KR970002614B1 - 백일해 내독소의 제거방법, 백일해 톡소이드 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용없음.

Description

백일해 내독소의 제거방법, 백일해 톡소이드 및 그 제조방법

제 1 도 및 제 2 도는 각각 실시예 1에서의 인산칼슘 겔화 그룹과 대조 그룹의 수크로오스-구배 원심분리 프로파일을 도시한 것이다.

본 발명은 백일해(pertussis) 내독소의 제거방법, 백일해 톡소이드(toxoid) 및 그 제조방법에 관한 것이다.

백일해는 보데텔라 퍼터시스(Bordetella pertussis)에 의한 접촉성 전염병이며, 유아 및 소아에 심각한 전염병이다.

이 질병을 예방하기 위하여, 지금까지 백신이 사용되어 오고 있다. 그러나, 보데텔라 퍼터시스(B.pertussis) 균체 전체를 사용하여 제조된 백신은 열병과 같은 심한 부작용을 일으키며, 이러한 단점을 극복하기 위하여, 섬유상 헤마글루티닌(filamentous hemagglutinin : FHA), 백일해 독소(pertussis toxin:PT)및 핌브리아(fimbriae)와 같은 감염 방지 프랙션(antiinfective fraction)(이후, 때때로 '보호 프랙션'이라 지칭함)을 분리함으로서 발열 및 다른 부작용을 일으키는 주요 물질인 내독소(endotoxin:ET)를 실질적으로 제거한 비세포성 백일해 백신(acellular pertussis vaccine : ACP 백신)을 개발하여 사용해오고 있다.

ACP 백신의 제조에 있어서 가장 결정적인 단계는 감염방지 프랙션으로부터 내독소(ET)를 분리하는 단계이며, 일반적으로는 이러한 분리를 목적으로 수크로오스-구배 원심분리법이 사용되어 왔다(EPC 공고 번호 제0047802호에 대응하는 일본국 특허 공개 번호 제57-50925호).

더우기, 피로겐(발열원)을 제거하기 위한 기술로서 인산칼슘 겔을 사용하는 방법이 알려져 있다(일본 특허 공고 번호 제34-2149호). 또한, 인산칼슘 겔을 안정화시킨 히드록실에퍼타이트 겔은 백일해 독소(PT)로부터 섬유상 헤마글루티닌(FHA)의 분리에 있어서 효과적이라는 것이 알려져 있으며, 내독소-제거된(실질적으로 제거된) 섬유상 헤마글루티닌은 히드록실에퍼타이트 겔상에서의 크로마토그래피에 의해 백일해 독소로부터 분리된 다음, 친화도 크로마토그래피 및 수크로오스-구배 원심분리법(Japanese Journal of Bacteri-ology, 38(1),423,l983)에 의해 더욱 정제될 수 있다는 것도 알려져 있다.

수크로오스-구배 원심분리법 단독으로도 약 99.995%의 내독소(ET)를 제거할 수 있지만, 감염 방지 프랙션을 함유한 미정제 액체는 많은 양의 내독소(ET)를 가지고 있으므로, 내독소(ET)로부터 보호 프랙션을 완전히 분리하는 것은 성사되기 어려운 일이며, 따라서, 감염 방지 프랙션의 수율은 높지 않다. 더우기, 그 제조량이 적고 많은 비용 및 시간이 들므로, 상기 방법은 상업적 용도로는 바람직하지 못하다.

다른 한편으로, 인산칼슘 겔로 단순히 처리하는 것은 약 90-99.9%의 낮은 내독소 제거 비율만을 보장하므로, 실용적인 용도에 대해서는 유용하지 못하다. 히드록실에퍼타이트 컬럼 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 및 수크로오스-구배 원심분리법을 조합하는 것에 의해서, 백일해 독소(PT)로부터의 분리물중에 내독소가 상당히 제거된 섬유상 헤마글루티닌(FHA)올 분리 및 정제하는 것은 실험실 규모로는 가능하지만, 이러한 방법은 상업적으로 유용한 생산량을 확보할 수 없다. 더우기, 상기 방법에서 사용되는 기술은 객관적으로 볼때 보호 프랙션 및 내독소(ET)를 함유한 액체로부터 내독소(ET)를 제거하는 본 발명과는 다르다.

상기 종래의 기술에 대하여, 본 발명자들은 내독소(ET)를 제거하는 효율적인 방법을 탐색하였던 바, 수크로오스-구배 원심분리에 앞서서 인산칼슘 겔 처리를 한 결과, 내독소(ET)로부터 보호 프랙션이 대단히 양호하게 분리되며, 더우기, 그 생산량 및 내독소 제거율 모두에 있어서 수크로오스-밀도 원심분리법을 능가하는 개선이 이루어진다는 사실을 발견하였다. 이러한 발견으로 인해 더욱 연구하게 된 바, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 (1) 대상(帶狀) 원심분리(zonal centrifugation)에 의해 보데텔라 퍼터시스(Bordetellapertussis) 상(相) I 균주의 감염 방지 프랙션과 내독소를 함유한 액체로부터 내독소를 제거하는 방법에 있어서, 대상 원심분리에 앞서서 과잉의 인산염의 존재하에 상기 액체에 칼슘이온을 공급하고, 생성된 침전물을 분리 제거하는 방법에 관한 것이며: (2) 상기 방법에 의해 얻어진 감염 방지 프랙을 함유한 액체를해독(detoxification)시킴으로써, 백일해 톡소이드(toxoid)를 제조하는 방법에 관한 것이고: (3) 10μg의 단백질성 질소당 0.5ng 이하의 내독소 함량을 가진 백일해 톡소이드에 관한 것이다.

본 발명의 백일해 내독소 제거 방법에 의해, 내독소로부터 감염 방지 프랙션을 더욱 확실하고 순수하게 분리할 수 있으며, 그 결과로 보호 프랙션은 향상된 수율로 쉽게 분리할 수 있다. 더우기, 다량의 출발물질을 대상 원심분리할 수 있으므로, 높은 효율로 내독소가 제거된 백일해 톡소이드를 2배 이상으로 생산할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 산업적 가치는 상당한 것이다.

더욱이, 본 발명에 따른 백일해 톡소이드중의 내독소 함량은 종래의 톡소이드와 비교할때 1/10 미만이며, 본 발명의 백일해 톡소이드를 사용함으로서 종래의 백신과 동일한 면역학적 효능을 가지면서도 감소된 독성을 가진 백신을 공업적으로 제조할 수 있다.

보데텔라 퍼터시스(Bordetella pertussis) 상(相) I 균주의 감염 방지 프랙션 및 내독소를 함유한 상기 액체는, 예컨대, 보데텔라 퍼터시스(B. pertussis) 상 I 균주를 증식시켜 얻을 수 있는 육즙 배양물의 상칭액 또는 그 농축물일 수 있으며, 특히 그 농축물이 바람직하다. 보데텔라 퍼터시스(Bordetella pertussis) 상(相) I 균주의 배양은 종래의 방법으로 수행할 수 있다. 따라서, 예를들면, 이 유기체는 약 35-37℃에서 약 5-7일 동안 육즙 배지(Cohen-Wheeler 배지 또는 Stainer-Scholte 배지등)중에서 중식시킨다. 이렇게 얻어진 육즙 배양물의 상칭액을, 예컨대, 여과 또는 원심분리에 의해 수집한다. 이러한 상칭액은, 직접 또는 농축후에, 내독소의 제거를 위한 다음 단계로 들어간다. 이러한 목적을 위한 농축은, 공지되어 있는 염석 기술 그 자체를 사용하여 수행할 수 있다. 예를들면, 2-5kg의 황산암모늄을 각각 10ℓ의 배양 상칭액에 가하고, 예를들면, 여과 또는 원심분리에 의해 생성 침전물을 수집한 다음, 이러한 침전물올 적당한 양의 1M 염화나트륨-0.05M 인산염 완충 용액중에 용해시키고, 용액을 원심분리하거나, 그렇지 않으면, 상칭액을 분리하는 처리를 한다.

본 발명에 따른 내독소의 제거방법은, 과잉의 인산 이온 존재하에, 보데텔라 퍼터시스(Bordetella pertussis) 상(相) I 균주의 감염 방지 프랙션과 내독소를 함유한 액체에 칼슘이온을 공급하고, 생성된 침전물을 분리 제거한 다음, 모(母)액체를 대상(帶狀) 원심분리하는 단계로 구성된다.

인산이온이 액체 물질내에 존재하지 않는다면, 예컨대, 1M 염화나트륨으로 보충된 0.05M 인산염 완충용액과 같은 인산염 완충 용액을 상기 액체에 가한 다음, 칼슘이온을 공급한다. 공급되는 칼슘이온은 초산칼슘, 염화칼슘, 질산칼슘등과 같은 가용성 칼슘염 및, 인산칼슘등과 같은 불용성 칼슘염의 어느 것일 수 있다. 이중에서도, 특히 바람직한 것은 초산칼슘과 염화칼슘이다.

인산이온:칼슘이온의 비율은 칼슘이온 1당량에 대하여 인산이온 약 1.25-30당량, 바람직하게는 1.5-7.5당량이며, 약 0.01-0.1밀리당량/ml, 바람직하게는 약 0.02-0.07밀리당량/m1의 인산칼슘겔이 형성되도록 하는 것이 좋다.

전형적인 절차는 다음과 같다. 보데텔라 퍼터시스(Bordetella pertussis) 상(相) I 균주의 육즙 배양물의 상칭액을 황산암모늄염을 사용하여 분별 침전시켜 얻어진 침전물을 1M 염화나트륨-0.05M 인산염 완충 용액에 용해시키는 경우, 초산칼슘을 pH 약 6.5-9에서 약 0.1-1.0w/v%, 바람직하게는 0.2-0.6w/v%의 종말농도로 가하고, 이 혼합물을 약 20분-2시간 동안 약 4℃-실온에서 점진적으로 반응시킴으로써 인산칼슘겔을 형성한다. 반응후, 생성된 침전물을 여과 또는 원심분리법 등의 그 자체 공지의 방법으로 제거한다. 이러한 절차에 의해, 약 90-99.9%의 내독소가 보호 프랙션의 손실없이 선택적으로 제거될 수 있다.

상기 방법으로 얻어진 조정제물(semi-crude product)은 더욱 대상(帶狀) 원심분리 처리되며, 바람직하게는 황산 암모늄 염석(분별 침전)에 의해 더욱 농축시킨 후 대상 원심분리 처리한다.

본 발명에 따른 대상(帶狀) 원심분리는 수크로오스-구배 원심분리, 주석산 칼륨-밀도 원심분리, 염화 세슘-구배 원심분리의 어느 것이라도 무방하나, 수크로오스-구배 원심분리가 특히 바람직하다. 수크로오스-구배 원심분리의 보편적인 조건은, 밀도 구배:0-30w/w%; Rmax:약 60,000-122,000G: 시간:약10-24시간이다.

본 발명에 따라서 제조되는 백일해 감염 방지 프랙션을 함유한 액체는, 포름알데히드, 글루타르알데히드, 피루브알데히드 등으로 해독시킨 다음, 과잉의 포름알데히드, 글루타르알데히드, 피루브알데히드등은 투석, 원심분리 또는 한외 여과등과 같은 그 자체 공지된 방법으로 제거하여, 백일해 톡소이드를 얻는다. 일본국 특허 공개 공보 번호 소 57-50925호에 기재된 바와같이, 전형적인 추천할만한 해독 절차는, 염기성 아미노산(예, L-리신, 글리신 등)의 실질적인 부재(즉,10mM 이하) 하에 약 0.1-0.6v/v%의 수준으로 포름알데히드를 백일해 외독소(exotoxin)를 함유한 액체에 가하고, 그 혼합물을 약 3-14일 동안 약 32-42℃로 항온정치하여 솜털상 침강 반응(flocculation)시키고, 적합한 수단(예: 약 10-50킬로사이클로 초음파 처리)으로 솜털상 침강 톡소이드를 분열시킨 다음, 상기 톡소이드를 적당한 수성 매질(예; M/100-M/250 인산염 완충 식염수)에 현탁시켜, 톡소이드 액체를 얻는 단계로 구성되어 있다.

리뮬러스(limulus) 용균물 시험으로 측정한 바, 본 발명에 따르면,10㎍의 단백질성 질소당 0.5ng 이하, 바람직하게는 0.1ng 이하의 내독소 함량을 가전 백일해 톡소이드를 제조할 수 있다. 다시 말해서, 내독소 제거율을 적어도 99.9994%, 바람직하게는 적어도 99.9998%로 향상시킬 수 있다.

본 발명에 의한 백일해 톡소이드는 당해 분야에서 기존의 확립된 절차에 따라, 인간에 대한 예방 접종용의 침강된 백일해 백선 또는 침강된 백일해-디프로테리아-파상풍의 삼중 백신으로 제조될 수 있다.

[실시예]

하기의 참고예 및 실시예는 본 발명을 더욱 설명하기 위한 것이지, 본 발명을 제한하고자 기술하는 것이 아니다.

하기의 실시예 및 참고예에서 사용된 보데텔라 퍼터시스(Bordetella pertussis) 토하마(Tohama) 상(相) I 균주의 특성은 문헌[감염과 면역(Infection and Immunity), 6,899,(1972)]에 기술되어 있다. 이 균주는 일본국, 토오쿄오, 국립 보건소(NIHJ)에 보관되어 있으며, 또한 1980년 8월 13일 이래로 수탁 번호 IFO 14073으로 일본국, 오오사까, IFO(Institute for Fementation) 에 기탁되어 있다.

[참고예 1]

보데텔라 퍼터시스(Bordetella pertussis) 토하마 상(相) I 균주(IFO 14073)을 감자, 펩톤, 염화나트륨, 한천 및 송아지 혈액으로 제조한 보데트-겐고우(Bordet-Gengou) 배지상에 접종하고, 2일 동안 35℃에서 항온배양하였다. 그 다음, 반투명한 원형 콜로니를 채취하고, K 아글루티닌 항체에 반응하는 콜로니를 보데트-겐고우 배지에 다시 도말하여 종자 배양물을 제조하였다. 이 종자 배양물을 코헨-월러(Cohen-Wheeler) 육즙 배지에 이식하고, 1일 동안 35℃에서 배양하였다. 생성된 세균 현탁액을 약 10억개의 세포/m1의 최종 농도로 스테이너-스콜테(Stainer-Scholte) 육즙 배지에 가하고, 록스(Roux)병을 사용하여 5일동안 35℃에서 배양했다. 배양 육즙을 수집하고, 약 20w/v%의 황산 암모늄을 상칭액에 가하였다. 완전히 혼합한 후, 이들 혼합물을 4℃에서 정치하였다, 약 14일 후, 이 혼합물을 원심분리하고, 상칭액을 분리 제거하고 침전물을 수집했다. 그 다음, 1M 염화나트륨-0.05M 인산염 완충 용액(pH 8.0)을 수집 용액을 기준으로 1/10 부피로 침전물에 가하고, 그 혼합물을 잘 교반한 다음, 4일 동안 4℃에서 정치했다. 그 다음, 혼합물을 다시 원심분리하고, 상칭액(추출물 I)을 수집하였다. 이러한 추출물 I은 섬유상 헤마글루티닌(FHA)및 백일해 독소(PT) 뿐만 아니라 내독소를 함유한 보호 프랙션이 풍부했지만, 세포는 없었다.

이러한 추출물 I의 부분표본에 0,0.2,0.4,0.6,0.8 및 1.0w/v%의 최종 농도로 초산칼슘을 점진적으로 가하고, 각각의 혼합물을 약 1시간 동안 실온에서 부드럽게 교반한 다음, 생성된 침전물을 여과지를 사용하여 여과 제거하여 상칭액을 얻었다. 상기 방법으로 얻어진 각각의 상칭액을 사용하여 병아리 헤마글루티닌(HA) 역가, PT 함량 및 ET 함량을 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다. PT 함량은 ELISA로 분석하고, ET 함량은 표준으로서 대장균(E.coli) 내독소(Difco 055-B5)를 사용한 리뮬러스 용균물 방법(Mallinckrodt kit) 으로 분석 하였다.

ET는 과잉의 인산 이온의 존재하에 칼슘염을 공급하고 침전물을 분리 제거하는 단계에 의해서 선택적으로 제거할 수 있다는 것은 표 1로부터 명백하다. 더우기, 0.2-0.6w/v%의 초산칼슘음 첨가하므로써, 약 99%의 ET를 보호 프랙션(HA 역가 및 PT 함량)의 손실을 초래하지 않고 제거할 수 있다.

표 1

* HA 역가는 FHA 함량을 우세하게 반영한다.

[참고예 2]

pH를 수산화나트륨 또는 염산을 사용하여 5.0-10.0으로 조절하고, 초산칼슘을 0.5w/v%로 첨가한 것을 제외하고는, 참고예 1의 처리방법을 반복하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.

pH 6.0에서부터 겔화가 일어났으며, pH의 증가에 따라 내독소 제거율이 증가했다. 최적 pH가 7-9 라는것은 표 2로부터 명백하다.

표 2

[참고예 3]

5w/v%의 히드록실에퍼타이트(BDH)를 0.5w/v%의 초산칼슘 대신에 사용한 것을 제외하고는, 참고예 2의 처리방법을 반복하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.

용액내에서 인산칼슘 겔을 형성시키기 위해서 초산칼슘을 첨가한 것과 비교할때, 히드록실에퍼타이트를 첨가하면 내독소의 제거 효율은 더 낮아지고, 앞에서 언급한 pH 의존성의 반대 현상을 나타낸다는 사실은 표 3으로부터 명백하다.

표 3

[실시예 1]

참고예 1의 처리 방법으로 얻어진 각각의 추출물 I(대조 그룹)과, 0.5w/v%의 최종 농도로 초산칼슘을 추출물 I에 첨가한 다음 참고예 1에 기재된 바와 같이 혼합물을 처리하여 얻어진 물질을, 등부피의 황산암모늄 포화수용액과 혼합하고, 그 혼합물을 7일 동안 4℃에서 정치하였다. 이 황산 암모늄 침전 물질을 20분동안 10,000rpm으로 원심분리하고, 침전물을 수집하였다. 그 다음, 1M 염화나트륨-0.05M 인산염 완충용액(pH 8.0)을 상기 용액의 부피를 기준으로 약 1/300 부피로 가하였다. 철저히 교반한 후, 이 혼합물을 외부액체로서 1M 염화나트륨 용액(pH 8.0)을 사용하여 관내에서 투석시켰다. 투석물을, 수크로오스 밀도 구배=1-30w/w%, Rmax=69,400G 및, 시간= 약 18시간의 조건으로 수크로오스-구배 원심분리 하였다. 인산칼슘 겔화 그룹에 대한 부하(load)는 대조 그룹에 대한 부하에 비해 2배였다. 원심분리후, 분별 수집하기 위하여 34w/w% 수크로오스 용액을 로우터(roter)내로 공급하였다. 그렇게 수집된 각각의 프랙션을 ELISA에 의한 FHA 함량 및 참고예 1과 동일한 방법으로 PT 및 ET 함량에 대해 측정하였다. 그 결과를 제 1 도 및 제 2 도에 나타낸다. 이들 도면에서, FHA, PT 및 ET 함량을 각각 -○-,-△- 및 -■-로 나타냈다.

부하를 2배로 걸었음에도 불구하고, 인산칼슘 겔화 그룹은 대조 그룹보다도 내독소로부터 명백히 더욱 극명하게 보호 프랙션(FHA,PT)을 분리한다는 것을 제 1 도 및 제 2 도로부터 명백하다.

각각의 인산칼슘 그룹과 대조 그룹에서, ET 함량이 적고 FHA 함량이 많은 프랙션을 수집하고, 그것의 단백질성 질소 함량을 약 50μg/ml로 조절하였다. 이것에, 0.02w/v%의 젤라틴, 0.05w/v%의 Tween 80 및, 0.4v/v%의 포름알데히드를 가하고, 이 혼합물을 몇일 동안 39℃에서 항온처리하였다. 생성된 톡소이드액을 투석하고, ET 함량을 측정하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다. ET 함량은, 표준으로서 대장균(E. coli) 내독소를 사용한 리뮬러스 용균물 시험(Wako Pure Chemical kit)으로 분석하였다.

백신 레벨(단백질성 질소함량 10μg/ml)에서의 백일해 톡소이드 원액의 ET 함량을 비교할때, 인산칼슘겔화 그룹내의 ET 함량은 대조 그룹 함량의 1/40 미만으로 개선되었다는 사실은 표 4로부터 명백하다.

표 4

* 괄호안의 숫자는 10ng/ml의 단백질성 질소당 내독소의 함량을 나타낸다.

[실시예 2]

Levine에 의한 원래의 방법(Reo Levine, Joseph L. Stone & Louise Wyman:Factors affecting the efficiency of the aluminum adjuvant in diphtheria and tetanus toxoids. J.Immunology 75, 301-307,1955)에 따라서, 각각 2뱃치의 백일해 톡소이드 원액을 M/250 인산염 완충 염수(pH 7.0)를 사용하여 약 10μg/ml의 단백질성 질소 함량이 되도록 희석시킨 다음, 0.18w/v%의 최종 농도로 염화알루미늄을 첨가하였다. 이 혼합물을 잘 교반하고, 염산 또는 수산화 나트륨으로 pH 7.0으로 조절하여 약 0.2mg/l의 알루미늄-흡착 백신을 제조하였다.

이 백신의 주된 성질은 다음과 같다: pH가 7.0, 토끼의 발연성은 음성, 마우스의 체중 감소율이 10BWDU/ml 또는 그 이하, 마우스의 백혈구 증가율은 0.5 LPU/ml 또는 그 이하, 마우스의 히스타민 감응도가 0.8 HSU/ml 또는 그 이하 및, 백일해 톡소이드 효능이 8 IU/ml 또는 그 이상이다. 따라서, 상기한 2 뱃치 모두는 생물학적 생성물의 기준(Standard of Biological Products)에 특정되어 있는 기준치를 충족시키고 있다.

Claims (16)

1. 보데텔라 퍼터시스(Bordetella pertussis) 상(相) I 균주의 감염 방지 프랙션(antiinfective fraction) 및 내독소(endotoxin) 함유액으로부터 대상(帶狀) 원심분리에 의하여 내독소를 제거하는 방법에 있어서, 대상(帶狀) 원심분리에 앞서서, 상기의 액체에 과잉의 인산 이온의 존재하에 칼슘이온을 공급하고, 생성되는 침전을 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 칼슘이온에 대한 인산 이온의 비율이 칼슘이온 1당량에 대하여 인산 이온 약 1.25-30당량인 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 칼슘이온 1당량에 대하여 인산 이온 약1.5-7.5당량의 비율인 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 공급되는 칼슘이온이 초산칼슘 또는 염화칼슘의 칼슘이온인 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 생성되는 침전이 약 0.01-0.1밀리당량/ml의 인산칼슘 겔인 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 생성되는 침전이 약 0.02-0.07밀리당량/ml의 인산칼슘 겔인 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 생성되는 침전을 약 4℃-실온의 온도 범위 및 약 6.5-9의 pH 범위에서 약 20분-2시간에 걸쳐서 서서히 형성시키는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 생성되는 침전이 보데텔라 퍼터시스(Bordetella pertussis) 상(相) I 균주의 육즙 배양물중 상칭액을 황산 암모늄을 사용하여 분별 침전시켜 얻은 침전을 1M 염화 나트륨-0.05M 인산염 완충용액중에 용해시키고, 초산칼슘을 약 6.5-9의 pH에서 약 0.1-1.0w/v%의 종말 농도가 되도록 상기 용액에 첨가하며, 이 혼합물을 약 4℃-실온에서 약 20분-2시간 동안 서서히 반응하도록 하는 단계들에 의해서 산출되는 인산칼슘 겔인 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 첨가되는 초산칼슘의 종말 농도가 약 0.2-0.6w/v%인 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 대상(帶狀) 원심분리가 수크로오스-구배 원심분리인 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 수크로오스-구배 원심분리를, 밀도 구배:0-30w/w%: Rmax:약 60,000-122,000G: 시간:약 10-24시간의 조전하에서 수행하는 방법.
12. 제 1 항에 따른 방법에 의하여 얻어지는 감염 방지 프랙션 함유액을 해독(detoxification)시키는 것을 특징으로 하는 백일해 톡소이드(toxoid)의 제조방법.
13. 제 12 항에 있어서, a) 보데텔라 퍼터시스(Bordetella pertusssis) 상(相) I 균주의 육즙 배양물중 상칭액을 황산 암모늄을 사용하여 분별 침전시켜 얻은 침전을 1M 염화나트륨-0.05M 인산염 완충 용액중에 용해시키는 단계, b) 초산칼슘을 약 6.5-9의 pH에서 약 0.2-0.6w/v%의 종말 농도가 되도록 상기 용액에 첨가하는 단계, c) 이 혼합물을 약 4℃-실온에서 약 20분-2시간 동안 서서히 반응시키는 단계, d) 생성되는 인산칼슘 겔을 제거한 다음, 수크로오스-구배:0-30w/w%; Rmax:약 60,000-122,000 G; 시간:약 10-24시간의 조건하에 수크로오스-밀도구배 원심분리하여 얻은 감염 방지 프랙션 함유액에, 염기성 아미노산의 실질적인 부재하에, 포름알데히드를 약 0.1-0.6v/v%의 수준으로 첨가하는 단계, e) 이 혼합물을 약 32-42℃에서 약 3-14일간 항온정치하여 솜털상 침강 반응(flocculation)시키는 단계, f) 솜털상으로 침강된 톡소이드를 분열시키는 단계, g) 상기 톡소이드를 수성 매질에 현탁시키는 단계를 포함하는 제조방법.
14. 10μg의 단백질성 질소당 내독소 함량이 0.5ng 이하인 백일해 톡소이드.
15. 제 14 항에 있어서,10㎍의 단백질성 질소당 내독소 함량이 0.lng 이하인 백일해 톡소이드.
16. 제 14 항에 있어서, 제 13 항의 방법에 의해서 제조되는 백일해 톡소이드.

Images