RU2068270C1

RU2068270C1 - Антиген менингококков группы в

Info

Publication number: RU2068270C1
Application number: RU93002339A
Authority: RU
Inventors: И.А. Баснакьян; Н.В. Стукалова; Н.Н. Алексахина; В.Л. Львов; И.К. Вернер; В.И. Карабак; Т.А. Артемьева
Original assignee: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова; Институт иммунологии
Priority date: 1993-01-13
Filing date: 1993-01-13
Publication date: 1996-10-27

Abstract

Использование: биотехнология, липополисахарид, Neisseria meningitidis серогруппы В, антиген, вакцина. Сущность изобретения: антиген получают из клеток, выращенных в условиях управляемого непрерывного процесса культивирования Neisseria meningitidis серогруппы В штамма ГИСК N 125 в синтетической питательной среде, по методу Westphal & jann. Полученный липополисахарид отличается электрофоретической картиной, молекулярной массой, соотношением моносахаров в углеводной части молекулы, а также увеличением константы связывания антигена с антителом по сравнению с низкомолекулярными липополисахаридами. 2 табл. 1 ил.

Description

Изобретение относится к медицине, в частности, к липополисахаридам Neisseria meningitidis серогруппы В с разной молекулярной массой, как кандидатам будущей вакцины.

Известен менингококковый липополисахарид (ЛПС) Neisseria meningitidis серогруппы В штамма М 981 (Chao-Ming Tsai и соавт. 1983) (1) (прототип), который находится в наружной клеточной мембране менингококка и имеет гликолипидную природу.

Авторы этого исследования получали менингококковый ЛПС серогруппы В по методу Westphal Jann (1965) (2) с предварительной обработкой клеток Neisseria meningitidis, выращенных в колбах Fernbach в триптиказо-соевом бульоне при разном содержании кислорода в культуральной среде, которое определялось числом оборотов шейкера 140 об/мин и 90 об/мин, лизоцимом (Johnson K.G. Perry M.B.) (3). Полученный препарат ЛПС имел минимальное количество примесей: белка, нуклеиновых и сиаловых кислот при высоком содержании кетодезоксиоктановой кислоты (КДО) 9% по сухому весу препарата. С.-М. Tsai и соавт. определяли КДО по методу Osborn M.J. (1971) (4) с использованием тиобарбитуровой кислоты.

Авторы анализировали также полученные препараты ЛПС с помощью SDS/PAGE - электрофореза по системе Laemmli U.K. (1970) (5) с использованием 4М мочевины в 15% полиакриламидном разделяющем геле. Результаты SDS/PAGE показали, что препарат ЛПС имел один низкомолекулярный компонент при лимите кислорода и два низкомолекулярных компонента при избытке кислорода в культуральной среде. Мажорный компонент характеризовался молекулярной массой 4800±300 Д, а минорный 4300 Д. В качестве маркера использовали ЛПС Salmonella typhimurium.

С. -М. Tsai и соавт. определили моносахаридный состав полученных препаратов ЛПС. Для обнаружения нейтральных сахаров образцы ЛПС были гидролизованы в 0,16 N метасульфоновой кислоте с добавлением Dowex 50. Моносахара в гидролизатах определяли с помощью анализатора, как описано у Boykins R.A. T. Y. Liu (1980) (6). Для определения аминосахаров и этаноламина образцы гидролизовали в 2N метансульфоновой кислоте. Гексозамины и этаноламин были количественно определены на аминокислотном анализаторе Beckman model 121-М. Молевое соотношение моносахаров в молекуле ЛПС составило: Gal (0,7) GLC (3,8 ) Hep (2,0) GlcNH₂ (2,1) EtNH₂ (0,7).

Цель изобретения получить менингококковый серогруппы В липополисахарид, имеющий отличную от прототипа молекулярную массу.

Поставленная цель достигается тем, что при осуществлении управляемых процессов культивирования Neisseria meningitidis серогруппы В, из клеток менингококка мы получили препарат ЛПС, который отличается от вышеописанного, во-первых, электрофоретической картиной, во-вторых, молекулярной массой, в-третьих, соотношением моносахаров.

Пример N 1 описания липополисахарида.

Источник выделения липополисахаридов (ЛПС) с разной молекулярной массой
Neisseria meningitidis серогруппы В штамм N 125. Данный штамм селекционирован в НИИВиС им. И.И. Мечникова РАМН и депонирован в коллекцию патогенных бактерий Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича МЗ России от 6.VIII.84 г.

Культивирование культуры проводили в синтетической питательной среде в ферментере (7). Процесс выращивания был непрерывным при постоянно контролируемом уровне кислорода, рН среды и оптической плотности биомассы.

Препараты ЛПС получали из клеток менингококка по методу Westphal Jann (1965) (2).

Все полученные нами препараты ЛПС были охарактеризованы по химическому составу: содержание белка, нуклеиновых и сиаловых кислот. Белок определяли по методу Lowry O.H. (8), сиаловые кислоты по методу Svennerholm (9) в реакции с резорциновым реактивом, нуклеиновые кислоты по методу Спирина А.С. (10). 2-кето-3-деоксиоктановую кислоту (КДО) определяли по методу Anaker R. L. (11) с использованием тиобарбитуровой кислоты. На фиг. 1(а) представлена биохимическая характеристика в полном объеме препарата ЛПС. Как видно из полученных данных, ЛПС был загрязнен сопутствующими примесями в пределах от 0,03% до 2,38% что в свою очередь соответствует стандарту чистоты препарата ЛПС.

Молекулярные параметры очищенных препаратов ЛПС изучали с помощью гель-фильтрации на колонке с носителем сефакрил S-300 и S-400 ("Pharmacia", Швеция), используя элюирующий буфер следующего состава: 20 mM трис, 2 mM ЭДТА, 1% ДОХ-Na, pH 8,5. Колонки калибровали раствором, содержащим 0,2% голубой декстран м.в. 2000000Д ("Pharmacia", Швеция) и 0,5%-мертиолят м.в. 405Д ("Serva", США). В каждой полученной фракции определяли КДО при длине волны 550 нм и, на основании полученных данных, строили профили элюции соответственно при 550 нм, 254 нм и 280 нм, соответственно. На фиг. 1(б) представлены результаты гель-фильтрации препарата ЛПС. На основании этих данных можно заключить, что препарат ЛПС [фиг. 1(б)] имеет три пика элюции с Каv₁ 0; Kav₂ 0,2; Kav₃ 0,9.

На фиг. 1(в) отражены результаты электрофореза в ПААГ в системе Laemmli U.K. (1970) (5) при 3% концентрирующем геле и 12% разделяющем геле с последующим окрашиванием нитратом серебра по методу, описанному в работе Tsai C. -M. (1982) (1). Как видно из этой фиг. препарат ЛПС (фиг. 1) имеет не только общеизвестный низкомолекулярный компонент, но и 6-7 полос, расположенных над ним в определенной последовательности, имеющих углеводную природу с молекулярной массой (12±2,5> кД.

Для получения более убедительного подтверждения того факта, что найденные нами более высокомолекулярные полосы принадлежат молекуле менингококкового серогруппы В липополисахарида, нами было определено соотношение моносахаров. Для этого сначала проводили деградацию препаратов ЛПС с помощью 1% раствора уксусной кислоты при 100^oС в течение полутора часа. В результате мы имели липидную и углеводную части молекулы ЛПС. Водная часть состояла из углеводной части молекулы ЛПС. Эту часть наносили на колонку с пиридинацетатным буфером, а в качестве сорбента использовали ТСК-50 суперфайн. После проведения гель-фильтрации были получено 2 фракции: 1 фракция - низкомолекулярная углеводная коровая часть молекулы ЛПС, 2 фракция более высокомолекулярная часть.

Моносахаридный состав этих фракций определяли методом ХМС в виде ацетатов полиолов и были идентифицированы глюкоза Glc, галактоза Gal, гептоза - Нер, глюкозамин GlcNH₂ в соотношении, которое было различно для препаратов ЛПС с разной молекулярной массой. Полученные результаты по моносахаридному составу представлены в табл. 1.

Как видно из представленных в табл. 1 результатов, препараты ЛПС штамма N 125 с молекулярной массой 4-7 и 10-15 кД принципиально отличались по содержанию глюкозы и глюкозамина. Соотношение этих моносахаров было значительно выше, чем у ЛПС низкомолекулярного как штамма N 125, так и штамма М986.

Для определения иммуносерологических свойств полученного препарата ЛПС использовали метод иммуноферментного анализа (ИФА), на основании которого рассчитывали константу связывания антигена с антителом (Ксв.) по методике, изложенной в работе Сорокиной Н.В. и соавт. (1989) (12). В осуществлении данного этапа работы нам оказали помощь Ванеева Л.И. и Шкурина Е.А.- сотрудники лаборатории ИФА НИИВиС им. И.И. Мечникова. Полученные результаты представлены в табл. 2.

Согласно полученным данным следует, что значения Ксв. антигена с антителом увеличиваются с увеличением молекулярной массы менингококкового ЛПС.

Claims

Антиген менингокков группы В, характеризующийся следующими признаками:
обладает протективными и иммуногенными свойствами; выделен из штамма бактерий Neisseria meningitidis группы В ГИСК N 125; локализован в наружной клеточной мембране; выделен методом Westphal Jann с использованием экстракции целевого продукта (45 ± 1)%-ным раствором фенола при (65 ± 5)^oС; имеет минимальное количество примесей, по сухой массе клеток:
Белок 2,38 ± 1,40
Нуклеиновые кислоты 0,03 ± 0,09
Сиаловые кислоты 1,20 ± 1,29
При высоком содержании кетодезоксиоктановой кислоты (КДО) 9,40 ± 3,70% по сухой массе препарата;
мол. м. 12,5 ± 2,5 кДальтон (при определении электрофорезом в полиакриламидном геле);
моносахаридный состав: галактоза, клюкоза, гептоза и глюкозамин в молярном соотношении 3,4 8,6 2,0 7,7; константа связывания антигена с антителом в тесте иммуноферментного анализа составляет 0,68•10⁶ моль^-1.