RU1835294C - Способ получени энтеротоксина еSснеRIснIа coLI - Google Patents
Способ получени энтеротоксина еSснеRIснIа coLIInfo
- Publication number
- RU1835294C RU1835294C SU904896276A SU4896276A RU1835294C RU 1835294 C RU1835294 C RU 1835294C SU 904896276 A SU904896276 A SU 904896276A SU 4896276 A SU4896276 A SU 4896276A RU 1835294 C RU1835294 C RU 1835294C
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- enterotoxin
- thermostable
- methanol
- carried out
- benzylpenicillin
- Prior art date
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Использование: биотехнологи , получение пенициллоил-термостабильного энтеротоксина Е.coil-вакцины против колибакте- риоза и смешанной инфекции, колибактери- оз, рота-, коронавирусна инфекци . Сущность изобретени ; культуру E.coll, продуцирующую термостабильный энтероток- син, культивируют на среде А льде рете, Далее отдел ют бакмассу, а энтеротоксин осаждают из жидкой фазы культуральной жидкости метанолом . Полученный осадок концентрируют и очищают. Очищенный энтеротоксин конъю- гируют с бёнзилпенициллин -К-солью. Энтеротоксин защищает животных как от гомологичного так и гетерологичных штаммов E.coli, продуцирующих термостабильный знтеротоксин. 1 пр. 2 табл.
Description
Изобретение относитс к биотехнологиии касаетс способа получени конюъгированно- го термостабильного энтеротоксина кишечной палочки и может быть использован в производстве вакцинных препаратов против колибакте- риоза и смешанной инфекции (колибактериоз, рота-, коронавирусна инфекци ).
Целью изобретени вл етс значительное упрощение, ускорение способа получени конъюгированного иммуногенноактивного термрстабильного энтеротоксина E.coll, а также повышение его биологической активности.
Поставленна цель достигаетс тем, что культуру E.coli, продуцирующую термостабильный энтеротоксин, высевают на среду Альдерете, инкубируют в течение 20-24 часов при 37°С в услови х аэрации. Отдел ют бакмассу центрифугированием при 6000- 8000 об/мин в течение 30-40 мин при 2-4°С. Надосадочную жидкость, содержащую нативный энтеротоксин сливают в стерильную посуду и подвергают концентрированию и очистке.
К 1 мл раствора нативного термостабильного энтеротоксина приливают 4 мл метанола , перемешивают и центрифугируют 30-40 мин при 6000-8000 об/мин на холоду. Добавл ют 1 мл хлороформа. Верхний слой отбрасывают, а к нижней хлороформсодер- , жащей фазе приливают 0,3 мл метанола, перемешают и центрифугируют 30-40 мин при 6000-8000 об/мин, при 2-4°С. Отдел ют супернатант и высушивают осадок в потоке воздуха.
Проводит фракционирование суммарной белковой фракции термостабильного энтеротоксина E.col на хроматографиче- еских колонках с сефадексом G-25. Элюцию провод т 0,16 н NaCf. Концентрацию белка в выделенных фракци х определ ли с помощью спектрофотометра СФ-26 при 260 и 280 нм по методу Варбурга и Христиана.
Дл электрофоретического контрол гомогенности выделенного материала его раствор ют в 50 мкл фосфатно-солевого буфера, содержащего 5% ДСН.
(Л
с
со со с ю
SQ
Биологическую активность выделенных фракций определ ют путем постановки проб на мышатах-сосунах по методу Дина. Белковую фракцию обладающую максимальной биологической активностью концентрируют против ПЭГ, высушивают в потоке воздуха и используют дл конъюгации.
1,0 г термостабильного энтеротоксина E.coll развод т в 4-6 мл дистиллированной воды. (рН 7,0-7,2), Добавл ют 10 мл 1 М МаСОз(рН 10,2-10,4) и 10гбензилпеницил- лина-К-соли. Довод т рН до 9,6 5 М NaOH и если необходимо, добавл ют дистиллированную воду дл полного растворени пенициллина . По 5-6 г бензилпенициллина добавл ют через 12- и 24 часа. После каждого добавлени рН довод т до 11,0. Через 5-6 часов после последнего внесени пенициллина провод т диализ против 0,002 М фосфатно-солевого буфера с рН 8,0-8,2 в течение 20-24 часов, в 20-100 кратном объеме при 2/3 кратной смене буфера.
Концентрацию белка устанавливают с помощью спектрофотометра СФ-26 при 280 нм по методу Варбурга и Христиана.
Процент термостабильного энтеротоксина в конечном конъюгате определ ют по разнице концентраций белка до и после диализа. Полученный материал при необходимости концентрируют до 1/10 объема против ПЭГ,
Сопоставительный анализ за вл емого решени с прототипом показывает,что за вл емый способ отличаетс от известногр тем, что культивирование токсигенного штамма E.coli провод т на одной питательной среде, а не на трех, как в прототипе. Это существенно не вли ет на активность термостабильного энтеротоксина E.coll, но значительно сокращает врем его получени . Термостабильный энтеротоксин концентрируют и очищают быстрым и легкодоступным способом, в отличие от громоздкого трех-этап- ного процесса, что позвол ет максимально сохранить его активность и специфичность. Термостабильный энтеротоксин после концентрировани и очистки сохран ет свою целостность, в отличие от его производных в прототипе, что позвол ет полностью сохранить активность и специфичность его антигенных детерминант. При увеличении времени и усложнении методов очистки активность и специфичность термостабильного энтеротоксина значительно снижаетс , или требуетс создание дополнительных условий дл их стабилизации. В предлагаемом способе разработаны услови и подобраны оптимальные услови дл конъюгации термостабильного энтеротоксина с бензилпе- нициллин - К - солью.
Однородность полученного конъюгата подтверждают результатами диск-электрофореза в полиакриламидном геле.
Сравнение за вл емого технического решени с прототипом позволило установить соответствие его критерию новизна.
При изучении других известных технических решений в данной области признаки., отличающие за вленное изобретение от прототипа, не были вы влены и потому они обеспечивают за вл емому техническому решению соответствие критерию существенные отличи ,
о
5Способ осуществл етс следующим образом .
Пример, Культуру кишечной палочки выделенную от павшего животного, продуцирующую термостабильный энтеротоксин
0 высевают на питательную среду Альдерете и культивируют в течение 24 часов при 37°С в услови х аэрации. Жидкую культуру центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин при 2°С и получают надосадочную жид5 кость содержащую энтеротоксин. Надосадочную жидкость сливают в стерильную посуду и подвергают концентрации и очистке.
К 1 мл раствора нативного термостабильного энтеротоксинэ приливают 4 мл
0 метанола, перемешивают и центрифугируют 30 мин при 6000 об/мин «a холоду (2°С), добавл ют 1 мл хлороформа. Верхний слой отбрасывают, а к нижней хлороформсо- держзщей фазе приливают 0,3 мл метанола,
5 перемешивают и цинтрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин при 2.QC. Отдел ют супернатант и высушивают осадок в потоке воздуха.
Провод т фракционирование суммар0 ной белковой фракции термостабильного энтеротоксина E.coli на хроматографиче- ских колонках с сефадексом G-25. Элюцию провод т 0,15 н NaCI. Концентрацию белка в выделенных фракци х определ ют с по5 мощью спектрофотометра СФ-26 при 260 и 280 нм по методу Варбурга и Христиана.
Дл электрофоретического контрол гомогенности выделенных фракций их развод т в 50 мкл фосфатно-солевого буфера,
0 содержащего 5% ДСН.
Биологическую активность выделенных белковых фракций определ ют путем постановки проб на мышатах-сосунах по методу Дина.
5 Белковую фракцию обладающую максимальной биологической активностью концентрируют против ПЭГ и высушивают в потоке воздуха.
Раствор ют 1 г термостабильного энтеротоксина E.coli в 5 мл дистиллированной
воды рН 7,0. Добавл ют 10 мл 1 М МаСОз рН 10,4 и 10 г бензилпенициллина-К-соли. Довод т рН до 9.6 5 М NaOH и если необходимо , добавл ют дистиллированную воду дл полного растворени пенициллина. Через 6 часов провод т диализ против 0,002 М фос- фатно-солевого буфера с рН 8,0 в течение 20 часов в 60 кратном объеме при 2-х кратной смене буфера.
Концентрацию белка в конъюгате устанавливают по методу Варбурга и Христиана.
Процент термостабильного энтеротоксйна в конечном конъюгате определ ют по разнице концентраций белка до и после диализа. Полученный препарат при необходимости концентрируют до 1/10 объема против ПЭГ.
Однородность полученного конъюгата подтверждают результатами диск-электрофореза в полиакриламидном геле.
Контроль стерильности и безвредности полученного препарата осуществл ют по общеприн той методике.
Иммуногенность препарата вместе с адъ- ювантом (раствор гидроокиси алюмини )провер ют на белых мышах. Вакцинирующий препарат ввод т двукратно, подкожно, в дозе 0,3 и 0,5 мл с интервалом в 7 дней. Через 20 дней после второй прививки животных заражают летальными дозами термостабильного энтеротоксйна и культурами гомологичного и гетерологичнцх штаммов E.coli.
Вакцинированные животные в 95% случае про вл ют устойчивость против 2 ДЛМ токсинов и ЛДбо культур гомологичного штамма и в 80% случае защита составила против 2 ДЛМ токсинов и ЛДбо культур ге- терологичных штаммов E.coli.
В контрольных группах мыши, которых заражают 2 ДЛМ токсинов и ЛДзо культур, пали в 90% случаев.
Сенсибилизирующую активность препарата исследуют в тесте активной системной анафилаксии на морских свинках по методу Немова.
0
5
0
5
0
5
0
5
Предложенный способ получени энте- ротоксина E.coli проще известного способа более чем в 20 раз сокращает врем получени иммуногена, значительно уменьшает необходимые объемы реактивов и оборудовани дл получени препарата и существенно увеличивает биологическую активность термоетабиль- ного энтеротоксйна E.coli.
Полученный препарат обладает хорошо выраженными защитными свойствами против летальных доз термостабильного энте- ротоксика как гомологичного так и гетерологичных штаммов E.coli, Препарат безвреден и нетоксичен дл лабораторных животных, не анафилактогенен. Технологи его приготовлени сравнительно проста и значительно коротка по времени, не требует дорогосто щего оборудовани и реактивов.
Claims (1)
- Формула изобретениСпособ получени энтеротоксйна Escherichlacoll, включающий культивирование штамма-продуцента в жидкой питательной среде Альдерете, отделение токсиносодержа- щего суперматанта от бакмассы центрифугированием , концентрирование и очистку энтеротоксйна обработкой супернатанта метанолом и хлороформом, высушивание очищенного энтеротоксина, растворение его в воде, конъюгацию и диализ, отличающийс тем, что, с целью ускорени способа и увеличени биологической активности целевого продукта, центрифугирование провод т при 6000-8000 об/мин в течение 30-40 мин, обработку осуществл ют путем последовательного добавлени метанола, хлороформа и затем повторно метанола с центрифугированием при 2-4°С в течение 30-40 мин после каждого добавлени , конъюгацию ведут калиевой солью бензилпенициллина при соотношении 1:10- 1:30 при р-Н 9,6 в течение 20-24 ч, диализуют против 0,002 М фос- фатно-солевого буфера с рН 8,0-8,2 и концентрируют до 1/10 объема против по- лиэтиленгликол .Таблица 1Вли ние соотношени бензилпенициллин/термостабильный энтеротоксин на процент термостабильного энтеротоксина в конечном конъюгате и его иммуногенна активностьИммуногенна активность энтеротоксина Б;соИ ft сравнении с термостабильным энтеротоксином E.coli и прототипомПродолжение табл. . 1Таблица 2
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904896276A RU1835294C (ru) | 1990-12-25 | 1990-12-25 | Способ получени энтеротоксина еSснеRIснIа coLI |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904896276A RU1835294C (ru) | 1990-12-25 | 1990-12-25 | Способ получени энтеротоксина еSснеRIснIа coLI |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU1835294C true RU1835294C (ru) | 1993-08-23 |
Family
ID=21551985
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU904896276A RU1835294C (ru) | 1990-12-25 | 1990-12-25 | Способ получени энтеротоксина еSснеRIснIа coLI |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU1835294C (ru) |
-
1990
- 1990-12-25 RU SU904896276A patent/RU1835294C/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Патент US № 4411888, кл. А 61 К 39/108, .1988. . Патент US № 4314993, кл.А61 К39/108. 1987. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Morse | Isolation and properties of a surface antigen of Staphylococcus aureus | |
US4460575A (en) | Vaccinal complex containing a specific antigen and vaccine containing it | |
ES2611464T3 (es) | Polisacárido capsular bacteriano para su uso como vacuna o para su unión a proteínas en vacunas de conjugados | |
US20030077294A1 (en) | Antigenic preparations and isolation of such preparations | |
EP0041897B1 (en) | Polysaccharide antigen from streptococcus and vaccines | |
KR101617464B1 (ko) | Ipv―dpt 백신 | |
PL126748B1 (en) | Method of obtaining thermally stable derivative of e. coli enterotoxin | |
KR900007644B1 (ko) | 백일해 균의 배양 방법, 백일해 톡소이드 및 백일해 백신 | |
KR970002614B1 (ko) | 백일해 내독소의 제거방법, 백일해 톡소이드 및 그 제조방법 | |
JP2003515342A (ja) | シュードモナス・エルジノサ抗原 | |
CA1180291A (en) | Process for the production of immunobiological preparations applicable in the diagnosis, prevention and/or treatment of candida guilliermondii infections | |
CN105646681B (zh) | 一种奶牛金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗的制备方法及应用 | |
RU1835294C (ru) | Способ получени энтеротоксина еSснеRIснIа coLI | |
EP0180012A1 (de) | Immunogene Polypeptidsequenz des Hepatitis B-Virus | |
US4374827A (en) | Water soluble extract from nonpathogenic aerobic corynebacteria | |
RU2311197C1 (ru) | Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий | |
CN112641936B (zh) | 一种鹅星状病毒纤突蛋白脂质体疫苗及其制备方法和应用 | |
RU2230325C2 (ru) | Способ приготовления очищенного препарата ботулинического токсина типа а | |
US4228068A (en) | Peptide complexes of DNA-containing organisms | |
US3269913A (en) | Staphylococcal-immunizing products and methods for their production | |
RU2185191C1 (ru) | Способ получения антигенного препарата haemophilus influenzae типа b (hib) | |
JPS58109426A (ja) | サルモネラ菌による感染に対して有効な細菌ワクチンの製造法 | |
RU2537006C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPA-OPRFI, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК F-I НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ Pseudomonas aeruginosa, ШТАММ Escherichia coli PA-OPRFI-ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА F-I НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ Pseudomonas aeruginosa И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА F-I НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ Pseudomonas aeruginosa | |
SU1750690A1 (ru) | Способ получени конъюгированного энтеротоксина ЕSснеRIснIа coLI | |
RU2109519C1 (ru) | Способ изготовления вакцины против некробактериоза животных |