JP5635915B2 - シアル酸結合オリゴ糖を単離する方法、及びそのようにして得られ得るシアル酸結合オリゴ糖を含む組成物 - Google Patents

Description

本発明は、シアル酸結合オリゴ糖（シアル酸から誘導される置換基を含むオリゴ糖（以降、シアル酸含有オリゴ糖ともいう））を単離する方法及び好ましくはシアル酸結合オリゴ糖を含む組成物、好ましくはシアリルラクトース含有組成物及び特に、シアル酸含有オリゴ糖及びリンの比、及び好ましくはシアリルラクトース及びリンの比、が相対的に高い組成物に関する。さらに、本発明は得られ得る及び得られた組成物及びそれらの組成物の使用、特に幼児用食品における使用、に関する。

シアリルラクトースは、哺乳類の乳に見出される乳のオリゴ糖である。例えば牛の乳におけるこの乳のオリゴ糖の含有量は、非常に低く、ヒトの乳では該シアリルラクトースは、絶対的な意味において、かなりより高い濃度で見出されることが公知である。

シアリルラクトースは、たくさんの重要な機能を有する。従って、シアリルラクトースは、プレバイオチックな活性を有し、ビフィズス菌的効果が記載されたことは公知である。さらに、シアリルラクトースは、抗接着性であり、病原細菌及び／又はウィルス及び／又は放出される毒を結合することにより腸の感染を阻害する又は防止する重要な役割を果たすのを許し、その結果、一方ではコロニー化及び他方では毒の効果が防がれることができる。また、シアリルラクトースは幼児の成長における脳の成長を促進することができることが記載された。

そのような積極的な効果もまた他のシアル酸含有オリゴ糖に起因する。

原則として、目的は、幼児及び嬰児用食品をヒトの乳とできるだけ類似せしめることであるから、そのような食品をシアリル酸含有オリゴ糖、好ましくはシアリルラクトースで富ませる必要が（特に幼児用粉ミルクに関して）ある。これは、本発明の目的の一つでもある。

一般的にシアル酸含有オリゴ糖、特にシアリルラクトースを得るために、種々の方法がすでに先行技術において提案された。たくさんのそれらの方法は、特に遺伝的に修飾された生物から得られる酵素を使用し、そうすることにより、例えばシアリダーゼ、シアリルトランスフェラーゼ及び／又はニューラミニダーゼで、所望されるシアリル基含有オリゴ糖が形成され、それは下流の加工を通して単離されることができるところのシアリル基含有化合物、例えばシアリルラクトースの酵素的製造を目的としている。

さらに、たくさんの方法が公知であり、該方法によりシアル酸及びシアリルラクトースがクロマトグラフ技術及び／又は膜ろ過技術の組み合わせにより乳から単離される。

シアリルオリゴ糖及びシアル酸回収の現行の方法の重大な欠点は、該方法が所望される化合物を相対的に低い含有量又は濃度で与え、さらにこれらの方法において、高いリンの含有量がシアリルオリゴ糖組成物に存在することである。高い程度までリン酸化された食品は消化が悪く、少なくともあまり良くなく、系へのカルシウム及び鉄の吸収に悪影響を及ぼし得、通常の生理学的過程に必要である２価のカチオンと胃腸の管において錯体を一般的に形成し、さらに胃腸の管におけるある種の酵素の作用が阻害され得ることが記載されている刊行物が公知である。特に、幼児及び嬰児の食品では、これは問題を起こし得る。

幼児の粉ミルクにおいて、リンの量は特にたんぱく質添加により決定される。他の成分による余分のリンの添加は勧められず、しないようにすら勧められる。また、この理由から、シアリル基：リンの比ができるだけ高いシアリル酸含有オリゴ糖組成物及び特にシアリルラクトース含有組成物の供給が考えられる。

本発明の目的は、シアル酸含有オリゴ糖に関して相対的に少ないリン化合物を有する生成物をもたらす分離技術が使用される方法を提供することである。これは、該生成物を、幼児用食品に使用されるように高度に適切にする。

そのような方法は、米国特許第６，６２３，９５４号にも記載されている。この刊行物において、ラクトース及びシアリルオリゴ糖を含む乳製品の流れがフィターゼ及びβ−ガラクトシダーゼと接触され、その後該乳製品の流れはナノろ過及び／又は超ろ過に付され、そうすることにより所望されるシアリルラクトースがペプチド画分に保持され、変性ステップ及び次のマイクロろ過の後、シリアルラクトース画分が得られる方法が記載されている。任意的に、該乳製品の流れが酵素と接触されるステップの前に、正に帯電した物質が、例えばカチオン交換又は逆浸透で除去されるステップが行われてもよい。

この方法の重大な欠点は、使用される膜の結果、シアリルラクトースを含むシアリルオリゴ糖の重要な部分が回収されることができないこと、及びリン：シアリルオリゴ糖の低い比を満足する生成物が得られるまでに長時間を要し得ることである。

本発明は、低いリンの含有量を得るために酵素を使用する必要なしに実行される。さらに、本発明は高い程度の効率（高い収率）及び選択性（高い純度）を有するシアリルオリゴ糖を回収することを可能にする。

アニオン樹脂の水分含有量と得られたＳＬ回収の関係を示す図である。

この目的のために、本発明は第一の特徴において、脱脂されかつ好ましくはたんぱく質を含まない乳の流れからシアル酸結合オリゴ糖、好ましくはシアリルラクトースを単離する方法において、該乳の流れが、遊離の塩基型の第一のアニオン交換樹脂を使用する第一のアニオン交換工程に付される該方法に関する。該樹脂は、３０〜４８％の水分含有量をさらに特徴とする。次の工程において、該第一のアニオン交換工程において得られた透過液が、該シアル酸結合オリゴ糖を吸着するために第二のアニオン交換樹脂を使用する第二のアニオン交換工程に付される。該シアル酸結合オリゴ糖、好ましくはシアリルラクトースは、第二のアニオン交換樹脂、好ましくはマクロ孔性又はゲルタイプのものに結合される。マクロ孔性又はゲルタイプの第二のアニオン交換樹脂は好ましくは４５％超、最も好ましくは５０〜７０％の水分含有量を有する。

３０〜４８％の水分含有量を特徴とする第一のタイプのアニオン交換樹脂は、好ましくはゲルタイプのアニオン交換体であり、乳の流れを脱塩するが、そうすることにより、シアリル基含有オリゴ糖及び特にシアリルラクトース（該オリゴ糖もまた塩の形で存在する）を結合しない。言い換えると、これは、シアリルラクトースに対してではなく、負に帯電した鉱物に対して選択性を有するアニオン交換樹脂を含む。この目的のために、水分含有量、即ち水の含有量、は、４８％、好ましくは４５％より高くない。３５％未満の水分含有量、３０％未満の水分含有量においてはより一層、脱塩の能力が有効な方法を生み出すには低くすぎになり始める。

アニオン交換体における水分含有量は、以下の方法で測定される：樹脂の水分含有量の測定の前に、密着している水は、例えば該樹脂を布に包み、次に遠心分離に付すこと（遠心機：３０ｃｍの直径；３０００ｒｐｍ）により除去される；次に該樹脂は例えば秤量瓶において秤量される；その後、該樹脂は、１０５℃の一定の温度において４時間乾燥される；該樹脂は次に乾燥器において３０分間冷却される；その後、今度は、乾燥した樹脂の重量が測定される；水分百分率（重量％）＝［（乾燥後の重さの損失（ｇ）］／（湿った樹脂の重さ）］×１００％。

この脱塩により、負に帯電したイオンの重要な部分は除去されるが、そうすることによりの実質的な量のシアリルラクトースは（負の荷電にもかかわらず）除去されない。

挙げられるアニオン交換樹脂は、好ましくはそして通常は、遊離塩基型（ヒドロキサイド型）である、なぜならこれは最も可能性のある脱塩能力をもたらすからである。適切なアニオン交換樹脂は、強く架橋されたポリスチレン−ジビニルベンゼンゲル、例えばＤａｉａｉｏｎ ＳＡ２０Ａ、Ｄａｉａｉｏｎ ＷＡ２０Ａ（三菱製）である。

本発明者らは、脱塩に使用されるアニオン樹脂の水分含有量が、一方では灰（負に帯電した鉱物）他方では不結合（ｎｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ）のシアリルラクトース（ＳＬ）の除去に重要であることを見出した。この目的のために制御された条件で、たくさんの樹脂が試験された。

これらの測定において、制御された条件は以下の通りである：

２つのカラムからなる装置が作られる。第一のカラムは１５ｍｌのＭａｒａｔｈｏｎ Ｃ樹脂（ダウ製；カチオン交換体 Ｈ^＋型）を含み、第二のカラムは、ヒドロキサイド型で調べられるべきアニオン交換体を含む。カラムは、軟化されたＮＦ濃縮物（実施例１も参照のこと）の上を０．５ｍｌ／分の速度で通すことにより試験される。約５床体積が適用された後、ＳＬの回収が測定されることができる。水分含有量と得られたＳＬ回収の関係はさらに図１にプロットされる。

この方法の間にシアリルラクトースの損失を得ないために、得られた生成物のｐＨは好ましくはｐＨ＝３〜ｐＨ＝９の間である。これを達成するために、好ましい実施態様では、存在するカチオン（特にナトリウム及びカリウム）もまたカチオン交換樹脂で除去される。カチオン交換樹脂は、Ｈ^＋型である。好ましい形において、まずカチオンが除去され、次にアニオンが除去される。

脱塩工程の後、脱塩された乳の流れは、好ましくはマクロ孔性又はゲルタイプのアニオン交換樹脂（シアリルラクトースを捕捉し結合することができる）と接触される。理論的には、シアリルラクトースは、どのようなアニオン交換樹脂にでも結合されることができる。なぜなら鉱物の塩は現在除去されているからである。効率を高めるために、好ましくはマクロ孔性又はゲルタイプのアニオン交換樹脂の水分含有量は４５％超であり、より好ましくは５０〜７０％である。そのような樹脂において、前の工程において使用されたアニオン交換体におけるより、より大きな孔が、存在する。シアリルラクトースは、少しの体積の一般的な塩又は他の塩の溶液、好ましくは酸の塩の溶液でのアニオン交換樹脂からの単純な溶出を許す。

得られた溶出物は、好ましくは希釈された酸、例えば塩酸、の助けでｐＨ＝３〜ｐＨ＝９のｐＨに中和される。好ましくは、最終生成物のｐＨはｐＨ＝６．５である。

シアリルラクトースを結合するために適するアニオン交換体の例は：

である。

シアリルラクトースを吸着するために、樹脂は好ましくは遊離の塩基型である。アニオン交換工程の温度は、好ましくは２０℃より低く、より好ましくは、１０℃より低い。

アニオン交換樹脂からのシアリルラクトースの溶出の後に、固形分に基づいて４重量％超、好ましくは５重量％超、最も好ましくは８重量％超、例えば、約１０％のシアリルラクトースの含有量を有する生成物が得られることができる。ところで、固形分に基づくシアリルラクトースの含有量は、慣用の技術、例えばナノろ過を使用してさらに増加させられることができる。一般的に、本発明の方法に従って得られるシアリルラクトース含有量は、８〜１５％であるが、さらにより高い濃度を達成することが可能である。さらにより高い濃度に到達する一つの方法は、アニオン交換樹脂からより多くのラクトースを流し去ることである。これは、塩での溶出の前に水によるカラムのフラッシングを延長することにより達成されることができる。

第一のアニオン交換樹脂で処理されるべき乳の流れは、脂肪を含まず、少なくとも０．５未満、より好ましくは０．２未満、最も好ましくは０．１重量％未満の脂肪を含む。このミルクの画分は、たんぱく質を含まないことが非常に好ましい。特に有利なのは、ホエイの流れより一層好ましくは、ホエイパーミエート（以下、ホエイパルミエートという）から出発することである。ところで、乳が何の哺乳類に由来するのであるかは重要ではなく、出発物質が牛の乳、羊の乳、山羊の乳、らくだの乳又は馬の乳であるとき、良い結果が得られることができる。

好ましい実施態様において、乳の流れ、より好ましくはホエイの流れ、最も好ましくはホエイパルミエートの流れが、２つのアニオン交換工程のいずれかに付される前に、軟化される。この軟化工程において、多価のイオン、例えばカルシウムイオン及びリン酸イオンが乳の流れから除去される。これは、例えば、関係するイオンを沈殿させること又はこれらのイオンを例えばナトリウム及び塩素イオンに、イオン交換工程により交換することにより行われる。この実施態様は実施例１において下記に説明される。

さらに好ましい実施態様において、本発明は、軟化された乳の流れが、２つのアニオン交換工程のいずれかに付される前に、ナノろ過に付され、絶対量で（ナノろ過の前の出発の流れと比較して）より低い数の単独イオン（ｓｉｎｇｌｅ ｉｏｎ）及び非たんぱく質の窒素化合物、特に尿素、を有する濃縮物が形成される。この実施態様は実施例２において説明される。

本発明に従う方法の使用により、シアリルラクトース：リンの高い重量比を有する、シアリルラクトースを有する組成物が該方法において得られる。原則として、本発明に従うこの比は、少なくとも６以上、好ましくは７以上、より好ましくは９以上、さらにより好ましくは１０以上である。

この比を計算するために、シアリルラクトースの含有量は、生成物の単位重量当たり３’−ＳＬ及び６’−ＳＬの含有量の合計として定義される。

特に、シアリルラクトースの濃度は、アニオン交換体（ＰＡ−Ｉカラム、Ｄｉｏｎｅｘ）上のクロマトグラフ技術により測定される。シアリルラクトースはパルスアンペロメトリック検出器で検出される。シアリルラクトースの含有量は３’−シアリルラクトース及び６’−シアリルラクトースの合計として計算される。

リンの含有量は、「ＡＯＡＣ公式方法９７３．５５（水の中でのリンの分析）」に従う、生成物の単位重量当たりの（硝酸による破壊後の）リンの合計含有量として定義される。

次に、シアリルラクトースとリンとの比が計算されることができる。

ところで、乳からシアリルラクトースを単離する公知の方法は、原則としてシアリルラクトース／リンの比が５より低い生成物を与える。

本発明に従うと、軟化工程においてリン化合物の約５０〜６０％が除去され、３０〜４８％の水分含有量を有するアニオン交換体が使用される工程において、リン化合物の約３０％が除去され、好ましくはマクロ孔性又はゲルタイプのアニオン交換体が使用される工程において、リン化合物の別の約１０％が除去される。

第二の特徴において、本発明は、シアル酸含有オリゴ糖又は酸オリゴ糖、好ましくは本発明に従う方法の使用により得られ得、固形分に基づいて少なくとも４重量％のシアリルラクトース含有量を有し、６より大きいシアリルラクトース／リンの重量比を有するシアリルラクトースを含む組成物に関する。この組成物には、シアリルラクトース以外に、シアル酸、ラクトース、非たんぱく質の窒素化合物、及びおそらくたんぱく質が存在する。

好ましい実施態様は、上記の含有量及び重量比を有する。

第三の特徴において、本発明は、シアル酸含有オリゴ糖及び特にシアリルラクトースを含む組成物を、幼児用食品、特にヒトの乳におけるシアリルラクトースの含有量に該当するシアリルラクトース含有量が得られるような幼児用食品に使用する方法に関する。

これは、そのことでは、シアリルラクトースが他の用途、例えば臨床食品及び経腸食品、又は例えば顔料活性を調節すること及び／又は皮膚のダメージの減少に関する皮膚のコンディショナーにおける成分としての化粧料用途、に使用され得ないことを意味しない。

現在、本発明は、以下の非制限的な実施例において及びそれにより説明される。実施例又は上記のテキストにおいてパーセント又はｐｐｍが使用される場合、これらは、特に明記しない限り、それぞれその成分を取り込んだ組成物の重量に基づいて、それぞれ重量％及び１００万重量部当たりの成分である。

実施例１
６．６６％の固形分含有量を有するホエイパルミエートの流れが、アニオン交換樹脂（ＸＡ３１１２（Ａｐｐｌｅｘｉｏｎ製）、塩化物型）上を、そしてカチオン交換樹脂（ＸＡ ２０３３（Ａｐｐｌｅｘｉｏｎ製）、ナトリウム型）上を続けて流された。この工程において、適用される搭載量に依存して、ある量のホスフェート及びカルシウムが、それぞれ、塩素及びナトリウムイオンに交換されることが見出された。約２５床量（ＢＶ）のホエイパルミエートが使用されるとき、存在するカルシウムイオンの約９０％及び存在するホスフェートの約５０〜６０％が除去されることが見出された。典型的なパルミエート軟化の実験データが表１にまとめられる。

実施例２：
実施例１で得られた生成物が、ナノろ過を使用して濃縮された。ナノろ過は、ＮＦ−２５４０膜（ダウ）で実行された。ろ過工程の間、２０〜２５バールの範囲の膜間圧力が使用された。濃縮物は、膜の上で出発物質の連続再循環により得られた。その結果、濃縮物の固形分が増加した。このようにして、濃縮物の固形分が＞１５％に設定されたが、２０％の固形分が到達されたとき、ろ過を留めることも可能であった。このようにして、存在する鉱物の大部分が除去された。典型的なナノろ過工程の実験結果が表２にまとめられる。

実施例３
実施例２で得られた生成物の中で、約２０％の固形分含有量を有する２００リットルが以下のカラム上を連続的に通過された。
カラム１は２５リットルのカチオン交換体（Ａｐｐｌｅｘｉｏｎ ７４８Ｈ）を含んでいた。
カラム２は２５リットルのアニオン交換体（ＤＩＡＩＯＮ ＳＡ２０）を含んでいた。

樹脂は、それぞれ、Ｈ^＋及びＯＨ⁻型に至らせられた。生成物が施与されるフロー速度は、１００〜１２５リットル／時であった。「スイートオン（ｓｗｅｅｔ ｏｎ）」を排除し、「スイートオフ（ｓｗｅｅｔ ｏｆｆ）」を含めて、約２２０〜２３０リットルの生成物が得られることができた。

このようにして得られた生成物は、完全に脱塩されていたが、それでもなお、実質的にすべてのシアリルラクトースを含んでいた。一般的に、収率は９０％より高いことが見出された。この工程の典型的な結果は表３にまとめられる。

実施例４：次の工程において、実施例３の生成物に存在するシアリルラクトースは、異なるアニオン交換体に結合された。この目的のために、得られた生成物（２２０リットル）は、アニオン交換体（カラム体積＝５リットル、樹脂＝ＸＡ９０ＯＨ、Ａｐｐｌｅｘｉｏｎ製）上を流された。この処理の結果、存在する実質的にすべてのシアリルラクトースがアニオン交換樹脂に結合された。

該カラムのフラッシング後、結合したＳＬは、ある量の塩（４０リットル； ０．２Ｍ ＮａＣｌ）で該アニオン交換体を溶出することにより回収された。溶出の間、ｐＨは塩酸を使用して約ｐＨ＝６．５ に中和された。典型的な結果は表４に示される。

Claims (15)

1. 脱脂された乳の流れから、シアル酸結合オリゴ糖を単離する方法において、該乳の流れが、３０〜４８％の水分含有量を有する遊離の塩基型の第一のアニオン交換樹脂を使用する第一のアニオン交換工程に付され、続いて、該第一のアニオン交換工程において得られた透過液が、該シアル酸結合オリゴ糖を吸着するために第二のアニオン交換樹脂を使用する第二のアニオン交換工程に付される、前記方法。
2. 該乳の流れがたんぱく質を含まない、請求項１に記載の方法。
3. 該シアル酸結合オリゴ糖がシアリルラクトースである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 該第二のアニオン交換樹脂がマクロ孔性又はゲルタイプのアニオン交換樹脂である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 該第二のアニオン交換樹脂が４５％超の水分含有量を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 該第二のアニオン交換樹脂が５０〜７０％の水分含有量を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 該乳の流れとしてホエイの流れが使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 該乳の流れとしてホエイパーミエートの流れが使用される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 該乳の流れが、該第一又は該第二のアニオン交換工程のいずれかに付される前に軟化される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 該軟化がナトリウム／塩素型の複数のイオン交換樹脂を使用して行われる、請求項９に記載の方法。
11. 該軟化が、カルシウム及びホスフェートイオンを沈殿させることにより実行される、請求項９に記載の方法。
12. 該乳の流れが、該第一又は該第二のアニオン交換工程のいずれかに付される前に、ナノろ過に付されて、絶対量で、より少ない数の単独イオン及び非たんぱく質の窒素化合物を有する濃縮物が形成される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. シアル酸結合オリゴ糖を含む組成物において、少なくとも４重量％の、固形分に基づくシアリルラクトースの含有量を有し、かつ６より大きいシアリルラクトース／リンの比を有し、且つ、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を使用して得られたものである、前記組成物。
14. 該シアル酸結合オリゴ糖がシアリルラクトースである、請求項１３に記載の組成物。
15. 幼児用食品、臨床食品又は経腸食品において、請求項１３又は１４に記載の組成物を使用する方法。

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