CN106474466B - 一种口蹄疫疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种口蹄疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：(i)获取口蹄疫病毒细胞培养液；(ii)将所述口蹄疫病毒细胞培养液通过双膜联用一体过滤系统进行分离纯化；(iii)收集步骤(ii)中所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液。本申请还涉及由所述方法制备得到的口蹄疫疫苗及其在制备用于预防动物口蹄疫疾病的药物中的用途。本申请还涉及一种用于制备口蹄疫疫苗的装置，其包括双膜联用一体过滤系统。

Description

一种口蹄疫疫苗的制备方法
技术领域
本申请涉及兽用生物制品领域，具体地，本申请涉及一种口蹄疫疫苗的制备方法、由所述方法制备得到的口蹄疫疫苗、所述口蹄疫疫苗在制备用于预防动物口蹄疫疾病的药物中的用途，以及用于制备口蹄疫疫苗的装置。
背景技术
口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、发热性、高度接触性传染的动物传染病。口蹄疫主要侵害偶蹄类动物，其临床诊断特征为口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。目前已开发出多种用于控制和预防口蹄疫疾病的口蹄疫疫苗。对于口蹄疫疫苗的制备方法，目前本领域通常采用的是各种分离纯化加工单元的简单组合，例如，采用连续流离心搭配直流过滤、深层过滤、或者中空纤维过滤、PEG沉淀法或者色谱层析法等手段对收获的口蹄疫病毒细胞培养液进行分离和纯化，以获得纯化的口蹄疫病毒疫苗。
然而，这种分离纯化加工单元的简单组合难以发挥各加工单元的最佳分离纯化效率，造成产品品质、生产效率和生产成本极不平衡的状况，而这是人们所不希望的。
发明概述
本申请涉及一种口蹄疫疫苗的制备方法、由所述方法制备得到的口蹄疫疫苗、所述口蹄疫疫苗在制备用于预防动物口蹄疫疾病的药物中的用途，以及用于制备口蹄疫疫苗的装置。
一方面，本申请提供了一种口蹄疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：(i)获取口蹄疫病毒细胞培养液；(ii)将所述口蹄疫病毒细胞培养液通过双膜联用一体过滤系统进行分离纯化，所述双膜联用一体过滤系统包括并行设置的微滤装置和超滤装置，所述微滤装置包括微滤料液罐、第一主泵和微滤膜，所述超滤装置包括浓缩罐、第二主泵和超滤膜；其中所述微滤装置用于除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的大颗粒杂质，所述超滤装置用于除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的小分子杂质；所述微滤装置和所述超滤装置同时运行对所述口蹄疫病毒细胞培养液同时进行微滤和超滤，从而在所述浓缩罐中形成含有口蹄疫病毒的浓缩液；(iii)收集步骤(ii)中所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液。
在某些实施方式中，所述浓缩罐的体积等于所述口蹄疫病毒细胞培养液的目标浓缩体积或者不大于所述目标浓缩体积的1.5倍。在某些实施方式中，所述浓缩罐的体积为所述口蹄疫病毒细胞培养液初始体积的1/5～1/50。
在某些实施方式中，所述微滤膜的孔径为0.1μm～0.45μm。在某些实施方式中，所述超滤膜是孔径为100kD～500kD的中空纤维超滤膜。
在某些实施方式中，在所述口蹄疫病毒细胞培养液至少部分通过所述微滤装置之后，进一步向所述微滤料液罐中加入第一洗滤液，使其通过所述双膜联用一体过滤系统，获得浓缩液。在某些实施方式中，所述第一洗滤液为pH7.2～pH9、电导5-300mS/cm的缓冲溶液。在某些实施方式中，所加入的第一洗滤液的体积为微滤截留液体积的1～5倍。在某些实施方式中，将步骤(ii)中所获得的超滤滤过液做为第一洗滤液加入至所述微滤料液罐中，使所述超滤滤过液通过所述双膜联用一体过滤系统，获得浓缩液。
在某些实施方式中，向步骤(ii)中所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液中加入第二洗滤液，使所述浓缩液中的小分子杂质透过超滤膜，获得纯化的病毒浓缩液。在某些实施方式中，所述第二洗滤液为pH7.2～pH9、电导5-300mS/cm的缓冲溶液。在某些实施方式中，所加入的第二洗滤液的体积为所述病毒浓缩液体积的1～10倍。
在某些实施方式中，所述微滤装置与第一恒流泵连接、所述超滤装置与第二恒流泵连接以动态控制过膜通量。在某些实施方式中，所述第一恒流泵设置在所述微滤装置的滤过端，所述第二恒流泵设置在所述超滤装置的滤过端。在某些实施方式中，所述过膜通量为微滤膜或超滤膜的临界膜通量的65％～100％。在某些实施方式中，所述过膜通量为10-150LMH。
在某些实施方式中，所述微滤膜和所述超滤膜的剪切速率各为1500～4000s-1。在某些实施方式中，所述微滤膜和所述超滤膜的物料与膜面积比均各为10～500L/m2。
在某些实施方式中，在步骤(iii)之后对所述含有口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活。在某些实施方式中，在所述灭活之后对所述含有口蹄疫病毒的浓缩液进行乳化。在某些实施方式中，在所述灭活之前或之后对所述含有口蹄疫病毒的浓缩液进行进一步纯化。在某些实施方式中，所述进一步纯化通过PEG沉淀法或色谱层析法进行。在某些实施方式中，所述色谱层析法包括排阻色谱层析法、离子交换色谱层析法、疏水色谱层析法和亲和色谱层析法。
在某些实施方式中，在步骤(iii)之后对所述微滤装置和所述超滤装置进行清洗再生。在某些实施方式中，所述清洗再生包括如下步骤：(a)将纯水分别加入所述微滤装置和所述超滤装置以分别清洗其中的微滤膜和超滤膜，清洗过程中膜剪切速率提升至8000s-1～16000s-1，过膜通量控制在10～500LMH；(b)经步骤(a)清洗后将0.1～0.5M NaOH溶液分别加入所述微滤装置和所述超滤装置做进一步清洗，溶液温度为45～55℃，膜剪切速率为8000s-1～16000s-1，过膜通量控制在50～500LMH，时间为30～60分钟；(c)经步骤(b)清洗后用纯水分别冲洗所述微滤装置和所述超滤装置至微滤滤过液和超滤滤过液的pH值降至9以下。
在某些实施方式中，所述口蹄疫病毒毒株包括一种或多种口蹄疫病毒血清型毒株。在某些实施方式中，所述血清型为O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型或Asia1型。
在另一方面，本申请涉及根据本申请所述的方法制备得到的口蹄疫疫苗。
在另一方面，本申请涉及根据本申请所述的口蹄疫疫苗在制备用于预防动物口蹄疫疾病的药物中的用途。
在另一方面，本申请涉及一种预防动物口蹄疫疾病的方法，包括给予所述动物免疫有效量的根据本申请所述的口蹄疫疫苗。
在另一方面，本申请涉及用于预防动物口蹄疫疾病的根据本申请所述的口蹄疫疫苗。
在另一方面，本申请涉及一种用于制备口蹄疫疫苗的装置，其包括双膜联用一体过滤系统，所述双膜联用一体过滤系统包括并行设置的微滤装置和超滤装置，所述微滤装置包括微滤料液罐、第一主泵和微滤膜，所述超滤装置包括浓缩罐、第二主泵和超滤膜；其中所述微滤装置用于除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的大颗粒杂质，所述超滤装置用于除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的小分子杂质；所述微滤装置和所述超滤装置同时运行对所述口蹄疫病毒细胞培养液同时进行微滤和超滤，从而在所述浓缩罐中形成含有口蹄疫病毒的浓缩液。
在某些实施方式中，所述微滤装置和所述超滤装置相互连接，以使得微滤滤过液和超滤截留液均置于所述浓缩罐中形成所述含有口蹄疫病毒的浓缩液。
在某些实施方式中，所述双膜联用一体过滤系统还包括第一恒流泵和第二恒流泵，所述微滤装置与所述第一恒流泵连接，所述超滤装置与所述第二恒流泵连接以动态控制过膜通量。在某些实施方式中，所述第一恒流泵设置在所述微滤装置的滤过端，所述第二恒流泵设置在所述超滤装置的滤过端。
附图说明
图1显示了本申请实施例1的口蹄疫疫苗制备工艺的示意图。
图2显示了本申请实施例2的口蹄疫疫苗制备工艺的示意图。
图3显示了本申请实施例1的口蹄疫病毒抗原SDS-PAGE电泳图。
图4显示了本申请实施例1的口蹄疫病毒抗原HPLC检测结果。
图5显示了本申请实施例5的微滤膜和超滤膜连续使用200次后清洗回复的水通量测定值。
发明详述
尽管本申请将在以下公开多个方面和实施方式，但是在不违背本申请主题精神和范围的前提下，本领域技术人员显然可以对其进行各种等同改变和修改。本申请公开的多个方面和实施方式仅用于举例说明，其并非旨在限制本申请，本申请的实际保护范围以权利要求为准。除非另外指出，本申请中使用的所有技术和科学术语均具有与本申请所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本申请中引用的所有参考文献、专利、专利申请均通过整体引用并入本文。
一方面，本申请提供了一种口蹄疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：(i)获取口蹄疫病毒细胞培养液；(ii)将所述口蹄疫病毒细胞培养液通过双膜联用一体过滤系统进行分离纯化，所述双膜联用一体过滤系统包括并行设置的微滤装置和超滤装置，所述微滤装置包括微滤料液罐、第一主泵和微滤膜，所述超滤装置包括浓缩罐、第二主泵和超滤膜；其中所述微滤装置用于除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的大颗粒杂质，所述超滤装置用于除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的小分子杂质；所述微滤装置和所述超滤装置同时运行对所述口蹄疫病毒细胞培养液同时进行微滤和超滤，从而在所述浓缩罐中形成含有口蹄疫病毒的浓缩液；(iii)收集步骤(ii)中所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液。
本申请中使用的术语“疫苗”是指含有一种或多种具有机体免疫能力的抗原的组合物。将疫苗引入到宿主动物体内后，该疫苗能激发宿主动物产生针对该一种或多种抗原的免疫反应。
本申请中使用的术语“宿主动物”是指能够被口蹄疫病毒侵入并允许口蹄疫病毒在其体内复制的动物。在某些实施方式中，宿主动物是偶蹄类动物。在某些实施方式中，宿主动物是猪、牛、羊等家畜动物。在某些实施方式中，宿主动物是猪。口蹄疫病毒在宿主动物中的侵入和复制可能使宿主动物产生口蹄疫的临床症状，也可能不使宿主动物产生任何临床症状。
本申请所述的口蹄疫病毒可以包括一种或多种口蹄疫病毒血清型毒株。在某些实施方式中，所述血清型为O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型或Asia1型。每种主型又分若干亚型，目前发现的亚型已有70多种。在某些实施方式中，所述血清型为A型。不希望受到任何理论的束缚，本申请的口蹄疫疫苗的制备方法适用于各种口蹄疫病毒血清型毒株或其混合物。
本申请所述的口蹄疫病毒可以是从自然环境中分离纯化获得的天然口蹄疫病毒，也可以是通过基因工程方法获得的重组口蹄疫病毒株，还可以是其他表达系统(工程菌、昆虫、植物)制备的类病毒颗粒、重组抗原。本领域技术人员可以通过本领域公知的基因工程方法获得重组口蹄疫病毒株或者口蹄疫病毒片段，参见，例如，http://www.science.gov/ topicpages/v/virus+vaccine+development.html中所描述的。
术语“口蹄疫病毒细胞培养液”是指被口蹄疫病毒感染并允许口蹄疫病毒生长复制的细胞培养液。可以使用本领域公知的方法制备口蹄疫病毒细胞培养液(参见，例如，厍大亮等，口蹄疫灭活疫苗的生产工艺概述，中国兽药杂志，2011 45(1):41～44)。适于培养口蹄疫病毒的细胞包括乳仓鼠肾细胞(BHK21细胞)、猪肾细胞(IBRS-2细胞)、牛肾细胞(MDBK细胞)、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)等。在优选的实施方式中，本申请使用BHK21细胞培养口蹄疫病毒。
本申请中使用的术语“双膜联用一体过滤系统”是指包括并行设置的微滤装置和超滤装置，并且所述微滤装置和所述超滤装置相互连接、相互配合的一体化过滤系统，其中所述微滤装置包括微滤料液罐、第一主泵和微滤膜；所述超滤装置包括浓缩罐、第二主泵和超滤膜，所述微滤装置和所述超滤装置同时运行对所述口蹄疫病毒细胞培养液同时进行微滤和超滤，从而在所述浓缩罐中形成含有口蹄疫病毒的浓缩液。在所述双膜联用一体过滤系统中，所述微滤装置和所述超滤装置并排安放并相互连接，以使得微滤滤过液和超滤截留液均置于所述浓缩罐中形成所述含有口蹄疫病毒的浓缩液。
本申请中使用的术语“微滤滤过液”是指所述口蹄疫病毒细胞培养液经过微滤装置之后得到的滤过液。微滤装置是为了除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的大颗粒杂质。当所述口蹄疫病毒细胞培养液经过所述微滤装置之后，所得的微滤滤过液包含的大颗粒杂质水平与在使所述口蹄疫病毒细胞培养液通过所述微滤装置之前的所述口蹄疫病毒细胞培养液中的大颗粒杂质水平相比有显著降低。例如，与在使所述口蹄疫病毒细胞培养液通过所述微滤装置之前的所述口蹄疫病毒细胞培养液中的大颗粒杂质水平相比较，所述微滤装置能除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或者甚至100％的大颗粒杂质。在某些实施方式中，与在使所述口蹄疫病毒细胞培养液通过所述微滤装置之前的所述口蹄疫病毒细胞培养液中的大颗粒杂质水平相比较，所述微滤装置能除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的约30％至约100％、约30％至约90％、约30％至约80％、约40％至约80％、约40％至约90％、约40％至约100％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约100％(例如，约60％至约90％、约70％至约90％)、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％或约95％至约100％(例如，约96％至约100％、约97％至约100％、约98％至约100％、约99％至约100％、约95％至约96％、约95％至约97％、约95％至约98％或约95％至约99％)的大颗粒杂质。
本申请中使用的术语“大颗粒杂质”是指存在于口蹄疫病毒细胞培养液中的细胞碎片、细菌、聚集体、凝絮体等杂质。在某些实施例中，所述大颗粒杂质的最小直径大于0.1μm。这些大颗粒杂质的尺寸大于微滤膜的孔径，因此不能通过微滤膜而被截留在微滤料液罐中。
当所述口蹄疫病毒细胞培养液经过微滤装置时，小分子杂质和口蹄疫病毒一起透过微滤膜，存在于微滤滤过液中。微滤滤过液进一步经过超滤装置，超滤装置可以除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的小分子杂质，但是口蹄疫病毒无法通过超滤膜，被截留在超滤截留液中。
本申请中使用的术语“超滤截留液”是指所述微滤滤过液中未通过超滤膜而在超滤装置的浓缩罐中被截留下来的液体，是含有口蹄疫病毒的浓缩液。微滤滤过液经过所述超滤装置之后，所得的超滤截留液包含的小分子杂质水平与在使所述微滤滤过液通过所述超滤装置之前的所述微滤滤过液中的小分子杂质水平相比有显著降低。例如，与在使所述微滤滤过液通过所述超滤装置之前的所述微滤滤过液中的小分子杂质水平相比较，所述超滤装置能除去所述微滤滤过液中的至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或者甚至100％的小分子杂质。在某些实施方式中，与在使所述微滤滤过液通过所述超滤装置之前的所述微滤滤过液中的小分子杂质水平相比较，所述超滤装置能除去所述微滤滤过液中的约30％至约100％、约30％至约90％、约30％至约80％、约40％至约80％、约40％至约90％、约40％至约100％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约100％(例如，约60％至约90％、约70％至约90％)、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％或约95％至约100％(例如，约96％至约100％、约97％至约100％、约98％至约100％、约99％至约100％、约95％至约96％、约95％至约97％、约95％至约98％或约95％至约99％)的小分子杂质。
本申请中使用的术语“小分子杂质”是指口蹄疫病毒细胞培养液中的核酸及核酸碎片、宿主蛋白、病毒非结构蛋白、蛋白及病毒降解物、培养基成分等杂质。在某些实施例中，所述小分子杂质的尺寸小于500,000道尔顿。这些小分子杂质的尺寸小于超滤膜的孔径，因此可以透过超滤膜而存在于超滤滤过液中。本申请中使用的术语“超滤滤过液”是指所述微滤滤过液经过超滤装置之后得到的滤过液。
本申请中所述的微滤料液罐用于盛放待分离纯化的口蹄疫病毒细胞培养液，未通过微滤膜的微滤截留液回流至所述微滤料液罐中。本申请中使用的术语“微滤截留液”是指未通过微滤膜而被截留在微滤料液罐中的液体。在某些实施方式中，所述微滤截留液和待分离纯化的口蹄疫病毒细胞培养液混合置于所述微滤料液罐中。在某些实施方式中，本申请的微滤装置带有搅拌装置，所述搅拌装置进行搅拌将所述微滤料液罐中的微滤截留液和待分离纯化的口蹄疫病毒细胞培养液混合均匀。
本申请所述的浓缩罐用于盛放微滤滤过液，未通过超滤膜的超滤截留液也盛放于浓缩罐中。在某些实施方式中，所述微滤滤过液和超滤截留液混合置于所述浓缩罐中。在某些实施方式中，本申请的超滤装置带有搅拌装置，所述搅拌装置将所述浓缩罐中的微滤滤过液和超滤截留液搅拌混合均匀。
本申请中所述的第一主泵用于将微滤料液罐内的液体不断泵入微滤装置，本申请中所述的第二主泵用于将浓缩罐内的液体不断泵入超滤装置。所述微滤装置和所述超滤装置同时运行对所述口蹄疫病毒细胞培养液同时进行微滤和超滤。在所述双膜联用一体过滤系统中，微滤和超滤同时进行，即在同一时刻，细胞培养液既有一部分在通过微滤膜进行过滤，也有一部分在通过超滤膜进行过滤，而不是像传统制备工艺那样，待所有口蹄疫病毒细胞液均通过微滤装置之后收集微滤滤过液，然后再将微滤滤过液经过超滤装置进行超滤。本申请中的双膜联用一体过滤系统不仅减少了管路衔接，减少了占地面积，而且还大大节省了过滤时间。
在某些实施方式中，进行微滤和超滤的温度均各为2～20℃，例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值。在优选的实施方式中，进行微滤和超滤的温度均各为2～8℃。恒定的低温控制有助于维持口蹄疫病毒抗原结构的稳定性。
在某些实施方式中，所述浓缩罐的体积等于所述口蹄疫病毒细胞培养液的目标浓缩体积或者不大于所述目标浓缩体积的1.5倍。例如，所述浓缩罐的体积是所述目标浓缩体积的1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值。
在某些实施方式中，所述浓缩罐的体积为所述口蹄疫病毒细胞培养液初始体积的1/5～1/50。例如，所述浓缩罐的体积为所述口蹄疫病毒细胞培养液初始体积的1/5、1/10、1/15、1/20、1/25、1/30、1/35、1/40、1/45、1/50或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值。
本申请中所述的微滤膜可以是市售的微滤膜，例如GE Healthcare LifeSciences公司、仕比纯公司、旭化成公司等公司生产的微滤中空纤维膜系列。在某些实施方式中，所述微滤膜的孔径为0.1μm～0.45μm，例如0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.22μm、0.25μm、0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。根据口蹄疫病毒的尺寸，选择尽可能小的微滤膜孔径有助于口蹄疫病毒抗原的回收和大颗粒杂质的去除。
本申请中所述的超滤膜可以是市售的超滤膜，例如GE Healthcare LifeSciences公司、仕比纯公司、旭化成公司等公司生产的超滤中空纤维膜系列。在某些实施方式中，所述超滤膜是孔径为100kD～500kD的中空纤维超滤膜，例如孔径为100kD、150kD、200kD、250kD、300kD、350kD、400kD、450kD、500kD或者以上任意两个数值范围之间任意数值的中空纤维超滤膜。根据口蹄疫病毒的尺寸，选择尽可能大的超滤膜孔径有助于口蹄疫病毒抗原的回收和小分子杂质的去除。
在某些实施方式中，在所述口蹄疫病毒细胞培养液至少部分通过所述微滤装置之后，进一步向所述微滤料液罐中加入第一洗滤液，使其通过所述双膜联用一体过滤系统，获得浓缩液。其中所述“至少部分”是指至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、甚至100％或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。加入第一洗滤液有利于残留在微滤料液罐中的口蹄疫病毒抗原通过微滤膜进入超滤装置进行富集，通过第一洗滤液的洗滤可以增加口蹄疫病毒抗原在微滤过程中的回收率。
在某些实施方式中，所述第一洗滤液为pH7.2～pH9、电导5-300mS/cm的缓冲溶液。在某些实施方式中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液(PBS)、硼酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、巴比妥酸盐缓冲溶液或者三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)。在优选的实施方式中，所述缓冲溶液是PBS缓冲溶液。在某些实施方式中，所述缓冲溶液的pH为7.2、7.5、8.0、8.5、9.0或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值。在某些实施方式中，所述缓冲溶液的电导为5mS/cm、50mS/cm、100mS/cm、150mS/cm、200mS/cm、250mS/cm、300mS/cm或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值。
在某些实施方式中，所加入的第一洗滤液的体积为微滤截留液体积的1～5倍，例如1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值。在某些实施方式中，使用的第一洗滤液的量可以是细胞培养液的初始体积的1/5倍、1/2倍、1倍或者2倍。
在某些实施方式中，将经过微滤和超滤后所获得的超滤滤过液做为第一洗滤液加入至所述微滤料液罐中，洗滤微滤膜截留的口蹄疫病毒抗原进入超滤装置，获得浓缩液。这样不仅可以合理回收利用资源，大幅降低洗滤液的用量，进一步降低成本，还可增加口蹄疫病毒抗原的回收率。
在某些实施方式中，向经过微滤和超滤后所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液中加入第二洗滤液，进一步使所述浓缩液中残留的小分子杂质通过超滤膜，获得纯化的病毒浓缩液。加入所述第二洗滤液有利于将超滤装置中的小分子杂质冲洗出来，减少小分子杂质在超滤截留液中的残留，从而提高口蹄疫病毒浓缩液中口蹄疫病毒的纯度。
在某些实施方式中，所述第二洗滤液为pH7.2～pH9、电导5-300mS/cm的缓冲溶液。在某些实施方式中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液(PBS)、硼酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、巴比妥酸盐缓冲溶液或者三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)。在优选的实施方式中，所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液。在某些实施方式中，所述缓冲溶液的pH为7.2、7.5、8.0、8.5、9.0或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值。在某些实施方式中，所述缓冲溶液的电导为5mS/cm、50mS/cm、100mS/cm、150mS/cm、200mS/cm、250mS/cm、300mS/cm或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值。
在某些实施方式中，所加入的第二洗滤液的体积为所述口蹄疫病毒浓缩液体积的1～10倍，例如1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值。本申请中使用的术语“口蹄疫病毒浓缩液”或者“含有口蹄疫病毒的浓缩液”是指经过微滤和超滤处理之后而降低了大颗粒杂质以及小分子杂质的含量的、未通过超滤膜而被截留在浓缩罐中的液体。
在某些实施方式中，所述微滤装置与第一恒流泵连接、所述超滤装置与第二恒流泵连接以动态控制过膜通量。本申请中使用的术语“动态控制”是指通过动态地改变过膜通量来维持微滤膜和超滤膜表面污染处于不可逆污染阈值及其以下，比如随着浓缩倍数的提高，需要不断调节恒流泵以降低过膜通量从而使膜表面污染处于不可逆污染状态，从而延缓膜的效率下降，延长膜的使用寿命。本申请中使用的术语“过膜通量”是指单位时间内通过单位膜面积上的流体量。在本申请中，过膜通量的单位用LMH(L/m^2*h)表示，即在一小时之内通过一平方米的膜面积的流体体积数。
本申请中所述的第一恒流泵用于控制微滤装置的过膜通量，所述的第二恒流泵用于控制超滤装置的过膜通量。在某些实施方式中，所述第一恒流泵设置在所述微滤装置的滤过端，所述第二恒流泵设置在所述超滤装置的滤过端，从而实现对过膜通量的动态控制。
可以通过控制口蹄疫病毒细胞培养液的浓缩倍数(即细胞培养液浓缩后的体积除以细胞培养液的初始体积所得之倍数)来控制过膜通量。优选地，当浓缩倍数为1/5～1/50时，过膜通量可以维持一个可以操作的合理范围，否则浓缩倍数过高会导致过膜通量过低，操作时间过长；而过低的浓缩倍数会使口蹄疫病毒抗原回收低，需要使用大量洗滤液进行洗滤。
在某些实施方式中，所述过膜通量为微滤膜或超滤膜的临界膜通量以下。本申请中使用的术语“临界膜通量”是微滤膜或超滤膜处于可逆污染和不可逆污染的临界值。当过膜通量在临界膜通量之下时，微滤膜或超滤膜处于可逆污染状态；而当过膜通量在临界膜通量之上时，微滤膜或超滤膜将处于不可逆污染状态。临界膜通量由于膜的孔径、材质、结构的不同而有所不同，而且样品状态和操作条件也会影响到临界膜通量。可以通过本领域已知的多种方法测定膜的临界膜通量，比如通过梯度增加过膜通量检测记录过膜压力的方式，或者通过梯度增加过膜压力检测记录过膜通量的方式(参见，例如，R.W.Field et al.,Critical flux concept for microfiltration fouling,Journal of MembraneScience,1995,100(3):259-272)。
在分离纯化过程中，过膜通量是影响口蹄疫病毒的产率和膜寿命的重要因素之一。如果过膜通量超过临界膜通量，则可能会导致膜的不可逆污染，从而降低膜的使用寿命；如果过膜通量过于低于临界膜通量，则可能会导致生产时间不断延长，生产体系稳定性维持成本加大，导致生产效率过低。因此，需要在临界膜通量以下选择合适的过膜通量，从而保证口蹄疫病毒的高收率和杂质的去除，也可保证系统控制的稳定性，维持较长的使用寿命，从而大幅降低生产成本。在某些实施方式中，所述过膜通量是微滤膜或超滤膜的临界膜通量的65％～100％，例如，过膜通量是微滤膜或超滤膜的临界膜通量的65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值。在某些实施方式中，所述过膜通量为10-150LMH，例如，10LMH、20LMH、30LMH、40LMH、50LMH、60LMH、70LMH、80LMH、90LMH、100LMH、110LMH、120LMH、130LMH、140LMH、150LMH或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值。
流体通过所述微滤膜和所述超滤膜时的剪切速率也是影响口蹄疫病毒的产率和膜寿命的重要因素之一。若采用过大的剪切速率，由于大于口蹄疫病毒抗原剪切耐受范围，会导致病毒的剪切破坏和解离，降低收率；而过小的剪切速率会降低过膜通量，降低膜分离的效率。在某些实施方式中，所述微滤膜和所述超滤膜的剪切速率各为1500～4000s-1，该剪切速率下可使口蹄疫病毒抗原的损失不超过5％。例如所述微滤膜和所述超滤膜的剪切速率各为1500s-1、1600s-1、1700s-1、1800s-1、1900s-1、2000s-1、2100s-1、2200s-1、2300s-1、2400s-1、2500s-1、2600s-1、2700s-1、2800s-1、2900s-1、3000s-1、3100s-1、3200s-1、3300s-1、3400s-1、3500s-1、3600s-1、3700s-1、3800s-1、3900s-1、4000s-1或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值。
所述微滤膜和所述超滤膜的物料与膜面积比也是影响产率和膜寿命的重要因素之一。物料与膜面积比的计算方式是待处理料液体积除以膜面积。如果物料与膜面积比过高，则可能超出膜载量，使临界膜通量及其以下的操作条件难以维持，导致膜不可逆污染，或者操作时间过长，生产效率低下；如果物料与膜面积比过低，则膜效率未被充分发挥，增加生产成本。因此，需要选择合适的物料与膜面积比，从而在确保高收率的前提下能尽可能地延长膜的使用寿命。在某些实施方式中，所述微滤膜和所述超滤膜的物料与膜面积比均各为10～500L/m2，例如10L/m2、50L/m2、100L/m2、150L/m2、200L/m2、250L/m2、300L/m2、350L/m2、400L/m2、450L/m2、500L/m2或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值。
在某些实施方式中，在上述步骤(iii)之后对所述含有口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活。可以采用本领域常用的方法对含有口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活，例如，将浓缩纯化得到的含有口蹄疫病毒的浓缩液用1mM～3mM的二乙烯亚胺(BEI)30℃灭活28h，之后按1.6％体积比加入阻断剂硫代硫酸钠，阻断20min，4℃备用；或者将1/4000β丙内酯加入浓缩纯化得到的含有口蹄疫病毒的浓缩液在37℃灭活3～4天，存储于4℃备用(参见，例如，厍大亮等，口蹄疫灭活疫苗的生产工艺概述，中国兽药杂志，2011 45(1):41～44)。
在某些实施方式中，在所述灭活之后对所述含有口蹄疫病毒的浓缩液进行乳化。可以采用本领域常用的方法对含有口蹄疫病毒的浓缩液进行乳化，例如先制备水相，即，使用灭菌处理过的生理盐水稀释所述含有口蹄疫病毒的浓缩液，备用；再制备油相，即，将油相佐剂，例如Montanide ISA 206在120℃下灭菌后备用；然后将水相和油相预热至30℃，按重量比1：1配置，在低速搅拌的情况下，将预热至30℃的水相缓慢加入到同样预热至30℃的油相中，乳化20分钟左右，使水相与油相充分混合，乳化成双向型(W/O/W)油乳剂疫苗，放置于4℃保存。
在某些实施方式中，在所述灭活之前或之后对所述含有口蹄疫病毒的浓缩液进行进一步纯化。在某些实施方式中，所述进一步纯化通过PEG(聚乙二醇)沉淀法或色谱层析法进行。
PEG沉淀法是通过加入PEG改变含有口蹄疫病毒的浓缩液的理化参数，控制浓缩液中各种成分的溶解度，从而将浓缩液中的口蹄疫病毒和其他杂质分开的技术。常用的沉淀剂有PEG2000、PEG4000、PEG6000等。一般操作步骤包括：向含有口蹄疫病毒的浓缩液中加入PEG形成沉淀，让生成的沉淀与母液一起放置一段时间促进沉淀粒子生成，然后再离心或过滤，收集沉淀物。
在某些实施方式中，所述色谱层析法包括排阻色谱层析法、离子交换色谱层析法、疏水色谱层析法和亲和色谱层析法。
排阻色谱层析法又称为凝胶色谱法，是利用含有口蹄疫病毒的浓缩液中口蹄疫病毒和其他杂质的分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使口蹄疫病毒和其他杂质相分离。用于凝胶色谱法的填料包括聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯稀凝胶、硅胶、聚甲基丙烯酸酯等。各种凝胶色谱填料也均是有市售的，例如GEHealthcare Life Sciences公司、Tosho公司、Merck Millipore公司、博格隆公司、纳微科技公司、西安蓝晓公司等生产的凝胶色谱填料。在某些实施方式中，所采用的凝胶色谱填料是交联葡聚糖凝胶。采用凝胶色谱法对含有口蹄疫病毒的浓缩液进行进一步纯化一般是将凝胶色谱填料加入到含有口蹄疫病毒的浓缩液中，然后再将填料装入色谱柱中进行色谱操作，或者是将含有口蹄疫病毒的浓缩液直接加入到装有凝胶色谱填料的色谱柱中进行色谱操作。
离子交换色谱法是利用离子交换色谱填料上的带电基团与含有口蹄疫病毒的浓缩液中不同带电组分的相互作用，将口蹄疫病毒与其他杂质相分离，从而达到进一步纯化口蹄疫病毒的目的。根据离子交换色谱填料表面的电荷不同可以分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。在某些实施方式中，所采用的离子交换色谱填料表面的离子交换基团为二乙基氨基乙基(DEAE)、季铵基(Q)、二乙基氨基丙基(ANX)、羧甲基(CM)、磺酸基(SP)等。各种离子交换色谱填料也均是有市售的，例如GE Healthcare Life Sciences公司、Tosho公司、Merck Millipore公司、博格隆公司、纳微科技公司、西安蓝晓公司等生产的离子交换色谱填料。采用离子交换色谱法对含有口蹄疫病毒的浓缩液进行进一步纯化一般是将离子交换色谱填料加入到含有口蹄疫病毒的浓缩液中，然后再将填料装入色谱柱中进行色谱操作，或者是将含有口蹄疫病毒的浓缩液直接加入到装有离子色谱填料的色谱柱中进行色谱操作。
疏水色谱层析法是利用疏水作用色谱填料上的疏水基团与含有口蹄疫病毒的浓缩液中的口蹄疫病毒表面的疏水基团的相互作用，实现口蹄疫病毒在色谱填料上的吸附，从而与浓缩液中不发生吸附和吸附较弱的杂质相分离。在某些实施方式中，所采用的疏水色谱填料表面的疏水基团为丁基、丁硫基、苯基、或辛基。各种疏水色谱填料也均是有市售的，例如GE Healthcare Life Sciences公司、Tosho公司、Merck Millipore公司、博格隆公司、纳微科技公司、西安蓝晓公司等生产的疏水色谱填料。采用疏水色谱层析法对含有口蹄疫病毒的浓缩液进行进一步纯化一般是将疏水作用色谱填料加入到含有口蹄疫病毒的浓缩液中，然后再将填料装入色谱柱中进行色谱操作，或者是将含有口蹄疫病毒的浓缩液直接加入到装有疏水作用色谱填料的色谱柱中进行色谱操作。
亲和色谱层析法是将具有特殊结构的亲和分子填料制成固相吸附剂放置在层析柱中，当含有口蹄疫病毒的浓缩液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的口蹄疫病毒就会被吸附而滞留在层析柱中，那些没有亲和力的杂质由于不被吸附而直接流出，从而实现口蹄疫病毒与杂质的分离。然后再选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的口蹄疫病毒洗脱下来。在某些实施方式中，使用的吸附剂为氧化铝、硅胶、聚酰胺等。各种亲和分子填料也均是有市售的，例如肝素亲和介质。采用亲和色谱层析法对含有口蹄疫病毒的浓缩液进行进一步纯化一般是将亲和分子填料加入到含有口蹄疫病毒的浓缩液中，然后再将填料装入色谱柱中进行色谱操作，或者是将含有口蹄疫病毒的浓缩液直接加入到装有亲和分子填料的色谱柱中进行色谱操作。
在某些实施方式中，在上述步骤(iii)之后对所述微滤装置和所述超滤装置进行清洗再生。所述微滤装置中的微滤膜和超滤装置中的超滤膜在长期运行过程中会导致膜的透水量随着运行时间的增加而降低，即产生膜污染。因此，有必要对微滤膜和超滤膜进行清洗再生，回复膜的性能，延长膜的使用寿命，从而降低生产成本。
在某些实施方式中，所述清洗再生包括如下步骤：(a)将纯水分别加入所述微滤装置和所述超滤装置以分别清洗其中的微滤膜和超滤膜，清洗过程中膜剪切速率提升至8000s-1～16000s-1，过膜通量控制在10～500LMH；(b)经步骤(a)清洗后将0.1～0.5M NaOH溶液分别加入所述微滤装置和所述超滤装置做进一步清洗，溶液温度为45～55℃，膜剪切速率为8000s-1～16000s-1，过膜通量控制在50～500LMH，时间为30～60分钟；(c)经步骤(b)清洗后用纯水分别冲洗所述微滤装置和所述超滤装置至微滤滤过液和超滤滤过液的pH值降至9以下。
在某些实施方式中，所述步骤(a)中膜剪切速率提升至8000s-1、9000s-1、10000s-1、11000s-1、12000s-1、13000s-1、14000s-1、15000s-1、16000s-1或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值，所述过膜通量控制在10LMH、50LMH、100LMH、150LMH、200LMH、250LMH、300LMH、350LMH、400LMH、450LMH、500LMH或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值。
在某些实施方式中，所述步骤(b)中NaOH溶液温度为45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值；膜剪切速率为8000s-1、9000s-1、10000s-1、11000s-1、12000s-1、13000s-1、14000s-1、15000s-1、16000s-1或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值；所述过膜通量控制在50LMH、100LMH、150LMH、200LMH、250LMH、300LMH、350LMH、400LMH、450LMH、500LMH或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值；所述时间为30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值。
在某些实施方式中，所述步骤(c)中的pH值降至9、8.5、8.0、7.5、7.0或者以上任意两个数值之间范围内的任意数值。
在某些实施方式中，所述清洗再生过程中仍然对过膜通量进行动态控制以避免污染物在高跨膜压下深入膜孔隙，导致难以清除。而且温热强碱对污染物具有分解作用，从而使得膜性能得到非常好的维护。
在另一方面，本申请涉及根据本申请所述的方法制备得到的口蹄疫疫苗。在某些实施方式中，本申请的口蹄疫疫苗可以通过适当的途径递送到给药动物中，包括但不限于，通过口服途径、注射途径(如静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、心内注射、鞘内注射、胸膜腔内注射、腹腔内注射等)、粘膜途径(如鼻腔内给药、口腔内给药等)、舌下途径、直肠途径、经皮途径、眼内途径、肺部途径。在某些实施方式中，本申请的口蹄疫疫苗可通过注射途径给药。如本领域技术人员所知，口蹄疫疫苗的用量依活性成分的活性、给药动物个体的年龄、体重等因素的不同而变化。本领域技术人员可以根据前述影响用量的因素容易地确定最合适的疫苗用量。
根据本申请所述的方法制备得到的口蹄疫疫苗可以通过已知的多种方法来检测其免疫效力。现有技术提供了多种评估疫苗免疫效力的试验方法，例如，攻毒保护试验、血清学试验等。攻毒保护试验直接采用强病毒原对疫苗接种后的试验动物进行人工感染，然后根据动物的发病情况来判断疫苗的免疫效力。攻毒保护试验是检验疫苗免疫效力的最直接的方法，因此包括中国在内的多个国家都要求采用攻毒保护试验来评价兽用疫苗的免疫效力。有关攻毒保护试验的具体操作方法可参见，2010版《中国兽药典》中有关半数保护量(PD50)测定的章节。也可以采用血清学试验方法来评估疫苗的免疫效力，例如通过ELISA法(即酶联免疫吸附测定法)测定免疫动物血清中产生的抗体含量进而判断疫苗的免疫效力。采用ELISA法测定时通常是先将抗原(或抗体)结合在固相载体上，然后加一种抗体(或抗原)与酶结合成的偶联物(标记物)，当偶联物与固相载体上的抗原(或抗体)反应结合后再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色，其所生成的颜色深浅与待测的抗原(或抗体)含量成正比。这些血清学指标与疫苗效力之间存在关联性，其可以用来对疫苗免疫效力进行初步评估。本领域技术人员可以根据具体的试验条件以及试验目的等因素来选择合适的试验方法。
在另一方面，本申请涉及根据本申请所述的口蹄疫疫苗在制备用于预防动物口蹄疫疾病的药物中的用途。在某些实施方式中，所述动物口蹄疫疾病为猪、牛或羊口蹄疫。在某些实施方式中，所述动物口蹄疫疾病为猪口蹄疫。在某些实施方式中，所述动物口蹄疫疾病为猪口蹄疫的A血清型。
在另一方面，本申请涉及一种预防动物口蹄疫疾病的方法，包括给予所述动物免疫有效量的根据本申请所述的口蹄疫疫苗。本申请中使用的术语“免疫有效量”是指在给药动物体内引起针对口蹄疫病毒的免疫反应的量。免疫有效量与给药动物的物种、品种、年龄、体重和健康状况等因素有关。在某些实施方式中，所述动物口蹄疫疾病为猪、牛或羊口蹄疫。在某些实施方式中，所述动物口蹄疫疾病为猪口蹄疫。在某些实施方式中，所述动物口蹄疫疾病为猪口蹄疫的A血清型。
在另一方面，本申请涉及用于预防动物口蹄疫疾病的根据本申请所述的口蹄疫疫苗。在某些实施方式中，所述动物口蹄疫疾病为猪、牛或羊口蹄疫。在某些实施方式中，所述动物口蹄疫疾病为猪口蹄疫。在某些实施方式中，所述动物口蹄疫疾病为猪口蹄疫的A血清型。
在另一方面，本申请涉及一种用于制备口蹄疫疫苗的装置，其包括双膜联用一体过滤系统，所述双膜联用一体过滤系统包括并行设置的微滤装置和超滤装置，所述微滤装置包括微滤料液罐、第一主泵和微滤膜，所述超滤装置包括浓缩罐、第二主泵和超滤膜；其中所述微滤装置用于除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的大颗粒杂质，所述超滤装置用于除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的小分子杂质；所述微滤装置和所述超滤装置同时运行对所述口蹄疫病毒细胞培养液同时进行微滤和超滤，从而在所述浓缩罐中形成含有口蹄疫病毒的浓缩液。在某些实施方式中，所述微滤装置和所述超滤装置相互连接，以使得微滤滤过液和超滤截留液均置于所述浓缩罐中形成所述含有口蹄疫病毒的浓缩液。
在某些实施方式中，所述双膜联用一体过滤系统还包括第一恒流泵和第二恒流泵，所述微滤装置与所述第一恒流泵连接，所述超滤装置与所述第二恒流泵连接以动态控制过膜通量。在某些实施方式中，所述第一恒流泵设置在所述微滤装置的滤过端，所述第二恒流泵设置在所述超滤装置的滤过端。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。所有实施例中涉及的生物学材料如口蹄疫病毒毒株、培养液、工具酶、缓冲溶液，以及各种培养方法、病毒灭活、纯化、精制等工艺均是本领域技术人员所熟悉的，可以参考Sambrook等人编著的“分子克隆”(实验室手册，冷泉港，1989)及“精编分子生物学实验指南”(美/F.奥斯伯等著，颜子颖等译，北京，科学出版社，1998)。
实施例1
本实施例提供了一种口蹄疫疫苗的制备方法，采用双膜联用一体过滤系统对口蹄疫病毒细胞培养液进行纯化，具体步骤如下：
(1)按图1搭建双膜联用一体过滤系统，采用pH7.6的PBS缓冲溶液平衡微滤膜(孔径：0.2μm，内径：1mm，膜面积：110cm2)和超滤膜(孔径：500kD，内径：1mm，膜面积：110cm2)，并将微滤膜和超滤膜的剪切速率均控制在4000s-1，将温度控制在2～10℃，同时将微滤膜和超滤膜的过膜通量均控制在63LMH，在浓缩罐中维持58mL pH7.6的PBS缓冲溶液；
(2)按80L/m2的物料/膜面积比，将经过BHK21细胞悬浮培养的口蹄疫病毒A/GDMM/2013(抗原浓度为2.3μg/mL)细胞培养液加入至微滤料液罐中，使其通过双膜联用一体过滤系统进行微滤超滤一体化处理，至口蹄疫病毒细胞培养液体积减少至初始体积的1/5时，将微滤膜和超滤膜的过膜通量同时调至49.5LMH，待口蹄疫病毒细胞培养液体积减少至初始体积的1/10时，将微滤膜和超滤膜的过膜通量同时调至40.5LMH；
(3)待口蹄疫病毒细胞培养液体积减少至初始体积的1/15时，以等超滤滤过液流速(74.25mL/min)向微滤料液罐中加入118mL(2倍浓缩罐体积的洗滤液)pH7.6、电导为31mS/cm的PBS缓冲溶液作为第一洗滤液进行微滤洗滤；
(4)微滤洗滤结束后，关闭微滤装置的滤过端阀门和第一恒流泵，以等超滤滤过液流速(74.25mL/min)向浓缩罐中加入259mL(4.4倍浓缩罐体积的洗滤液)pH7.6、电导为31mS/cm的PBS缓冲溶液作为第二洗滤液进行超滤洗滤；
(5)收集浓缩罐中含有口蹄疫病毒的浓缩液，其中口蹄疫病毒抗原的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳图如图3所示，高效液相色谱(HPLC)检测结果如图4所示。
检测口蹄疫病毒抗原浓度及总蛋白浓度，测得口蹄疫病毒抗原浓度为34.2μg/mL，其杂蛋白去除率在98％以上，所得口蹄疫病毒抗原总收率为98％。
实施例2
本实施例提供了一种口蹄疫疫苗的制备方法，采用双膜联用一体过滤系统对口蹄疫病毒细胞培养液进行纯化，并利用色谱层析法进行进一步纯化(即，精制)，具体步骤如下：
(1)按图2搭建双膜联用一体过滤系统，采用pH7.6的PBS缓冲溶液平衡微滤膜(孔径：0.45μm，内径：1mm，膜面积：110cm2)和超滤膜(孔径：300kD，内径：1mm，膜面积：110cm2)，并将微滤膜和超滤膜的剪切速率均控制在1500s-1，将温度控制在2～10℃，同时将微滤膜和超滤膜的过膜通量控制在36LMH，在浓缩罐中预先加入58mL pH7.6的PBS缓冲溶液；
(2)按80L/m2物料/膜面积比，将经过BHK21细胞悬浮培养的口蹄疫病毒A/GDMM/2013(抗原浓度为2.3μg/mL)细胞培养液加入至微滤料液罐中，使其通过双膜联用一体过滤系统进行微滤超滤一体化处理，至口蹄疫病毒细胞培养液体积减少至初始体积的1/5时，将微滤膜和超滤膜的过膜通量同时调至28.2LMH，待口蹄疫病毒细胞培养液体积减少至初始体积的1/10时，将微滤膜和超滤膜的过膜通量同时调至23.1LMH；
(3)待口蹄疫病毒细胞培养液体积减少至初始体积的1/15时，以等超滤滤过液流速(42.4mL/min)，将118mL(2倍浓缩罐体积的洗滤液)超滤滤过液回流至微滤料液罐作为第一洗滤液进行微滤洗滤；
(4)微滤洗滤结束后，关闭微滤装置的滤过端阀门及第一恒流泵，以等超滤滤过液流速(42.4mL/min)向浓缩罐中加入259mL(4.4倍浓缩罐体积的洗滤液)pH7.6、电导100mS/cm的PBS缓冲溶液作为第二洗滤液进行超滤洗滤；
(5)将步骤(4)浓缩罐中所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液上样至经pH7.6、电导90mS/cm的PBS缓冲溶液淋洗过的Capto butyl色谱填料，上样后继续用pH7.6、电导90mS/cm的PBS缓冲溶液淋洗5个柱体积，然后用pH7.6、电导5mS/cm的PBS缓冲溶液洗脱口蹄疫病毒抗原。
检测洗脱峰的口蹄疫病毒抗原浓度、总蛋白浓度和核酸残留，测得口蹄疫病毒抗原浓度为32μg/mL，宿主核酸去除率在99％以上，杂蛋白去除率在99％以上，所得口蹄疫病毒抗原总收率为92％。
实施例3
本实施例提供了一种口蹄疫疫苗的制备方法，采用双膜联用一体过滤系统对口蹄疫病毒细胞培养液进行规模化纯化，具体步骤如下：
(1)按图1搭建双膜联用一体过滤系统，采用pH7.6的PBS缓冲溶液平衡微滤膜(孔径：0.2μm，内径：1mm，膜面积：38m2)和超滤膜(孔径：500kD，内径：1mm，膜面积：36m2)，并将微滤膜和超滤膜的剪切速率均控制在2000s-1，将温度控制在2～10℃，将微滤膜的过膜通量控制在41.8LMH，将超滤膜的过膜通量控制在39.6LMH(微滤膜和超滤膜的过膜通量的差异是为了保持相同的滤过液流速)，微滤料液罐和浓缩罐中各维持200L pH7.6的PBS缓冲溶液；
(2)以23.76L/min的流速向微滤料液罐中加入经过BHK21细胞悬浮培养的口蹄疫病毒A/GDMM/2013(抗原浓度为2.1μg/mL)细胞培养液，使其通过双膜联用一体过滤系统进行微滤超滤一体处理。待泵入2400L口蹄疫病毒细胞培养液进入双膜联用一体过滤系统时，将进料速度调至19.8L/min，并将微滤膜的过膜通量调至31.2LMH，同时将超滤膜的过膜通量调至33LMH。待再次泵入300L口蹄疫病毒细胞培养液进入双膜联用一体过滤系统时，将进料速度调至16.2L/min，将微滤膜的过膜通量调至25.5LMH，同时将超滤膜的过膜通量调至27LMH；
(3)待口蹄疫病毒细胞培养液全部(共3000L)泵入双膜联用一体过滤系统时，以等超滤滤过液流速(16.2L/min)向微滤料液罐中加入400L(2倍浓缩罐体积的洗滤液)pH7.6、电导为31mS/cm的PBS缓冲溶液作为第一洗滤液进行微滤洗滤；
(4)微滤洗滤结束后，关闭微滤装置的滤过端，以等超滤滤过液流速(16.2L/min)向浓缩罐中加入1000L(5倍浓缩罐体积的洗滤液)pH7.6、电导为31mS/cm的PBS缓冲溶液作为第二洗滤液进行超滤洗滤；
(5)收集浓缩罐中含有口蹄疫病毒的浓缩液。
检测口蹄疫病毒抗原浓度及总蛋白浓度，测得口蹄疫病毒抗原浓度为30.2μg/mL，杂蛋白去除率在94％以上，所得口蹄疫病毒抗原总收率为96％。
实施例4
本实施例制备了灭活纯化口蹄疫疫苗和灭活精制口蹄疫疫苗，并用制备的疫苗分别进行动物免疫效力实验，具体步骤如下：
(1)将实施例1制备得到的纯化口蹄疫病毒抗原和实施例2制备得到的精制口蹄疫病毒病原分别用二乙烯亚胺(BEI)灭活后，加入硫代硫酸钠阻断；
(2)灭活的纯化口蹄疫病毒抗原和灭活的精制口蹄疫病毒抗原分别过孔径为0.22μm的微滤膜除菌，按10：7的体积比(抗原溶液：缓冲溶液)各加入pH7.4的PBST缓冲溶液(即，加入吐温-20的PBS缓冲溶液)稀释至口蹄疫病毒抗原浓度为20μg/mL，再按1:1重量比加206佐剂乳化，分装得猪口蹄疫A型灭活纯化疫苗和猪口蹄疫A型灭活精制疫苗；
(3)选择12头雄性无特定病原猪(SPF猪)，分成两组，实验组10头，对照组2头。对于实验组中的5头SPF猪，每头颈部肌肉注射猪口蹄疫A型灭活纯化疫苗1mL；对于实验组中的另外5头SPF猪，每头颈部注射猪口蹄疫A型灭活精制疫苗1mL；对照组中的2头SPF猪不进行任何免疫。第28天，对每头SPF猪用0.5mL含105TCID50的流行A型口蹄疫病毒攻击，观察猪口蹄疫症状15天。
结果表明，实验组的所有免疫猪均未见不良反应，未见口蹄疫症状出现，而对照组的未免疫猪全部死亡。由此可见，用本申请的方法制备得到的猪口蹄疫A型灭活纯化疫苗和猪口蹄疫A型灭活精制疫苗的免疫保护率均为100％。而且，本实施例还表明，采用本发明的双膜联用一体过滤系统制备得到的口蹄疫病毒抗原已达到动物安全免疫的纯度，可无需进一步纯化即可制备疫苗。
实施例5
本实施例提供了微滤膜和超滤膜的清洗再生方法，具体步骤如下：
(1)将纯水分别加入实施例1-3使用后的双膜联用一体过滤系统中的微滤装置和超滤装置以分别清洗其中的微滤膜和超滤膜，清洗过程中将膜剪切速率提升至16000s-1，将过膜通量由10LMH逐步提升至50LMH；
(2)经步骤(1)清洗后将0.1～0.5M NaOH溶液分别加入微滤装置和超滤装置做进一步清洗，溶液温度为50℃，剪切速率为16000s-1，过膜通量由50LMH逐步提升至400LMH，时间为60分钟；
(3)经步骤(2)清洗后用纯水以洗滤模式冲洗微滤装置和超滤装置至微滤滤过液和超滤滤过液的pH降至9以下；
(4)将剪切流速降低至2000s-1，温度控制在20℃，将过膜通量由5LMH逐步提升至100LMH，测定系统的水通量并记录。
(5)检测记录200次使用后的微滤膜和超滤膜的水通量，如图5所示。
由图5可见，在200次的使用过程中，微滤膜和超滤膜均保持较好的回复性和一致性。由于微滤和超滤均在膜的可逆污染区域以内进行，降低了膜污染程度，减轻了清洗回复的负担，同时在使用清洁剂之前分步排放污染物和热水冲洗均提高了膜的性能回复。通过膜水通量的测定，膜在200次以内的使用处于稳定状态，比传统工艺的膜寿命长5-10倍，这将大幅降低设备耗材投入，降低生产成本。
综上所述，本发明采用双膜联用一体过滤系统在优化的控制条件下实现了线型放大，并且保持小试一体工艺高回收率，高杂质去除的性能。在规模生产工艺中，双膜联用一体过滤系统中的两个料液罐(即微滤料液罐和浓缩罐)体积接近待浓缩后的料液体积，比传统过滤系统中两个与预处理料液等体积的料液罐相比小了10-20倍，时间缩短一半。最为重要的是，本发明采用双膜联用一体过滤系统的疫苗制备方法在保持高回收率和高纯度的基础上，一步实现了传统口蹄疫疫苗制备工艺中多步操作的效果。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (26)

1.一种口蹄疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(i)获取口蹄疫病毒细胞培养液；
(ii)将所述口蹄疫病毒细胞培养液通过双膜联用一体过滤系统进行分离纯化，所述双膜联用一体过滤系统包括并行设置的微滤装置和超滤装置，所述微滤装置包括微滤料液罐、第一主泵和微滤膜，所述超滤装置包括浓缩罐、第二主泵和超滤膜；其中所述微滤装置用于除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的大颗粒杂质，所述超滤装置用于除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的小分子杂质；所述微滤装置和所述超滤装置同时运行对所述口蹄疫病毒细胞培养液同时进行微滤和超滤，从而在所述浓缩罐中形成含有口蹄疫病毒的浓缩液；其中所述微滤装置与第一恒流泵连接、所述超滤装置与第二恒流泵连接以动态控制过膜通量，所述过膜通量为微滤膜或超滤膜的临界膜通量的65％～100％；其中所述浓缩罐的体积为所述口蹄疫病毒细胞培养液初始体积的1/5～1/50，并且所述浓缩罐的体积等于所述口蹄疫病毒细胞培养液的目标浓缩体积或者不大于所述目标浓缩体积的1.5倍；
(iii)收集步骤(ii)中所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微滤膜的孔径为0.1μm～0.45μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述超滤膜是孔径为100kD～500kD的中空纤维超滤膜。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在所述口蹄疫病毒细胞培养液至少部分通过所述微滤装置之后，进一步向所述微滤料液罐中加入第一洗滤液，使其通过所述双膜联用一体过滤系统，获得浓缩液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一洗滤液为pH7.2～pH9、电导5-300mS/cm的缓冲溶液。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所加入的第一洗滤液的体积为微滤截留液体积的1～5倍。
7.根据权利要求1所述的方法，其中将步骤(ii)中所获得的超滤滤过液做为第一洗滤液加入至所述微滤料液罐中，使所述超滤滤过液通过所述双膜联用一体过滤系统，获得浓缩液。
8.根据权利要求1所述的方法，其中向步骤(ii)中所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液中加入第二洗滤液，使所述浓缩液中的小分子杂质透过超滤膜，获得纯化的病毒浓缩液。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第二洗滤液为pH7.2～pH9、电导5-300mS/cm的缓冲溶液。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所加入的第二洗滤液的体积为所述病毒浓缩液体积的1～10倍。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一恒流泵设置在所述微滤装置的滤过端，所述第二恒流泵设置在所述超滤装置的滤过端。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述过膜通量为10-150LMH。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述微滤膜和所述超滤膜的剪切速率各为1500～4000s-1。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述微滤膜和所述超滤膜的物料与膜面积比均各为10～500L/m2。
15.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(iii)之后对所述含有口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活。
16.根据权利要求15所述的方法，其中在所述灭活之后对所述含有口蹄疫病毒的浓缩液进行乳化。
17.根据权利要求15所述的方法，其中在所述灭活之前或之后对所述含有口蹄疫病毒的浓缩液进行进一步纯化。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述进一步纯化通过PEG沉淀法或色谱层析法进行。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述色谱层析法包括排阻色谱层析法、离子交换色谱层析法、疏水色谱层析法和亲和色谱层析法。
20.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(iii)之后对所述微滤装置和所述超滤装置进行清洗再生。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述清洗再生包括如下步骤：
a)将纯水分别加入所述微滤装置和所述超滤装置以分别清洗其中的微滤膜和超滤膜，清洗过程中膜剪切速率提升至8000s-1～16000s-1，过膜通量控制在10～500LMH；
b)经步骤a)清洗后将0.1～0.5M NaOH溶液分别加入所述微滤装置和所述超滤装置做进一步清洗，溶液温度为45～55℃，膜剪切速率为8000s-1～16000s-1，过膜通量控制在50～500LMH，时间为30～60分钟；
c)经步骤b)清洗后用纯水分别冲洗所述微滤装置和所述超滤装置至微滤滤过液和超滤滤过液的pH值降至9以下。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述口蹄疫病毒毒株包括一种或多种口蹄疫病毒血清型毒株。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述血清型为O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型或Asia1型。
24.一种用于制备口蹄疫疫苗的装置，其包括双膜联用一体过滤系统，所述双膜联用一体过滤系统包括并行设置的微滤装置和超滤装置，所述微滤装置包括微滤料液罐、第一主泵和微滤膜，所述超滤装置包括浓缩罐、第二主泵和超滤膜；其中所述微滤装置用于除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的大颗粒杂质，所述超滤装置用于除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的小分子杂质；所述微滤装置和所述超滤装置同时运行对所述口蹄疫病毒细胞培养液同时进行微滤和超滤，从而在所述浓缩罐中形成含有口蹄疫病毒的浓缩液，其中所述双膜联用一体过滤系统还包括第一恒流泵和第二恒流泵，所述微滤装置与所述第一恒流泵连接，所述超滤装置与所述第二恒流泵连接以动态控制过膜通量。
25.根据权利要求24所述的装置，其中所述微滤装置和所述超滤装置相互连接，以使得微滤滤过液和超滤截留液均置于所述浓缩罐中形成所述含有口蹄疫病毒的浓缩液。
26.根据权利要求24或25所述的装置，其中所述第一恒流泵设置在所述微滤装置的滤过端，所述第二恒流泵设置在所述超滤装置的滤过端。
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