RU2799574C1 - Способ получения холерного токсина для контроля производства холерной химической вакцины - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Описан способ получения холерного токсина для контроля производства холерной химической вакцины, включающий глубинное культивирование штаммов-продуцентов, стерилизующую фильтрацию культуральной жидкости, осаждение белковой фракции. Способ отличается от аналогов тем, что холерный токсин выделяют последовательным применением тангенциальной ультрафильтрации для удаления примесей с молекулярной массой выше 100 кДа и концентрирования полученного фильтрата с дополнительной адсорбирующей фильтрацией через двуслойный фильтр с положительным зарядом и колоночной гель-хроматографией. Технический результат заключается в упрощении технологии получения препарата XT с сохранением его иммунохимических свойств. 4 ил., 1 табл., 2 пр.

Description

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и может быть использовано для получения основного протективного антигена холерного вибриона - холерного токсина. Холерный токсин (XT) является основным фактором иммуногенности, обеспечивающим формирование антитоксического иммунитета при холере. Препарат холерного токсина - «Тест-токсин холерный» используется для получения антихолерогенной сыворотки и тестирования активности холерогена-анатоксина, являющегося одним из компонентов иммунобиологического лекарственного средства «Вакцина холерная бивалентная химическая, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой. Вакцинация против холеры включена в Национальный календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям (Приказ Минздрава России. №1122н от 16.12.2021 г.), а сам препарат в Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов (Распоряжение Правительства РФ от 12.10.2019 №2406-р (ред. от 30.03.2022).

Известен метод выделения холерного токсина по методу Mekalanos J.J. et al. (1978). Получение холерного токсина состоит из следующих последовательно выполняющихся стадий: глубинное культивирование штамма холерного вибриона 569В Инаба O1 серогруппы классического биовара; отделение центрифугированием микробной биомассы; стерилизующая фильтрация центрифугата; осаждение белковых фракций из фильтрата соляной кислотой в присутствии 0,25% гексаметафосфата натрия при рН 4,3; выделение полученного осадка центрифугированием; диализ; центрифугирование для удаления нерастворимых примесей; ионнообменная хроматография на фосфоцеллюлозе; диализ. Энтеротоксин холерный очищенный, приготовленный методом Mekalanos J.J. et al. (1978) из фильтрата бульонной культуры холерного вибриона штамма 569В, представляет собой белок с молекулярной массой 85 кДа, имеющий субъединичную структуру. Его молекула состоит из одной субъединицы А (27,2 кДа), и пяти субъединиц В (11,6 кДа) (Zhang R. et al., 1995) Обладает высокой антигенной и протективной активностью.

Традиционный метод, используемый для очистки XT, является трудоемким, многоэтапным процессом, требующим наличия дорогостоящих реактивов и оборудования.

В настоящее время для очистки и концентрирования антигенов применяются методы ультрафильтрации. Широкое применение полимерных мембран обусловлено такими их достоинствами, как химическая и биологическая инертность, большой диапазон размеров пор, простота получения и дешевизна.

Описан способ получения холерного токсина с использованием тангенциальной фильтрации на мембранах с пропускной способностью 30 кДа (Jang Н. et al., 2009). При этом авторы применяли ионообменную хроматографию для выделения антигена.

Также описан способ получения холерного токсина из штамма V. cholerae 569В с использованием ультрафильтрационной колонки Amicon (Алексеева Л.П. с соавт., 2019), в котором также применена дальнейшая очистка токсина методом ионообменной хроматографии.

Описан способ получения В-субъединицы холерного токсина с помощью тангенциальной фильтрации (Комиссаров А.В. с соавт., 2015), при этом исходным материалом для выделения В-субъединицы являлись обработанные формалином центрифугаты бульонной культуры рекомбинантного штамма V. cholerae КМ93, продуцирующего только В-субъединицу холерного токсина.

Разработаны методические приемы применения тангенциальной ультрафильтрации для выделения холерогена-анатоксина из культуральной жидкости холерного вибриона штамма V. cholerae 569В (Патент RU 2535122). Метод разработан для получения компонента вакцины холерной химической.

Задачей изобретения является разработка более простого и экономичного способа выделения препарата холерного токсина для контроля производства холерной химической вакцины, позволяющего получить холерный токсин из различных штаммов холерного вибриона.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в упрощении технологии получения препарата XT с сохранением его иммунохимических свойств.

Технический результат достигается способом получения холерного токсина, который предусматривает глубинное культивирование штаммов-продуцентов, стерилизующую фильтрацию культуральной жидкости, последовательное применение тангенциальной ультрафильтрации для удаления примесей с молекулярной массой выше 100 кДа и концентрирования полученного фильтрата, осаждение белковой фракции, с дополнительной адсорбирующей фильтрацией и колоночной гель-хроматографией, исключая стадию ионообменной хроматографии.

Новизна заявляемого изобретения заключается в том, что холерный токсин из штаммов холерного вибриона после тангенциальной ультрафильтрации через мембраны 100 кДа с целью удаления примесей с молекулярной массой выше 100 кДа, концентрирования полученного фильтрата методом тангенциальной ультрафильтрации через мембраны 10 кДа и осаждения 18,5% раствором соляной кислоты в присутствии 0,25% гексаметафосфата натрия был подвергнут дополнительной фильтрации через двуслойный адсорбирующий фильтр с положительным зарядом и гель-хроматографии, что позволило уменьшить количество стадий получения препарата. Преимуществом метода гель-хроматографии по сравнению с ионообменной является относительная простота исполнения и отсутствие необходимости проведения диализа.

Заявляемый способ получения холерного токсина подробно описан в примере 1:

Первым этапом нашей работы было получение осадка, содержащего холерный токсин. Технологический процесс фракционирования и концентрирования складывался из ряда последовательно выполняющихся операций: стерилизующей фильтрации культуральной жидкости V. cholerae 569В (10 л) на мембранах 0,22 мкм, отделение О-антигена методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по молекулярной массе (НОММ) 100 кДа, концентрирование холерного токсина методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с НОММ 10 кДа (1 л). Далее фракцию, содержащую токсин, осаждали из концентрата 18,5% раствором соляной кислоты в присутствии 0,25% гексаме-тафосфата натрия при (рН 4,2±0,1), центрифугировали и диализовали. Полученный препарат (100 мл), содержал холерный токсин (титр в РДП 1:32) и следовые количества О-антигена (титр в РДП 1:2). Содержание белка по Лоури составляло 1 мг/мл. Дальнейшая очистка токсина проводилась последовательным освобождением полуфабриката, содержащего холерный токсин от О-антигена, имеющего липополисахаридную природу путем фильтрации супернатанта через адсорбирующий двуслойный фильтр с положительным зарядом, который обеспечивает удаление отрицательно заряженных частиц, в том числе эндотоксинов. Данная процедура позволяет получать препарат, практически свободный от О-антигена.

Далее полученный препарат подвергали гель-хроматографии на колонке с TSK-гелем HW-60. Элюцию осуществляли 0,01М фосфатным буфером рН 7,0, фракционируя по 5 мл. Фракции спектрофотометрировали при 280 нм и анализировали в реакции иммунодиффузии по Оухтерлони с антихолерогенной (АХС) и О-сывороткой. Фракции, содержащие токсин, объединяли и измеряли объем (0,4±0,1) л. Анализ полученного после хроматографической очистки препарата тест-токсина показал, что содержание белка составляло (0,2±0,04) мг/мл, иммунохимическая активность с антихолерогенной сывороткой в реакции диффузионной преципитации по Оухтерлони 1:32 (64), с О-сывороткой тест был отрицательный, что свидетельствует об отсутствии О-антигена. Активность в пробе Крейга составляла 1:40000 (0,0025 мкг по белку), что соответствует требованиям нормативной документации (1:16000 в пробе Крейга). Также были исследованы электрофоретическая подвижность и иммунохимическая специфичность полученного препарата в иммуноблоттинге с антихолерогенной сывороткой. На фиг. 1 представлены результаты анализа электрофоретической подвижности препаратов, проведенного с использованием диск-электрофореза с окраской по Кумасси R-250: М - маркеры молекулярного веса; 1 - исходный образец (полуфабрикат); 2 - токсин, полученный по методу Mekalanos; 3 - образец XT. На фиг. 2 - иммуноблоттинг препаратов холерного токсина: М - маркеры молекулярного веса; 4 - исходный образец (полуфабрикат); 5 - токсин, полученный по методу Mekalanos; 6 - образец XT.

Молекула холерного токсина состоит из одной субъединицы А (27,2 кДа), и пяти субъединиц В (11,6 кДа), которые образуют димеры, тримеры, тетрамеры и пентамеры, регистрируемые в электрофоретическом анализе. На электрофореграмме видны мажорные полосы молекулярной массой 55 и 27 кДа. Иммунохимическая активность белковых полос также подтверждается иммуноблоттингом (Фиг. 2). Полученные данные свидетельствуют о том, что белковые комплексы токсина, полученного по заявляемой технологии, соответствуют таковым холерному токсину, приготовленному по описанной ранее методике (Mekalanos J.J. et al., 1978).

Таким образом, в результате последовательного применения методов тангенциальной ультрафильтрации, дополнительной фильтрации через адсорбирующий фильтр и хроматографической очистки нами получен препарат холерного токсина, который может применяться для контроля специфических фракций и готовой продукции - таблеток холерной химической вакцины.

Пример 2.

Для выделения холерного токсина, применяемого в качестве тест-токсина для контроля формализированного центрифугата, фракций и таблеток вакцины холерной химической, согласно нормативной документации используют штамм V. cholerae 569В O1 серогруппы классического биовара. Учитывая, что в настоящее время возбудителем холеры являются штаммы V. cholerae O1 серогруппы, продуцирующие холерный токсин классического типа, но относящихся к другому биовару - Эль Тор, а также наличие созданных генно-инженерных штаммов-продуцентов холерного токсина в ходе предварительных экспериментов нами были отобраны штаммы-продуценты с повышенной продукцией холерного токсина. Штамм V. cholerae КМ68 O1 серогруппы классического биовара, производный штамма Дакка 35 серовара Огава, содержит рекомбинантную плазмиду рСО 107-2 и является продуцентом холерного токсина, также в работе был использован природный штамм V. cholerae Р-18899 Тох⁺ Инаба O1 Эль Тор биовара. Штаммы получены из коллекции ГКПБ РосНИПЧИ «Микроб». Все изучаемые штаммы имеют типичные для холерного вибриона морфологические, культуральные, биохимические и серологические свойства и обладают холерогенными, токсигенными и иммуногенными свойствами в опытах на лабораторных животных.

Для получения препаративного количества холерного токсина было проведено глубинное культивирование в лабораторном биореакторе с рабочим объемом 1 л в среде для культивирования холерных вибрионов, с содержанием аминного азота (1,75±0,25) г/л, рН (8,0±0,1) с подпиткой источником углеводного питания при температуре (30±0,2)°С для V.cholerae КМ68 и (37±0,2)°С для штамма V.cholerae Эль Тор Р-18899 в течение 8-9 ч до достижения стационарной фазы роста микробной популяции. Безмикробные центрифугаты культуральной жидкости штаммов после стерилизующей фильтрации подвергали тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по молекулярной массе (НОММ) 100 кДа, концентрированию методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с НОММ 10 кДа. Далее фракцию, содержащую холерный токсин, осаждали 18,5% раствором соляной кислоты в присутствии 0,25% гексаметафосфата натрия при рН (4,2±0,1), центрифугировали, диализовали, подвергали дополнительной адсорбирующей фильтрации и хроматографической очистке.

Сравнительный анализ показал, что выход холерного токсина из штамма V. cholerae КМ68 был максимальным по сравнению с другими штаммами-продуцентами, а из штамма V. cholerae Р-18899 несколько меньше, чем из производственного штамма V. cholerae 569В (Таблица.). По своим характеристикам полученные антигены соответствовали препарату «Тест-токсин холерный» по показателям активности в пробе по Крейгу (Таблица.). Так, если нормируемая активность тест-токсина должна составлять не менее 1:16000 (0,006 мкг по белку), то активность холерного токсина из штамма V. cholerae Р-18899 была 1:20000 (0,005 мкг по белку), из штамма V. cholerae 569В была 1:40000 (0,0025 мкг по белку). Активность холерного токсина из штамма V. cholerae КМ68 была наибольшей 1:120000 (0,0008 мкг по белку).

Образцы XT анализировали в белковом SDS-PAGE с последующим иммунноблоттингом со специфической антихолерогенной сывороткой. В очищенных препаратах выявлены специфические полосы, характерные для токсина, выделенного по классическому способу (Mekalanos J.J. et al., 1978), показаны на фиг. 3 где М - маркеры молекулярного веса; 7 - XT V.cholerae 569В; 8 - XT V.cholerae Р-18899; 9 - XT V.cholerae KM68 и фиг. 4 где М - маркеры молекулярного веса; 10 - XT V.cholerae 569В; 11 - XT V.cholerae Р-18899; 12 - XT V.cholerae КМ68.

Таким образом, заявляемый способ позволяет получать препарат холерного токсина как из природных, так и генно-инженерных штаммов холерного вибриона.

В производстве холерной химической вакцины холерный токсин используется в качестве антигена для получения специфической кроличьей антихолерогенной сыворотки. Были получены сыворотки на токсины, выделенные заявляемым способом, из штаммов V. cholerae 569В и V. cholerae КМ68. Анализ сывороток показал их соответствие требованиям нормативной документации: содержание антитоксических единиц (АЕ) должно быть не менее 6400 АЕ на мл при отрицательной реакции диффузионной преципитации с О-антигеном холерного вибриона. Данный показатель для сыворотки на холерный токсин из штамма V. cholerae 569В составлял 16000 АЕ и 32000 АЕ для сыворотки на холерный токсин из штамма V. cholerae КМ68. Полученные сыворотки не взаимодействовали с О-антигеном холерного вибриона в реакции диффузионной преципитации. Высокая активность антихолерогенных сывороток свидетельствует об иммунобиологической активности препаратов «Тест-токсина холерного», полученных заявляемым методом.

Литература:

1. Алексеева, Л.П. Современные методические приемы очистки холерного токсина / Л.П. Алексеева, О.А. Якушева, В.П. Зюзина [и др.] // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2019. - Т. 15. - №1. - С. 5-10.

2. Комиссаров, А.В. Совершенствование технологии получения В-субъединицы холерного токсина / А.В. Комиссаров, С.А. Еремин, О.А. Волох [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2015. - №4. - С. 100-102.

3. Комиссаров, А.В. Способ получения холерогена-анатоксина / А.В. Комиссаров, С.А. Еремин, О.В. Громова [и др.] // Патент №2535122 РФ, МПК A61K 39/106 А61Р 31/04; 2014.

4. Приказ от 6.12.2021 г. №1122н об утверждении национального календаря профилактических прививок, календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям и порядка проведения профилактических прививок [Министерство здравоохранения Российской Федерации] [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://docs.cntd.ru/document/727605537?marker=6520IM (дата обращения 31.05.2022).

5. Распоряжение от 12.10.2019 N 2406-р (ред. от 30.03.2022) об утверждении перечня жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов, а также перечней лекарственных препаратов для медицинского применения и минимального ассортимента лекарственных препаратов, необходимых для оказания медицинской помощи [Правительство Российской Федерации] [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://government.ru/docs/38100/ (дата обращения 12.06.2022).

6. Jang, Н. Improved purification process for cholera toxin and its application to the quantification of residual toxin in cholera vaccines / H. Jang, H.S. Kim, J.A. Kim [et al.] / J. Microbiol Biotechnol. - 2009. - V. 19, №1. - P. 108 - 112.

7. Mekalanos, J.J. Purification of cholera toxin and its subunits: new methods of preparation and the use of hypertoxinogenic mutants / J.J. Mekalanos, R.J. Collier, W.R. Romig // Infect. Immun. - 1978. - Vol. 20, №2. - P. 552-558.

8. Zhang, R. The three-dimensional crystal structure of cholera toxin / R. Zhang, D. Scott, M. Westbrook [et al.] // J. Mol. Biol. - 1995. - V. 251, №4. - P. 563-573.

Claims (1)

1. Способ получения холерного токсина для контроля производства холерной химической вакцины, включающий глубинное культивирование штаммов-продуцентов, стерилизующую фильтрацию культуральной жидкости, осаждение белковой фракции, отличающийся тем, что холерный токсин выделяют последовательным применением тангенциальной ультрафильтрации для удаления примесей с молекулярной массой выше 100 кДа и концентрирования полученного фильтрата с дополнительной адсорбирующей фильтрацией через двуслойный фильтр с положительным зарядом и колоночной гель-хроматографией.

Images