RU2456996C1 - Способ получения очищенной в-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма vibrio cholerae - Google Patents
Способ получения очищенной в-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма vibrio cholerae Download PDFInfo
- Publication number
- RU2456996C1 RU2456996C1 RU2011123073/10A RU2011123073A RU2456996C1 RU 2456996 C1 RU2456996 C1 RU 2456996C1 RU 2011123073/10 A RU2011123073/10 A RU 2011123073/10A RU 2011123073 A RU2011123073 A RU 2011123073A RU 2456996 C1 RU2456996 C1 RU 2456996C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- subunit
- cholera toxin
- purified
- cholera
- toxin
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- Y02A50/472—
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение раскрывает способ получения основного протективного антигена холерного вибриона В-субъединицы холерного токсина. Способ включает в себя осаждение белковой фракции из фильтрата бульонной культуры рекомбинантного штамма не 01 серогруппы Vibrio cholerae KM93 (ГК «Микроб»). Из осажденной белковой фракции выделяют В-субъединицу и очищают ее с помощью трех ступеней колоночной гель-проникающей хроматографии на геле TSK HW-60. Очищенный препарат В-субъединицы применяют для получения антитоксических сывороток, высокоспецифических иммуноглобулинов и диагностических тест-систем, а также в качестве компонента, добавляемого к вакцинным препаратам. Использование изобретения позволит повысить выход высокоочищенного нативного иммуногенного препарата В-субъединицы холерного токсина. 2 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и может быть использовано для получения основного протективного антигена холерного вибриона В-субъединицы холерного токсина, применяемого в дальнейшем для получения антитоксических сывороток, высокоспецифических иммуноглобулинов и диагностических тест-систем, а также в качестве компонента, добавляемого к вакцинным препаратам.
Известно, что В-субъединица холерного токсина является основным фактором иммуногенности, обеспечивающим формирование антитоксического иммунитета при холере, что позволяет использовать ее в качестве иммунизирующего агента при создании эффективных профилактических и диагностических препаратов. Современная тенденция развития вакцинопрофилактики характеризуется получением вакцин с химически определенным составом и регулируемой иммуногенностью, новыми повышенными требованиями к безвредности и чистоте антигенных препаратов, предполагающими разработку достаточно совершенных технологических методов их выделения.
Известен способ получения очищенного препарата В-субъединицы, основанный на выделении ее из очищенного холерного токсина с помощью гельфильтрации на сефадексе G-75 (Lai C.Y., Mendez E., Chang D. Chemistry of cholera toxin: the subunit structure/ J.Infect. Dis. - 1976. - V.133. - S23-S30), при котором разделение токсина на субъединицы происходит в кислой среде (рН 3,2) в присутствии мочевины в высокой концентрации, что приводит к денатурации белка и требует последующего ренатурирования и диализа. При выделении В-субъединицы описанным способом происходит частичная утрата ею своих нативных иммуногенных свойств.
Известен способ очистки В-субъединицы с помощью аффинной хроматографии с использованием колонки лизо-GM1-ганглиозида (Dertzbaugh M.T., Macrina F.L., Cholera toxin B-subunit gene fusion: Structure and functional analysis of the chimeric protein// Infect. Immun. - 1990. - V.58.N1 - P.70-79), также предусматривающий выделение В-субъединицы из предварительно полученного очищенного холерного токсина, при этом в качестве лиганда в способе используют GM1- ганглиозиды, имеющие сродство к В-субъединице холерного токсина. Для приготовления GM1- ганглиозидов, которые химически пришиваются к афинным хроматографическим носителям, требуются высококвалифицированные специалисты-химики.
Вышеописанные способы являются трудоемкими и многоэтапными процессами, требующими наличия дорогостоящих хроматографических сорбентов, реактивов и оборудования. Кроме того, препараты В-субъединицы обладают остаточной токсичностью из-за присутствия в них примесей субъединицы А, это снижает качество получаемых в дальнейшем препаратов.
Наиболее близким к заявляемому способу является получение очищенной В-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма Vibrio cholerae (Захарова Т.Л., Ливанова Л.Ф., Заднова С.П., Смирнова Н.И./ Биотехнология, 2003, №5, С.53-56), при котором основная стадия очистки осуществляется с помощью ионообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе. Этот метод основан на использовании рекомбинантного штамма - продуцента В-субъединицы, лишенного продукции субъединицы А, штамм выращивают в реакторе методом глубинного культивирования. Затем из фильтрата бульонной культуры осаждают белковую фракцию и выделяют из нее В-субъединицу на колонке с фосфоцеллюлозой - ионообменником, который перед каждым использованием подвергают обработке кислотой, щелочью, промывают водой, уравновешивают буферным раствором, это создает определенные трудности, связанные с затратой материальных средств и времени. Недостатком метода также является то, что только небольшая часть от исходной концентрации В-субъединицы связывается с катионообменником в процессе хроматографии, а большее количество антигена утрачивается.
В связи с вышеизложенным очевидна актуальность разработки более эффективного способа выделения и очистки важнейшего холерного протективного антигена - В-субъединицы холерного токсина.
Задачей изобретения является разработка простого, экономичного и эффективного способа получения высокоочищенного нативного иммуногенного препарата В-субъединицы холерного токсина.
Технический результат заключается в упрощении технологии получения очищенной В-субъединицы, увеличении ее выхода с сохранением нативных иммуногенных свойств.
Технический результат достигается способом получения очищенной В-субъединицы холерного токсина из фильтрата бульонной культуры рекомбинантного штамма холерного вибриона, выращенного методом глубинного культивирования, включающим осаждение белковой фракции с последующим выделением из нее и очисткой В-субъединицы, которую согласно заявляемому изобретению осуществляют с помощью трех ступеней колоночной гель-проникающей хроматографии на геле TSK HW-60.
Новым в заявляемом способе является применение на основном этапе очистки целевого продукта метода гель-проникающей хроматографии на геле TSK HW-60 в три ступени. При использовании указанного метода колонку с гелем используют многократно, промывая после каждого применения буферным раствором. По способу прототипу, при котором на основном этапе очистки применяется метод ионообменной хроматографии, фосфоцеллюлозу снимают с колонки после каждого использования и регенерируют последовательной обработкой растворами щелочи и кислоты с многократным промыванием после каждой стадии дистиллированной водой, далее уравновешивают буферным раствором и вновь вносят на колонку и промывают буфером до достижения точного значения рН. Таким образом, при использовании метода ионообменной хроматографии для очистки В-субъединицы необходимо использовать ряд реактивов и методических приемов, которые не требуются при применении колоночной гельпроникающей хроматографии, что значительно снижает материальные и трудовые затраты при получении очищенного препарата В-субъединицы. Относительная простота исполнения сопровождается другими значительными преимуществами используемого метода. Применение TSK-геля HW-60, обладающего высокой механической стабильностью, обеспечивает высокоскоростное выделение антигена при минимальном разведении образца и полное сохранение нативных свойств В-субъединицы. Опытным путем авторами установлено, что применение трех ступеней очистки указанным методом необходимо и достаточно для того, чтобы обеспечить максимальный выход очищенной В-субъединицы из общей белковой фракции.
Заявляемый способ получения очищенной В-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма V.cholerae подробно расписан в примере 1.
В предлагаемом способе получения очищенной В-субъединицы холерного токсина для решения поставленной задачи применяют следующие последовательно сменяющиеся операции. Проводят глубинное культивирование рекомбинантного штамма V.cholerae. В работе был использован штамм не O1 серогруппы V.cholerae KM93, содержащий гибридную плазмиду рIЕМ3 с клонированными генами vctB, детерминирующими синтез В-субъединицы холерного токсина (депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб»). Источником В-субъединицы служит фильтрат бульонной культуры указанного штамма. Из фильтрата бульонной культуры штамма осаждают общую белковую фракцию снижением рН до 4,0 в присутствии 0,25% гексаметафосфата натрия, перемешивая в течение 2 ч при комнатной температуре. Далее отделяют осадок центрифугированием и суспендируют его в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,0. Затем полученную суспензию диализуют против 50 объемов 0,007 М фосфатного буфера рН 7,0, в течение 24 ч и удаляют нерастворимые примеси центрифугированием. Полученный препарат подвергают гельпроникающей хроматографии на колонке с TSK-гелем HW-60 в три ступени. Элюцию осуществляют 0,007 М фосфатным буфером рН 7,0, фракционируя по 5 мл. Фракции спектрофотометрировали при 280 нм и анализировали в реакции иммунодиффузии (РИД) по Оухтерлони с антисывороткой к В-субъединице холерного токсина. На первой ступени очистки В-субъединица обнаруживалась в начальной половине второго пика (фиг.1). На второй ступени фракции, содержащие В-субъединицу, объединяли, концентрировали и вновь наносили на колонку. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока В-субъединица не сходила с колонки одним самостоятельным пиком. Для этого потребовалось три ступени очистки на TSK-геле HW-60. Полученный целевой продукт диализовали против 0,9% хлорида натрия, разливали по 1 мл в ампулы и лиофильно высушивали. Выход очищенной В-субъединицы от общего количества белка в исходном препарате составил 30% (тогда как у прототипа - 20%).
На фиг.1а) представлены профили элюции первой (В-субъединица обнаруживалась в начале второго пика) и на фиг.1б) - профили третьей (В-субъединица выходила отдельным пиком) ступени очистки. По оси ординат - оптическая плотность при 280 нм, по оси абсцисс - объем элюата в мл.
После каждой ступени очистки препарата чистоту В-субъединицы анализировали методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле, в результате чего выяснили, что трех ступеней очистки достаточно для получения лишенного примесей препарата В-субъединицы холерного токсина.
Препарат, полученный заявляемым способом, обладает следующими свойствами. В полученном препарате содержится 200 мкг/мл белка (по методу Лоури). По данным диск-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в конечном целевом продукте обнаруживается одна белковая полоса, идентичная по расположению полосе коммерческой В-субъединицы холерного токсина с молекулярной массой 58 кДа, отсуствуют другие примеси, что является свидетельством гомогенности и чистоты. По титру специфической активности в РИД по Оухтерлони полученный препарат также не отличается от коммерческой В-субъединицы, которая взята в качестве эталона, от В-субъединицы, полученной способом - прототипом, и от В-субъединицы, выделенной ранее из целого токсина методом Lai C.Y. В кожной пробе Крейга на остаточную токсичность очищенная предлагаемым способом В-субъединица, также как и выделенная способом - прототипом, не вызывала образование инфильтрата, что указывает на полное отсутствие в ней фактора кожной проницаемости (таблица).
Пример 2. Оценка иммунологической активности.
Иммунологическая активность очищенной В-субъединицы была подтверждена получением кроличьей антисыворотки. Для этого было проиммунизировано 6 кроликов породы «Шиншилла» весом 2,5 кг. Иммунизацию животных проводили путем введения 200 мкг очищенного препарата В-субъединицы внутрикожно в область спины двукратно с интервалом в один месяц. Антигенность очищенной В-субъединицы холерного токсина определялась путем выявления в сыворотке крови антитоксических антител в РИД по Оухтерлони с очищенным препаратом В-субъединицы холерного токсина. Было установлено, что полоса преципитации образовывалась не только с цельной сывороткой, но и в разведении ее 1:64-1:128. Из этого следует, что очищенная В-субъединица холерного токсина обладает антигенностью, в результате чего была получена антисыворотка, содержащая значительное количество антител, о чем свидетельствует высокий уровень ее активности (1:64-1:128).
Специфичность сыворотки оценивалась в реакции пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) на плотной среде. На чашки с синказным агаром методом реплик наносили бактериальные колонии штамма V.cholerae KM93 - продуцента В-субъединицы холерного токсина, и высокотоксигенный штамм V.cholerae 569B (положительные контроли), а также штамма V.cholerae 509, не продуцирующего ни холерный токсин, ни его В-субъединицу, и E.coli M17, которые были использованы в качестве отрицательного контроля. Через 18 часов инкубации чашки с выросшими макроколониями указанных штаммов заливали слоем синказного агара с добавлением полученной антисыворотки. Через 2-3 часа вокруг макроколоний штаммов V.cholerae KM93 и 569B, продуцирующих, соответственно лишь только В-субъединицу холерного токсина, либо В-субъединицу в составе холерного токсина образовывалась зона гемолиза в результате специфического взаимодействия антител и антигена, приводящего в присутствии комплемента к лизису эритроцитов. Вокруг макроколоний V.cholerae 509, не продуцирующего холерный токсин, и макроколоний E.coli M17 эта зона отсутствовала. На основании проведенных данных следует считать, что антисыворотка к В-субъединице холерного токсина специфична, поскольку имеющиеся в ней антитела не взаимодействовали ни с одним другим антигеном, находящимся на поверхности штаммов V.cholerae 509 и E.coli M17, взятых в качестве отрицательного контроля.
Таблица | ||
Способ получения очищенной В-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма Vibrio cholera | ||
Свойства препаратов В-субъединицы холерного токсина | В-субъединица холерного токсина, полученная способом - прототипом | В-субъединица холерного токсина, полученная заявляемым способом |
Специфическая активность по титру РИД с антисывороткой к В-субъединице холерного токсина | 1/64 | 1/64 |
Чистота по данным диск-электрофореза в ПААГ | Одна белковая полоса - 58 кДа | Одна белковая полоса - 58 кДа |
Остаточная токсичность в кожной пробе Крейга | Инфильтрат отсутствует | Инфильтрат отсутствует |
Процент выхода очищенной В-субъединицы от общего количества белка | 20% | 30% |
Claims (1)
- Способ получения очищенной В-субъединицы холерного токсина из фильтрата бульонной культуры рекомбинантного штамма холерного вибриона, выращенного методом глубинного культивирования, включающий осаждение белковой фракции с последующим выделением из нее и очисткой В-субъединицы, отличающийся тем, что очистку В-субъединицы осуществляют с помощью трех ступеней колоночной гель-проникающей хроматографии на геле TSK HW-60.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011123073/10A RU2456996C1 (ru) | 2011-06-07 | 2011-06-07 | Способ получения очищенной в-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма vibrio cholerae |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011123073/10A RU2456996C1 (ru) | 2011-06-07 | 2011-06-07 | Способ получения очищенной в-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма vibrio cholerae |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2456996C1 true RU2456996C1 (ru) | 2012-07-27 |
Family
ID=46850608
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011123073/10A RU2456996C1 (ru) | 2011-06-07 | 2011-06-07 | Способ получения очищенной в-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма vibrio cholerae |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2456996C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2703282C1 (ru) * | 2019-01-10 | 2019-10-16 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ получения диагностикума для определения токсина холерного вибриона, выделенного из объектов окружающей среды |
EP3390646A4 (en) * | 2015-12-14 | 2019-10-30 | Msd Wellcome Trust Hilleman Laboratories Pvt. Ltd. | NOVEL METHOD FOR THE PRODUCTION OF CLEANED RECOMBINANT CHOLERATOXIN B (RCTB) AND FORMULATION THEREOF |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1505022A1 (ru) * | 1987-09-18 | 1991-10-15 | Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи | Рекомбинантна плазмидна ДНК р1ЕМЗ, кодирующа синтез В-субъединицы холерного токсина, способ ее конструировани и штамм бактерий VIвRIо сноLеRае - продуцент В-субъединицы холерного токсина |
RU2159251C1 (ru) * | 1999-04-29 | 2000-11-20 | ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных | Способ получения рецепторов лактогенных гормонов |
RU2231364C2 (ru) * | 2001-11-01 | 2004-06-27 | Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт | Способ получения капсульного вещества возбудителя мелиоидоза |
RU2401301C1 (ru) * | 2009-04-06 | 2010-10-10 | Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН | Клон гибридных клеток животных mus musculus l - продуцент моноклональных антител к холерному токсину |
-
2011
- 2011-06-07 RU RU2011123073/10A patent/RU2456996C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1505022A1 (ru) * | 1987-09-18 | 1991-10-15 | Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи | Рекомбинантна плазмидна ДНК р1ЕМЗ, кодирующа синтез В-субъединицы холерного токсина, способ ее конструировани и штамм бактерий VIвRIо сноLеRае - продуцент В-субъединицы холерного токсина |
RU2159251C1 (ru) * | 1999-04-29 | 2000-11-20 | ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных | Способ получения рецепторов лактогенных гормонов |
RU2231364C2 (ru) * | 2001-11-01 | 2004-06-27 | Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт | Способ получения капсульного вещества возбудителя мелиоидоза |
RU2401301C1 (ru) * | 2009-04-06 | 2010-10-10 | Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН | Клон гибридных клеток животных mus musculus l - продуцент моноклональных антител к холерному токсину |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3390646A4 (en) * | 2015-12-14 | 2019-10-30 | Msd Wellcome Trust Hilleman Laboratories Pvt. Ltd. | NOVEL METHOD FOR THE PRODUCTION OF CLEANED RECOMBINANT CHOLERATOXIN B (RCTB) AND FORMULATION THEREOF |
RU2703282C1 (ru) * | 2019-01-10 | 2019-10-16 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ получения диагностикума для определения токсина холерного вибриона, выделенного из объектов окружающей среды |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106474466B (zh) | 一种口蹄疫疫苗的制备方法 | |
US5173294A (en) | Dna probe for the identification of haemophilus influenzae | |
CN103732610A (zh) | 纯化天然或突变体形式的白喉毒素的方法 | |
JP2009173945A (ja) | Gbsトキシン/cm101の精製方法 | |
TWI503411B (zh) | B群腦膜炎球菌次單位疫苗之製造及純化 | |
Simon et al. | A scalable method for biochemical purification of Salmonella flagellin | |
Fiske et al. | Method for reducing endotoxin in Moraxella catarrhalis UspA2 protein preparations | |
US4402939A (en) | Vaccinating glycopeptidic antigenic fraction with a very high level of immunogenicity, isolated from cultures of pathogenic germs, processes for isolating said fraction and vaccines containing said fraction | |
RU2456996C1 (ru) | Способ получения очищенной в-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма vibrio cholerae | |
Pieroni et al. | Identification of a human erythrocyte receptor for colonization factor antigen I pili expressed by H10407 enterotoxigenic Escherichia coli | |
CN108774628B (zh) | 合成致新生儿脑膜炎大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的大肠杆菌工程菌及用途 | |
CN102286100A (zh) | 一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法 | |
JPS6176422A (ja) | 百日ぜきコンポ−ネントワクチンおよび百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合ワクチンの製造方法 | |
EP0389925A1 (en) | A method for purifying an outer membrane protein of Haemophilus influenzae | |
Jang et al. | Improved purification process for cholera toxin and its application to the quantification of residual toxin in cholera vaccines | |
RU2715672C2 (ru) | Рекомбинантные ДНК pG4223 и плазмидная ДНК pQE 30-pG4223, штамм Escherichia coli M 15-G4223, обеспечивающие получение полипептида G4223, селективно связывающего IgG, и его применение в аффинной хроматографии для выделения IgG | |
US5300632A (en) | Method for purifying an outer membrane protein of Haemophilus influenzae | |
RU2799574C1 (ru) | Способ получения холерного токсина для контроля производства холерной химической вакцины | |
RU2533815C1 (ru) | Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий | |
JPH11505267A (ja) | ヘリコバクター・ピロリの新規膜タンパクp76 | |
CN106008719B (zh) | 抑制产气荚膜梭菌感染的融合蛋白的制备方法 | |
RU2769201C2 (ru) | Способ получения высокоочищенного рекомбинантного ингибитора с1-эстеразы человека для медицинского применения | |
CN117264031B (zh) | 一种B群脑膜炎奈瑟菌fHBP重组蛋白及其应用 | |
CA3231514A1 (en) | Peptides for metabolic syndrome | |
RU2473558C1 (ru) | Белок, обуславливающий свойство аутоагглютинации клеток чумного микроба, и способ его получения |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160608 |