CN104017793A - 一种去除糜蛋白酶中的内毒素的方法 - Google Patents

一种去除糜蛋白酶中的内毒素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种去除糜蛋白酶中的内毒素的方法。该方法包括下述步骤：将糜蛋白酶滤饼溶解于水中，超滤浓缩得到浓缩液，依次加入磷酸盐水溶液和钙盐水溶液，调节pH值为8～9，离心，即可。本发明的在糜蛋白酶生产过程中去除内毒素的方法，在不影响糜蛋白酶活性、收率的前提下，有效地去除糜蛋白酶生产中含有的内毒素污染物，目前已经应用于糜蛋白酶原料药生产，内毒素含量符合2010版中国药典要求。

Description

一种去除糜蛋白酶中的内毒素的方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种去除糜蛋白酶中的内毒素的方法。
背景技术
糜蛋白酶作为一类肽链内切酶，其在创伤手术后愈合、抗炎、眼科手术等方面被广泛应用；同时作为一种肌内注射药品，为保障其临床应用安全性，2010版药典规定每1单位糜蛋白酶中含内毒素的量应小于0.075EU。内毒素产生于革兰氏阴性细菌的细胞外壁，其主要成份是脂多糖(LPS)及类脂A，是热原的活性部分。它们的相对分子质量一般为1万～2.5万，在水溶液中形成缔合体，相对分子质量可达50万～100万。其具有耐热性和化学稳定性，不易被除灭。注入人体的注射剂中含有热原量达1μg/kg就可引起不良反应，发热反应通常在注入1小时后出现，可使人体产生发冷、寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。因此，在生物制品生产过程中，需要有严格的工艺控制策略对内毒素进行去除或限量控制。
目前，水溶液中常用的内毒素去除方法主要有如下几种：
1、超滤
内毒素具有较大的相对分子质量，因此，可选用超滤膜去除水中的内毒素。在使用超滤方法去除内毒素时需要根据被处理药物的相对分子质量、特性选择超滤膜的孔径及材质，因此该方法不具备通用性。另外，内毒素并不以单一分子存在，而是以相对分子质量不等的集聚体存在，因此大小不一，这也给超滤法去除内毒素带来了挑战。
2、活性炭吸附法
活性炭吸附是一种较早用于内毒素去除的方法，但是，由于活性炭选择性差，在吸附内毒素的同时吸附有效活性成分，影响产品收率。
3、化学降解法
化学降解法是指用强酸、强碱或氧化剂等使内毒素降解以达到去除内毒素的目的，这种方法有可能造成有效成分的降解或失活，因此，该方法的使用需结合产品的理化性质。
4、离子交换色谱法
离子交换色谱法是根据内毒素带有部分负电荷的性质，用阴离子交换色谱来去除内毒素，但这种方法不适合于溶液中存在其它带负电荷物质的情况。
蛋白质种类较多，其分离纯化步骤各不相同，不同终产品对内毒素含量要求也有差异，因此，去除内毒素的方法和效果无法完全通用。糜蛋白酶作为一种活性蛋白酶类药物，其具有易失活、不稳定的特点，在内毒素去除过程中保证其本身性质及有效活性成分不受影响至关重要，这也是本领域长期以来存在的、难以克服的技术难题。在糜蛋白酶内毒素去除方法选择过程中，超滤法因糜蛋白酶分子量较大而无法应用，活性炭吸附法专一性不强，化学降解法极易造成糜蛋白酶失活，色谱法耗时较长，不利于糜蛋白酶稳定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中糜蛋白酶中的内毒素无法去除彻底、易造成糜蛋白酶失活、耗时较长的缺陷，而提供了一种去除糜蛋白酶中的内毒素的方法。本发明的方法将超滤与磷酸钙沉淀联合使用，可以有效除去内毒素，且不会影响糜蛋白酶的活性，适用于大规模条件下除去蛋白质中的内毒素。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明提供了一种去除糜蛋白酶中的内毒素的方法，其包括下述步骤：将糜蛋白酶滤饼溶解于水中，超滤浓缩得到浓缩液，依次加入磷酸盐水溶液和钙盐水溶液，调节pH值为8～9，离心，即可。
其中，所述的糜蛋白酶滤饼可为本领域常规的糜蛋白酶处理方法得到的糜蛋白酶滤饼，一般经过多步盐析、结晶、过滤、活化、盐析得到，较佳地通过下述步骤得到：将糜蛋白酶原料用水溶解，加入硫酸调节pH值为2～3，加入饱和硫酸铵溶液盐析，加入磷酸缓冲液调节pH值为7.5～7.7，再加入胰蛋白酶进行活化，用硫酸调节pH值为3.5～4.5，加入固体硫酸铵进行盐析，即得到糜蛋白酶滤饼。
所述的糜蛋白酶滤饼更佳地通过下述步骤制得：在糜蛋白酶原料中加入7倍量(v/w)纯化水溶解，并加2.5mol/L H2SO4溶液调节pH值为2.8～3.2，搅拌，放置过夜，加2.5mol/L H2SO4溶液调pH值为2.5～2.7，再加2倍量(v/w)饱和硫酸铵溶液搅拌均匀，再用5mol/L NaOH溶液调pH值为4.9～5.1，置25℃恒温箱，保温48小时，布氏漏斗过滤，收集滤饼，滤液弃去，过滤所得滤饼，用3倍量(v/w)纯化水溶解后，以1倍量(v/w)饱和硫酸铵盐析，25℃保温24小时，反复3次，后二次滤出母液，收集待用，滤饼待活化；将以上结晶后过滤的滤饼加入3倍量(v/w)纯化水，并加2.5mol/L H2SO4溶液90ml助溶，待完全溶解后，布氏漏斗过滤，收集滤液，用2.5mol/L H2SO4溶液调滤液pH值至2.8～3.1；加5mol/L NaOH溶液调pH为7.4～7.7，再加入1倍量(v/w滤饼重)0.5mol/L、pH7.6的磷酸缓冲液，搅拌均匀得结晶物溶液，再按胰蛋白酶∶结晶物溶液＝5mg∶100ml的比例加入胰蛋白酶，置4℃冰箱中活化72小时，pH控制在7.6；将以上活化液用2.5mol/L H2SO4溶液调pH值为3.9～4.1，测活化液体积，按500g/L加入固体硫酸铵进行盐析，放置过夜，次日布氏漏斗过滤，弃滤液，即得糜蛋白酶滤饼。
其中，所述的水与所述的糜蛋白酶滤饼的体积质量比较佳地为8～12ml/g。
其中，所述的超滤浓缩采用的超滤膜较佳地为德国赛多利斯公司的Hydrosart超滤膜，截留相对分子质量是5kDa或10kDa。
其中，所述的超滤浓缩得到的浓缩液的体积较佳地为超滤浓缩前体积的0.1～0.3倍。
其中，所述的磷酸盐可为本领域常规的可溶于水的各种磷酸盐，较佳地为磷酸钠和/或磷酸钾。
其中，所述的钙盐可为本领域常规的可溶于水的各种钙盐，较佳地为醋酸钙和/或氯化钙。
其中，所述的磷酸盐水溶液与所述的浓缩液的体积比较佳地为(0.1～0.2)：1。
其中，所述的钙盐水溶液与所述的磷酸盐水溶液的体积比较佳地为(0.5～0.7)：1。
其中，所述的磷酸盐水溶液的浓度较佳地为0.2～0.5mol/L。
其中，所述的钙盐水溶液的浓度较佳地为0.8～1.5mol/L。
其中，所述的磷酸盐与所述的钙盐的摩尔比较佳地为1：(0.5～2)，更佳地为1：1.5。
其中，所述的离心的转速较佳地为3000～4000rpm。
其中，所述的离心较佳地为冷冻离心10～30min，冷冻离心的温度较佳地为4～10℃。
其中，所述的离心结束后还可进行后处理；所述的后处理包括下述步骤：透析，加入硅藻土，过滤，冻干，即得成品。所述的透析的温度较佳地为3～5℃。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明先通过超滤方法大大减少了糜蛋白酶操作体积，同时，使糜蛋白酶溶液中内毒素得到富集，有利于后续磷酸钙沉淀内毒素及透析、冻干，提高生产效率。
(2)在磷酸钙沉淀糜蛋白酶中的内毒素技术方案中，磷酸盐与钙盐的摩尔比为1:1.5时恰好完全反应生成磷酸钙沉淀，用以吸附内毒素，后续经离心操作除去沉淀复合物。过量的磷酸盐或钙盐溶液不利于糜蛋白酶稳定性，并且会影响后续终产品质量符合标准(如炽灼残渣)。整个磷酸钙沉淀内毒素操作工序耗时30-60分钟，极大降低了对糜蛋白酶活性的影响。
(3)本发明的在糜蛋白酶生产过程中去除内毒素的方法，在不影响糜蛋白酶活性、收率的前提下，有效地去除糜蛋白酶生产中含有的内毒素污染物，目前已经应用于糜蛋白酶原料药生产，内毒素含量符合2010版中国药典要求。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
糜蛋白酶原料批号091269，产自内蒙古集宁牛羊脏器加工部，糜蛋白酶糜原是新鲜牛胰脏经硫酸浸泡、绞碎、盐析结晶所得，其纯度(质量百分比)不应低于30％。糜蛋白酶原料投料1100g，加7倍量(v/w)纯化水溶解，并加2.5mol/L H2SO4溶液290ml调节pH为3.0，搅拌8小时后，放置过夜。次日搅拌，并加2.5mol/L H2SO4溶液调pH为2.6，再加2倍量(v/w)饱和硫酸铵溶液搅拌均匀，再用5mol/L NaOH溶液调pH为5.0，置25℃恒温箱，保温48小时，布氏漏斗过滤，收集滤饼，滤液弃去。过滤所得滤饼，用3倍量(v/w)纯化水溶解后，以1倍量(v/w)饱和硫酸铵盐析，25℃恒温保温24小时，反复3次，后二次滤出母液，收集待用，滤饼待活化。将以上结晶后过滤的滤饼置于不锈钢桶内，加入3倍量(v/w)纯化水，并加2.5mol/LH2SO4溶液90ml助溶。待完全溶解后，布氏漏斗过滤，收集滤液，用2.5mol/LH2SO4溶液调滤液pH至3.0，搅拌3小时。
加5mol/L NaOH溶液调pH为7.6，再加入1倍量(v/w滤饼重)0.5mol/L、pH为7.6的磷酸缓冲液，搅拌均匀得结晶物溶液，测pH为7.6，再按比例(胰蛋白酶∶结晶物溶液＝5mg∶100ml)加入胰蛋白酶，置4℃冰箱中活化72小时，活化第二天应注意其pH值，pH控制在7.6。
将以上活化液用2.5mol/L H2SO4溶液调pH为3.9，测活化液体积，按500g/L加入固体硫酸铵进行盐析，放置过夜，次日布氏漏斗过滤，弃滤液，收集滤饼1648g，加纯化水16500ml溶解，过滤，收集滤液。用10kD的超滤膜(型号：Hydrosart德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为2400ml。缓慢加入240ml0.4mol/L的4℃磷酸三钠溶液，搅拌，再缓慢加入144ml1mol/L的4℃醋酸钙溶液，搅拌，用2.5M NaOH调节pH至8.51，搅拌10分钟后用3000转/分的转速4℃离心20分钟，后续溶液扎包，约100ml/包，4℃左右透析3天，每12小时换水一次(水温控制在4℃左右)。
收集、合并透析液，加100g硅藻土，过滤，量取滤液体积，用折叠式过滤器(0.22μm孔径滤膜、德国赛多利斯公司)过滤，调节pH为6.0，滤液装盘(1000ml/盘)，送冻干机(上海东富龙科技股份有限公司)冻干得糜蛋白酶成品110201。
实施例2
糜蛋白酶原料批号091270，产自内蒙古集宁牛羊脏器加工部，糜蛋白酶糜原是新鲜牛胰脏经硫酸浸泡、绞碎、盐析结晶所得，其质量百分比纯度不应低于30％。糜蛋白酶原料投料1100g，加7倍量(v/w)纯化水溶解，并加2.5mol/L H2SO4溶液290ml调节pH为3.1，搅拌8小时后，放置过夜。次日搅拌，并加2.5mol/L H2SO4溶液调pH为2.5，再加2倍量(v/w)饱和硫酸铵溶液搅拌均匀，再用5mol/L NaOH溶液调pH为4.9，置25℃恒温箱，保温48小时，布氏漏斗过滤，收集滤饼，滤液弃去。过滤所得滤饼，用3倍量(v/w)纯化水溶解后，以1倍量(v/w)饱和硫酸铵盐析，25℃恒温保温24小时，反复3次，后二次滤出母液，收集待用，滤饼待活化。将以上结晶后过滤的滤饼置于不锈钢桶内，加入3倍量(v/w)纯化水，并加2.5mol/L H2SO4溶液110ml助溶。待完全溶解后，布氏漏斗过滤，收集滤液，用2.5mol/L H2SO4溶液调滤液pH至2.9，搅拌3小时。
加5mol/L NaOH溶液调pH为7.6，再加入1倍量(v/w滤饼重)0.5mol/L、pH为7.6的磷酸缓冲液，搅拌均匀得结晶物溶液，测pH为7.6，再按比例(胰蛋白酶∶结晶物溶液＝5mg∶100ml)加入胰蛋白酶，置4℃冰箱中活化72小时，活化第二天应注意其pH值，pH控制在7.6。
将以上活化液用2.5mol/L H2SO4溶液调pH为4.1，测活化液体积，按500g/L加入固体硫酸铵进行盐析，放置过夜，次日布氏漏斗过滤，弃滤液，收集滤饼1895g，加纯化水18950ml溶解，过滤，收集滤液。用5kD的超滤膜(型号：Hydrosart德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为2800ml。缓慢加入300ml0.4mol/L的4℃磷酸三钠溶液，搅拌，再缓慢加入180ml1mol/L的4℃醋酸钙溶液，搅拌，用2.5M NaOH调节pH至8.00，搅拌10分钟后用3000转/分的转速冷冻离心20分钟，后续溶液扎包，约100ml/包，4℃左右透析3天，每12小时换水一次(水温控制在4℃左右)。
收集、合并透析液，加100g硅藻土，过滤，量取滤液体积，用折叠式过滤器(0.22μm孔径滤膜、德国赛多利斯公司)过滤，调节pH为6.0，滤液装盘(1000ml/盘)，送冻干机(上海东富龙科技股份有限公司)冻干得糜蛋白酶成品110202。
实施例3
糜蛋白酶原料批号091271，产自内蒙古集宁牛羊脏器加工部，糜蛋白酶糜原是新鲜牛胰脏经硫酸浸泡、绞碎、盐析结晶所得，其质量百分比纯度不应低于30％。糜蛋白酶原料投料1100g，加7倍量(v/w)纯化水溶解，并加2.5mol/L H2SO4溶液290ml调节pH为2.9，搅拌8小时后，放置过夜。次日搅拌，并加2.5mol/L H2SO4溶液调pH为2.5，再加2倍量(v/w)饱和硫酸铵溶液搅拌均匀，再用5mol/L NaOH溶液调pH为5.0，置25℃恒温箱，保温48小时，布氏漏斗过滤，收集滤饼，滤液弃去。过滤所得滤饼，用3倍量(v/w)纯化水溶解后，以1倍量(v/w)饱和硫酸铵盐析，25℃恒温保温24小时，反复3次，后二次滤出母液，收集待用，滤饼待活化。将以上结晶后过滤的滤饼置于不锈钢桶内，加入3倍量(v/w)纯化水，并加2.5mol/L H2SO4溶液100ml助溶。待完全溶解后，布氏漏斗过滤，收集滤液，用2.5mol/L H2SO4溶液调滤液pH至2.9，搅拌3小时。
加5mol/L NaOH溶液调pH为7.6，再加入1倍量(v/w滤饼重)0.5mol/L、pH为7.6的磷酸缓冲液，搅拌均匀得结晶物溶液，测pH为7.6，再按比例(胰蛋白酶∶结晶物溶液＝5mg∶100ml)加入胰蛋白酶，置4℃冰箱中活化72小时，活化第二天应注意其pH值，pH控制在7.6。
将以上活化液用2.5mol/L H2SO4溶液调pH为4.1，测活化液体积，按500g/L加入固体硫酸铵进行盐析，放置过夜，次日布氏漏斗过滤，弃滤液，收集滤饼1850g，加纯化水18000ml溶解，过滤，收集滤液。用10kD的超滤膜(型号：Hydrosart赛多利斯、德国赛多利斯公司)进行超滤浓缩，超滤后溶液体积为2500ml。缓慢加入480ml0.4mol/L的4℃磷酸三钠溶液，搅拌，再缓慢加入288ml1mol/L的4℃醋酸钙溶液，搅拌，用2.5M NaOH调节pH至9.00，搅拌10分钟后用3000转/分的转速冷冻离心20分钟，后续溶液扎包，约100ml/包，4℃左右透析3天，每12小时换水一次(水温控制在4℃左右)。
收集、合并透析液，加100g硅藻土，过滤，量取滤液体积，用折叠式过滤器(0.22μm孔径滤膜、德国赛多利斯公司)过滤，调节pH为6.0，滤液装盘(1000ml/盘)，送冻干机(上海东富龙科技股份有限公司)冻干得糜蛋白酶成品110203。
实施例4
实施例1～3中的三批次糜蛋白酶内毒素检测均按照2010版中国药典二部XIE“细菌内毒素检查法”。即采用鲎试剂法来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定，检测结果如下表1所示，其中阴性对照品为注射用水，阳性对照品为内毒素标准品(购于中国食品药品检定研究院)。
表1三批糜蛋白酶成品内毒素检测结果
批号 编号 内毒素含量(EU/1单位) 阴性对照 阳性对照
110201 实施例1 0.000015 -- ++
110202 实施例2 0.000026 -- ++
110203 实施例3 0.000018 -- ++
由上表可知，实施例1～3得到的三批次糜蛋白酶成品均符合2010版药典要求(2010版药典规定，每1单位糜蛋白酶中含内毒素的量应小于0.075EU)。
实施例5
糜蛋白酶原料批号091271，产自内蒙古集宁牛羊脏器加工部，糜蛋白酶糜原是新鲜牛胰脏经硫酸浸泡、绞碎、盐析结晶所得，其纯度不应低于30％。糜蛋白酶原料1000g经多步盐析、结晶、过滤、活化、盐析(具体方法参照实施例1)后的滤饼用10倍量纯化水溶解，留样500ml待测，其余经一步超滤之后得到超滤液(具体操作参照实施例1)。超滤液平均分成若干份，依次加入0.1倍超滤液体积15％(w/v)的磷酸钠、17.3％(w/v)醋酸钙溶液，分别达到磷酸根与钙离子摩尔终比例为10︰1、5︰1、2︰1、1︰1.5、1︰2、1︰5、0。用2.5M NaOH调节pH至8.5，4℃搅拌10分钟；3000rpm转速条件下，冷冻离心15分钟，收集合并滤液，参照2010版中国药典二部XIE“细菌内毒素检查法”检测内毒素含量，部分上述滤液经透析后冻干，参照2010版药典检测糜蛋白酶质量指标。
表2磷酸钙沉淀对超滤前后样品内毒素的去除水平
由表2可以看出，超滤浓缩在不影响糜蛋白酶效价的前提下可有效提高溶液中内毒素浓度，内毒素由超滤前4020EU/ml提高到19000EU/ml，使内毒素得到有效富集，利于提高后续磷酸钙沉淀内毒素去除率，未超滤糜蛋白酶溶液内毒素去除率为99.788％，超滤后糜蛋白酶溶液内毒素去除率提高到99.988％。
表3不同磷酸根、钙离子情况下内毒素去除水平
注：2010版中国药典二部规定，糜蛋白酶炽灼残渣量不应大于2.5％。
由表3可以看出，通过磷酸盐和钙离子反应生成磷酸钙凝胶可有效去除糜蛋白酶中存在的内毒素，其中磷酸根离子与钙离子最佳反应比例为1︰1.5，内毒素去除率可以高于99.98％。磷酸根过量不利于糜蛋白酶中内毒素去除，且会影响糜蛋白酶效价及炽灼残渣量。钙离子过量在不影响糜蛋白酶效价的前提下可有效去除内毒素，但会造成糜蛋白酶炽灼残渣超标。

Claims (10)

1.一种去除糜蛋白酶中的内毒素的方法，其包括下述步骤：将糜蛋白酶滤饼溶解于水中，超滤浓缩得到浓缩液，依次加入磷酸盐水溶液和钙盐水溶液，调节pH值为8～9，离心，即可。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的糜蛋白酶滤饼通过下述步骤得到：将糜蛋白酶原料用水溶解，加入硫酸调节pH值为2～3，加入饱和硫酸铵溶液盐析，加入磷酸缓冲液调节pH值为7.5～7.7，再加入胰蛋白酶进行活化，用硫酸调节pH值为3.5～4.5，加入固体硫酸铵进行盐析，即得到糜蛋白酶滤饼。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水与所述的糜蛋白酶滤饼的体积质量比为8～12ml/g；
和/或，所述的超滤浓缩采用的超滤膜为德国赛多利斯公司的Hydrosart超滤膜，截留相对分子质量是5kDa或10kDa；
和/或，所述的超滤浓缩得到的浓缩液的体积为超滤浓缩前体积的0.1～0.3倍。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐为磷酸钠和/或磷酸钾；
和/或，所述的钙盐为醋酸钙和/或氯化钙。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐水溶液与所述的浓缩液的体积比为(0.1～0.2)：1；
和/或，所述的钙盐水溶液与所述的磷酸盐水溶液的体积比为(0.5～0.7)：1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐水溶液的浓度为0.2～0.5mol/L；
和/或，所述的钙盐水溶液的浓度为0.8～1.5mol/L。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐与所述的钙盐的摩尔比为1：(0.5～2)。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐与所述的钙盐的摩尔比为1：1.5。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心的转速为3000～4000rpm。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心为冷冻离心10～30min；所述的冷冻离心的温度较佳地为4～10℃。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN88103075A (zh) * 1987-05-22 1988-12-21 武田药品工业株式会社 一种除去百日咳内毒素的方法，一种百日咳类毒素及生产方法
CN103667226A (zh) * 2013-11-23 2014-03-26 青岛康原药业有限公司 一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法

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