하	15∼20 psi
투과액 압력 강하	15∼20 psi - 평행류
통상의 플럭스	80∼100 LMH

V. 투석 여과 부피 수치

정제 밀크를 일정 수의 투석 여과 부피로 투석 여과시킨 대신에, 보유액이 280 ㎚에서의 O.D.가 될 때까지 분별하였다. 280 ㎚에서의 보유액 흡광도로써 투석 여과를 중단하는 정확한 시점을 결정하였다. 표적 흡광도는 4배 농축시 4.0 AU였다. 280 ㎚에서 흡광도 4.0인 것은 RPC에 의한 총 단백질 농도가 6 ㎎/㎖인 경우에 해당한다. 이러한 특성은 출발 농도에 상관없이 동일한 총 단백질 농도에서 분별된 생산물을 일정하게 생산할 수 있도록 한다. 일단 20 mM 포스페이트 완충 플러쉬로 1:1 희석할 때의 최종 총 단백질 농도에 대해 설정한 목표치는 2.8∼3.2 ㎎/㎖이다.

[그래프 Q]

상기 그래프는 투석 여과 부피 대 플럭스, 그리고 투석 여과 부피 대 흡광도의 관계를 나타낸다. 투석 여과가 진행될 때 흡광도는 약간 지수 함수적으로 붕괴된다. 일단 통과되는 단백질의 대부분이 제거되면, 체류하는 단백질은 최종 분별 생산물을 구성한다. 이러한 최종 생산물은 통상적으로 재조합 인간 알파 태아 단백질, 단백질, 알부민 및 카세인을 포함한다.

[표 6]

수율%(RPC에 의함)
시료	농축 hAFP(㎎/㎖)	총 단백질(㎎/㎖)
201-TR-0001A 시료 #3	0.61	N/A
201-TR-0001A 시료 #7	0.94	2.98

각 시료들을 2개로 나누어 희석시키고 이에 대해 2회 시험하였다. 보고된 농도는 4회 주입의 평균값이다.

상기 RPC 분석법은 2가지의 중요한 데이터 즉, 재조합 인간 알파 태아 단백질 농도 및 총 단백질 농도를 나타낸다. 상기 표 6은 분별 개시 이전에 재조합 인간 알파 태아 단백질의 최초 농도가 0.61 ㎎/㎖임을 나타낸다. 분별 이후 최종 농도는 농도 인자가 2배일때 0.94 ㎎/㎖이다. 최종 수율은 표적 2배 농도 인자라고 가정하였을 때 다음과 같은 방법으로 계산될 수 있다.

% 수율 = [(최종 농도/농도 인자)/초기 농도]×100

% 수율 = [(0.94 ㎎/㎖/2)/0.61 ㎎/㎖]×100 = 78% 수율

^*주: 농도 인자가 표적 값으로서 사용된 것처럼 상기 수율은 대략적인 값이다.

[표 7]

총 단백질(RPC에 의함)
시료	농축 hAFP(㎎/㎖)	총 단백질(㎎/㎖)
201-TR-0001A 시료 #3	0.61	N/A
201-TR-0001A 시료 #7	0.94	2.98

최종 재조합 인간 알파 태아 단백질 시료를 RPC를 사용하여 이의 총 단백질 농도에 대해 시험하였다. 이는 이후 컬럼 로딩시 활용될 정보이다. 우선 최종 분별된 재조합 인간 알파 태아 단백질에 대한 표적 총 단백질 농도는 4배 농축하여 6 ㎎/㎖로 목표를 잡았다. 이후 분별된 재조합 인간 알파 태아 단백질을 동 부피의 플러싱 완충액으로 희석시켜, 최종 표적 총 단백질 농도를 3.0 ㎎/㎖로 만들었다.

단백질 순도(RPC 및 SDS PAGE로 측정)

이후 분별된 재조합 인간 알파 태아 단백질을 RPC를 이용하여 오염 단백질에 대해 분석하였다. 추가로 SDS PAGE를 실행하여 나머지 오염 단백질을 평가하였다.

[그래프 R]

단백질 순도(RPC 및 SDS PAGE로 측정)

상기 RPC 크로마토그래피 결과는 100 KD 접선 흐름 막에 의해 수행되는 단백질 분별을 설명하는데 도움이 된다. 첫 번째 RPC 크로마토그래피 결과는 용리 시간이 4.2 분임을 참고로 하여 1.0 ㎎/㎖의 재조합 인간 알파 태아 단백질이 정제됨을 보여준다. 두 번째 RPC 크로마토그래피 결과는 단백질 분별 이전에 정제된 출발 밀 크에 관하여 나타내는 것이다. 세 번째 RPC 크로마토그래피 결과는 분별 재조합 인간 알파 태아 단백질(6번 피크) 및 잔류하는 오염 밀크 단백질을 나타낸다. 1번 및 2번 피크는 미확인 밀크 단백질이고, 3번 및 5번 피크는 카세인, 4번 피크는 염소 혈청 알부민이며, 7번 피크는 고분자량 밀크 단백질이다. 두 번째 및 세 번째 크로마토그래피 결과의 차이는 단백질 분별 단계에 의해 제거된 오염 단백질의 상대량을 나타낸다.

[그래프 S]

상기 SDS 겔은 레인 2의 정제된 출발 물질을 나타내는 것이다. 정제된 밀크는 몇몇 오염 밀크 단백질을 함유한다. 레인 2∼6은 투과액 및 통과하여 분리된 밀크 단백질을 나타낸다. 레인 7은 최종 분별 재조합 인간 알파 태아 단백질을 나타낸다.

[그래프 T]

상기 SDS 겔은 레인 2의 30g TOX 전개시 정제된 출발 물질을 나타내는 것이다. 레인 3∼11은 오염 단백질이 제거될때의 rhAFP를 나타내는 것이다. 최종 분별 rhAFP는 레인 12에 나타내었다.

[표 8]

정제 밀크 로트의 효과

재조합 인간 알파 태아 단백질 동물의 수유기 전반에 걸쳐 정제된 밀크를 2개의 독립된 풀(pool)로 합하였다. 수유기중 상반기로부터 정제한 밀크를 TOX1(청색)으로 풀링하였고, 하반기로부터 정제해 낸 밀크는 TOX2(녹색)로 풀링하였다. 280㎚에서 TOX1 풀의 흡광도는 TOX2 풀 흡광도의 약 1.6배였다. 상기 2개의 풀에서의 차이로 인해, TOX1 및 TOX2 사이의 투석 여과 부피에 대한 수치에서도 차이가 났다.

[그래프 U]

[그래프 V]

[그래프 W]

[그래프 X]

상기 SDS 겔은 30g TOX 전개시 정제된 출발 물질을 나타내는 것이다. 레인 1은 표준 MW를 나타낸다. 레인 2∼5는 100 KD 막을 사용하여 분별된 재조합 인간 알파 태아 단백질을 나타낸다.

VI. 막 회수

정규화된 물 투과도(NWP)는 전개액 간 막 성능 회수율을 측정한 값이다. 막 세정 효율을 측정하는 수단이 없으면, 막 수명에 비하여 성능이 떨어질 수 있다. 신규 막의 NWP를 측정하여 추가로 기록된 NWP 데이터 모두에 대해 기준점으로 이용한다. 원래 NWP의 90% 이상이 회수될 때 이 막은 통상적으로 "청결"한 것으로 간주 한다. 다음의 그래프는 진행시 사용된 폴(Pall) OS100C12 카세트의 동향을 나타낸다.

[그래프 Y]

제대로 세정되지 않은 카세트를 사용할 때의 효과를 나타내는 가장 효율적인 방법은 막힌(fouled) 막으로 공정을 실제 수행해 보는 것이다. 이하의 그래프는 막의 NWP가 원래의 NWP의 60% 이상 회수되었을 때 3회의 독립 전개시 공정 플럭스를 나타내는 것이다. 전개액 번호는 각각 081403A, 081403B, 081503A 및 081503B이며, 이것들의 공정 플럭스는 모두 50∼70 LMH 범위에 있다. 일단 상기 4개의 전개액의 용리가 완결되면 상기 막을 50℃에서 0.5M NaOH 및 400 ppm NaOCl로 철저히 세정한다. 상기 NWP를 측정한 결과, 원래 NWP의 90% 이상 회수되었음을 알 수 있었다. 081803A, 081803B 및 081903A 전개시의 공정 플럭스는 모두 110∼130 LMH 범위에 있다. 이러한 공정 플럭스는 전개액 082003A에 의해 나타내어지는 신규 막의 공정 플럭스에 해당한다.

각각의 전개액으로부터 얻은 최종 분별 생산물들을 SDS PAGE를 이용하여 비교하였다. 막혀있는 막을 사용할 때 공정 플럭스는 상당히 감소하였으나, 분별에는 그다지 영향을 받는 것 같지는 않다. 이 데이터는 전술한 NWP 회수 모델이 유효하며 분별 공정에 사용될 수 있다는 사실을 뒷받침해 준다.

[그래프 Z]

100KD "막힌(fouled)" 막 - 3회 전개 - 081403A, 081403B, 081503A, 081503B 100KD "세정된(cleaned)" 막 - 3 회 전개 - 081803A, 081803B, 081903A 100KD "신규" 막 -1 회 전개 - 082003A

[그래프 AA]

실험 매개 변수: 100 KD MWCO PES 0.2 ft 막 카세트 200 ㎖ 정제된 AFP 교류: 0.5 ℓ/분/ft² TMP: 10 psi 투석 여과 완충액: 20 mM 포스페이트(pH 6.5) 12 투석 여과 부피

[그래프 BB]

상기 SDS PAGE는 전개액 간 순도의 상대적 차이를 나타내는 것이다. 첫번째 레인은 MW 기준을 나타낸다. 이하 4개의 레인(2∼5)은 막혀있는 막을 사용하여 분별하였을 때의 최종 생산물에 관한 결과이다. 레인(6∼8)은 적당히 세정된 막을 사용하여 분별하였을 때의 최종 생산물에 관한 것이다. 레인 9는 신규 막을 사용하여 분별되었을 때의 최종 생산물에 관한 결과이다.

본 발명에 의하면, HPTFF를 사용하여 목적 단백질을 오염 단백질로부터 분리하는 목적이 기술되어 있다. 이 분별의 목적은 표적 단백질(AFP)은 체류시키고 주요 오염 밀크 단백질은 통과시키는 것이다. RPC, 총 단백질 및 SDS 겔 분석 결과는 오염 밀크 단백질의 농도가 효과적으로 감소될 수 있다는 사실을 보여준다. 100 KD 접선 흐름 막과 본 발명의 방법을 사용하였을 때 재조합 인간 알파 태아 단백질 및 CSA만이 그 농도가 효과적으로 감소한다.

막 분자량 컷오프(MWCO)

막의 세공 크기 및 화학적 성질은 분별 과정의 효율도에 상당한 영향을 미치는 역할을 담당한다. 30KD,50KD, 70KD 및 100KD를 포함하는 몇몇 MWCO 막을 평가하였다. 30KD의 경우에서처럼 MWCO가 낮으면, 작동 조건이 어떤 것이 사용되는 가에 상관없이 오염성 단백질이 보유된다. 이러한 세공 크기를 사용하는 분별 과정은 재조합 인간 알파 태아 단백질로부터 오염 단백질을 효과적으로 분별 처리할 것 같지는 않아 보인다. 각각의 큰 세공 크기에 대해서 이의 보유도 및 선택도를 평가하였다. 30KD, 50KD, 및 70KD 막은 모두 다량의 오염 밀크 단백질을 보유하는 것으로 밝혀졌으므로, 이들은 분별 과정에 효율적으로 사용될 수 없다. lOOKD 막은 최적화되기 전, 초기에 생성물을 실질적으로 감소시켰음을 보여 주었다. 이 막의 세공 크기는 사용 가능한 최대의 크기인 것으로 밝혀졌지만, 재조합 인간 알파 태아 단백 질을 여전히 내포할 수 있다.

다양한 막의 유형으로는 재생된 셀룰로스, 폴리아크릴로니트릴(PAN), 및 변형 폴리에테르설폰(PES)을 포함한다. 이들 각 막은 자신의 독특한 세트의 특성을 지니므로 분별 처리 공정에 영향을 줄 수 있다. 일단 적절한 막의 세공 크기가 선택되었다면, 그 막의 유형 또는 화학적 성질을 평가한다. 폴 코오포레이션(Pall Corp.)의 오메가 변형 폴리에테르설폰(PES) 막을 선택한 이유는 이것이 일정한 세공 크기 및 중성 막 전하를 가졌기 때문이다.

막간 차압(TMP)

최적 막간 차압은 재순환 모드의 100KD HPTFF를 사용하여 측정하였다. 출발 재료는 pH 6.5하에서 20mM 포스페이트 완충액에 의해 투석 여과 처리된 정제 밀크였다. 상기 완충액 조건이 이러한 분별 과정에 적합한 것은 저염 농도가 rhAFP 분자의 보유력을 향상시키기 때문이다. 최적화 곡선은 TMP 공정이 정확히 전이 대역 내에서 약 12-20 psi 압력으로 유지되어야 함을 보여주었다. 막 제어 영역에서의 낮은 TMP는 오염 밀크 단백질과 이들의 투과를 감소시키는 막 간의 전하 상호 반응을 증폭시킨다. 겔 층 제어 영역에서의 높은 TMP는 모든 단백질을 그 표면으로 가도록 해서 벌크 용액의 질량 전달 계수를 증가시킨다. 이것은 재조합 인간 알파 태아 단백질의 단백질 회수율을 낮춘다. 교차 유속은 더 이상 최적화되지 않았지만, 제조업자의 권고에 따라 0.6 L/분/ft²에서 유지되었다.

정제된 밀크의 pH 및 이온 강도

재조합 인간 알파 태아 단백질의 등전점은 약 5.0 이며, 이 막의 등전점은 7.0이다. 재조합 인간 알파 태아 단백질의 보유도를 최대화하기 위해서, 완충액의 pH는 약 6.0-6.5인 것이 선택되었다. 이러한 조건하에서, 막과 재조합 인간 알파 태아 단백질 분자 이 두 가지는 음전하를 가질 것이므로 서로 반발하게 될 것이다. 이온 강도는 재조합 인간 알파 태아 단백질의 단백질 분자의 보유 특성에 상당히 중요한 역할을 담당한다. 염 상태가 증가되는 조건의 경우에(>l.O ml NaCl), 이 분자는 대부분 모든 작동 조건하에서 100KD의 세공 속을 좀 더 자유롭게 통과하였다. 염 상태가 감소된 경우에는 이와 반대 현상이 나타난다: 대부분의 재조합 인간 알파 태아 단백질의 단백질 분자가 보유된다. 이러한 두 가지의 인자가 상술한 현상에 기여하는 것으로 알려져 있다. 염 농도가 감소되면 단백질과 막간의 전하 영향력이 증가 된다. 또한, 염 농도의 감소는 재조합 인간 알파 태아 단백질의 단백질 주변을 싸고 있는 물(水) 층의 "팽윤"효과를 일으킨다. 이와 같이 연합된 효과는 정상적으로는 그렇지 않을 것 같은 100KD 막에 단백질 분자가 보유되도록 한다.

정제 밀크의 농도 인자(CFac)

정제 밀크의 농도 인자는 초기에 전체 밀크 농도의 2X이다. 이후 정제 밀크는 본 발명의 100KD HPTFF 막 시스템을 사용하여 분별 처리한다. 일반적으로, 투석 여과의 최적점(CD)은 겔 층의 최대 농도값(CG)을 곱해서 CG/e를 얻는 방식으로 결정된다.

CD =CG/e = 0.37 CG

분별 공정에서의 투석 여과의 최적 농도는 쉽게 계산되지 않는데, 그 이유는 감지할 만한 양의 단백질이 정제 밀크가 농축되는 동안 제거되어 버리기 때문이다. 그러므로, CG가 항상 변화하는 것은 벌크 단백질 농도가 세미-로그 플럿트에서 예측한 바와 같이 증가 되지 않기 때문이다.

따라서, 투석 여과의 최적점은 실험에 의해 결정되었다. 정제 밀크는 1X, 2X, 및 4X 하에서 투석 여과 처리되었다. 분별 처리 공정을 수행하기 전에 농도 인자를 증가시키는 효과는 동일한 수준의 순도에 도달하는 데 필요한 투석 부피의 수를 증가시켰다. 그러나, 농도를 4X로 올렸을 때의 장점은, 투석 여과 부피의 수가 2배가 된다 하더라도 완충액 요구치는 50%의 감소를 유발할 수도 있다는 데 있다.

투석 여과 부피의 수

재조합 인간 알파 태아 단백질을 분별 처리하는데 사용되는 투석 여과 부피의 수는 제거되는 오염 단백질의 양이 투과물 중에서 소실되는 재조합 인간 알파 태아 단백질의 양보다 적은 지점으로 결정하였다. 이 지점은 SDS PAGE 정보를 관찰함으로써 평가될 수 있다. 1X 농도에 필요한 투석 여과 부피의 초기 수는 약 10DV 였으며, 4X 농도에서는 20DV였다. 가장 효율적인 설계는 차후에 4X 농도에서 20DV를 보인 것으로 입증되었다.

투석 여과 종말점에 대한 변화는 초기의 Q-칼럼 전개 이후에 일어났다. 전체 단백질의 양을 각 작동시마다 모니터한 결과, 이것이 사용가능한 투석 여과 부피의 정확한 수를 예측하는 데 더욱 효과적인 방식인 것으로 입증되었다.

분별 처리 공정에 선택된 최종 방법은 보유물이 280 nm에서 측정된 O.D. 아래로 떨어질 때까지 투석 여과 처리하는 것이었다. 투석 여과를 멈추기 위한 실제 시점은 280nm에서의 보유물 흡광도로 결정되었다. 표적 흡광도는 4X 농도에서 4.0 AU 인 것으로 나타났다. 280nm에서 흡광도가 4.0 이라는 것은 RPC로 관찰했을 때 전체 단백질이 6 mg/ml에 해당한다는 것이다. 이는 본 공정으로 하여금 출발 농도와 무관하게, 동일한 총 단백질 농도로 일관성 있게 분별 처리된 생성물을 생산 가능케 한다. 후속의 음이온 크로마토그래피 단계로 인해 본 공정이 구속받을 때의 전체 단백질의 농도가 선택되었다. 오염 단백질: AFP의 비는 Q-칼럼의 로딩에 영향을 미치므로 반드시 작동시마다 일관성이 있어야만 한다. 20mM의 포스페이트 완충액으로 1:1 희석된 후 Q-로드 최종 단백질의 표적 농도는 2.8-3.2 mg/ml 이다.

정제 밀크 로트(Milk Lot)

분별 처리를 수행하기 위해 사용되는 정제된 로트의 로트는 동일한 종말점에 도달하는 데 필요한 투석 여과량에 영향을 준다(O.D. @ 280nm). 유즙 분비 초기에 수집한 정제 밀크는 유즙 분비 말기에 수집한 로트보다 50%가 더 많은 단백질을 함유하는 경향이 있었다. 하지만, 정제 로트에서의 생성물의 양은 일정하게 남아 있곤 했다. 단백질 농도의 이러한 차이는 유즙 분비 초기에 다량의 오염 밀크 단백질 때문인 것 같다. 또한, 이러한 정제 밀크의 초기 로트는 후기의 로트보다 50% 더 많은 투석 여과 처리를 필요로 하였다. RPC, SDS, PAGE 및 Bradford 전체 단백질 테스트를 포함한 분석은 사용된 정제 재료와 무관하게 모든 분별 처리된 로트 간에는 유사한 결과를 보인다.

막 회수 - 정상수 투과도(NWP)

HPTFF 카세트 시스템은 1 년까지의 기간 동안 재사용이 가능하도록 제작된 다. 그러므로, 각각의 작동 후에는 막을 효과적으로 세정(클리닝)하는 것이 중요하다. 100KD 막에 사용된 클리닝 용액은 1시간 동안 40 내지 50℃에서 0.5M NaOH 및 400ppm 표백 용액이었다. 이 클리닝 요법은 막의 정상수 투과도(NWP)를 회수하는 데 있어서 효과적인 것으로 입증되었다. 카세트가 새로운 것이었을 때 취한 원래의 NWP의 90%내에 막이 속해 있다면 막의 NWP는 "회수된 것"으로 간주 된다. 사이클 # 그래프 대(對) NWP는 막이 적어도 60 회를 작동할 수 있는 예상 공정 수명을 가져야 한다는 것을 제시한다.

단백질의 분별 과정이 신뢰할만하고 또한 막 회수가 막 성능을 예측한다는 것을 추가로 보여 주기 위해서, 막을 고의적으로 오염시킨 후 이를 단백질 분별 처리 공정에 3회 사용하였다. 공정 플럭스(flux)는 원래의 깨끗한 막의 약 1/2에 해당했지만 분별 처리 공정은 놀랍게도 변화되지 않았다. 균일성을 보여주기 위해서 RPC 및 SDS PAGE를 사용하여 분별 처리된 재료들을 분석하였다. 이 데이터는 물 플럭스가 제시된 회수율 90% 보다 훨씬 낮다는 것을 제시한다.

이 실험을 통해 얻은 데이터는 100KD MWCO 및 HPTFF 시스템을 사용하는 단백질 분별 과정이 오염 밀크 단백질의 농도를 효과적으로 감소시킬 수 있었다는 것을 보여주었다. 이 과정은 80 내지 100LMH의 액체 플럭스로 효율적으로 작동되므로 크로마토그래피와 같은 기타 상향류 정제 방법과 비교해볼 때 최소의 자본이 들어가는 장치를 요구한다. 상대적인 재조합 인간 알파 태아 단백질의 단백질 순도는 초기에는 정제 밀크중에서 6-10%로 시작하지만, 분별 처리 후에는 30%의 순도로 증가 된다. 공정 수율은 80% 범위 내로 일치해서 나오며, 이는 후속 정제 단계와 거의 동등한 수준이다.

본 발명에 따라, 대규모로 제어할 수 있는 여과 공정 변수들의 관계, (CM, V, TMP, T, 여기서 V는 유속을 나타내며)를 생성물 통과, 보유도 및 품질로서 결정하기 위한 실험 전략을 사용한다. 이러한 관계는 개개의 벤치 규모 실험을 통하여 정해졌으며, 최적의 작동 윈도우가 확인되었다. 이 최적의 파라미터들은 전체 수율과 질량 균형을 연구하는 실험 시리즈와 통합된다. 성능은 생성물 수율, 정제도, 및 플럭스 효율의 관점에서 측정되었다. 다음의 공정 변수들이 개개의 벤치 스케일 실험 매트릭스로서 연구된다.

농도(Cm) 최적의 밀크 농도 인자는 경험적으로 얻은 생성물 통과 데이터에 의해 결정되었다. 고정된 시간 동안 1㎡ 당 생성물의 투과 속도는 생성물 플럭스(Jp)로 간주한다. 생성물 플럭스는 정제 단계가 진행되는 동안의 농도 인자에 대한 관계로 측정될 것이다(유닛 작동 # 1).

도 1을 다시 언급하는 것과 관련하여, 아래에 제공되는 내용은 본 발명의 구성 요소에 대한 설명이다.

도 1의 구성 요소들

공정류 설명

공정류 번호 설명

1a 원 트랜스제닉 밀크

lb 미세 여과 CIP 용액

2a 투석 여과 후 배수되는한 미세 여과 보유물

2b 배수되는 사용된 CIP 용액

3 공정 진행 중의 MF 보유물 (루프)

4 MF CIP 재순환 과정 (루프)

5 미세 여과 여과물

6 한외 여과 CIP 용액

7 배수되는 사용된 CIP 용액

8 한외 여과 공급(미세 여과 여과물)

9 공정 진행 중의 UF 보유물 (루프)

10 한외 여과 투과물 (MF 보유물을 투석 여과하기 위함)

11 농축된 정제 밀크

12 UF CIP 재순환 (루프)

13 AF CIP 용액

14 무균 필터 공급물

15 생물학적 부담이 감소된 농축 정제 벌크

16 배수되는 사용된 CIP 용액

가장 광범위한 범주로서, 본원에 제공된 본 발명에 따른 고성능의 접선-흐름 여과 처리 공정은 TMP 와 플럭스의 일정 조건하에서 시스템의 HPTFF 유형에 맞도록 디자인된 장치 또는 모듈중에서 하나 또는 그 이상의 여과 막 내로 분리시키려는 분자 종들의 혼합물을 통과시키는 것을 포함한다. 이 TMP는 주로 전이점에서의 TMP 값보다 크지 않은 값 범위에서, 주로 플럭스 대 TMP 곡선의 압력 의존 영역 범위로 유지된다. 그러므로, 여과 공정은 약 5% 내지 100%까지의 전이점 플럭스의 범위를 갖는 플럭스에서 작동한다. 그래프 A 및 B를 참조하라. 여기에서 플럭스 대(對) TMP 곡선은 전이점을 따라 도시된다. 그 결과, 목적하는 분자 종은 보유물로서 막에 의해 선택적으로 보유되는 반면, 이보다 적은 크기의 종들은 막을 통과하거나, 또는 목적 종들은 여과물로서 막을 통과하고 혼합물중에 존재하는 오염물은 막에 보유된다. 한외 여과 처리를 위해 사용되는 목적 종들은 생물학적 거대 분자로서 분자량이 최소한 약 1000 달톤인 것이 바람직하며, 폴리펩티드 및 단백질인 것이 가장 바람직함을 주목하라. 또한, 목적 분자 종들은 분리되는 종들보다, 즉 오염물보다는 10배 미만으로 크거나 또는 분리되는 종들보다 10배 미만으로 작은 것이 바람직하다.

본원에 사용된, "여과실의 유체 방향과 나란한 여과실내로 여과물을 재순환 시키기 위한 수단"이란 표현은 여과실에서 나온 유체 일부를, 여과실의 유입구로부터 출구까지 인접한 여과실을 통과하는 유체의 흐름과 나란한 방향 및 실질적으로 동일한 방향(흐름에서 일종의 소용 돌이가 일어나게끔 한다)으로 흘러가게 하는 메카니즘 또는 장치를 말한다. 바람직하게는, 이 수단은 펌프 수단이다.

TMP는 여과 공정의 시간이 경과 함에 따라 증가하지는 않으며, 이것이 여과 공정을 통하여 일정하게 유지되고 있을 필요는 없다는 것에 주목하라. TMP는 시간의 경과에 따라 일정하게 유지될 수 있거나 또는 여과 공정이 진행되어 가면서 감소될 수 있다. 보유된 종이 농축되면, 농축 단계 시에 TMP를 감소시키는 것이 바람 직하다.

각 막은 약 10 마이크론까지의 크기의 종들을 보유하는 세공 크기를 가지는 것이 바람직하며, 1kDa 내지 10 마이크론까지의 크기를 보유하는 세공 크기를 가지는 것이 더욱 바람직하다. 한외 여과 공정으로 분리될 수 있는 종들의 예로는 단백질, 폴리펩티드, 콜로이드, 면역글로블린, 융합 단백질, 면역글로블린 단편, 미코플라즈마, 내독소, 바이러스, 아미노산, DNA, RNA 및 탄수화물을 포함한다. 미소여과에 의해 분리될 수 있는 종들의 예로는 포유 동물 세포 및 세균과 같은 미생물을 포함한다.

막 필터는 완전하지 않고 일종의 의도된 보유물 분자가 빠져나가도록 크기가 크게 구성되기 때문에 고르지 못한 부분이나 구멍을 가질 수 있는바, 본원에서는 동일한 세공 크기를 갖는 한 개의 막 보다는 많은 수의 막을 사용하는 것이 바람직한데, 여기서 막들은 서로에 대해 나란한 방향으로 적층화 되어 있고, 바람직하게는 다른 층 상단에 한 층이 올라 있는 방식으로 적층화 되어 있다. 이러한 목적에 적합한 막의 수는 2개인 것이 바람직하다.

상기 공정에서 유지되는 압력하에서 플럭스는 약 5 내지 100%의 적절한 범위를 가지는 데, 플럭스가 낮으면, 막의 표면적이 클 것이 요구된다. 따라서, 막 단가를 최소화하기 위해서는 스펙트럼의 높은 단부 에서 유지시키는 압력하에 플럭스를 작동시키는 것이 바람직하다. 그 범위는 전이점 플럭스의 약 50% 내지 100% 인 것이 바람직하며, 약 75% 내지 100% 가 더욱 바람직한 범위이다.

TMP가 막 표면을 따라 실질적으로 일정하게 유지될 필요는 없지만, TMP를 실 질적으로 일정하게 유지하는 것이 바람직하다. 이러한 상태는 일반적으로 막의 여과물 측에서 압력 구배를 일으킴으로써 이루어진다. 따라서, 여과 장치의 보유물 구획에 있는 혼합물의 흐름과 동일한 방향 및 나란한 방향으로 여과 장치의 여과 구획으로 여과물을 재순환한다. 재순환된 재료의 유입구 압력 및 출구 압력을 조절하여 여과물 구획 전체의 압력 강하와 보유물 구획 전체의 압력 강하가 동일하도록 한다.

이러한 여과물 압력 구배를 달성하기 위해서 몇 가지 실질적인 수단들이 사용될 수 있다. 바람직한 구체화의 일부 예들은 도 2A 및 도 2B에서 보여준 배치들이다. 이들 배치에 따르면, 분리되는 용리물 들은 유입 도관(36)을 통하여 장치 내로 들어가는데, 이것은 분리될 생성물이 발효조에 유지되고 있는 경우 발효기 탱크(도시되어 있지 않음)와 연통 되어 있다. 이것은 또한 세포 배양계에서 세포를 수집한 후에 트랜스제닉 (Tg) 밀크 또는 세포 용해질 또는 상청액 원료를 담고 있는 용기(도시되어 있지 않음)와도 연통하고 있을 수도 있다. 도관(36)에서의 유속은 펌프 수단(40)에 의해 조절된다. 이 펌프는 당업계에 공지된 임의의 적당한 펌프로서, 유속은 당업자에게 공지된 바와 같이, 여과물의 특성에 따라 조정될 수 있다.

본 발명의 미세 여과 유닛(30)에 있어서, 압력 게이지(45)를 임의적으로 사용하여 펌프 수단(40)으로부터 흐르는 유입구 압력을 측정한다. 유입 도관(36)의 유체는 여과 유닛(50)으로 들어간다. 이 여과 유닛(50)은 그 유입구 상단 부위에 있는 여과실(51)과 출구 부위에 있는 여과실(52)을 구비한다. 이들 두 개의 구획은 여과 막(56)에 의해 분할되어 있다. 유입구 유체는 여과실(51)내의 여과 막(55)의 방향과 나란한 방향으로 흐른다. 상단의 여과실(51)은 목적 분자를 함유한 용해물을 지니고 있는 혼합물을 수용한다. 분자의 크기는 표적 분자가 막(55)을 통과하여 여과물로 들어갈 정도로 작거나 또는 출구 여과실(52)로 들어갈 정도로 작다. 농축된 보유물은 출구 도관(60)을 지나 여과 유닛(50)을 통과하는데, 필요하다면, 부가의 막을 이동하는 것을 포함하여 목적하는 소정의 종 분자를 얻기 위해서 미세 여과(MF) 막(65)내로 보유물을 더 수집하거나 가공 처리할 수 있다. 이 전체의 과정이 진행되는 동안에, 그리고 품질 제어 목적으로, 본 발명은 일련의 시료 지점(99)에서 분자 농도, pH 및 오염 "경로 B"를 모니터하도록 한다. 대안으로서, 보유물 스트림은 혼합물이 원래 있던 곳으로부터 "경로 A"를 거쳐 탱크 또는 발효기(35)에 재순환되고, 추가의 정제를 위해서 유입 도관(36)으로 재순환된다.

막(55)을 통과하여 여과실(52)내로 진입하는 목적 분자 함유 용액은 또한 여과 유닛(50)의 동일 단부 에서 출구 도관(70)을 지나 여과 유닛(50)을 떠나가게 되고 보유물 유체는 출구 도관(60)을 통과하여 배출된다. 그러나, 출구 도관(70)을 통하여 흐르는 목적 분자 및 용액은 탱크(35)에 되돌아가고, 이들은 추가의 공정 처리를 위해 압력 게이지(72)로 측정된다.

이와 유사하게, 도 2B에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 이중 TFF 시스템 (80)을 설명한다.

도 2A에 도시된 배치 형태에 있어서, 막은 여과실(51, 52)에 대해서 서로 배치됨으로써 지시된 유속과 막의 압력 차이를 제공할 것이다. 본 발명의 공정에 유 용하게 사용되는 막은 일반적으로 평편한 시트 형태, 둘둘 말린 시트 형태, 실린더 형태, 동심원 실린더 형태, 다양한 단면을 가진 덕트 형태 및 기타 형태로서 어셈블된 단일 형태이거나 또는 그룹 형태로서 존재하며, 이들은 여과 유닛 내에서 연속적으로 또는 병렬적으로 연결되어 있다. 일반적으로 여과 과정 및 여과실이 막의 길이 전체를 따라 작동되도록 이들 장치가 제조된다.

적합한 막은 시스템의 연속 작동에 충분한 속도를 제공하고 실질적인 막힘 문제없이 혼합물 중에서 바람직하지 않은 종들과 바람직한 종들을 분리해 내는 막이다. 세공 크기가 일반적으로 0.1 내지 10 마이크로미터이며, 이 크기보다 더 큰 모든 입자를 보유하도록 제조된 미소 다공성 막이 그 예에 속한다. 이들은 본 발명에 따라 미세 여과 공정에 사용하고 또한 TFF에도 사용이 모두 가능하도록 세라믹 재질인 것이 바람직하다. 한외 여과 막은 작은 세공 크기 및 보유될 단백질의 크기에 따른 특성을 지닌다. 이 막은 1000 내지 1,000,000 달톤의 공칭 분자량 한계치 내에서 일정하게 증가 되는 분자량을 지닌 것이 유용하게 이용된다.

한외 여과 막은 본 발명의 공정에 사용되기에 가장 적합하다. 한외 여과 막은 일반적으로 이들의 분리력과 관계있는 상향 표면상의 박막 필름이거나 또는 얇은 외장을 지닌 것이다. 이들은 일반적으로 재생된 셀룰로스 또는 폴리설폰으로 제조된다.

접선-흐름 여과 시스템(80)에 사용되는 막 필터는 취급할 액체의 부피에 따라 그리고 다양한 세공 크기에 따라 다양한 형태의 유닛으로 제공된다. 본 발명에 특히 적합하게 사용되는 것은, 비교적 대규모 크기를 기준으로, 상업적으로 시판되 고 있는 접선-흐름 여과 유닛으로 공지되어 알려져 있는 것들이다.

대안적이면서 바람직한 장치 및 전술한 이유로 인해서, 도 2A의 미세 여과 유닛(30)은 여러 개, 바람직하게는 두 개의 여과 막, 막(56)과 (57)을 각기 포함한다. 이들 막은 병렬 형태로 서로 층을 이루고 있다.

본 발명은 또한 다단계 캐스케이드 공정을 포함하는데, 여기서 상기 공정으로부터 오는 여과물은 제2 접선-흐름 여과 장치중의 제1 여과 장치의 막보다는 작은 세공크기를 지닌 여과 막을 통과하고, 이 제2 여과 과정에서 나온 여과물은 제1 장치로 재순환 됨으로써 공정이 반복된다.

본 발명에 따른 공정 또는 미소여과 유닛(30)과 함께 사용되기에 적합한 하나의 접선-흐름 시스템(80)이 도 2B에 제시되어 있다. 여기에는, 제1 용기(85)가 유입 도관(90)을 따라 여과 유닛(95) 내에 배치된 여과실(96)에 연결되어 있다. 제1 유입 펌프 수단(100)은 제1 용기(85)와 여과실(96) 사이에 배치된다. 여과실(96)은 출구 도관(110)을 통하여 제1 용기(85)에 연결된다. 여과실(96)은 제1 여과 막(115)에 의해 제1 여과실(97)과 분리되어 있는데, 이 여과실(97)은 여과 유닛(95)내에서 그것 바로 아래에 위치한다. 제1 여과실(97)은 여과실(97)의 유입구에 연결된 출구 도관(98)을 구비하며, 여과물 펌프 수단(120)은 도관(98)에 배치된다. 출구 도관(98)에 연결된 도관(45)은 제2 용기(120)에 또한 연결된다.

이 용기(120)는 유입 도관(125)을 통하여 제2 여과 유닛(130) 내에 배치된 제2 여과실(127)에 연결되어 있다. 제2 유입 펌프 수단(133)은 제2 용기(12)와 여과실(127) 사이에 배치된다. 여과실(127)은 제2 여과 막(128)에 의해 제2 여과 실(129)과 분리되어 있는데, 이 제2 여과실은 여과 유닛 (130)내에서 그것 바로 아래에 위치한다. 제2 여과실(129)은 출구 도관(135)을 구비하며, 이 출구 도관은 여과실(129)의 유입구에 연결되어 있고, 여과 펌프 수단(140)은 도관(135)에 배치된다. 출구 도관(135)에 연결되어 있는 도관(125)은 제3 용기(150)에 또한 연결된다.

이 용기(150)는 제3 여과 유닛(160) 내에 배치된 제3 여과실(157)에 유입 도관(155)을 통하여 연결되어 있다. 제3 유입 펌프 수단(165)은 제3 용기(150)와 여과실(157) 사이에 배치된다. 여과실(157)은 제3 여과 막(165)에 의해 제3 여과실(159)과 분리되어 있는데, 이 제3 여과실은 여과 유닛 (160) 내에서 그것 바로 아래에 위치한다. 제3 여과실(159)은 도관(155)에 연결된 출구 도관(170)을 구비하는데, 이것은 제1 용기(150)에 연결되어 원래의 탱크 내로 여과물이 재순환되도록 한다. 시료점(99)은 공정뿐 아니라 압력 게이지(175)를 모니터하기 위해서도 또한 제공되었다.

본 발명의 공정은 상업용 규모에도 상당히 적합하게 사용된다. 본 공정은 배치 또는 연속 공정식, 또는 반-연속 공정식, 예를 들면 여과 단계 사이에 세척 단계를 삽입하면서 전체의 커다란 배치가 여과될 때까지 접선-흐름 필터를 통과시켜 소정의 종들을 함유하는 용액을 연속적으로 흐르게 하는 방식으로 작동할 수 있다. 이후에, 새로운 배치 용액을 처리할 수 있다. 이러한 방식으로, 연속 사이클 공정을 수행하면 비교적 짧은 시간 동안 허용 가능한 정제형으로 소정의 생성물 다량이 수득된다.

필터의 막힘 없이 고형분을 함유하는 용액을 제공하는 여과 능력을 가진 본 원에서 설명된 독특한 특성의 접선-흐름 여과 과정은 연속적이면서 상업적 규모 사용에 적합하도록 생물학적 반응 생성물을 분리 및 정제하는 데 있어서 매우 이로운 공정을 제공한다. 또한, 이 공정은 생물학적 분자, 예를 들면 트랜스제닉 기원 물질, 항체, 세포 단편 및 세포 배양 용해질과 같은 광범위한 범위의 생물학적 분자에 적용해서 사용하는 것도 가능하게 한다.

하기의 실시예는 본 발명을 자세히 기술하지만, 본 발명이 이것에 의해서만 제한되는 것은 아니다. 이들 실시예에서, 모든 참고 개시 문헌은 참고용으로 본 명세서에 인용된다.

정제 방법

본 발명에 유용하게 사용되는 막은 여러 가지 유형으로 생성 모듈에 따라 제작될 수 있다. 접선-흐름 여과에 적합하게 사용되는 일반적인 포맷은 다음과 같다:

·평평한 플레이트

·나사형 부분

·중공 섬유

각 모듈에 대한 기본적인 흐름 패턴이 도 3에 도시되어 있는데, 이것은 다양한 HPTFF 및 TFF 모듈내로 공급류의 유체가 흘러가는 흐름 패턴을 보여주는 것이다.

종종 나사형 모듈 및 편평한 플레이트 모듈의 공급물 및/또는 여과 채널내에 스크린을 삽입시키면 채널간에 교류가 증가되면서 농도의 극성화는 감소된다. 이것은 중공 섬유 모듈에 대한 옵션은 아니다. 교류 촉진 채널은 낮은 교차 흐름 속도 하에서 높은 질량 전달 계수를 지니는데, 이는 높은 플럭스가 낮은 펌프 요구치로 달성된다는 것을 의미한다. 교류 촉진 공급 채널은, 그러므로, 개방 채널보다 더욱 효율적이다. 평편한 플레이트 모듈에 달려 있는 스크린을 사용하면 두 가지 개방 채널 및 교류 촉진 채널 일부가 형성된다. 도 7은 채널 배열의 다양한 유형을 도시한 것이다.

평편한 플레이트

(종종 카세트라고 지칭함) 평편한 플레이트 막 모듈에 있어서, 분리체 스크린의 교호층을 구비하거나 구비하지 않은 막 층들을 쌓아서 서로 적층체를 이루도록 한후 패키지로 밀봉하였다. 공급 유체를 이 적층체의 한 단부에 있는 교호성 채널 내로 펌프하고, 여과물은 막을 지나 여과 채널 내로 통과시킨다. 일반적으로, 평편한 플레이트 모듈은 높은 패킹 밀도(플로어 공간 면적당 막의 면적)를 지니므로 선형 스케일링을 허용하며, 일부는 개방형 채널 또는 교류 촉진 채널의 선택을 가능케 한다.

나선형 모듈

나선형 모듈에 있어서, 막과 분리체인 스크린의 교호성 층은 중공의 중심 핵 주변을 둘러싼다. 공급류는 한 단부 내로 펌프질해 들어간 후 카트리지의 축아래로 흐른다. 여과물은 막과 나선 모듈을 통과하여 코어까지 간후 이것을 제거한다. 분리체 스크린은 흐름 패턴에서 교류를 증가시켜, 중공 섬유보다는 더 높은 효율을 유발한다. 나선형 모듈이 가진 단점은 이들이 선형의 규모를 가질 수 없다는 것인데, 그 이유는 공급물의 흐름 경로 길이(카트리지 길이) 또는 여과물 흐름 경로(카 트리지 너비)가 규모 내에서 변화되어야 하기 때문이다.

중공 섬유

중공 섬유 모듈은 일반적으로 0.1 mm 내지 2.0mm 의 좁은 직경을 가진 막 튜브 번들로 구성된다. 중공 섬유 모듈에 있어서, 공급류는 튜브의 루멘(내면)내로 펌프되고, 여과물은 막을 지나 외장 측까지 가서 여기서 제거된다. 매우 개방적인 공급 흐름 경로 때문에, 적절한 교차 흐름 속도 하에서조차 낮은 전단력이 발생한다. 이러한 현상은 높은 전단력-민감 생성물에 유용하게 사용될 수 있긴 하지만, 일반적으로 경쟁력 있는 플럭스를 달성하기 위해서는 매우 높은 펌핑 능력을 필요로 하기 때문에 모듈의 효율을 감소시킨다.

공급-및-배출 실험을 제외하고는 모든 실험은 미세 여과 시스템으로 수행하였는데, 이때 사용된 장치는 다음과 같다:

펌프와 상호 연관되도록 구경화된 60 LPM 펌프(펌프 곡선)

1"OD 스테인레스 스틸 위생 파이핑

0.2 ft²또는 1.5 ft²의 0.2㎛ 세공 크기 세라믹 막

1 1/2" 출구 포트를 구비한 스텐레스 스틸 위생 막 홀더

1/4" ID 유연한 투과물 튜빙

보유물 라인상의 다이아프람(Diaphragm) 밸브

2 압력 게이지

스틸 1.2 L 공급물 저장고

3/4" ID 유연한 보유물 튜빙

모든 HPTFF 실험을 위해서, 전술한 장치들이 하기의 장치와 커플링 되어 있다:

최대 800mLPM의 출력을 지닌 다이아프램 펌프

모든 라인상의 1/4"ID 유연한 압력 저항 튜빙

공급물 압력 측정을 위한 1 압력 게이지

보유물 및 투과물 라인 상의 2 다이아프람 밸브

0.2 ft²또는 1 ft²의 30kDa NMWCO PES 팔 피트론 센트라메이트(Pall Filtron Centramate) 막

스텐레스 스틸 팔 필트론 센트라메이트 막 홀더

투과물 포트를 연결하기 위한 1 스텐레스 스틸 u-밴드 파이트

막 선택

본 발명의 HPTFF 시스템용으로 선택된 막은 다양한 형태 및 공칭 분자량 컷-오프로 구성된 군에서 선택된 것이었다. 예전 연구는 정제 단계에서 높은 MWCO UF 막뿐 아니라 세라믹을 기준으로 한 중합체를 사용하는 것에 관한 것이었다. 밀크를 2배 묽게 농축시킨 후 모든 막에 대해서 HPTFF를 수행하였다. 이후 막을 다수회의 작동 및 세정 단계를 거치게 함으로써 막의 재사용 여부를 분석하였다. 정상수 플럭스가 최초 막의 80% 이상으로 유지될때 막은 다음 공정에 사용가능 하도록 회수되는 것으로 간주하였다. 평편한 중합성 막 카세트 어느 것도 3회 사용 후 표적수 플럭스 회수를 유지한 것이 없었던 반면, 세라믹 막은 60회 이상 회수되었다. 이것은 높은 화학적 농도 와 높은 온도의 거친 조건을 사용하여 세라믹을 세정하는 역량 때문이었다. 30kDa의 한외 여과 막은 20 회수의 사이클을 넘어서도 높은 수(水) 플럭스 회수율을 유지 하였다.

0.2㎛의 공칭 세라믹 튜브 막을 사용하여 밀크를 정제하고 목적 단백질을 통과시키기 위한 제1 유닛을 테스트하였다. 30kDa 분자량 컷-오프의 평편한 한외 여과 막을 사용하여 목적 단백질 포획용의 제2 시스템을 테스트하였다.

분석 방법

각 실험 시료에서 얻은 샘플을 분석하는데, 단백질 A HPLC에 의해서는 재조합 인간 알파 태아 단백질(rhAFP)의 함량을, SDA-PAGE에 의해서는 이의 열화를, 등전포커싱(IEF)에 의해서는 이의 변형을, 그리고 크기 절단 크로마토그래피(SEC)에 의해서는 이의 응집 여부를 분석하였다.

절차

공정 작동 관계를 이해하고자 0.2㎛ 분자량 컷-오프 세라믹 미세 여과 막을 사용하여 일련의 제어 실험을 수행하였다. 생성물 플럭스 (Jp)는 유속(u), 막간 차압(TMP), 온도(t), 및 밀크 농도(c)와 관련하여 측정하였다. 이들 관계가 일단 정립되면, 작동의 최적 윈도우를 결정하고 콤파일된 공정을 테스트하였다. 시료를 취하고 질량 균형 데이터를 모은 후 초기 생성물 수득량과 생산량을 분석하였다(도 2A 및 2B 참조)

온도 실험

본 실험의 목적은 최저 부피로 0.2 ㎛, 3 mm 채널의 세라믹 MF 막을 통과시켰을때 최적의 rhAFP를 제공하는 작동 온도의 범위를 측정하기 위한 것이었다. 공정을 처리하는 동안에 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 rhAFP 열화를 분석하기 위해서 밀크를 풀링(pooling)하기 전에 각 밀크 단편의 pH를 취하였다. 밀크를 MF 공급물 탱그내에 넣어 풀로 만든 후 전체 부피를 기록하였다. 이번에는 MF 펌프 제어기를 20Hz 내지 45 Hz(약 5L/분 내지 약 20 L)로 올렸다. 매 연속적인 시점마다 온도, 압력, 교차 흐름 속도, 투과 유속 및 부피와 같은 모든 파라미터를 기록한다. 이 MF 루프는 5분간 재순환(경로 A)으로 작동된다. 막간 차압을 12 psi로 조정한 후 5분간 재순환시킨다(경로 A)(온도 20℃에서 유지됨). 밀크가 원래의 밀크 부피의 2X로 농축될 때까지 투과물 라인을 배수시킨다(투과물이 수집된다). 온도는 20℃에서 유지하였다. 시료 2 및 3은 공급물 저장고 및 투과물 라인에서 취하였다. 이후 투과물 라인을 경로 A로 되돌아가게 한 후 10분간 재순환하였다. 시료 4 와 5를 취하였다. 온도를 25℃로 증가시켰다. 이후에 이 시스템을 10분간 재순환시키고 난 후 시료 6과 7을 취하였다. 온도를 30℃로 증가시켰다. 다음에, 이 시스템을 10분간 재순환시키고 시료 8과 9를 취하였다. 온도를 35℃로 증가시켰다. 다음에, 이 시스템을 10분간 재순환 시키고 시료 10 및 11을 취하였다. 온도를 40℃로 증가시켰다. 이후 시스템을 10분간 재순환 시키고 시료 12와 13을 취하였다. 다음에 펌프의 전원을 끄고, 시료를 2-8℃에서 보관한 후 정량 분석하였다. 시료는 IEF로 분석하였다.

MF 밀크 농축 실험

본 발명의 바람직한 구체화에 따른 본 실험의 목적은 최저 부피로 0.2 ㎛, 3 mm 채널의 세라믹 MF 막을 통과하여 초기의 밀크 농도 범위를 측정하기 위한 것이었다.

절차적인 관점에서, 밀크를 풀링 하기 전에 각 밀크 단편의 pH를 취하였다. 밀크를 MF 공급물 탱크 내로 유입한 후 총 부피를 기록한다. 이번에는 MF 펌프 제어기를 20Hz 내지 45 Hz(약 5L/분 내지 약 20 L)로 올렸다. 매 연속적인 시점마다 온도, 압력, 황단 속도, 투과 유속 및 부피와 같은 모든 파라미터를 기록한다. 이 MF 루프는 5분간 재순환(경로 A)으로 작동된다. 막간 차압을 12 psi로 조정한 후 5분간 재순환시킨다(경로 A)(온도 20℃에서 유지됨). 막간 차압을 15 psi로 조정하고 5분간 재순환(경로 A)시켰다. 모든 밀크가 농축될 때까지 투과물 라인을 배수하고, 550ml의 투과물을 수집한 후, 경로 A에 대한 투과물 라인으로 되돌아가게 하였다(10분간 재순환된다). 시료 2와 3을 공급물 저장고 및 투과물 라인으로부터 각기 취하였다.

투과물 라인은 경로 B로 향하게 하고 600ml의 밀크를 공급물 저장고에 첨가하였다. 모든 밀크가 농축될 때까지 투과물 라인을 배수하고, 500ml의 투과물을 수집한 후 투과물 라인을 경로 A로 되돌아 가게 하였다(재순환은 10분간). 시료 4 와 5를 공급물 저장고 및 투과물 라인으로부터 각각 취하였다. 이후 투과물 라인을 경로 B에 보내고, 500ml의 밀크를 공급물 저장고에 첨가하였다. 밀크가 농축될 때까지 투과물 라인을 배수하고, 500ml의 투과물을 수집한 후 투과물 라인을 경로 A로 재순환 하였다(재순환은 10분간). 시료 6 와 7을 공급물 저장고 및 투과물 라인으 로부터 각각 취하였다. 다음에, 투과물 라인을 경로 B에 보내고, 380ml의 밀크를 공급물 저장고에 첨가하였다. 밀크가 농축될 때까지 투과물 라인을 배수하고, 400ml의 투과물을 수집한 후 투과물 라인을 경로 A로 재순환 하였다(재순환은 10분간). 시료 8 와 9를 공급물 저장고 및 투과물 라인으로부터 각각 취하였다. 펌프의 전원을 껐다. 시료는 2-8℃에 보관한 후 단백질 A 분석에 의한 단백질 정량 분석, 응집 과정에 대해서는 SDS-PAGE 및 웨스턴 분석, 응집 과정에 대해서는 SEC, 그리고 등전점 변형점에 대해서는 IEF로 분석을 수행하였다.

원유로부터 지방, 카세인, 마이셀(micelles), 및 세균과 같은 과립성 덩어리를 제거하는 방식으로 밀크 매트릭스 중에서 rhAFP를 정제하고 안정화시키는 공정으로 HPTFF를 개량하였다. 생물공학 및 낙농 산업에서는 불순물 및 농축 생성물을 제거하기 위해서 HPTFF를 제한적 모드로 사용하고 있다. 본 발명에 따라 HPTFF를 효과적으로 사용하기 위해서, 적절한 막을 선택하고, 높은 생성물 플럭스를 얻도록 공정 파라미터(온도, 막간 차압, 교차 흐름 속도 및 밀크 농도)를 최적화하며, 세정 및 보관 절차를 개발하여 오랜 막 수명을 보장하였다. 본 발명에 따른 실험 매트릭스 파라미터는 본원에 기술되어 있으므로, 이를 트랜스제닉 염소 밀크에 적용시켜 이전의 작동 파라미터를 확인한다. 막 세정 및 보관 조건을 또한 연구하였다. HPTFF 공정을 완결한 무균 여과 단계를 개발하여 대상 단백질이 함유된 정제 밀크 생성물에 남아 있는 임의의 세균을 제거하였다. 공정에 대한 정보를 파일럿 스케일 장치로 보내는데, 이 장치는 초기 공정 작동을 수행하는 장치이다. 주입하기 위한 물의 필요성을 방지하고자 어떠한 첨가제도 사용하지 않으면서 일종의 공정 디자인 기준으로서 긴 막 수명, 고 수율, 및 짧은 공정 시간을 포함하였다. 본 발명의 공정은 파일럿 작동 및 제조 작동으로 바람직하게 규모화할 수 있는 것이었다.

비-트랜스제닉 공급-및-배출 실험

0.2 마이크로미터의 세라믹 미세 여과 막을 사용하는 농축 과정 동안에 비-트랜스제닉 밀크를 사용하여 액체 플럭스 부식을 분석하였는데, 이는 비-트랜스제닉 밀크의 충분한 공급이 가능하기 때문이었다. 이러한 실험에 사용되는 장치는 미세 여과 실험장치에 설명된 것과 동일한 설비를 포함하였지만, 제2 공급물 저장고와 공급 펌프가 보충되어 투과물이 막으로부터 흘러나가는 속도와 동일한 속도로 밀크가 미세 여과 시스템의 공급물 저장고 내로 흘러가게 한다는 점이 다르다. 설비에 대한 도식은 다음과 같다.

그래프 A

상기 그래프 A에서 보는 바와 같이, 공급물 저장고에 밀크 1500 ml를 넣어 충진시키고 펌프는 45Hz하에 출발하였다. 보유물의 압력 없이 이 시스템을 10분간 재순환으로 작동하였다. 모든 파라미터를 기록하였다. 다음에, 보유물의 압력을 막간 차압 11 psig에 대하여 10 psi로 증가시켰다. 이 막간 차압은 보유물 밸브를 조정함으로써 실험 전체를 통해 일정하게 유지되었다. 투과물을 배수하고, 제2 펌프 를 작동시켜 투과물이 제거되는 속도와 동일한 속도로 생 밀크를 공급물 저장고로 펌프질하되, 공급물 저장고의 부피가 일정하게 유지되도록 하였다. 모든 파라미터를 5-10분의 간격으로 기록하고, 제2 펌프 속도를 조정하여 공급물 저장고에서의 밀크 레벨을 일정하게 하였다. 밀크가 5.37X 또는 82%로 농축될 때까지 실험을 작동하였다.

막 세정

엄격한 클리닝(세정) 조건을 사용하여 사이클에서 다음 사이클까지 막 물 흐름 회수율이 높도록 보장하였다. 클리닝 단계는 생약학적 실시의 관점을 고려하여 낙농 산업의 표준 막 클리닝을 모방 디자인하였다. 물 세척(flush) 단계는 적절한 pH 값과 전도율 값을 얻기 위해서 잔여성 화학 약품을 세척해내면서 물의 사용은 최소화하도록 최적화한 것이다. 하기의 클리닝 사이클들은 표 1 및 2에 제공된 매 공정 단계 후에 수행하였다.

[표 5]

세라믹 막 세정 단계

	단계	농도	부피	시간	온도	pH
1)	물 세척(플러쉬)	-	16-20L	5분	60℃	7.0
2)	NaOH 세정(wash) 차아염소산나트륨	0.5M 400ppm	1L	10분	60℃	>11.5
4)	NaOH 세정 차아염소산나트륨	0.5M 400ppm	1L	30분	60℃	>11.5
5)	물 세척	-	20-25L	5분	60℃	7.0
6)	구연산 세정	0.4M	1L	30분	60℃	<2.75
7)	물 세정	-	16L	10분	60℃	7.0
8)	차아염소산나트륨	300ppm	1L	15분	60℃	>9.5
9)	NaOH 물 세척	0.05M -	12L	10분	60℃	7.0
10)	NaOH 보관	0.1M	1L		20℃	10-12

밀크를 정제하기 위한 파일럿 공법에 사용되는 설비 장치상에서 다수의 공정을 수행한 후, 투명한 정제 밀크를 일정하게 생산하기 위해서 필요한 장치와 공정 절차를 변형하였다. 광범위한 테스트를 위해서 파일럿 공법의 GMP 환경으로부터 이들 장치를 제거하여 개발 실험실에 보냈다. 이 시스템에 대한 변형은 투과물 파이핑(piping)을 줄이고 밸브의 위치를 시스템 내에서 변화시켜 클리닝 및 위생화 단계 중에 린스를 용이하고 쉽게 한 것이다. 클리닝 프로토콜을 약간 변형하여 클리닝 효율을 개선하고 물의 사용을 감소시켰다. 공정의 온도 범위를 측정하였다. 마지막으로, 공정 파라미터들은 GMP 문헌 작업에서보다 훨씬 더 잘 정의되었다.

파일럿 설비 장치에 합당한 원래의 디자인을 구축하는데 있어서 이 장치는 모두 스텐레스 스틸로 하였다. 그러나, 이 디자인이 클리닝 처리를 수행하기 불편한 것은 공정 모드에서 클리닝 모드로 분해하는 데 길다란 길이의 파이프가 많이 필요하다는 것이었다. UF 투과물 파이핑의 길이 및 내부 직경 때문에, 클리닝 프로토콜 진행시 효과적으로 클리닝 되지 않거나 또는 헹구어(RINSE)지지 않았다. 다수의 조각들을 MF 시스템에 첨가하면 클리닝이 용이하게 진행되지만, 이러한 구조는 다시 모아야 하는 파편을 위한 사각 지대를 제공해야 한다. 이 문제는 기다란 UF 투과물 파이핑 대신에 1/4" 내부 직경 튜빙을 사용함으로써 해결되었다. 클리닝 셋업을 변경하면 MF 막의 상단 포트가 다른 조각들을 제거하는 데 필요한 막의 투과물 측을 클리닝하는 데도 사용될 수 있을 것이다. 다음에, UF 투과물 튜빙은 클리닝 진행중에 UF상에 그대로 남게 된다. 또한, 커다란 열 교환기를 시스템의 MF 부 위에 설치하면, MF에서의 미세한 온도 조절이 가능하긴 하지만, 적당한 공정 처리 범주 내에서 UF 온도를 제어하는 것이 불가능하다. 따라서, 열교환기를 시스템으로부터 제거하고, 냉각기를 세팅하여 적당한 온도 범위 내에서 이 두 개의 시스템을 적절히 냉각시켰다. 최종적인 디자인은 다음과 같다. 보관, 위생 처리 및 공정 처리를 위한 설비 장치가 어셈블리 되었다. 본 발명의 바람직한 구체화에 있어서, 장치의 배열은 상기 그래프 O 및 P에 나타난다.

세정 및 위생화 공정의 변형

설비 장치의 변형은 클리닝(세정) 프로토콜 및 위생화 처리 프로토콜을 변경시킬 필요에서 수행되는 것이었다. 클리닝 프로토콜은 상기 표에 따라 매번 작동한 후에 나타난 것이다. MF상의 보유물 밸브를 1/2은 개방 상태로 두어 적절한 헹굼 공정을 각 헹굼 단계 시마다 용이하게 수행하는 것이 필요했는데, 이는 밸브와 저장고 사이에 기다란 길이의 사각 지대가 존재하기 때문이다. 작동 4를 시행한 후, 클리닝 프로토콜을 시행하고 물의 소비를 추적하였다(노트북 10586). 이 실험에 사용된 물은 작동 5, 6, 및 7를 수행한 후에 입증되었으며, 이는 GMP 공정에 사용되도록 권고된 것이었다. 또한, 전술한 바와 같이, 설비 장치를 변경하면 이 공정 모드를 통해 본 시스템이 위생 처리 되도록 하므로 이를 테스트하였다. 시스템에서 위생물을 헹구는데 필요한 USP 물을 또한 측정하였다.

동작

HPTFF를 사용하여 밀크 가공 공정을 수행하기 위해 취해진 실제 단계들은 다음 단락에 기재되어 있다. 이들은 시스템을 위생 처리하는 공정으로부터 가공 처리 하는 공정, 클리닝 하는 공정, 그리고 보관하는 공정으로 이루어진 전체 공정을 포함한다. 이 절차들은 작동 5-7 시행시 개발 실험실에 있는 장치를 사용하여 수행되었는데, 그 결과 투명한 정제 밀크가 생산되었다.

위생화 처리 공정

세라믹으로 만든 0.2 마이크로미터 미세 여과 막 및 30kDa 한외 여과 막을 사용하는 HPTFF를 수행하여 트랜스제닉 염소 밀크를 정제하고 농축하기 위해서는 시스템은 0.1M 수산화나트륨으로 위생처리 해야만 한다. 상술한 바와 같이, 본 장치를 위생 처리하고 가공하기 위해 설비 장치를 어셈블리한다. USP 물로 제조한 수산화나트륨 0.1 M 2L을 각 시스템을 통해 펌프질하고, 15 LPM의 교차 흐름은 MF상에, 그리고 1LPM의 교차 흐름은 UF상에 흐르게 하였다. 5 psi의 압력이 UF의 보유물에 부가된 반면, 보유물의 압력은 MF에 부가되지는 않았다. 이 투과물 밸브는 완전히 개방되어 있어서 수산화나트륨이 전체 시스템을 재순환되게끔 한다. 재순환은 15분간 수행되며, 이후 탱크와 펌프 사이의 배출 밸브를 통하여 시스템 내로 용액을 배수시킨다. 필요할 때마다 USP 물로 탱크를 완전히 채우는 방식으로 USP 물을 사용하여 시스템을 헹군다. 1L의 물을 각 배출 밸브로부터 배수한다. MF상의 보유물 밸브는 1/2을 잠그고 투과물 밸브는 완전히 닫는다. 20 LPM의 교차 유속하에 12L의 USP 물을 MF 보유물 전체를 세척하였다.15-20 LPM의 유속 및 6-8 psi의 TMP하에 4L의 USP 물로 MF 보유물 전체를 세척하였다. 7L의 USP 물을 1 LPM의 교차 유속하에 MF 보유물 라인 및 투과물 라인내로 통과시켜 세정한 후, 투과물을 3L의 물로 더 세척한다.

USP 물(필요할 경우 더 첨가함)을 사용하여, MF를 20LPM에서 펌프하고, 투과물의 압력이 없는 가운데 TMP가 15 psi에 도달할 때까지 보유물의 압력을 증가시킨 후, 교차 유속을 펌프 속도가 15LPM이 되게 조정한다. 온도(25 내지 28℃), 압력, 및 교차 유속을 기록한다. 투과물 배수 밸브를 통과하는 투과물의 유속을 측정한다. l LPM의 교차 흐름 및 보유물 압력 5 psi, 그리고 투과물 압력 0 (약 10 psi의 TMP)을 사용하여 UF 상에서 이를 반복한다. 투과물 유속과 막의 처음 물 투과력의 유속은 서로 대등하다. 투과 속도가 원래 값의 80% 미만인 경우라면, 막을 다시 클리닝하거나 또는 이들을 대체한다.

밀크 가공 처리 공정

밀크를 반드시 풀(pool) 처리하고 온도를 15 내지 20℃로 올린다. 밀크를 MF 저장고에 넣어 풀 처리한 후, MF 투과물 밸브를 닫고, 보유물 밸브를 개방한 후, 펌프에 전원을 넣어 20LPM의 교차 속도를 유지한다. 5분 후에, 초기의 밀크 시료를 취한다. 이후 압력을 증가시켜 TMP가 15 psi이 되도록 하고, 교차 유속은 15 LPM이 되게 한다. 밀크 온도가 20℃에 도달할 때까지 재순환을 시킨다. 이어서, 냉각기에 전원을 넣어 10℃로 유지하고, 세라믹 막의 투과물을 수집하는 방식으로 MF 투과물 밸브를 개방하여 밀크가 미세 여과 시스템상에서 원래 부피의 1/2가 되도록 농축한다. MF는 막간 차압이 15 psi이면서 15LPM의 교차 유속으로 수행된다. MF의 온도는 증가된 후 26℃±2.0에서 유지되어야 한다. 한외 여과 시스템은 이후에 0.8-1 LPM/ft² 교차 유속으로 시작되어야 한다. 각 막의 투과물 유속은 투과물 밸브를 통 하여 측정된다. UF의 보유물 압력과 투과물의 압력은 투과물의 유속이 MF의 투과물 유속과 일치되도록 조정되어야만 한다. UF 투과물 유속이 MF의 유속과 일치되면, 이 시스템은 5-6 투석 여과 부피에서 작동되어야 한다.

투석 여과 공정이 완결되면, 시스템은 연결이 끊어지게 되고, MR는 차단되며, 배수 및 클리닝 된 후, 4X의 전체 농도를 나타내도록, UF의 공급물 저장고에 있는 정제된 농축물의 벌크 부피가 1/2 부피로 농축될 때까지 UF 투과물은 배수된다. 다음에 UF를 배수하고, 벌크 정제 농축물을 무균 여과한 후, UF를 세정한다.

세정 및 보관 프로토콜

대상 단백질의 분별 과정을 허용하는 본 장치의 구성 요소들을 적절히 클리닝하고 보관하기 위해서, 처음에 공급류 유입을 시스템에 차단한다. MF를 20L의 고온 연수(45-65℃)로 헹구고, 보유물의 밸브는 1/2을 개방하여 두며, 투과물은 배수되게 하였다. 용액이 공급물 저장고에 되돌아 가도록 밸브를 재순환 위치에 놓고, 400ppm의 차아염소산나트륨과 함께 2L의 고온 0.5 M 수산화나트륨을 5분간 재순환한다. 상기 용액을 시스템으로부터 배수하고, 2L의 동일한 화학 약품으로 대체한다. 새 용액을 30분간 재순환하고, 배출 밸브 내에서 배수한다. 이후 보유물 밸브를 1/2 개방한 상태에서 시스템을 20L의 고온 연수로 세척한다. TMP 6-8 psi 및 20LPM 하에서 막의 보유물 측 상에 물을 재순환 시키는 방식으로 4L를 투과물 내에 넣어 세척한다. 남은 물은 배출 밸브를 통해서 배수한다. 2L의 고온 0.5 M 구연산을 시스템 내에서 30분간 20LPM과 TMP 6-8 psi 에서 재순환하였다. 구연산을 이후에 배출 밸브를 통하여 배수하였다. 15L의 연수를 사용하여 MF의 보유물 측을 헹구 고, 4L를 사용하여 투과물 측을 헹구었는데, 이는 부식 단계로서 행한 것처럼 수행하였다. 부식 단계에서 수행한 것처럼, 400mp의 표백제와 함께 2L의 고온 0.05M 수산화나트륨을 MF를 통하여 15분간 재순환 시킨 후 배수하고, 보유물 측 상에서 10L의 물로 헹구고, 4L 물로 투과물 측을 헹구었다.

보유물 밸브를 배수하게 하면서 전체 투과물 라인을 배수하는(밸브에 의해서가 아님) 방식으로 UF 보유물 라인과 투과물 라인을 초기 물 세척용 배수 라인으로 사용한다. 항상 펌프를 1LPM 하에서 작동한다. 즉, 보유 압력이 증가 되는 경우, 펌프 속도 또한 1LPM을 유지하도록 증가시켜야만 한다. 4L의 USP 물을 상기 두 개의 라인을 통하여 헹군다. USP 물과 함께 250ppm 차아염소산나트륨을 지닌 2L의 0.5 M 수산화나트륨으로 두 개의 라인을 세척한다. 공급물 저장고에 연결된 투과물 라인을 지닌 시스템 내로 2L의 신선한 용액을 재순환시키고, 보유물 밸브를 60분간 저장고에 대해서 개방 상태로 둔다. 배출 밸브를 통하여 용액을 배수한다. 초기 세척 과정처럼 두 개의 라인을 배수시킨다. 저장고를 USP 물로 채우고 배출 밸브를 통하여 1L의 물을 배수한다. 두 개의 라인을 통하여 8L로 세척하고, 추가의 4L로 보유물의 압력이 5 psi 되게 하면서 투과물 라인을 통하여 세척한다. 시스템내로 60분간 2L의 0.4 M 구연산을 재순환시킨다. 배출 밸브를 통하여 산 용액을 배수하고, 저장고를 USP 물로 채우고, 1L를 분지 밸브를 통하여 배수한다. 8 L의 물을 보유물 라인과 투과물 라인으로 보내 세척하고, 이후에 5 psi의 보유물 압력을 지닌 막 전체에 대해서 1LPM의 교차 속도하에 추가의 8L의 물을 투과물 속으로 보내 세척한다.

두 개의 시스템이 세정되고 헹구어지면, 이들은 보관(상기 다이아그램)을 위해 어셈블리 된다. 2L의 0.1M 수산화나트륨을 각 공급물 용기에 붓고, 보유물과 투과물 밸브는 개방한 상태로 펌프질하여 재순환한 후, 2분간 밸브를 폐쇄한다. 이 용기를 덮은 후 클리닝 처리한 것으로 라벨을 부착하여 0.1 수산화나트륨 중에서 보관한다.

공정 파라미터는 일관성 있는 재료를 생산하는 데 있어서 중요한 것으로 나타났다. 정제에 사용되는 막은 CerCor 세라믹으로 만든 0.2 마이크로미터 세공 크기의 막, 1.5 ft² 및 30kDa NMWCO 팔 피트론 PES 카세트, 2ft²이었다(2 카세트). 미세 여과 시스템의 온도는 최적으로 목적하는 투명도(clarity)와 플럭스를 얻기 위해서 26 내지 29℃에서 유지되었다. 미세 여과 시스템은 15 psi의 막간 차압으로 보유물 유속 14LPM(42 cm/s)하에 작동되어야 한다. 밀크는 원래의 풀 부피의 40 내지 70%로 묽은 농도여야 한다(1.5-2.5X). 시스템의 한외 여과 처리 공정은 공급물 압력이 20-30 psi, 보유물 유속이 1.6 내지 2LPM에서 작동되어야 한다. 투과물 유속은 투과물 압력을 조정함으로써 미세 여과 시스템의 그것과 일치되어야 한다. 최종 벌크 정제 농도는 원래의 밀크 풀의 1/4이 되어야 한다(4X 농도).

재조합체 생산

치료 및 진단 용도로 많은 수의 재조합 단백질이 개발되고 있다. 하지만, 많은 이들 단백질은 통상의 방법을 사용하여서는 기능적 형태 및/또는 필요한 양으로 생산하기 어렵거나 비용이 비싸다. 통상적인 방법은 특정 단백질의 생산에 관여하 는 유전자를 숙주 세포, 예를 들면 세균, 효모, 또는 포유 동물 세포, 예를 들면, COS 또는 CHO 세포 내로 삽입한 후, 이 세포를 배양 배지 내에서 자라게 하는 것이다. 다음에, 배양된 세포는 원하는 단백질을 합성한다. 전통의 세균 또는 효모 계로는 기능적 형태로는 많은 복잡한 단백질을 생산하는 것이 힘들 수도 있다. 포유 동물 세포는 복잡한 단백질을 재생산할 수 있긴 하지만, 이들을 자라게 하는 것은 일반적으로 어렵고 비용이 많이 들며, 종종 mg/L 단위의 소량 단백질을 생산할 뿐이다. 또한, 분비되지 않은 단백질은 원핵 세포 또는 포유 동물 세포로부터 정제하는 것이 비교적 어려운데, 이는 이들이 배양 배지 내로 분비되지 않기 때문이다.

일반적으로, 트랜스제닉 기술은, 정상적으로는 분비되지 않는(비-분비성 단백질) 단백질을 제조하여 분비하는 데 그 특징이 있다. 이 방법은 다음을 함유하는 핵산 구조체로부터 단백질을 발현하는 것을 포함한다: (a) 프로모터, 예를 들면, 유방 상피 특이적 프로모터, 예를 들면, 밀크 단백질 프로모터; (b) 단백질의 분비를 지시하는 시그날, 예를 들면, 밀크 특이적 단백질로부터의 시그날 서열; (c) 임의적 으로는, 예를 들면 분비하지 않은 단백질의 분비를 트랜스제닉 포유 동물의 유즙에 분비하도록, 유즙 내에서 분비된 단백질, 즉 분비된 단백질의 아미노 말단 암호 영역의 충분한 부위를 암호화하는 서열; 및 (d) 분비되지 않은 단백질을 암호화하는 서열로서, 여기서 구성 요소 (a), (b), 임의적으로는 (c), 및 (d)는 인용된 순서에 바람직하게 작동가능하게 결합 된다.

바람직한 구체화에 있어서, 구성 요소 a, b, c (존재한다면), 및 d는 동일한 유전자로부터 유래된 것이며; 구성 요소 a, b, c (존재한다면), 및 d는 2 가지 이 상의 유전자로부터 유래된 것이다.

바람직한 구체화에 있어서, 분비는 트랜스제닉 포유 동물의 밀크 내에서 이루어진다.

바람직한 구체화에 있어서, 시그날 서열은 β-카세인 시그날 서열이며, 프로모터는 β-카세인 프로모터 서열이다.

바람직한 구체화에 있어서, 분비되지 않은 단백질 암호화 서열은 인간 기원의 것이며; 원추 절단된 폴리펩티드, 핵상 폴리펩티드, 또는 원형질 폴리펩티드의 암호; 인간 혈청 알부민 또는 다른 소정의 목적 단백질의 암호이다.

본 발명의 실시는, 특별한 언급이 없는 한, 당 기술 분야 내의 모든 세포 생물학, 세포 배양학, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌들에 설명되어 있다. 참조, 예를 들면, Sambrook, Fritsch 및 Maniatis에 의한 Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed. ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed. , 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gaited., 1984); Mullis 등의 미국 특허 제 4,683,195호; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds.1984) ; Culture Of Animal Cells (R.1. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); 논문, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y. ); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller 및 M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu 등. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer 및 Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir 및 C.C.Blackwell, eds. , 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1986).

밀크의 특이적 프로모터

본 발명의 실시에 유용하게 사용되는 전사성 프로모터는 유방 상피 세포에서 우세하게 활성화되는 프로모터들로서, 카세인, β-락토글로블린(Clark 등., (1989)B1O/TECHNOLOGY 7:487-492), 휘장 산 프로테인(Gorton 등 (1987)Bio/Technology 5:1183-1187), 및 락트알부민(Soulier 등. (1992) FEBS LETTS. 297: 13)과 같은 밀크 단백질을 암호화하는 유전자를 제어하는 프로모터를 포함한다. 카세인 프로모터는 임의의 포유 동물 종의 α, β, γ, 또는 κ 카세인 유전자로부터 유래 된 것일 수 있다; 바람직한 프로모터는 염소의 β-카세인 유전자로부터 유래된다(DiTullio, (1992) Bio/Technology 10:74-77). 밀크-특이적 단백질 프로모터 또는 유방 조직에서 특이적으로 활성화되는 프로모터는 cDNA 또는 게놈성 서열로부터 유래된 것일 수 있다. 이 프로모터는 게놈 기원의 것이 바람직하다.

적어도 하나의 유기체, 흔히 몇몇 유기체중에서 상술한 모든 포유 동물의 유 선 특이적 유전자의 경우에 대한 DNA 서열 정보가 밝혀져 있다. 참조, 예를 들면, Richards 등에 의한 J. Biol. Chem. 256, 526-532 (1981)(α-락트알부민 래트); Campbell 등, Nucleic Acids Res. 12,8685-8697 (1984) (래트 WAP); Jones 등에 의한 J. Biol.Chem. 260, 7042-7050 (1985) (래트 β-카세인); Yu-Lee & Rosen, J. Biol.Chem. 258, 10794-10804 (1983) (래트-감마-카세인); Hall, Biochem. J. 242,735-742 (1987) (α-락트알부민 인간); Stewart에 의한 Nucleic Acids Res. 12,389 (1984) (소의 αsl 및 κ- 카세인 cDNA); Gorodetsky 등에 의한 Gene 66, 87-96 (1988) (소의 β-카세인); Alexander 등에 의한 Eur. J. Biochem. 178, 395-401 (1988) (소의 β-카세인) ; Brignon 등에 의한 FEBS Lett. 188,48-55 (1977) (소의 αS2 카세인); Jamieson 등에 의한 Gene 61, 85-90(1987), Ivanov 등에 의한 Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 425-429 (1988), Alexander 등에 의한 Nucleic Acids Res. 17, 6739 (1989) (소의 β-락토글로블린); Vilotte 등에 의한 Biochimie 69, 609-620 (1987) (소의 α-락토알부민). 다양한 밀크 단백질의 구조 및 기능은 Mercier & Vilotte에 의한 J.Dairy Sci. 76,3079-3098 (1993)(이 문헌 전체가 참고로 인용됨)에서 검토되었다. 부가의 서열 데이터가 필요한 경우에는, 프로브로서 기존의 서열을 사용하여 이미 얻은 서열 인접 영역을 쉽게 클론화 시키면 된다. 다양한 유기체에서 유래한 유선 특이적 조절 서열은 공지된 동종 뉴클레오티드 서열, 또는 프로브로서 동종 단백질에 대한 항체를 사용하여 이러한 유기체로부터 라이브러리를 스크리닝하여 얻는다.

전술한 발명은 이해의 목적으로 실시예를 제시하고 또한 구체화의 방식을 통 해서 어느 정도 자세히 기술하긴 했지만, 당업자라면 일종의 변형 및 수정을 실시할 수 있다는 것을 잘 알 수 있을 것이다. 그러므로, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예는 첨부된 청구범위가 포괄하는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

그러므로, 주어진 공급류로부터 목적 분자를 고수율로 생성하기 위한 고성능 접선-흐름 여과의 개선된 방법을 제공하는 본 발명의 구체화는 본 발명의 원리를 단순히 구체화하여 적용하는 것이다. 또한, 개시된 형태의 변형, 사용 방법의 변형, 및 개시된 구성 요소를 사용하는 것에 대한 변형은 첨부된 청구 범위의 영역 또는 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범주에서 전술한 설명으로부터 가능함이 명백하다.

Claims

공급류로부터 목적 단백질을 분리하는 방법으로서,

(a) 플럭스(flux) 대(對) TMP 곡선의 압력-의존 영역에서 전이점 플럭스의 약 5% 내지 100% 범위의 수준으로 플럭스를 유지시키면서, 상기 목적 단백질의 전하 및 세공 크기를 기준으로 하여 상기 공급류로부터 상기 목적 분자 종을 분리시키는 고성능 접선-흐름 여과 공정에 의해 상기 공급류를 여과하며, 이로써 상기 목적 단백질이 이의 생물학적 활성을 보유하도록 상기 공급류로부터 선택적으로 분리되는 단계로서, 여기서 막간 차압은 여과의 전이점에서의 막간 차압보다 크지 않은 수준으로 막을 따라 실질적으로 일정하게 유지되는 것인 단계; 및

(b) 한외 여과 공정에 의해 상기 공급류를 여과하는 단계

를 포함하며, 상기 여과는 상기 목적 단백질의 전이점 플럭스 이상에서 일어나며, 상기 분자 종은 분자량이 1 내지 1000 kDa인 방법.
제1항에 있어서, 상기 공급류를 분별하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 공급류를 정제하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 공급류를 투석 여과하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 여과 공정의 전반부 동안에는 막간 차압은 증가시키면서 플럭스는 감소시키는 것을 더 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 여과 공정의 후반부 동안에는 막간 차압을 감소시키는 것을 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 공급류는 여과하기 전에 농축시키는 것인 방법
제1항에 있어서, 상기 목적 단백질은 상기 공급류 중의 제2 목적 단백질보다 분자량이 10배 미만으로 크거나 작은 것인 방법.
제1항에 있어서, 목적 단백질은 혼합물 중의 제2 목적 단백질보다 분자량이 10배 이상 크거나 작긴 하지만 동일한 전하 또는 동일한 등전점을 가지는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 공급류를 농축시키는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 모든 여과 단계는 한외 여과인 방법.
제1항에 있어서, 상기 공급류는 밀크(milk)인 방법.
제1항에 있어서, 상기 공급류는 세포 용해물액인 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 생약제인 방법.
제12항에 있어서, 상기 밀크의 상태는 a) 원유; b) 희석유; c) 완충 용액으로 처리된 밀크; d) 화학적으로 처리된 밀크; 및 e) 부분적으로 증발 처리된 밀크 중 하나로부터 선택되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 분별 단계는 세라믹 여과 막을 이용하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 정제 단계는 세라믹 여과 막을 이용하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 분별 단계는 소정의 등전점 프로파일을 갖는 중합체 여과 막을 이용하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 정제 단계는 중합체 여과 막을 이용하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 분별 단계는 셀룰로스 여과 막을 이용하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 정제 단계는 셀룰로스 여과 막을 이용하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 시스템 파라미터를 최적화하는 것을 더 포함하는 방법.
제22항에 있어서, 상기 시스템 파라미터는 온도, 공급류 유속, 막간 차압, 공급류 농도 및 투석 여과 부피를 포함하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 시스템 파라미터를 최적화하는 것을 더 포함하는 방법.
제24항에 있어서, 상기 시스템 파라미터는 온도, 공급류 유속, 막간 차압, 공급류 농도 및 투석 여과 부피를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 목적 분자 종은 단백질, 면역글로블린, 폴리펩티드, 펩티드, 당단백질, RNA 및 DNA로 구성된 군에서 선택되는 생물학적 물질인 방법.
제23항에 있어서, 최적 온도 범위는 15℃ 내지 50℃인 방법.
제23항에 있어서, 최적 온도 범위는 20℃ 내지 35℃인 방법.
제23항에 있어서, 최적 온도 범위는 25℃ 내지 29℃인 방법.
제25항에 있어서, 최적 온도 범위는 15℃ 내지 50℃인 방법.
제25항에 있어서, 최적 온도 범위는 20℃ 내지 35℃인 방법.
제25항에 있어서, 최적 온도 범위는 25℃ 내지 29℃인 방법.
제23항에 있어서, 공급류 유속은 10 cm/sec 내지 100 cm/sec인 방법.
제23항에 있어서, 공급류 유속은 20 cm/sec 내지 60 cm/sec인 방법.
제23항에 있어서, 공급류 유속은 25 cm/sec 내지 45 cm/sec인 방법.
제25항에 있어서, 공급류 유속은 10 cm/sec 내지 100 cm/sec인 방법.
제25항에 있어서, 공급류 유속은 20 cm/sec 내지 60 cm/sec인 방법.
제25항에 있어서, 공급류 유속은 25 cm/sec 내지 45 cm/sec인 방법.
제23항에 있어서, 막간 차압의 범위는 2 psi 내지 40 psi인 방법.
제23항에 있어서, 막간 차압의 범위는 5 psi 내지 30 psi인 방법.
제23항에 있어서, 막간 차압의 범위는 10 psi 내지 20 psi인 방법.
제25항에 있어서, 막간 차압의 범위는 2 psi 내지 40 psi인 방법.
제25항에 있어서, 막간 차압의 범위는 5 psi 내지 30 psi인 방법.
제25항에 있어서, 막간 차압의 범위는 10 psi 내지 20 psi인 방법.
제23항에 있어서, 공급류 농도는 천연 밀크의 0.25배 내지 4배인 방법.
제23항에 있어서, 공급류 농도는 천연 밀크의 0.5배 내지 3배인 방법.
제23항에 있어서, 공급류 농도는 천연 밀크의 1.0배 내지 2배인 방법.
제25항에 있어서, 공급류 농도는 천연 밀크의 0.25배 내지 4배인 방법.
제25항에 있어서, 공급류 농도는 천연 밀크의 O.5배 내지 3배인 방법.
제25항에 있어서, 공급류 농도는 천연 밀크의 1.O배 내지 2배인 방법.
제23항에 있어서, 투석 여과 부피의 범위는 농축된 MF 보유물 부피의 1배 내지 20배인 방법.
제23항에 있어서, 투석 여과 부피의 범위는 농축된 MF 보유물 부피의 3배 내지 15배인 방법.
제23항에 있어서, 투석 여과 부피의 범위는 농축된 MF 보유물 부피의 5배 내지 10배인 방법.
제25항에 있어서, 투석 여과 부피의 범위는 농축된 MF 보유물 부피의 1배 내지 20배인 방법.
제25항에 있어서, 투석 여과 부피의 범위는 농축된 MF 보유물 부피의 3배 내지 15배인 방법.
제25항에 있어서, 투석 여과 부피 범위는 농축된 MF 보유물 부피의 5배 내지 10배인 방법.
제2항에 있어서, 한외 여과 막이 모든 여과 단계에 사용되는 것인 방법.
제7항에 있어서, 한외 여과 막이 모든 여과 단계에 사용되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 밀크는 a) 물, b) 완충 염 수용액 c) 킬레이트제 d) 산 용액; 및 e) 알칼리 용액으로 구성된 군에서 선택되는 용액으로 처리하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 투석 여과는 한외 여과 투과물을 이용하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 투석 여과는 물을 이용하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 투석 여과는 완충 염 용액을 이용하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 사용된 막은 20℃보다 높은 온도의 용액으로 세정하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 사용된 막은 온도 범위가 20℃ 내지 70℃인 용액으로 세정하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 사용된 막은 온도 범위가 40℃ 내지 60℃인 용액으로 세정하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 사용된 막은 산 용액으로 세정하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 사용된 막은 알칼리 용액으로 세정하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 사용된 막은 차아염소산염 용액으로 세정하는 것인 방법.
제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 용액을 사용한 후에 물로 헹구는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 사용된 막은 사용하기 전에 수산화물 용액으로 소독하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 사용된 막은 사용하기 전에 알콜 용액으로 소독하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 사용된 막은 사용하기 전에 차아염소산염 용액으로 소독하 는 것인 방법.
제1항에 있어서, 사용된 막은 20분 내지 45분간 세정하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 제2 접선-흐름 여과 단계에서의 여과로부터 얻은 여과물을, 제1 여과 단계에 사용된 막보다 세공 크기가 더 작은 막에 통과시켜 여과하고, 이 제2 여과 단계의 여과물을 제1 여과 단계로 다시 재순환시킴으로써 공정을 반복하는 단계를 더 포함하는 방법.
공급류로부터 목적 단백질을 분리하는 방법으로서,

a) 플럭스 대(對) TMP 곡선의 압력-의존 영역에서 전이점 플럭스의 약 5% 내지 100% 범위의 수준으로 플럭스를 유지시키면서, 상기 목적 단백질의 전하 및 세공 크기를 기준으로 하여 상기 공급류로부터 상기 목적 분자 종을 분리시키는 고성능 접선-흐름 여과 공정에 의해 상기 공급류를 여과하며, 이로써 상기 목적 단백질이 이의 생물학적 활성을 보유하도록 상기 공급류로부터 선택적으로 분리되는 단계로서, 여기서 막간 차압은 여과의 전이점에서의 막간 차압보다 크지 않은 수준으로 막을 따라 실질적으로 일정하게 유지되는 것인 단계;

(b) 미세 여과 공정에 의해 상기 공급류를 여과하는 단계;

(c) 여과 처리의 전반부 동안 막간 차압은 증가시키면서 플럭스는 감소시키는 단계; 및

(d) 여과가 진행됨에 따라 플럭스를 감소시킨 후 증가 또는 유지하는 단계

를 포함하며, 상기 여과는 상기 목적 단백질의 전이점 플럭스 이상에서 일어나며, 상기 분자 종은 분자량이 1 내지 1000 kDa인 방법.
제1항 또는 제75항에 있어서, 상기 목적 단백질은 재조합 인간 알파 태아 단백질인 방법.
제1항 또는 제75항에 있어서, 상기 목적 단백질은 재조합 인간 알부민인 방법.
제1항 또는 제75항에 있어서, 상기 목적 단백질은 트랜스제닉 포유 동물의 밀크로부터 유래되는 것인 방법.