WO2011043696A1 - Способ получения iga1 протеазы из культуры n. меningiтidis серогруппы а и поливалентный вакцинный препарат для профилактики инфекции, вызываемой бактериями n. меningiтidis серогрупп а и в - Google Patents

Способ получения iga1 протеазы из культуры n. меningiтidis серогруппы а и поливалентный вакцинный препарат для профилактики инфекции, вызываемой бактериями n. меningiтidis серогрупп а и в Download PDF

Info

Publication number
WO2011043696A1
WO2011043696A1 PCT/RU2010/000541 RU2010000541W WO2011043696A1 WO 2011043696 A1 WO2011043696 A1 WO 2011043696A1 RU 2010000541 W RU2010000541 W RU 2010000541W WO 2011043696 A1 WO2011043696 A1 WO 2011043696A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture
cetavlon
meningitidis
precipitate
igal
Prior art date
Application number
PCT/RU2010/000541
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Александр Павлович АЛЛИЛУЕВ
Лев Давыдович РУМШ
Елена Юрьевна ЯГУДАЕВА
Лариса Стефановна ЖИГИС
Леонид Васильевич КОЗЛОВ
Ольга Викторовна КОТЕЛЬНИКОВА
Вера Сергеевна ЗУЕВА
Ольга Алексеевна РАЗГУЛЯЕВА
Эдвард Эдуардович МЕЛЬНИКОВ
Анна Мироновна БИЧУЧЕР
Виталий Павлович ЗУБОВ
Ирина Викторовна АНОХИНА
Анатолий Эдуардович ABAKOB
Original Assignee
Alliluev Aleksandr Pavlovich
Roumsh Lev Davydovich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alliluev Aleksandr Pavlovich, Roumsh Lev Davydovich filed Critical Alliluev Aleksandr Pavlovich
Publication of WO2011043696A1 publication Critical patent/WO2011043696A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to microbiology, immunochemistry and vaccinology, in particular to the production and purification of IgAl protease, which can be used both as an independent drug and for the preparation of a meningococcal multivalent vaccine.
  • IgAl protease of meningococci Various methods have been described for the production of IgAl protease of meningococci.
  • Application (WO9011367, M. KILIAN et al., 04.10.1990) describes a method for producing a meningococcal recombinant IgAl protease and fragments thereof obtained by cloning an IgAl protease gene from a microorganism, especially N. influenzae serotype B and N. meningitidis strain HF13, in E. coli cells.
  • the patent also describes the preparation of an IgAl fragment of a protease that is used as a carrier peptide.
  • the synthesis of an IgAl protease fragment containing from 40 to 200 amino acid residues and including 40 amino acid residues of the sequence SEQ ID ⁇ : 1 is described using an automatic synthesizer.
  • the protease when conjugated with an IgAl polysaccharide, the protease provides protection only against serogroup C meningococcus and is not effective against serogroup B meningococcus.
  • the patent (US7407653, Plaut et al., 08/05/2008) describes the use of bacterial IgAl proteases for the treatment of diseases associated with IgAl deposits in tissues and organs of the body.
  • Soluble IgAl proteases containing various labels, for example, a polyhistidine fragment get recombinant method.
  • the enzyme is isolated by a known method using ultrafiltration, ion exchange and metal chelate chromatography.
  • the resulting enzymes can be used to obtain therapeutic agents intended for the treatment of diseases associated with the accumulation of IgA.
  • the yield of the active enzyme is not given, although it is indicated that approximately 20 L of culture medium containing recombinant IgAl protease is used for isolation.
  • a method for isolating an IgAl protease is also described (MS Blake and C. Eastby. Studies on the gonococcal IgAl-protease II. Improved methods of enzyme purification and production of monoclonal antibodies to the enzyme, J. Immunol. Meth., 1991, 144, 215- 221), including fractionation of the culture fluid containing IgAl-protease, chromatography on phenyl-sepharose, then on an Mono S ion-exchange column. The supernatant obtained by centrifuging the culture fluid after biomass growth of N. meningitidis or N. gonorrhoeae was applied to a phenyl-column sepharose. Fractions with enzymatic activity were pooled and applied onto a Mono S column to provide highly purified IgAl protease in 0.4 mg yield from 1 L of culture fluid.
  • meningococcal IgAl protease preparation, properties, application prospects. // Vestnik RAMS, 2001, ° 5, pp. 39-42 .
  • the protease was isolated from Hottinger broth, on which N. meningitidis culture was grown. Cells were removed by centrifugation and the enzyme was isolated by salting out (NH 4 ) 2 S0 4 , hydrophobic chromatography on phenyl-sepharose, chromatography on an ion-exchange medium and ultrafiltration, followed by freeze drying. The yield of purified enzyme was 1-2 mg from 50 l of culture fluid.
  • the closest analogue of the first invention of the group is a method for producing a meningococcal IgAl protease (see V. I. Surovtsev et al. Obtaining an IgAl protease secreted by Neisseria meningitidis II cells Biotechnology. 2006, No. 3, P. 62-67 - prototype). The technology for the production of highly purified meningococcal IgAl protease is described.
  • the method is based on the cultivation of bacteria in the culture fluid and its concentration, use for purification of IgAl chromatography proteases on C-80 silochrome, hydrophobic chromatography on phenyl-Sepharose and gel filtration on Sepharose CL 6B-200.
  • the yield of purified enzyme was 15.0 mg from 50 L of culture fluid.
  • this method is complex and uses multi-stage inactivation of the pathogen using an antibiotic, thiolate and EDTA.
  • Vaccines for the prevention of meningococcal infections are described. So in the patent (RU2333007 C2, PIZZA, NOVARTIS VEXINES AND DAIEGNOSTICS S.R.L. (IT), 09/10/2008) a vaccine is described which, after administration, is able to induce a humoral immune response and protect the body against some highly virulent strains (A4, ET5 ) N. meningitidis serogroup B. Five protein antigens of the outer membrane are used, in particular: (1) NadA protein; (2) the protein "741"; (3) protein "936”; (4) protein "953” and (5) protein "287".
  • proteins with established amino acid sequences are described, obtained from bacteria mainly of strains A and B, which exhibit antigen properties. Proteins can be used as antigens for the production of specific antibodies and the manufacture of compositions for the treatment, prevention, or diagnosis of infection caused by N. meningitidis.
  • Compositions prepared on the basis of a protein, nucleic acid fragments or antibodies with the addition of a pharmaceutically acceptable carrier are vaccine, diagnostic or pharmaceutical preparations.
  • the invention (RU2361609 C2, GIULIANI et al., July 20, 2009) provides a vaccine composition having immunogenic activity against serogroups B and C of N. meningitidis containing an immunogenic amount of oligosaccharide N. meningitidis serogroup C, the outer membrane protein of serogroup B meningococcus in the form of protein-lipid vesicles.
  • the specified composition provides high titers of antibodies, determined by ELISA, and bactericidal antibodies, which may find application as a protective vaccine against N. meningitidis serogroups B and C.
  • the objective of the invention is to improve the method of producing meningococcal IgAl protease and the creation of a multivalent vaccine preparation based on a non-polysaccharide nature to protect against infection not only by meningococcus serogroup A, but also from infection by meningococcus serogroup B.
  • the method of producing IgAl protease from N. meningitidis consists in growing a culture of N. meningitidis serogroup A strain A 208, followed by inactivation of the culture fluid and sedimentation of the microbial mass by centrifugation, isolation of the IgAl protease by purification, including ultrafiltration, absorption column chromatography on silochrome-80 sorbents and phenyl-sepharose, concentration and freeze drying of the product.
  • the patented method is characterized in that a modified Franz nutrient medium is used to grow N. meningitidis serogroup A culture, microorganisms are inactivated by adding cetavlon to the culture fluid to a final concentration of 0.1%. The resulting mixture was separated by centrifugation, and both fractions — the cetavlon supernatant and the cetavlon precipitate — were used to isolate the IgAl protease. The resulting precipitate was extracted many times, the extracts of the precipitate and the supernatant were concentrated by ultrafiltration.
  • the obtained concentrates are fractionated by absorption chromatography on a column with a silochrome-80 sorbent at a temperature of + 8 ° ⁇ balanced by 0.02 M phosphate-buffered saline, pH 7.0, whereby the IgAl protease is obtained by washing the sorbent with the indicated buffer solution.
  • a multivalent vaccine preparation for the prevention of infection caused by bacteria N. meningitidis serogroups A and B contains an IgAl protease derived from a culture of N. meningitidis serogroup A.
  • the technical result of the first invention of the group is to simplify the method by replacing the multi-stage inactivation of the pathogen using an antibiotic, merthiolate and EDTA with a single-stage treatment with cetavlon, eliminating the stage of gel permeation chromatography and increasing the environmental safety of this process as a whole.
  • the technical result of the second invention of the group is to obtain a vaccine of non-polysaccharide nature or its component to protect against infection not only meningococcus serogroup A, but also meningococcus serogroup B. This possibility was first established experimentally by the authors of the application and does not follow from the prior art.
  • FIG. 1 - the results of chromatography of the supernatant in the first stage
  • FIG. 2 - chromatography results of the supernatant in the second stage
  • FIG. 3 results of protein electrophoresis in PAGE of samples containing IgAl protease before and after chromatography
  • FIG. 4 dynamics of the formation of antibodies to IgAl protease
  • FIG. 5 protection of mice immunized with IgAl protease from infection with serogroup B meningococcus
  • FIG. 6 bacteremia level in mice immunized with IgAl protease, 4 hours after infection with serogroup B meningococcus.
  • N. meningitidis serogroup A strain A 208 L. A. Tarasevich Institute for Standardization and Control of Medical and Biological Preparations
  • bottles containing Franz’s modified semi-synthetic medium see Frantz ID Growth requirements of the meningococcus. - J. Bacteriol.-1942.-N6.-P.757-761; US4123520, Hagopian, et al., 10.31.1978; Kuvakina V.I. Meningococcal polysaccharide vaccines of groups A and C. // Diss. Doct. biol. N., Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology. G.N.Gabrichevsky, M., 1989).
  • the bottles with the culture fluid which is a suspension of bacteria in Franz’s medium, are incubated at a temperature of 37 ⁇ 1 ° C with constant shaking for 12-16 hours. Then the contents of the bottles are combined and a 10% solution of cetavlon (hexadecyltrimethylammonium bromide, cetavlon) is added to a final concentration of 0.1% in suspension, the suspension is thoroughly mixed and kept at room temperature for 2-3 hours. The resulting mixture is separated by centrifugation to obtain cetavlon supernatant and cetavlon sediment.
  • cetavlon hexadecyltrimethylammonium bromide
  • the indicated supernatant in an amount of 2.5 l was concentrated 10 times by ultrafiltration on a Halipor-1 membrane with a nominal cut-off molecular weight of 65 kDa, and then several times washed with water from salts and reagents by diafiltration on the specified membrane.
  • the result was 35 ml of concentrate with a total protein content of 55 mg and an enzymatic activity of 0.775 thousand units / mg (see table. 1).
  • the resulting concentrate (35 ml) was dialyzed against the initial buffer solution I (see below) for chromatography on silochrome (2.0 L).
  • the resulting concentrate in an amount of 35 ml was further fractionated by two-stage column chromatography.
  • this concentrate was applied to a column with a volume of 70 ml (30x130 mm) filled with a silochrome-80 sorbent and balanced with 0.02 M FSB, pH 7.0 (phosphate-buffered saline, initial buffer solution I).
  • Fraction 1 obtained after the first purification step and containing an active IgAl protease (volume 35 ml, protein content 0.385 mg, enzymatic activity 47.3 thousand units / mg, protein yield 0.001%, purification 61) was purified by hydrophobic chromatography (second purification step) on a column (10x90 mm) with 5 ml phenyl-Sepharose, balanced with a buffer solution of 0.05 M Tris-HCl, pH 9.2, containing 0.7 M ammonium sulfate (initial buffer solution II).
  • the specified fraction was concentrated by ultrafiltration to a volume of 2–3 ml, ammonium sulfate was added to it to a concentration of 0.7 M, and the resulting solution was applied to a column.
  • IgAl protease was eluted by washing the column with demineralized water. The enzymatic activity of IgAl protease with high specificity was found only in fractions 1–3 (protein content 0.012 mg, protein yield 0.0004%, enzymatic activity 640 thousand units / mg, purification degree 824). The results are presented in FIG. 2 and in table 2.
  • the results of chromatography on silochrome indicate a change in the properties of the enzyme compared with the properties described in the prototype article (V.I. Surovtsev et al., // Biotechnology. - 2006. - N 3. - P. 62- 67), due to the presence of cetavlon, a surfactant, in the starting material.
  • the isolated enzyme is not adsorbed on silochrome and elutes in the initial buffer solution, while a significant part of the impurities is adsorbed on silochrome and eluted in these solutions.
  • the advantage of the precipitate is that it can be stored frozen at a low temperature of -80 ° C for a long time, and used both for the production of polysaccharide meningococcal vaccine and purified IgAl protease.
  • about 24% of the IgAl protease activity is calculated as a precipitate based on the total IgAl protease activity in the starting culture fluid.
  • IgAl protease preparations obtained during purification were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis in Na dodecyl sulfate (EP in SDS page - SDS, reducing conditions, manifestation by silver - see Fig. 3), and enzymatic activity was determined (see tables 1,2 )) by enzyme immunoassay for IgAl protease.
  • FIG. Figure 3 presents the results of protein electrophoresis in PAGE of samples containing IgAl protease before and after chromatography.
  • Cetavlon supernatant lane / - source, 2 - fr. 1; 3 - fr. 3 (phenyl-sepharose).
  • Cetavlon sediment 4 - initial extract, 5 - fr. 1, 6 - fr. 2; 7 - fr. 3 (silochrome); 8 - fr. 1-1; 9 - fr. 1-2; 10 - fr. 1-3 (phenyl-sepharose).
  • Lane 11 is a control mixture of HMW marker proteins with molecular weights of 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 30, 15 and 10 kDa.
  • the results of electrophoresis indicate that the obtained preparation of the present invention contains IgAl protease with a molecular weight of -120 kDa and low molecular weight impurities in much smaller quantities.
  • the presence of such impurities can be explained by the fact that, according to published data (see, for example, WO9011367), the IgAl protease can be cleaved into lower molecular fragments during the purification process, which also have enzymatic activity.
  • RESULTS The immunogenic and protective activity of the obtained IgAl protease was evaluated in Balb / C mice. To evaluate these parameters, animals were immunized with IgAl protease twice intravenously with an interval of 45 days.
  • mice For the first immunization of mice at a dose of 10 ⁇ g / mouse, a preparation was used obtained after the second extraction of cetavlon sediment and chromatography on C-80 silochrome, dialysis and freeze drying (100 ⁇ g IgA protease, with an enzymatic activity of ZLO 5 u / mg). For mice reimmunization, a preparation obtained after two-step chromatography (195 ⁇ g IgAl protease with activity 5.36.10 5 u / mg) in the same dose was used.
  • An indicator of the immunogenicity of the obtained IgAl protease was the increase in specific antibodies determined by ELISA in the blood of mice on various days after immunization.
  • mice On the 12th day after reimmunization, the mice were infected with a live virulent culture of meningococcus serogroup B strain H44 / 47.
  • IgAl proteases The protective activity of IgAl proteases was evaluated by the level of bacteremia in immunized animals 4 hours after infection with serogroup B meningococcus, as well as by the number of animals surviving on the 5th day after infection, compared with the same indicators for control non-immunized mice.
  • FIG. 4 shows a diagram of the immunogenic activity of IgAl protease.
  • the numbers indicate the period after immunization: 1 - 6th day; 2 - 13th day; 3 - 20th day; 4 - 28th day; 5 - 35th day and 6 - 41st day after the first immunization, respectively; 7 - 12th day after re-immunization; 8 - control group.
  • FIG. Figure 5 shows the bacteremia level (in%) in immunized mice (shaded bar) compared with control, non-immunized animals (black bar).
  • the bacteremia level in the group of immunized mice was reduced by 35% (65 CFU) compared to control non-immunized mice (100 CFU).
  • FIG. Figure 6 shows the protection of mice from infection by serogroup B meningococcus.
  • immunized mice shaded column
  • control black.
  • mice were infected with meningococcus at a dose of 25-10 4 microbial cells in the control group only one animal out of 10 (10%) survived, while in the group immunized with IgAl protease, 9 mice survived (90%).

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Способ получения IgA1 протеазы из N. meningitidis состоит в выращивании культуры N. meningitidis серогруппы А (штамм А 208) на модифицированной питательной среде Франца, с последующей инактивацией культуральной жидкости цетавлоном и осаждением микробной массы центрифугированием, выделением IgA1 протеазы путем очистки, включающей ультрафильтрацию, абсорбционную колоночную хроматографию на сорбентах cилoxpoм-80 и фенил-сефарозе, концентрирование и лиофильное высушивание продукта. Используют обе фракции - цетавлоновый супернатант и цетавлоновый осадок. Полученный осадок многократно экстрагируют, экстракты осадка и супернатант концентрируют методом ультрафильтрации. Полученные концентраты фракционируют методом абсорбционной хроматографии на колонке с сорбентом cилoxpoм-80, уравновешенной 0,02 M фосфатно-солевым буферным раствором, причем IgA1 протеазу получают при промывке сорбента указанным буферным раствором. С использованием выделенной IgA1 протеазы из N. meningitidis получен поливалентный вакцинный препарат для профилактики инфекции, вызываемой бактериями N. meningitidis серогрупп А и В.

Description

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ IgAl ПРОТЕАЗЫ ИЗ КУЛЬТУРЫ
N MENINGITIDIS СЕРОГРУППЫ А И ПОЛИВАЛЕНТНЫЙ ВАКЦИННЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ
БАКТЕРИЯМИ N. MENINGITIDIS СЕРОГРУПП А И В
Область техники
Изобретение относится к микробиологии, иммунохимии и вакцинологии, а именно к получению и очистке IgAl протеазы, которая может быть использована как самостоятельный препарат, так и для приготовления менингококковой поливалентной вакцины.
Предшествующий уровень техники
Описаны различные способы получения IgAl протеазы менингококков. В заявке (WO9011367, KILIAN М. et al., 04.10.1990) описан способ получения менингококковой рекомбинантной IgAl протеазы и ее фрагментов, полученных при клонировании гена IgAl протеазы из микроорганизма, прежде всего Н. influenzae серотипа В и N. meningitidis штамма HF13, в клетках Е. coli. Предполагается, что указанный рекомбинантный фермент и его фрагменты можно использовать для получения вакцин, предназначенных для профилактики менингита всех типов менингококка и гонококка, однако не приводится данных по иммуногенной или протективной активности полученных препаратов фермента.
В патенте (US7235242, Achtman, et al., 26.06.2007) также описано получение фрагмента IgAl протеазы, который используют в качестве пептида-носителя. Описан синтез фрагмента IgAl протеазы, содержащего от 40 до 200 аминокислотных остатков и включающего 40 аминокислотных остатков последовательности SEQ ID ΝΟ:1, с использованием автоматического синтезатора. Однако при конъюгации с полисахаридом IgAl протеаза обеспечивает защиту только от менингококка серогруппы С и не эффективна против менингококков серогруппы В.
В патенте (US7407653, Plaut et al., 05.08.2008) описано применение бактериальных IgAl протеаз для лечения заболеваний, связанных с отложениями IgAl в тканях и органах организма. Растворимые IgAl протеазы, содержащие различные метки, например, полигистидиновый фрагмент, получают рекомбинантным способом. Фермент выделяют по известной методике с использованием ультрафильтрации, ионообменной и металл-хелатной хроматографии. Полученные ферменты можно использовать для получения терапевтических агентов, предназначенных для лечения заболеваний, связанных с накоплением IgA. Однако не приводится выход активного фермента, хотя указано, что для выделения используют приблизительно 20 л культуральной среды, содержащей рекомбинантную IgAl протеазу.
Описан также способ выделения IgAl протеазы (M.S. Blake and C.Eastby. Studies on the gonococcal IgAl -protease II. Improved methods of enzyme purification and production of monoclonal antibodies to the enzyme, J. Immunol. Meth., 1991, 144, 215-221), включающий фракционирование культуральной жидкости, содержащей IgAl -протеазу, хроматографией на фенил-сефарозе, затем на ионообменной колонке Mono S. Супернатант, полученный при центрифугировании культуральной жидкости после наращивания биомассы N. meningitidis или N. gonorrhoeae, наносили на колонку с фенил-сефарозой. Фракции, обладающие ферментативной активностью, объединяли и наносили на колонку Mono S, при этом получали высокоочищенную IgAl протеазу с выходом 0,4 мг из 1 л культуральной жидкости.
Описаны другие способы получения менингококковой IgAl протеазы (см., например, В.И.Суровцев и др., Бактериальные IgAl протеазы: получение, свойства, перспективы применения. // Вестник РАМН, 2001, Ν° 5, с. 39-42). Протеазу выделяли из бульона Хоттингера, на котором выращивали культуру N. meningitidis. Клетки удаляли центрифугированием и фермент выделяли высаливанием (NH4)2S04, гидрофобной хроматографией на фенил-сефарозе, хроматографией на ионообменном носителе и ультрафильтрацией с последующим лиофильным высушиванием. Выход очищенного фермента составлял 1-2 мг из 50 л культуральной жидкости.
Наиболее близким аналогом первого изобретения группы является способ получения менингококковой IgAl протеазы (см. В. И. Суровцев и др. Получение IgAl -протеазы, секретируемой клетками Neisseria meningitidis II Биотехнология. 2006, N 3, С. 62-67 - прототип). Описана технология получения высокоочищенной менингококковой IgAl -протеазы. Метод основан на выращивании бактерий в культуральной жидкости и ее концентрировании, использовании для очистки IgAl протеазы хроматографии на силохроме С-80, гидрофобной хроматографии на фенил-сефарозе и гель-фильтрации на сефарозе CL 6В-200. Выход очищенного фермента составлял 15,0 мг из 50 л культуральной жидкости. Однако этот способ сложен и использует многостадийную инактивацию возбудителя с использованием антибиотика, мертиолята и ЭДТА.
Описаны вакцины, предназначенные для профилактики менингококковых инфекций. Так в патенте (RU2333007 С2, ПИЦЦА, НОВАРТИС ВЭКСИНЕС ЭНД ДАИЭГНОСТИКС С.Р.Л. (IT), 10.09.2008) описана вакцина, которая после введения способна индуцировать гуморальный иммунный ответ и обеспечивать защиту организма от некоторых высоковирулентных штаммов (А4, ЕТ5) N. meningitidis серогруппы В. Используются пять белковых антигенов наружной мембраны, в частности: (1) белок "NadA"; (2) белок «741»; (3) белок «936»; (4) белок «953» и (5) белок «287».
В другом изобретении (RU2343159 С2, МАСИНЬЯНИ и др. 10.01.2009) описаны белки с установленными аминокислотными последовательностями, полученные из бактерий преимущественно штаммов А и В, которые проявляют свойства антигена. Белки могут быть использованы в качестве антигенов для получения специфических антител и изготовления композиций для лечения, профилактики или диагностики инфекции, вызванной N. meningitidis. Композиции, приготовленные на основе белка, фрагментов нуклеиновой кислоты или антител с добавлением фармацевтически приемлемого носителя, представляют собой вакцинные, диагностические или фармацевтические препараты.
В изобретении (RU2361609 С2, ДЖУЛИАНИ и др., 20.07.2009) предложена вакцинная композиция, обладающая иммуногенной активностью в отношении серогрупп В и С N. meningitidis, содержащая иммуногенное количество олигосахарида N. meningitidis серогруппы С, белка наружной мембраны менигококка серогруппы В в виде белково-липидных везикул. Указанная композиция обеспечивает высокие титры антител, определенных методом ИФА, и бактерицидных антител, что может найти применение в качестве протективной вакцины в отношении N. meningitidis серогрупп В и С.
Однако для изготовления вышеописанных вакцин используются рекомбинантные продукты, для получения которых требуется проведение сложного многостадийного технологического процесса. В то же время для получения компонентов вакцин и препаратов не известно использование менингококковой IgAl-протеазы, которая, как установлено, является иммуногенным и протективным вакцинным препаратом в отношении менингококковой инфекции гетерологичной серогруппы В.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретений является усовершенствование способа получения менингококковой IgAl протеазы и создание поливалентного вакцинного препарата на ее основе неполисахаридной природы для защиты от заражения не только менингококком серогруппы А, но и от заражения менингококком серогруппы В.
Способ получения IgAl протеазы из N. meningitidis состоит в выращивании культуры N. meningitidis серогруппы А штамм А 208, с последующей инактивацией культуральной жидкости и осаждением микробной массы центрифугированием, выделением IgAl протеазы путем очистки, включающей ультрафильтрацию, абсорбционную колоночную хроматографию на сорбентах силохром-80 и фенил- сефарозе, концентрирование и лиофильное высушивание продукта.
Патентуемый способ характеризуется тем, что для выращивания культуры N. meningitidis серогруппы А используют модифицированную питательную среду Франца, инактивацию микрорганизмов осуществляют путем добавления в культуральную жидкость цетавлона до конечной концентрации 0,1%. Полученную смесь разделяют центрифугированием, причем для выделения IgAl протеазы используют обе фракции - цетавлоновый супернатант и цетавлоновый осадок. Полученный осадок многократно экстрагируют, экстракты осадка и супернатант концентрируют методом ультрафильтрации. Полученные концентраты фракционируют методом абсорбционной хроматографии на колонке с сорбентом силохром-80 при температуре +8°С, уравновешенной 0,02 М фосфатно-солевым буферным раствором, рН 7,0, причем IgAl протеазу получают при промывке сорбента указанным буферным раствором.
Способ может характеризоваться тем, что осадок экстрагируют буферным раствором 0,05 М Трис-HCl, рН 7,0 при перемешивании при температуре +8°С, затем суспензию центрифугируют при 1 1000 g при температуре +4°С. Поливалентный вакцинный препарат для профилактики инфекции вызываемой бактериями N. meningitidis серогрупп А и В (или компонент такого вакцинного препарата) содержит IgAl протеазу, полученную из культуры N. meningitidis серогруппы А.
Технический результат первого изобретения группы - упрощение способа за счет замены многостадийной инактивации возбудителя с использованием антибиотика, мертиолята и ЭДТА на одностадийную обработку цетавлоном, исключение стадии гель-проникающей хроматографии и повышение экологической безопасности указанного процесса в целом.
Технический результат второго изобретения группы - получение вакцины неполисахаридной природы или ее компонента для защиты от заражения не только менингококком серогруппы А, но и менингококком серогруппы В. Такая возможность впервые установлена экспериментальным путем авторами заявки и не следует из уровня техники.
Краткое описание фигур чертежей
На фигурах приведены результаты очистки и характеристики полученной менингококковой IgAl протеазы, а также результаты микробиологических экспериментов :
фиг. 1 - результаты хроматографии супернатанта на первой стадии;
фиг. 2 - результаты хроматографии супернатанта на второй стадии;
фиг. 3 - результаты белкового электрофореза в ПААГ образцов, содержащих IgAl протеазу до и после проведения хроматографии;
фиг. 4 - динамика формирования антител к IgAl протеазе;
фиг. 5 - защищённость мышей, иммунизированных IgAl протеазой от заражения менингококком серогруппы В;
фиг. 6 - уровень бактериемии у мышей, иммунизированных IgAl протеазой, через 4 часа после заражения менингококком серогруппы В.
Лучший вариант осуществления изобретения
Микробную массу N. meningitidis серогруппы А штамм А 208 (Институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича) выращивают в бутылях, содержащих модифицированную полусинтетическую среду Франца (см. Frantz I.D. Growth requirements of the meningococcus. - J.Bacteriol.-1942.-N6.-P.757-761; US4123520, Hagopian, et al., 31.10.1978; Кувакина В.И. Менингококковые полисахаридные вакцины групп А и С.// Дисс. докт. биол. н., МНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского, М., 1989).
Бутыли с культуральной жидкостью, представляющей собой взвесь бактерий в среде Франца, инкубируют при температуре 37±1°С при постоянном встряхивании в течение 12-16 час. Затем содержимое бутылей объединяют и добавляют 10%-ный раствор цетавлона (гексадецилтриметиламмонийбромида, cetavlon) до конечной его концентрации во взвеси 0,1%, взвесь тщательно перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 2-3 ч. Полученную смесь разделяют центрифугированием с получением цетавлонового супернатанта и цетавлонового осадка.
Указанный супернатант в количестве 2,5 л (общее содержание белка 27500 мг) концентрировали в 10 раз методом ультрафильтрации на мембране Халипор-1 с номинальной отсекаемой молекулярной массой 65 кДа, а затем несколько раз отмывали водой от солей и реагентов методом диафильтрации на указанной мембране. В результате получено 35 мл концентрата с общим содержанием белка 55 мг и ферментативной активностью 0,775 тыс.ед./мг (см. табл. 1). Затем проводили диализ полученного концентрата (35 мл) против исходного буферного раствора I (см. ниже) для хроматографии на силохроме (2,0 л).
Полученный концентрат в количестве 35 мл далее фракционировали методом двухстадийной колоночной хроматографии. На первой стадии указанный концентрат наносили на колонку объемом 70 мл (30x130 мм), заполненную сорбентом силохром-80 и уравновешенную 0,02 М ФСБ, рН 7,0 (фосфатно-солевой буферный раствор, исходный буферный раствор I). Колонку промывали исходным буферным раствором I, затем 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 8,2 и наконец 0,2 М буферным раствором глицин/МаОН/0,ЗМ NaCl, рН 9,2, скорость элюции 2,5 мл/мин. Хроматографию проводили при температуре +8°С, собирали фракции объемом 10 мл, во фракциях определяли содержание белка и активность IgAl протеазы в условных единицах на мг белка методом иммуноферментного анализа (RU2310853, Козлов и др., 20.11.2007). Полученные результаты представлены на фиг.1 и в таблице 1. Фракцию 1, полученную после первой стадии очистки и содержащую активную IgAl протеазу (объем 35 мл, содержание белка 0,385 мг, ферментативная активность 47,3 тыс. ед./мг, выход по белку 0,001%, степень очистки 61) очищали методом гидрофобной хроматографии (вторая стадия очистки) на колонке (10x90 мм) с фенил-сефарозой объемом 5 мл, уравновешенной буферным раствором 0,05 М трис-HCl, рН 9,2, содержащим 0,7 М сульфат аммония (исходный буферный раствор II). Указанную фракцию концентрировали методом ультрафильтрации до объема 2- 3 мл, добавляли в нее сульфат аммония до концентрации 0,7 М и полученный раствор наносили на колонку. Колонку промывали исходным буферным раствором, а затем 0,05 М натрий-ацетатным буферным раствором, рН 6,0, до отсутствия поглощения при λ=280 нм. IgAl протеазу элюировали при промывке колонки деминерализованной водой. Ферментативная активность IgAl протеазы с высокой специфичностью обнаружена только во фракции 1-3 (содержание белка 0,012 мг, выход по белку 0,0004%, ферментативная активность 640 тыс. ед./мг, степень очистки 824). Полученные результаты представлены на фиг. 2 и в таблице 2.
Результаты хроматографии на силохроме (первая стадия очистки) свидетельствуют об изменении свойств фермента по сравнению со свойствами, описанными в прототипе-статье (В. И. Суровцев и др., // Биотехнология. - 2006. - N 3. - С. 62-67), вследствие присутствия в исходном материале цетавлона - поверхностно-активного вещества (ПАВ). Выделяемый фермент не сорбируется на силохроме и элюируется в исходном буферном растворе, тогда как значительная часть примесей сорбируется на силохроме и элюируется в указанных растворах.
Приведенные экспериментальные данные показывают, что из указанного количества культуральной жидкости (2,5 л) получен фермент с достаточно высокой степенью очистки, но с низким выходом IgAl протеазы. Однако для специалиста представляется очевидным, что выход продукта может быть повышен при использовании более эффективных установок для ультрафильтрации, позволяющих сократить время пребывания фермента в растворенной форме.
Цетавлоновый осадок в количестве 103 г, полученный из 36 л культуральной жидкости, суспендировали в 2 л буферного раствора 0,05 М Трис-HCl, рН 7, и перемешивали в течение ночи при температуре +8°С, затем суспензию центрифугировали при 11000 g при температуре +4°С. Полученный супернатант концентрировали на мембране и подвергали диафильтрации, как описано выше. Концентрат (40 мл, 10.9 тыс. ед./мг) диализовали против 2 л 0,02 М PBS, рН 7.0 в течение ночи при температуре +8°С, затем проводили очистку фермента двухстадийной колоночной хроматографией, как описано выше для цетавлонового супернатанта. Осадок экстрагировали в общей сложности пять раз и из каждого экстракта выделяли фермент как описано выше. Результаты приведены в таблице 2
Было установлено, что в качестве сырья для получения IgAl протеазы могут быть использованы также готовые полупродукты - цетавлоновый супернатант и осадок, полученные после инактивации микробной культуры в процессе производства полисахаридов менингококков серогрупп А и С (RU2283135 С1 , Аваков и Аллилуев, 10.09.2006). Использование супернатанта тем более целесообразно, поскольку он представляет собой отход производства на Предприятии по производству бактерийных препаратов им. Г.Н.Габричевского, никоим образом не используемый и сливаемый в отбросы. Преимущество осадка состоит в том, что его можно хранить в замороженном состоянии при низкой температуре -80°С в течение длительного времени, и использовать как для производства полисахаридной менингококковой вакцины, так и очищенной IgAl протеазы. Кроме того, в осадке содержится примерно 24% активности IgAl протеазы в расчете на общую активность IgAl протеазы в исходной культуральной жидкости.
Препараты IgAl протеазы, полученные в ходе очистки, анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в додецилсульфате Na (ЭФ в ПААГ - ДСН, восстанавливающие условия, проявление серебром - см. фиг. 3), а также определяли ферментативную активность (см. таблицы 1,2)) методом иммуноферментного анализа IgAl протеазы.
На фиг. 3 представлены результаты белкового электрофореза в ПААГ образцов, содержащих IgAl протеазу до и после проведения хроматографии. Цетавлоновый супернатант: дорожка / - исходный, 2 - фр.1 ; 3 - фр.З (фенил- сефароза). Цетавлоновый осадок: 4 - исходный экстракт, 5 - фр.1 , 6 - фр.2; 7 - фр.З (силохром); 8 - фр.1-1 ; 9 - фр.1-2; 10 - фр.1-3 (фенил-сефароза). Дорожка 11 - контрольная смесь белков-маркеров HMW с молекулярными массами 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 30, 15 и Ю кДа. В очищенном препарате IgAl протеазы (дорожка 3) наблюдается зона с молекулярной массой около 120 кДа, что соответствует литературным данным о молекулярной массе интактного фермента [см. прототип, а также Таймуразов М.Г. Диссертация канд. биол. наук., Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск. 2006], а также некоторое количество примесей на уровне 50 кДа.
Результаты электрофореза свидетельствуют о том, что в полученном препарате по настоящему изобретению содержится IgAl протеаза с молекулярной массой -120 кДа и низкомолекулярные примеси в значительно меньшем количестве. Наличие таких примесей можно объяснить тем, что, согласно литературным данным (см., например, WO9011367), IgAl протеаза может расщепляться в процессе очистки на более низкомолекулярные фрагменты, которые также обладают ферментативной активностью. РЕЗУЛЬТАТЫ. Иммуногенную и протективную активность полученной IgAl протеазы оценивали на мышах линии Balb/C. Для оценки этих показателей животных иммунизировали IgAl протеазой дважды внутривенно с интервалом 45 дней. Для первой иммунизации мышей в дозе 10 мкг/мышь использовали препарат, полученный после второй экстракции цетавлонового осадка и хроматографии на силохроме С-80, диализа и лиофильной сушки (100 мкг IgAl протеазы, с ферментативной активностью ЗЛО5 ед/мг). Для реиммунизации мышей использовали препарат, полученный после двухстадийной хроматографии (195мкг IgAl протеазы с активностью 5,36.105 ед/мг) в той же дозе.
Показателем иммуногенности полученной IgAl протеазы служило нарастание специфических антител, определяемых методом ИФА, в крови мышей в различные дни после иммунизации.
На 12-й день после реиммунизации мышей заражали живой вирулентной культурой менингококка серогруппы В штамм Н44/47.
Протективную активность IgAl протеазы оценивали по уровню бактериемии у иммунизированных животных через 4 часа после заражения менингококком серогруппы В, а также по числу животных, выживших на 5-й день после заражения, по сравнению с этими же показателями для контрольных не иммунизированных мышей.
На фиг. 4 показана диаграмма иммуногенной активности IgAl протеазы. По оси абсцисс цифрами обозначен срок после иммунизации: 1 - 6-й день; 2 - 13-й день; 3 - 20-й день; 4 - 28-й день; 5 - 35-й день и 6 - 41-й день после первой иммунизации, соответственно; 7 - 12-й день после повторной иммунизации; 8 - контрольная группа. По оси ординат - оптическая плотность сывороток в разведении 1:80 при =492нм. Видно, что нарастание специфических антител наблюдается на 13-й день после однократной иммунизации и достигает максимального значения к 35-му дню. Максимальный уровень антител отмечен на 12-ый день после реиммунизации.
На диаграмме фиг. 5 представлен уровень бактериемии (в %) у иммунизированных мышей (заштрихованный столбик) по сравнению с контрольными, не иммунизированными, животными (черный столбик). Уровень бактериемии в группе иммунизированных мышей снижен на 35 % (65 КОЕ) по сравнению с контрольными не иммунизированными мышами (100 КОЕ).
На диаграмме фиг. 6 показана защищённость мышей от заражения менингококком серогруппы В. По оси ординат - число выживших мышей (в %): иммунизированные мыши - заштрихованный столбик, контрольные - чёрный. При заражении мышей менингококком в дозе 25-104 микробных клеток в контрольной группе выжило только одно животное из 10-ти (10%), тогда как в группе иммунизированных IgAl протеазой - выжило 9 мышей (90%).
Промышленная применимость
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о перспективности патентуемого способа для приготовления активного компонента поливалентной вакцины на основе IgAl протеазы, выделенной из культуры менингококка серогруппы А. Показана высокая эффективность вакцинного препарата IgAl протеазы, способного защищать от заражения живой менингококковой культурой гетеро логичного штамма - менингококка серогруппы В. Полученный препарат может быть использован также для защиты от менингококка гомологичной серогруппы А. Таблица 1
ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУКТОВ ОЧИСТКИ ЦЕТАВЛОНОВОГО СУПЕРНАТАНТА
НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ
Figure imgf000013_0001
(*) -отношение удельной активности очищенного фермента к удельной активности исходного концентрата. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУКТОВ ОЧИСТКИ ЦЕТАВЛОНОВОГО ОСАДКА
НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ
Figure imgf000014_0001
* отношение удельной активности очищенного фермента к удельной активности исходного концентрата.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения IgAl протеазы из N. meningitidis, заключающийся в выращивании культуры N. meningitidis серогруппы А штамм А 208, с последующей инактивацией культуральной жидкости и осаждением микробной массы центрифугированием, выделением IgAl протеазы путем очистки, включающей ультрафильтрацию, абсорбционную колоночную хроматографию на сорбентах силохром-80 и фенил-сефарозе, концентрирование и лиофильное высушивание продукта,
отличающийся тем, что
для выращивания культуры N. meningitidis серогруппы А используют модифицированную питательную среду Франца,
инактивацию микрорганизмов осуществляют путем добавления в культуральную жидкость цетавлона до конечной концентрации 0,1%,
после разделения полученной смеси центрифугированием для выделения
IgAl протеазы используют обе фракции - цетавлоновый супернатант и цетавлоновый осадок,
полученный осадок многократно экстрагируют, экстракты осадка и супернатант концентрируют методом ультрафильтрации,
полученные концентраты фракционируют методом абсорбционной хроматографии на колонке с сорбентом силохром-80 при температуре +8°С, уравновешенной 0,02 М фосфатно-солевым буферным раствором, рН 7,0, причем IgAl протеазу получают при промывке сорбента указанным буферным раствором.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осадок экстрагируют буферным раствором 0,05 М Трис-HCl, рН 7,0 при перемешивании при температуре +8°С, затем суспензию центрифугируют при 11000 g при температуре +4°С.
3. Поливалентный вакцинный препарат, содержащий IgAl протеазу, полученную из культуры N. meningitidis серогруппы А способом по любому из п.п. 1 -2, который предназначен для профилактики инфекции, вызываемой бактериями N. meningitidis серогрупп А и В.
PCT/RU2010/000541 2009-10-05 2010-09-30 Способ получения iga1 протеазы из культуры n. меningiтidis серогруппы а и поливалентный вакцинный препарат для профилактики инфекции, вызываемой бактериями n. меningiтidis серогрупп а и в WO2011043696A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2009136634 2009-10-05
RU2009136634/10A RU2407792C1 (ru) 2009-10-05 2009-10-05 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ IgAl-ПРОТЕАЗЫ ИЗ КУЛЬТУРЫ NEISSERIA MENINGITIDIS СЕРОГРУППЫ А И ИММУНОГЕННЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕЕ ОСНОВЕ

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011043696A1 true WO2011043696A1 (ru) 2011-04-14

Family

ID=43856987

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2010/000541 WO2011043696A1 (ru) 2009-10-05 2010-09-30 Способ получения iga1 протеазы из культуры n. меningiтidis серогруппы а и поливалентный вакцинный препарат для профилактики инфекции, вызываемой бактериями n. меningiтidis серогрупп а и в

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2407792C1 (ru)
WO (1) WO2011043696A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104073474A (zh) * 2014-06-27 2014-10-01 樊均明 一种IgA1酶及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990011367A1 (en) * 1989-03-17 1990-10-04 Mogens Kilian IMMUNOGLOBULIN A1 PROTEASES (IgA1 PROTEASES), METHOD OF GENE-TECHNOLOGICALLY PRODUCING THIS TYPE OF ENZYME AND VACCINES CONTAINING THE ENZYMES AND FRAGMENTS THEREOF FOR IMMUNIZING AGAINST BACTERIAL MENINGITIS AND OTHER DISEASES CAUSED BY IgA1 PROTEASE-PRODUCING BACTERIA
SU1750689A1 (ru) * 1990-05-17 1992-07-30 Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова Способ получени полисахаридно-белковой вакцины против NeISSeRIa меNINGIтIDIS серогруппы В

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990011367A1 (en) * 1989-03-17 1990-10-04 Mogens Kilian IMMUNOGLOBULIN A1 PROTEASES (IgA1 PROTEASES), METHOD OF GENE-TECHNOLOGICALLY PRODUCING THIS TYPE OF ENZYME AND VACCINES CONTAINING THE ENZYMES AND FRAGMENTS THEREOF FOR IMMUNIZING AGAINST BACTERIAL MENINGITIS AND OTHER DISEASES CAUSED BY IgA1 PROTEASE-PRODUCING BACTERIA
SU1750689A1 (ru) * 1990-05-17 1992-07-30 Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова Способ получени полисахаридно-белковой вакцины против NeISSeRIa меNINGIтIDIS серогруппы В

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KENNY CP. ET AL.: "A chemically defined protein-free liquid medium for the cultivation of some species of Neisseria.", BULL. ORG. MOND. SANTE, BULL. WLD HITH ORG., vol. 37, 1967, pages 569 - 573 *
SUROVTSEV V.I. ET AL.: "Bakterialnye IgA1-proteazy: poluchenie, svoistva perspektivy primeneniya", VESTNIK ROSSYSKOI AKADEMII MEDITSINSKIKH NAUK, 2001, pages 39 - 42 *
SUROVTSEV V.I. ET AL.: "Poluchenie IgA1-proteazy, sekretiruemoi kletkami Neisseria meningitidis.", BIOTEKHNOLOGIYA, vol. 3, 2006, pages 62 - 67 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104073474A (zh) * 2014-06-27 2014-10-01 樊均明 一种IgA1酶及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
RU2407792C1 (ru) 2010-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4271147A (en) Process for the isolation of membrane proteins from Neisseria meningitidis and vaccines containing same
CA1142083A (en) Process for the isolation of membrane proteins from neisseria meningitidis and vaccines containing same
US9707286B2 (en) Process for detergent-free production of outer membrane vesicles of a gram-negative bacterium
US6177085B1 (en) Generation of immune response using immunogenic conjugate of molecules
ES2198405T3 (es) Antigenos de superficie de tipo i asociados a staphylococcus epidermis.
JP2017206564A (ja) Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ５型および８型の莢膜糖の精製
JPH10504717A (ja) 肺炎双球菌感染症に対する免疫化のための肺炎双球菌多糖−組み換えニューモリシン結合体ワクチン類
KR102626831B1 (ko) 수막구균 백신
AU662176B2 (en) Vaccine for Neisseria Meningitidis infections
KR20160127104A (ko) 변형된 수막구균 fhbp 폴리펩티드
EP0041897B1 (en) Polysaccharide antigen from streptococcus and vaccines
US5989542A (en) Capsular polysaccharides from enterococci
JPH08277298A (ja) 細菌抗原、抗体、ワクチン及びその製造方法
JPH0561255B2 (ru)
USRE37741E1 (en) Purified nontypable Haemophilus influenzae P5 protein as a vaccine for nontypable Haemophilus influenzae infection
US5618540A (en) Subunit vaccine against Neisseria meningitidis infections and corresponding subunits in the purified state
RU2186582C2 (ru) Способ выделения и очистки белка внешней мембраны moraxella catarrhalis, штамм м.catarrhalis для получения белка cd, изолированный и очищенный неденатурированный белок cd внешней мембраны м.catarrhalis и иммуногенная композиция, содержащая белок cd внешней мембраны м.сatarrhalis
HU200194B (en) Process for removal of pertussis endotoxin
RU2407792C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ IgAl-ПРОТЕАЗЫ ИЗ КУЛЬТУРЫ NEISSERIA MENINGITIDIS СЕРОГРУППЫ А И ИММУНОГЕННЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕЕ ОСНОВЕ
CN105175549A (zh) 一种流感嗜血杆菌融合蛋白及其构建方法与应用
RU2311197C1 (ru) Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий
US6722062B2 (en) Capsular polysaccharides from enterococci
CN104096228B (zh) 一种增强流行性嗜血杆菌b型多糖蛋白结合物免疫原性的方法
CN104096224B (zh) 一种增强流行性嗜血杆菌b型多糖蛋白结合物免疫原性的方法
Yagudaeva et al. Isolation and determination of the activity of IgA1 protease from Neisseria meningitidis

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10822304

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10822304

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1