JP2023554574A - 乳オリゴ糖の製造方法及び製造されたオリゴ糖粉末、食品 - Google Patents

Abstract

本願は、乳製品の高度な加工の技術分野に関し、具体的には、乳オリゴ糖の製造方法及び製造された乳オリゴ糖粉末、食品に関する。製造方法は、ホエイ液を少なくとも３回限外濾過し、限外濾過透過液を複数回ナノ濾過濃縮し、ナノ濾過貯留液をクロマトグラフィー分離精製し、ラクトースを含む色層分析収集液を除去し、シアリルラクトースを含む色層分析収集液を収集し、脱塩し、乾燥してオリゴ糖粉末を得るステップを含む。本願により製造された乳オリゴ糖、及び当該乳オリゴ糖を含む食品は、主に牛乳オリゴ糖であり、色が淡い黄色又は白色を呈し、風味が薄く、粒子が均一で、熱安定性に優れ、可溶性を有する。当該乳オリゴ糖は、主に３’－シアリルラクトースと６’－シアリルラクトースとを含む。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、中国特許局で提出され、出願番号が２０２１１１６４９０６５．５で、出願日が２０２１．１２．２９日で、出願名称が「乳オリゴ糖の製造方法及び製造されたオリゴ糖粉末、食品」である中国特許出願の優先権を主張し、当該出願の内容の全ては、参照により本願に組み込まれる。

本願は、乳製品の高度な加工の技術分野に関し、特に乳オリゴ糖の製造方法及び製造されたオリゴ糖粉末、食品に関する。

母乳は、新生児が生命の第１段階で唯一の栄養源である。いくつかの世紀以来、母乳は、新生児を養うように進化していき、満期児の栄養の「ゴールドスタンダード」と見なされる。母乳オリゴ糖（ヒトミルクオリゴ糖、ＨＭＯｓ）は、母乳において含有量が豊富で独特であるが、栄養面で長年にわたって無視される。現在、２００種類以上の成分が検出されており、そのうちの１００種類以上の構造が明らかにする。

母乳オリゴ糖は、巨大な構造の多様性を有する。個体の間及び授乳期間において、濃度及び成分は、大きく変化する。これらは、遊離構造で出現したり、糖タンパク質、糖脂質などの高分子と結合したりする。母乳オリゴ糖の構造は、主にグルコース、ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、及びＮ－アセチルノイラミン酸の５種類のモノマーにより構成され、各ＨＭＯｓは、いずれもラクトース残基をコアとして、繰り返しラクトサミン単位により直鎖又は分岐構造に延長される。このようにして形成された直線又は分岐構造は、フコシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼの作用によりさらにフコシル化及びシアリル化のオリゴ糖に伸長される。

最初、母乳オリゴ糖は、「ビフィズス因子」として発見され、所望の細菌の代謝基質としてもよく、優性腸内細菌叢の形成に寄与する。現在、ますます多くの証拠によると、母乳オリゴ糖は、抗接着、抗菌、腸管上皮及び免疫細胞の調節、過度の粘膜白血球浸潤及び活性化の低減、新生児壊死性小腸結腸炎の低減、ならびに乳幼児に脳の発達及び認知のための潜在的に必要な栄養素としてシアル酸を提供するという役割を果たす。従って、世界保健機関は、母乳哺育について、「少なくとも６ヶ月間の完全な母乳哺育を推奨する」を提案する。しかし、中国発展研究基金会が２０１９年２月に発表した「中国母乳哺育影響因子の調査報告書」によると、６ヶ月以内の乳児の完全な母乳哺育率は２９．２％しかなく、「中国児童発展綱要（２０１１－２０２０年）」及び「国民栄養計画（２０１７－２０３０）」から提案された２０２０年に中国の完全な母乳哺育率が５０％に達する目標との格差は、非常に大きく、世界中の平均レベル４３％及び中低収入国の平均レベル３７％を下回っている。中国の母乳哺育率が低いことは、主に、公衆の母乳哺育に対する認知不足、産休が短く、母子室の欠乏、母乳の不足、自身の職業又は疾患などに起因する。乳幼児用調合粉ミルクの誕生により、母乳で哺育が不十分又は母乳で哺育ができないベビーに十分な栄養物質を提供する。母乳オリゴ糖は、大量生産することができないため、ガラクトオリゴ糖及びフラクトオリゴ糖は、通常、乳児用調合粉ミルクに添加されるが、それら中で母乳オリゴ糖におけるフコース、シアル酸及びＮ－アセチルグルコサミンモノマーが存在しないことが研究により見出された。

乳幼児用調合粉ミルクに１～６個の母乳オリゴ糖モノマー分子を添加することは、現在大きな進歩を遂げる。これは体外、体内及び臨床試験によると、母乳オリゴ糖は、安全性と免疫効果を有することも証明されるためである。現在、高純度母乳オリゴ糖モノマー分子（２’－フコシルラクトース、ビフコシルラクトース、ラクトース－Ｎ－テトラオース、ラクトース－Ｎ－ネオテトラオース、３’－シアリルラクトース及び６’－シアリルラクトース）は、欧州連合及び米国食品薬品監督管理局（ＦＤＡ）の承認を受けており、乳幼児用調合粉ミルクの補充剤とすることができる。しかし、１種又は数種の母乳オリゴ糖モノマーを添加しただけでは、母乳におけるオリゴ糖の複雑な構造を模倣することができない。

近年、膜分離技術が急速に発展し、各業界で広く適用されているが、省エネルギー、エネルギー消費削減、相変化がなく、汚染がないなどの利点を有するため、乳製品工業において広く適用されており、例えば、精密濾過除菌、脱脂乳成分分離、ホエイ成分分離、ラクトース濃縮、逆浸透水分除去などの面において、従来方法に匹敵できない利点を示し、真の意味での副生成物の回収利用を実現することができる。そのうち、乳除菌、ホエイプロテインとカゼイン、α－ラクトアルブミン、β－ラクトグロブリン、α－カゼイン及びβ－カゼインの乳成分を膜技術で分離することは、現在、国内外研究のホットスポット課題となっている。膜分離技術は、環境に優しい物理的分離過程であり、回転、単一効用又は複効蒸発、凍結乾燥、及び噴霧乾燥に比べてエネルギー消費が少なく、分離過程において有毒で有害な有機試薬を一切添加する必要がない。また、操作温度が低く、特に熱に敏感な成分に適しており、タンパク質、ラクトース、オリゴ糖の天然構造を破壊することがなく、生産された製品は、より高い機能性を有する。乳製品の加工過程においてより多くの応用価値及び広い実用的将来性を有する。

牛ホエイは、チーズを作る際に生じる副生成物、又は精密濾過により製造される天然透過液であり、通常、廃液として排出されたり、噴霧乾燥によりホエイ粉末を製造して安価に販売される。他の家畜の乳汁に比べて、大量かつ低コストであるなどの特徴を有する。従って、母乳オリゴ糖の代替品として、ホエイ（甘性ホエイ、復元脱塩ホエイ、牛乳の精密濾過透過液などを含む）を利用して、どのようにして、牛乳オリゴ糖を大規模に抽出するかことは大きな意義を有する。現在、商業的な要求を満たすために、どの動物由来の乳汁からも母乳オリゴ糖代替物を得ることがない。

本願は、上記不足を解決するために、乳オリゴ糖の製造方法及び製造されたオリゴ糖粉末、食品を提供することを目的とする。

動物の乳オリゴ糖、特に牛乳オリゴ糖は、母乳オリゴ糖を模倣した新規な成分（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ）であり、母乳オリゴ糖の構造と生物学的機能を有する。従って、ガラクトオリゴ糖やフラクトオリゴ糖に代えて、牛乳オリゴ糖が乳幼児用調合や特殊医学などの機能性食品に適用することは、健康的な価値があるとともに、現在十分に利用されていない乳製品においてより高い付加価値を獲得する機会もある。

本願の目的を実現するために、本願により採用される技術的解決手段は、以下のとおりである。

第１の態様において、本願ではホエイ液を少なくとも３回限外濾過し、限外濾過透過液を複数回ナノ濾過濃縮し、ナノ濾過貯留液をクロマトグラフィー分離精製し、ラクトースを含む色層分析収集液を除去し、シアリルラクトースを含む色層分析収集液を収集し、脱塩し、乾燥してオリゴ糖粉末を得るステップを含む乳オリゴ糖の製造方法が提供される。

さらに、シアリルラクトースを含む色層分析収集液を収集する方法は、管ごとに色層分析収集液を収集して検出し、シアリルラクトースを含む色層分析収集液を合わせ、シアリルラクトースの検出方法がオリゴ糖検出方法を採用することである。

さらに、乾燥ステップは、凍結乾燥であり、選択可能に、凍結乾燥のステップは、脱塩後の濃縮貯留液を凍結乾燥機に入れて乾燥させるステップを含み、選択可能に、凍結乾燥は、真空凍結乾燥昇温プログラムを２０°Ｃ ２ｈ、４０°Ｃ １ｈ、５５°Ｃで終了まで乾燥するように設定し、コールドトラップ温度が－５０°Ｃであり、真空度が２．５０～６．５０ＭＰａであり、乾燥基準含水率が５％未満まで乾燥させるステップを含む。

さらに、クロマトグラフィー分離精製のステップにおいて、使用される色層分析フィラーの担体は、アガロース及びデキストラン架橋複合物又は架橋アガロースであり、前記クロマトグラフィーフィラーの担体は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０ ｉｎｃｒｅａｓｅプレパックカラム、又はＤＥＡＥアガロースゲル、又はＱ－アガロースゲルでもいい、クロマトグラフィー分離精製のステップは、
ナノ濾過貯留液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０ ｉｎｃｒｅａｓｅプレパックカラムにローディングし、流速が０．５～０．８ｍＬ／ｍｉｎであり、０．５～２ｍＬ／管を収集し、好ましく、流速が０．６ｍＬ／ｍｉｎであり、１ｍＬ／管を収集するステップ、
又は、ナノ濾過貯留液を１．５ｃｍ×２０ｃｍのＤＥＡＥアガロースゲルＦＦクロマトグラフィーカラムにローディングし、流速が１～２ｍＬ／ｍｉｎであり、０．５～１．５ｍＬ／管を収集し、好ましくに、流速が１．５ｍＬ／ｍｉｎであり、１ｍＬ／管を収集するステップ、
又は、ナノ濾過貯留液を１０ｃｍ×５０ｃｍのＱ－アガロースゲルＦＦクロマトグラフィーカラムにローディングし、流速が１５～２５ｍＬ／ｍｉｎであり、４０～６０ｍＬ／管を収集し、好ましくに、流速が２０ｍＬ／ｍｉｎであり、５０ｍＬ／管を収集するステップを含む。

本願により採用されるクロマトグラフィーフィラーは、耐熱、耐圧、高い解像度、高い化学的安定性、高い流速、高い担持量、定置洗浄可能、再利用可能、非特異的吸着が低く、回収率が高いという特徴を有し、工業的大量生産に適する。

さらに、前記ホエイ液は、チーズを作る際に生じる副生成物であるホエイ液、又は脱塩ホエイ粉末の再溶解後のホエイ液、又は脱脂後の動物乳の精密濾過により製造される透過液であり、好ましくに、前記動物乳は、牛乳であり、脱塩ホエイ粉末と水との質量比は、１：４～２０であり、
選択可能に、前記動物乳を精密濾過を経て透過液を製造する方法は以下のとおりである：脱脂後の動物乳を少なくとも３回精密濾過し、精密濾過透過液を得る、選択可能に、前記脱脂後の動物乳における脂肪の質量百分含有量は、０．１％以下であり、好ましくは０．０２％～０．１％であり、
選択可能に、動物乳を脱脂するステップは、原料乳を殺菌した後、プレート式熱交換器により４５℃～５５℃に冷却して脱脂するステップを含み、
選択可能に、少なくとも３回の精密濾過の方法は、脱脂後の動物乳を精密濾過して２～５倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第１回の精密濾過透過液を得、第１回の精密濾過貯留液に水を添加して希釈し、再度精密濾過して２～５倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第２回の精密濾過透過液を得、第２回の精密濾過貯留液に水を添加して希釈し、再度精密濾過して２～５倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第３回の精密濾過透過液を得、以下同様のことであり、好ましくは、精密濾過の回数は、５回であり、精密濾過前の脱脂後の動物乳の質量と同程度であるように水を添加して希釈し、
選択可能に、精密濾過濃縮において、採用される精密濾過膜の孔径は、５０ｎｍ～１４０ｎｍであり、選択可能に、精密濾過膜は、管状セラミック膜を採用する。セラミック膜は、分離効率が高く、効果が安定し、化学的安定性が高く、耐酸アルカリ性、耐有機溶剤性、耐細菌性、耐高温性、耐汚染性、機械的強度が高く、及び再生性能がよいという特徴を有し、分離過程が簡単で、エネルギー消費が低く、操作や保守が簡単であり、エコで環境に優しい技術である。

選択可能に、精密濾過条件は、供給液の温度が４５℃～５５℃であり、入口圧力が２～５ｂａｒであり、出口圧力が１～４ｂａｒであり、背圧が０．５～３ｂａｒであり、膜間圧力差が３ｂａｒを超えないことである。圧力が大きすぎると、膜の閉塞がひどく、濃度分極が速くなり、牛乳オリゴ糖の透過に影響を与えるからである。また、膜間圧力差が大きすぎても小さすぎても分離効率が低くなる原因とし、時間やエネルギーを要し、微生物により汚染されやすい。

本願では、脱脂後の動物乳を複数回精密濾過することは、脱脂牛乳におけるカゼインを除去して、次の段階の限外濾過膜の汚染を防止するとともに、より多くの牛乳オリゴ糖を分離できるようにするためである。

さらに、少なくとも３回の限外濾過の方法は以下のとおりである、精密濾過透過液を限外濾過して２～７倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第１回の限外濾過透過液を得、第１回の限外濾過貯留液に水を添加して希釈し、再度限外濾過して２～７倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第２回の限外濾過透過液を得、第２回の限外濾過貯留液に水を添加して希釈し、再度限外濾過して２～７倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第３回の限外濾過透過液を得、以下同様のことであり、好ましくは、限外濾過の回数は、６回であり、好ましくは水を添加して希釈する水の添加量は、希釈対象の限外濾過貯留液の量と近い。

さらに、限外濾過ステップにおいて、使用される限外濾過膜の貯留分子量は、５ＫＤａ～３０Ｋｄａであり、選択可能に、限外濾過膜は、複合管式の有機膜である。有機膜は、有効膜面積が大きく、価格が低く、投資が少なく、孔径分布が均一で、操作や洗浄が容易である。

さらに、限外濾過条件は、供給液の温度が２０℃～４５℃であり、入口圧力が６～９ｂａｒであり、出口圧力が５～８ｂａｒであることであり、選択可能に、膜間圧力差が３ｂａｒを超えない。

さらに、複数回のナノ濾過濃縮の方法は、限外濾過透過液をナノ濾過して２～１３倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第１回のナノ濾過貯留液を得、第１回のナノ濾過貯留液に水を添加して希釈し、再度限外濾過して２～１３倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第２回のナノ濾過貯留液を得、第２回のナノ濾過貯留液に水を添加して希釈し、再度ナノ濾過して２～１３倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第３回のナノ濾過貯留液を得、以下同様のことであり、好ましくに、ナノ濾過の回数は、６回であり、選択可能に、水を添加して希釈する水の添加量は、希釈対象のナノ濾過貯留液の量と近い。

さらに、ナノ濾過ステップにおいて、使用されるナノ濾過膜の貯留分子量は、１００Ｄａ～３０００Ｄａであり、選択可能に、ナノ濾過ステップにおいて、ナノ濾過膜は、複合管式の有機膜である。

さらに、ナノ濾過条件は、供給液の温度が２０～４５℃であり、入口圧力が１６～２０ｂａｒであり、出口圧力が１４～１８ｂａｒであることであり、選択可能に、膜間圧力差が３ｂａｒを超えない。

さらに、脱塩ステップは、ナノ濾過脱塩又は電気透析脱塩を採用し、
選択可能に、ナノ濾過脱塩ステップは、色層分析収集液をナノ濾過して分離し、伝導率が低下しないまで脱イオン水で洗浄濾過し、機器の最小循環体積まで濃縮してナノ濾過濃縮貯留液を得、ナノ濾過濃縮が終了するステップを含み、選択可能に、ナノ濾過脱塩において、採用されるナノ濾過膜の貯留分子量が１００Ｄａ～５００Ｄａであり、選択可能に、ナノ濾過脱塩において、採用されるナノ濾過膜は、複合管式の有機膜であり、選択可能に、ナノ濾過脱塩において、条件は、供給液の温度が２０～４５℃であり、入口圧力が１０～１５ｂａｒであり、出口圧力が５～１０ｂａｒであるように設定し、選択可能に、膜間圧力差が３ｂａｒを超えなく、
選択可能に、電気透析ステップは、色層分析収集液を電気透析機器に入れて透析を行い、電流が変化しなくなる時、脱塩が終了し、選択可能に、電気透析の条件は、電圧を８Ｖに調整し、材料流速が５０Ｌ／ｈであり、超純水流速が５０Ｌ／ｈであり、極液流速が４５Ｌ／ｈであるように設定する。

さらに、ナノ濾過透過液を逆浸透濃縮し、プロセス内で適用な脱イオン水を生成するステップをさらに含み、
選択可能に、逆浸透濃縮ステップは、具体的に、前記ナノ濾過透過液を逆浸透して機器の最小循環体積まで濃縮して逆浸透透過液を得、逆浸透が終了するステップを含み、
選択可能に、逆浸透ステップにおいて、使用される膜の安定な塩除去率は、９９．５％であり、
選択可能に、逆浸透条件は、供給液の温度が２０～４５℃であり、入口圧力が１６～２０ｂａｒであり、出口圧力が１４～１８ｂａｒであることであり、選択可能に、膜間圧力差が３ｂａｒを超えない。

さらに、前記限外濾過、ナノ濾過、逆浸透のステップは、集積化された限外濾過－ナノ濾過－逆浸透装置を採用する。

別の態様において、提供されるオリゴ糖粉砂糖は、前記方法により製造された乳オリゴ糖粉末であり、選択可能に、前記乳オリゴ糖粉末は、シアリルラクトースを含み、選択可能に、シアリルラクトースは、３’－シアリルラクトースと６’－シアリルラクトースとを含み、選択可能に、前記乳オリゴ糖粉末における３’－シアリルラクトース及び６’－シアリルラクトースの総質量百分含有量は、２５％以上である。

さらに別の態様において、提供されるオリゴ糖食品又は健康食品は、前記方法により製造されたオリゴ糖粉末又は上記オリゴ糖粉砂糖を含む。

オリゴ糖食品又は健康食品は、前記方法により製造されたオリゴ糖粉末を含み、選択可能に、前記オリゴ糖粉末は、シアリルラクトースを含み、選択可能に、シアリルラクトースは、３’－シアリルラクトースと６’－シアリルラクトースとを含む。

（１）本願は、少なくとも３回の限外濾過を採用し、ホエイ液におけるホエイプロテインを効果的に除去し、次の段階のナノ濾過膜の汚染を回避し、より多くの牛乳オリゴ糖を分離させることができ、複数回のナノ濾過濃縮を採用し、水分及び一部のラクトースを除去し、非プレバイオティクス成分の干渉を最大限に減少するとともに、乾物含有量を向上させることができ、クロマトグラフィーによる分離は、残留するラクトースを除去することで、主にシアリルオリゴ糖を含む製品を得るためであり、脱塩は、クロマトグラフィーに導入されたＮａＣｌを除去するためである。

（２）本願により製造された乳オリゴ糖、及び当該乳オリゴ糖を含む食品は、主に天然の牛乳オリゴ糖であり、色が淡い黄色又は白色を呈し、風味が薄く、粒子が均一で、熱安定性に優れ、可溶性を有する。当該乳オリゴ糖は、主に３’－シアリルラクトースと６’－シアリルラクトースとを含む。

（３）本願は、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、逆浸透、クロマトグラフィー、凍結乾燥技術を採用して得られた牛乳オリゴ糖粉末であり、伝統的なバイオテクノロジー技術に比べて、発酵や酵素変換を経ることなく、牛乳オリゴ糖の天然構造を保持し、加工品質特性に優れ、風味が純粋であり、食品産業において広い適用将来性を有する。

１つ又は複数の実施例は、これらに対応する図面の中の写真により例示的に説明し、これらの例示的な説明は、実施例を限定するものではない。本明細書において、専門用語「例示的」は、「例、実施例、又は説明的なものとして機能する」を意味する。本明細書において、「例示的」として説明されるいかなる実施例は、必ずしも他の実施例よりも優れ又は好ましいものとして解釈されるべきではない。
本願の実施例１の精密濾過ステップにおける各段階の牛乳オリゴ糖の透過率の柱状グラフである。 本願の実施例１、２における脱脂牛乳の膜分離過程における脱脂牛乳、精密濾過透過液、精密濾過貯留液及び浸透液、限外濾過透過液及び限外濾過貯留液のポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。 本願の実施例２の復元脱塩ホエイ粉末液の限外濾過の各段階における牛乳オリゴ糖透過率の柱状グラフである。 本願の実施例２の復元脱塩ホエイ粉末液の膜分離過程における復元脱塩ホエイ粉末液、限外濾過透過液及び限外濾過貯留液のポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。 本願の実施例３のナノ濾過濃縮の各段階における牛乳オリゴ糖の貯留率の柱状グラフである。 本願の実施例５のＳｕｐｅｒｄｅｘ３０ ｉｎｃｒｅａｓｅプレパックカラムによるナノ濾過貯留液の分離精製図である。 本願の実施例５のＤＥＡＥアガロースゲルＦＦによるナノ濾過貯留液の分離精製図である。 本願の実施例５のＱ－アガロースゲルＦＦによるナノ濾過貯留液の分離精製図である。 比較例１のＡＮＸアガロースゲルクロマトグラフィーによるナノ濾過貯留液の分離精製図である。 比較例１のＣＭ－アガロースゲルＦＦクロマトグラフィーによるナノ濾過貯留液の分離精製図である。 比較例１のＱＸＬリポ多糖ゲルクロマトグラフィーによるナノ濾過貯留液の分離精製図である。 比較例１のＳＰアガロースゲルＦＦクロマトグラフィーによるナノ濾過貯留液の分離精製図である。 比較例１のＳＰアガロースゲルＸＬクロマトグラフィーによるナノ濾過貯留液の分離精製図である。 比較例２の活性炭によるオリゴ糖の回収率及びラクトースの除去率である。 比較例３の異なる分子量の透析バッグによるオリゴ糖の回収率及びラクトースの除去率である。 比較例４の異なる結晶方式による牛乳オリゴ糖の回収率及びラクトースの除去率である。 本願の実施例６の脱塩過程におけるナノ濾過脱塩率の柱状グラフである。 本願の実施例６の脱塩過程における電気透析脱塩率の柱状グラフであり、そのうち、導電率単位：ｍＳ／ｃｍ、電流単位：Ａ、電圧単位：Ｖ、柱体積高さ単位：ｃｍとする。 本願の実施例７の牛乳オリゴ糖粉末の写真図である。

本願の実施例の目的、技術的解決手段及び利点をより明瞭にするために、以下、本願の実施例における技術的解決手段を明瞭且つ完全に記述し、明らかに、記述された実施例は、本願の一部の実施例に過ぎず、全ての実施例ではない。本願における実施例に基づき、当業者が創造的な労力を払わない前提で得られた全ての他の実施例は、いずれも本願の保護範囲に属する。

また、本願をよりよく説明するために、以下の具体的な実施形態では、多くの具体的な詳細について述べる。しかし、当業者にとっては、本願がこれら特定の詳細がなくても実施可能であることを理解すべきである。いくつかの実施例では、本願の趣旨の強調を容易にするために、当業者に知られている原料、要素、方法、手段などの詳細について詳しく説明しない。

別に明確に示さない限り、明細書及び特許請求の範囲全体において、用語「含む」又はその変換「包含」又は「有する」などは、記載された要素又は構成要素を含むものとして理解されるべきであるが、他の要素又は他の構成要素は除外されない。

本願は、ラクトースのみを指し、シアリルラクトースと互いにクロスする関係がなく、本願のラクトースは、１，４－ガラクトシルセルロースを指し、シアリルラクトースは、プレバイオティクスのオリゴ糖に属し、本願のホエイ液から分離されたオリゴ糖は、主にシアリルラクトースである。

本願は、乳オリゴ糖の製造方法を提供し、採用されるホエイ液の原料は、３つの供給源を有することができ、１）ホエイ液は、チーズを作る際に生じる副生成物であるホエイ液であり、２）脱塩ホエイ粉末の再溶解後のホエイ液であり、３）脱脂後の動物乳（一般的に牛乳を採用する）を精密濾過して製造される透過液であり、
そのうち、チーズを作る際に生じる副生成物であるホエイ液、又は脱塩ホエイ粉末の再溶解後のホエイ液は、直接又は単純に濾過した後、直接限外濾過を行うことができ、一般的に、脱塩ホエイ粉末の再溶解後のホエイ液は、脱塩ホエイ粉末と水とを質量比１：４～２０で製造して得られる。

以下の実施例及び比較例において、ラクトース及び牛乳オリゴ糖の検出方法は、以下のとおりである。

牛乳オリゴ糖の検出方法：脱脂牛乳を１００倍に希釈し、透過液を２倍に希釈し、０．２２μｍナイロン濾過膜をかけた後、原液及び分離して得られたオリゴ糖試料をそれぞれ１００マイクロリットルずつ分取し、０．５モルの２－アミノベンズアミド（２－アミノベンズアミドを誘導体化試薬とする）と１モルの２－メチルピリジンボラン複合物（２－メチルピリジンボラン複合物を糖類標識還元アミノ化試薬とする）をそれぞれ５０マイクロリットル添加し、そのうち、２－アミノベンズアミドと２－メチルピリジンボラン複合物の溶液に使用する溶媒は、いずれも体積比８５：１５でのジメチルスルホキシドと酢酸の混合溶液であり、均一に混合した後に６５℃で２．５ｈ誘導体化し、取り出して室温まで冷却し、続いて液相バイアルにローディングして検出を行う。そのうち、移動相は、１００ミリモルのギ酸アンモニウム溶液（ｐＨ＝４．５）及びアセトニトリル溶液である。クロマトグラフィーカラムは、Ｗａｔｅｒｓ ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ｇｌｙｃａｎ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅクロマトグラフィーカラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、１．７μｍ）であり、クロマトグラフィーカラムの温度は、５２℃に設定する。蛍光検出器の励起波長と発光波長は、それぞれ２５０ｎｍと４２５ｎｍである。

ラクトース検出方法：脱脂乳を１００００倍に希釈し、透過液を１００～５０００倍に希釈し、貯留液を１００～５０００倍に希釈し、希釈試料１００マイクロリットルを分取し、０．５モルの２－アミノベンズアミド（２－アミノベンズアミドを誘導体化試薬とする）と１モルの２－メチルピリジンボラン複合物（２－メチルピリジンボラン複合物を糖類標識還元アミノ化試薬とする）を５０マイクロリットル添加し、そのうち、２－アミノベンズアミドと２－メチルピリジンボラン複合物の溶液に使用する溶媒は、いずれも体積比８５：１５でのジメチルスルホキシドと酢酸の混合溶液であり、均一に混合した後に６５℃で２．５ｈ誘導体化し、取り出して室温まで冷却し、続いて液相バイアルにローディングして検出を行う。そのうち、移動相は、１００ミリモルのギ酸アンモニウム溶液（ｐＨ＝４．５）及びアセトニトリル溶液である。クロマトグラフィーカラムは、Ｗａｔｅｒｓ ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ｇｌｙｃａｎ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅクロマトグラフィーカラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、１．７μｍ）であり、クロマトグラフィーカラム温度は、５２℃に設定する。蛍光検出器の励起波長と発光波長は、それぞれ２５０ｎｍと４２５ｎｍである。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法：試料を希釈した後、それぞれ２×試料緩衝液と１：１の体積比で混合し、沸騰水浴５ｍｉｎで１０μＬをローディングする。試料電圧は、１４０Ｖであり、ブロモフェノールブルーの下端が下縁から１ｃｍ離れた時に電気泳動を終了する。電気泳動が終了した後、クマシーブリリアントブルーＧ２５０染色液で１ｈ染色し、バンドが明瞭になるまで脱色液で４ｈ脱色した後に撮像する。そのうち、電気泳動支持媒体は、グラジエントゲルにより構成され、グラジエントゲルは、６～１８％の濃度のプレゲルである。そのうち、ＳＤＳ－ＰＡＧＥランニング溶液、プレゲル、染色液、及び脱色液は、いずれも南京金斯瑞有限公司から購入する。
（実施例１）

ホエイ液は、脱脂後の動物乳（一般的には牛乳を採用する）を精密濾過して製造した透過液である場合、製造方法は、以下のとおりであってもよい：
一般的には、まず原料乳に対して滅菌と脱脂処理を行い、原料乳のパスツール殺菌は、まず原料乳を７２～８５℃で１５～３０ｓ加熱することで、生産過程全体における微生物の成長と繁殖を抑制するとともに、ホエイプロテインの変性を防止することを含む。原料乳を殺菌した後、プレート式熱交換器により４５℃～５５℃に冷却して脱脂するか、又は脱脂後、１～４℃に冷却して貯蔵し、一時貯蔵された脱脂牛乳を６～４８時間内に消耗し完了する必要があり、加工時にプレート式熱交換器により４５℃～５５℃に加熱し、上記方法において、前記脱脂牛乳における脂肪の質量百分含有量は、０．１％未満で、具体的には０．０２％～０．１％であってもよく、これにより、脂肪球による精密濾過孔の閉塞を防止し、
脱脂後の牛乳の精密濾過の１つの操作の実施例は、以下のとおりであってもよい：
（１）５回の精密濾過濃縮において、脱脂牛乳４８Ｌを精密濾過機器に入れ、冷媒装置を開放することで温度を５０℃に安定化させ、膜材料として孔径１００ｎｍの管状セラミック膜を選択し、入口圧力が５ｂａｒであり、出口圧力が４ｂａｒであり、背圧が３ｂａｒであった。

脱脂牛乳を精密濾過して３倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第１回の精密濾過透過液を得、第１回の精密濾過が終了し、
さらに添加された水と第１回の精密濾過貯留液との総質量が原脱脂牛乳と等しくなるまで脱イオン水３２ｋｇを一度に添加し、引き続き精密濾過して３倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第２回の精密濾過透過液を得、第２回の精密濾過が終了し、
さらに添加された水と第２回の精密濾過貯留液との総質量が原脱脂乳と等しくなるまで脱イオン水３２ｋｇを一度に添加し、引き続き精密濾過して３倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第３回の精密濾過透過液を得、第３回の精密濾過が終了し、
さらに添加された水と第３回の精密濾過貯留液との総質量が原脱脂乳と等しくなるまで脱イオン水３２ｋｇを一度に添加し、引き続き精密濾過して３倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第４回の精密濾過透過液を得、第４回の精密濾過が終了し、
さらに添加された水と第４回の精密濾過貯留液との総質量が原脱脂乳と等しくなるまで脱イオン水３２ｋｇを一度に添加し、引き続き精密濾過して３倍の濃縮倍率まで濃縮した時、第５回の精密濾過が終了し、合計精密濾過透過液１６０ｋｇを得た。

膜分離過程において、脱脂牛乳、貯留液、及び浸透液に対してオリゴ糖及びラクトースの検出を行い、その結果を図１に示した。

また、膜分離過程において、脱脂牛乳、精密濾過貯留液、及び第１、２、３、４及び５回の精密濾過透過液に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、そのうち、脱脂乳を１０倍に希釈し、精密濾過貯留液を２６倍に希釈し、精密濾過透過液を２倍に希釈し、その結果を図２に示した。

図１から明らかなように、精密濾過浸透液は、脱脂牛乳に比べて、牛乳オリゴ糖９１．０５％を含む。図２は、カゼインが実質的に透過しないことを示した。この現象から、使用されるセラミック膜により、牛乳オリゴ糖の透過とホエイプロテインの透過が可能であり、それとカゼインとの分離を実現し、次のステップの限外濾過膜の汚染が低減されることが証明された。
（実施例２）

６回の限外濾過濃縮において、
実施例１で得られた精密濾過透過液１６０Ｌを集積化した限外濾過－ナノ濾過－逆浸透機器に入れ、
又は脱塩ホエイ粉末８ｋｇを１６０Ｌに定容して集積化した限外濾過－ナノ濾過－逆浸透機器に入れ、
復元脱塩ホエイ粉末溶液に対して、それぞれ以下の限外濾過操作を行う：
まず溶液を限外濾過して６．４倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第１回の限外濾過透過液を得、第１回の限外濾過が終了し、
さらに脱イオン水２５ｋｇを一度に添加し、引き続き限外濾過して２倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第２回の限外濾過透過液を得、第２回の限外濾過が終了し、
さらに脱イオン水２５ｋｇを一度に添加し、引き続き限外濾過して２倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第３回の限外濾過透過液を得、第３回の限外濾過が終了し、
さらに脱イオン水２５ｋｇを一度に添加し、引き続き限外濾過して２倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第４回の限外濾過透過液を得、第４回の限外濾過が終了し、
さらに脱イオン水２５ｋｇを一度に添加し、引き続き限外濾過して２倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第５回の限外濾過透過液を得、第５回の限外濾過が終了し、
さらに脱イオン水２５ｋｇを一度に添加し、引き続き限外濾過して２倍の濃縮倍率まで濃縮した時、第６回の限外濾過が終了し、合計限外濾過透過液２６０ｋｇを得、
本実施例で使用される限外濾過膜の貯留分子量は、５ＫＤａ～３０Ｋｄａであり、選択可能に、限外濾過膜は、複合管式の有機膜であった。

復元脱塩ホエイ粉末溶液、限外濾過透過液、限外濾過貯留液に対して、オリゴ糖検出、ラクトース検出及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行い、そのうち、限外濾過貯留液を４倍に希釈し、オリゴ糖検出の結果を図３に示した。復元脱塩ホエイ粉末溶液及びその限外濾過透過液、貯留液のＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を図４に示した。

図３から明らかなように、復元脱塩ホエイ粉末溶液の限外濾過透過液は、牛乳オリゴ糖９６．９２％を含み、図４と組み合わせて、ホエイプロテインが大幅に貯留されることを説明し、使用された限外濾過有機膜が牛乳オリゴ糖とホエイプロテインを分離することができ、次のステップのナノ膜の汚染を低減することが十分に証明された。

脱脂牛乳の精密濾過透過液を限外濾過することで、その限外濾過透過液における牛乳オリゴ糖の含有量も９６％以上に達することができ、復元脱塩ホエイ粉末溶液の限外濾過透過液の成分と近く、脱塩ホエイ粉末のコストが生牛乳よりもはるかに低く、脱塩ホエイ粉末の取得及び貯蔵が容易であるため、復元脱塩ホエイ粉末溶液の限外濾過透過液を例に、次のステップの操作を行う。
（実施例３）

６回のナノ濾過濃縮：
実施例２で得られた復元脱塩ホエイ粉末溶液の限外濾過透過液２６０ｋｇを限外濾過－ナノ濾過－逆浸透機器に入れることで、過剰な水分を除去する、限外濾過透過液をナノ濾過して１３倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第１回のナノ濾過貯留液を得、第１回のナノ濾過が終了し、
さらに脱イオン水２０ｋｇを一度に添加し、引き続きナノ濾過して２倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第２回のナノ濾過貯留液を得、第２回のナノ濾過が終了し、
さらに脱イオン水２０ｋｇを一度に添加し、引き続きナノ濾過して２倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第３回のナノ濾過貯留液を得、第３回のナノ濾過が終了し、
さらに脱イオン水２０ｋｇを一度に添加し、引き続きナノ濾過して２倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第４回のナノ濾過貯留液を得、第４回のナノ濾過が終了し、
さらに脱イオン水２０ｋｇを一度に添加し、引き続きナノ濾過して２倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第５回のナノ濾過貯留液を得、第５回のナノ濾過が終了し、
さらに脱イオン水２０ｋｇを一度に添加し、引き続きナノ濾過して２倍の濃縮倍率まで濃縮した時、第６回のナノ濾過が終了し、合計１７ｋｇのナノ濾過貯留液を得た。

本実施例で使用されたナノ濾過膜の貯留分子量は、１００Ｄａ～３０００Ｄａであり、選択可能に、ナノ濾過膜は、複合管式の有機膜であった。

ナノ濾過貯留液に対してオリゴ糖検出を行い、オリゴ糖検出の結果を図５に示した。図５から明らかなように、限外濾過透過液をナノ濾過濃縮する時、ナノ濾過貯留液は、牛乳オリゴ糖９８．３０％を保留することができる。
（実施例４）

一回の逆浸透濃縮：
実施例３で得られたナノ濾過透過液を逆浸透濃縮することで脱イオン水を得、プロセスにおける水が必要な場所を補充することにより、エコな生産試行を達成する。
実施例３で得られたナノ濾過透過液３４０Ｌを限外濾過－ナノ濾過－逆浸透機器に入れ、２０倍逆浸透濃縮し、一回逆浸透透過液を得、逆浸透濃縮が終了した。
その結果によると、逆浸透により製造された水の導電率が２～５ｕＳ／ｃｍであり、プロセスにおける需要用水を満たし、再利用が可能であり、全過程においてエコ（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ）で汚染がなく、有害物質の残留がないことを示した。
（実施例５）

クロマトグラフィー分離精製：
実施例３で得られたナノ濾過貯留液をクロマトグラフィー分離することで非プレバイオティクス物質（ラクトース）を除去する。３つの分離方法に使用されるクロマトグラフィーカラムは、それぞれＳｕｐｅｒｄｅｘ３０ ｉｎｃｒｅａｓｅプレパックカラム、ＤＥＡＥアガロースゲルＦＦ、及びＱ－アガロースゲルＦＦであり、いずれもＣｙｔｉｖａ会社から購入した。

ａ）実施例３で得られたナノ濾過貯留液５００μＬをＳｕｐｅｒｄｅｘ３０ ｉｎｃｒｅａｓｅプレパックカラムにローディングし、流速が０．６ｍＬ／ｍｉｎであり、１ｍＬ／管を収集し、各管の収集液に対してオリゴ糖及びラクトース検出を行い、その検出結果を図６に示した。

ｂ）実施例３で得られたナノ濾過貯留液５００μＬをＤＥＡＥアガロースゲルＦＦクロマトグラフィーカラム（１．５ｃｍ×２０ｃｍ）にローディングし、流速が１．５ｍＬ／ｍｉｎであり、１ｍＬ／管を収集し、各管の収集液に対してオリゴ糖及びラクトース検出を行い、その検出結果を図７に示した。

ｃ）実施例３で得られたナノ濾過貯留液１ＬをＱ－アガロースゲルＦＦ（１０ｃｍ×５０ｃｍ）にローディングし、流速が２０ｍＬ／ｍｉｎであり、５０ｍＬ／管を収集し、各管の収集液に対してオリゴ糖及びラクトース検出を行い、その検出結果を図８に示した。

図６～図８から明らかなように、これら３種の方法は、いずれもシアリルラクトースと非プレバイオティクス物質（ラクトース）との分離を満たすことができ、牛乳オリゴ糖の工業化が可能となった。

本願の出願人は、開発の過程において、ＡＮＸアガロースゲルクロマトグラフィー、ＣＭ－アガロースゲルＦＦクロマトグラフィー、ＱＸＬリポ多糖ゲルクロマトグラフィー、ＳＰアガロースゲルＦＦクロマトグラフィー及びＳＰアガロースゲルＸＬクロマトグラフィーを採用してオリゴ糖及びラクトースの分離を試みたが、効果が理想的ではなく、詳しくは、比較例１を参照されたい。
（比較例１）

他のクロマトグラフィー分離精製：
１）実施例３で得られたナノ濾過貯留液１００μＬをＡＮＸアガロースゲルクロマトグラフィーカラム（０．７ｃｍ×２．５ｃｍ）にローディングし、流速が０．１ｍＬ／ｍｉｎであり、０．２ｍＬ／管を収集し、各管の収集液に対してオリゴ糖及びラクトース検出を行い、その検出結果を図９に示した。

２）実施例３で得られたナノ濾過貯留液１００μＬをＣＭ－アガロースゲルＦＦクロマトグラフィーカラム（０．７ｃｍ×２．５ｃｍ）にローディングし、流速が０．１ｍＬ／ｍｉｎであり、０．２ｍＬ／管を収集し、各管の収集液に対してオリゴ糖及びラクトース検出を行い、その検出結果を図１０に示した。

３）実施例３で得られたナノ濾過貯留液１００μＬをＱＸＬリポ多糖ゲルクロマトグラフィーカラム（０．７ｃｍ×２．５ｃｍ）にローディングし、流速が０．１ｍＬ／ｍｉｎであり、０．２ｍＬ／管を収集し、各管の収集液に対してオリゴ糖及びラクトース検出を行い、その検出結果を図１１に示した。

４）実施例３で得られたナノ濾過貯留液１００μＬをＳＰアガロースゲルＦＦクロマトグラフィーカラム（０．７ｃｍ×２．５ｃｍ）にローディングし、流速が０．１ｍＬ／ｍｉｎであり、０．２ｍＬ／管を収集し、各管の収集液に対してオリゴ糖及びラクトース検出を行い、その検出結果を図１２に示した。

５）実施例３で得られたナノ濾過貯留液１００μＬをＳＰアガロースゲルＸＬクロマトグラフィーカラム（０．７ｃｍ×２．５ｃｍ）にローディングし、流速が０．１ｍＬ／ｍｉｎであり、０．２ｍＬ／管を収集し、各管の収集液に対してオリゴ糖及びラクトース検出を行い、その検出結果を図１３に示した。

図９～図１３から明らかなように、ＡＮＸアガロースゲルクロマトグラフィー、ＣＭ－アガロースゲルＦＦクロマトグラフィー、ＱＸＬリポ糖ゲルクロマトグラフィー、ＳＰアガロースゲルＦＦクロマトグラフィー及びＳＰアガロースゲルＸＬクロマトグラフィーの５種のイオンクロマトグラフィーフィラーを採用しても、シアリルラクトースと非プレバイオティクス物質（ラクトース）とを効果的に分離することができなかった。

本願の出願人は、開発の過程において、他の分離精製方法を試みたが、詳しくは、比較例２～４を参照されたい。
（比較例２）

活性炭吸着：
実施例３のナノ濾過貯留液を凍結乾燥して粗牛乳オリゴ糖粉末を得、粉末５００ｍｇ及び活性炭３ｇを異なるエタノール溶液（５、１０及び１５％）１００ｍＬに溶解することでＢＭＯの吸着及びラクトースの脱着の最適な濃度を測定する。次いで３０分間撹拌し、終了後に混合物をＷｈａｔｍａｎ 番号１の濾過紙で真空下で濾過し、活性炭を対応するエタノール溶液２５ｍＬで洗浄した。さらに、エタノール（５０％、ｖ／ｖ）１００ｍＬで、活性炭から牛乳オリゴ糖を脱着した。混合物を３０分間撹拌し、前述のように濾過した。濾過液を５０℃の真空条件下で蒸発させ、５ｍＬの脱イオン水に溶解させた。本比較例の活性炭は、シグマアルドリッチ公司から購入した。

オリゴ糖及びラクトース検出を行い、その結果を図１４に示し、結果によると、本比較例の活性炭の吸着では、ラクトースを効果的に除去できないことが明らかになった。
（比較例３）

透析バッグの取り除き：
実施例３のナノ濾過貯留液を、分子量１００～５００Ｄａ、５００～１０００Ｄａの透析バッグにそれぞれ入れ、脱イオン水で４℃で４８時間透析した。本比較例の透析バッグは、上海源葉有限公司から購入した。

オリゴ糖及びラクトース検出を行い、その結果を図１５に示し、結果によると、本比較例の１００～５００Ｄａの透析透過バッグのラクトース除去率は、８１％程度のみであるが、オリゴ糖の貯留回収率は、理想的ではなく、５００～１０００Ｄａの方がラクトースをよりよく除去できるが、それに応じて、オリゴ糖の回収率も大幅に低下することが明らかになった。
（比較例４）

結晶化方法：
実施例３のナノ濾過貯留液を結晶化することでラクトース母液を生産した。ナノ濾過貯留液をロータリーエバポレーターにより５０°Ｂｅ´まで濃縮し、そのうち２部に０．０２％の種結晶を添加してそれぞれ室温及び４℃で結晶化し、他の２部は、同じ条件で種結晶を添加せず対照とした。上澄み液を得た後、結晶化ラクトースを少量の氷水（４℃）で洗浄した。次に、オリゴ糖の収率とラクトースの除去率に基づいて結晶化条件を選別した。ラクトース種結晶は、米国ヒルマ公司から購入した。

オリゴ糖及びラクトース検出を行い、その結果を図１６に示し、結果によると、本比較例の結晶化方法によるラクトース除去効果も理想的ではないことが明らかになった。

上記比較例２～３の結果によると、活性炭吸着と結晶化方法によれば、大量のオリゴ糖を回収することができるが、大量のラクトースも回収し、非プレバイオティクス物質の含有量が向上し、牛乳オリゴ糖の生物活性に影響を及ぼすおそれがあることが明らかになった。透析バッグ方法によれば、ラクトース除去率が高いものの、大量の牛乳オリゴ糖が失われる。従って、これら３種の方法は、いずれもシアリルラクトースと非プレバイオティクス物質（ラクトース）との分離を満たすことができず、工業的な要求を満たすことができない。
（実施例６）

ナノ濾過又は電気透析脱塩：
実施例５における３’－シアリルラクトースと６’－シアリルラクトースの色層分析収集液を合わせて（実施例５における３種のクロマトグラフィーフィラーは、いずれも牛乳オリゴ糖を効果的に分離することができ、そのうちの１つ以上のクロマトグラフィー収集液を分取してもよいが、本実施例ではＱ－アガロースゲルＦＦにより分離精製した収集液を採用し）、続いてナノ濾過スルコトデすることで食塩を除去する。使用された膜ユニットは、それぞれ１００Ｄａであった。

又は合わせ液を電気透析機器に入れて脱塩した。

オリゴ糖の検出方法は、上記と同様であり、いずれも上記２種の試薬で誘導体化して
試料を測定した。

ナノ濾過脱塩：実施例５の合わせ液１１００ｍＬをナノ濾過機器に添加し、入口圧力を１０ｂａｒに調整し、出口圧力を５ｂａｒに調整し、透過液が透過していくことにつれて、引き続き脱イオン水９Ｌを補給し、この時に導電率が変化しなくなり、試験を終了し、その結果を図１７に示した。

電気透析脱塩において、実施例５の合わせ液１７００ｍＬを電気透析機器に添加し、電圧を８Ｖに調整し、材料流速が５０Ｌ／ｈであり、超純水流速が５０Ｌ／ｈであり、極液流速が４５Ｌ／ｈであり、電流が変化しなくなる時、試験を終了し、その結果を図１８に示した。

図１７～１８から明らかなように、ナノ濾過脱塩及び電気透析脱塩の合計脱塩率は、それぞれ９６．６１％及び９４．５％であり、これら２種の方法がいずれも優れた脱塩率を有することを説明し、相対的にナノ濾過脱塩効率が高く、化学汚染がなく、好ましくはナノ濾過脱塩である。
（実施例７）

凍結乾燥において、
実施例６の脱塩後の牛乳オリゴ糖溶液を凍結乾燥して牛乳オリゴ糖粉末を得た。

具体的には、まず凍結乾燥機の試料棚板に置いて予備凍結し、プロセスに応じて、真空凍結乾燥の昇温プログラムを２０℃－２ｈ、４０℃－１ｈ、５５℃で終了まで乾燥するように設定した。コールドトラップ温度が－５０°Ｃであり、真空度が２．５０～６．５０ＭＰａであり、乾燥基準含水率が５％未満まで乾燥させた。当該牛ホエイ粉末の実物図を図１９に示した。図１９から分かるように、当該牛乳オリゴ糖粉末は、色が白色又は淡い黄色を呈し、試料が均一で、正常な視力に見られる不純物がなかった。

本願の製造方法は、脱脂牛乳を精密濾過濃縮した後に精密濾過透過液を得、前記精密濾過透過液を限外濾過して限外濾過透過液を得（又は脱塩ホエイ粉末を再溶解して限外濾過して限外濾過透過液を得る）、前記限外濾過透過液体をさらにナノ濾過してナノ濾過貯留液を得ることでナノ濾過透過液を逆浸透して逆浸透水を製造し、前記逆浸透水を精密濾過、限外濾過及びナノ濾過の洗浄濾過ステップに用いることで、一連の環境に優しいプロセスを形成し、前記ナノ濾過貯留液に対してさらにクロマトグラフィーにより残留するラクトースを除去し、前記クロマトグラフィー収集液をさらにナノ濾過して牛乳オリゴ糖溶液を得、さらに凍結乾燥して前記牛乳オリゴ糖粉末を得るステップを含む。本願は、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、逆浸透、クロマトグラフィー、凍結乾燥技術を採用して得られた牛乳オリゴ糖粉末であり、伝統的なバイオテクノロジー技術に比べて、発酵や酵素変換を経ることなく、牛乳オリゴ糖の天然構造を保持し、加工品質特性に優れ、風味が純粋であり、食品産業において広い適用将来性を有する。

最後に、上記の実施例は、単に本願の技術的解決手段を説明するためだけで、本願を限定するものではなく、前記実施例を参照して本願を詳細に説明したが、当業者であれば、それは依然として、前記各実施例に記載した技術的解決手段を修正するか、又はそのうちの一部の技術的解決手段を均等置換することができるが、これらの修正又は均等置換は、対応する技術的解決手段の本質を本願の各実施例の技術的解決手段の精神及び範囲から逸脱させないことを理解すべきである。

本願は、乳オリゴ糖の製造方法及び製造された乳オリゴ糖粉末、食品を提供し、そのうち、製造方法は、ホエイ液を少なくとも３回限外濾過し、限外濾過透過液を複数回ナノ濾過濃縮し、ナノ濾過貯留液をクロマトグラフィー分離精製し、ラクトースを含む色層分析収集液を除去し、シアリルラクトースを含む色層分析収集液を収集し、脱塩し、乾燥してオリゴ糖粉末を得るステップを含む。本願により製造された乳オリゴ糖及び当該乳オリゴ糖を含む食品は、主に牛乳オリゴ糖であり、色が淡い黄色又は白色を呈し、風味が薄く、粒子が均一で、熱安定性に優れ、可溶性を有する。当該乳オリゴ糖は、主に３’－シアリルラクトースと６’－シアリルラクトースとを含む。

Claims (10)

1. ホエイ液を少なくとも３回限外濾過し、限外濾過透過液を複数回ナノ濾過濃縮し、ナノ濾過貯留液をクロマトグラフィー分離精製し、ラクトースを含む色層分析収集液を除去し、シアリルラクトースを含む色層分析収集液を収集し、脱塩し、乾燥してオリゴ糖粉末を得るステップを含む、
   ことを特徴とする乳オリゴ糖の製造方法。
2. シアリルラクトースを含む色層分析収集液を収集する方法は、管ごとに色層分析収集液を収集して検出し、シアリルラクトースを含む色層分析収集液を合わせ、シアリルラクトースの検出方法がオリゴ糖検出方法を採用するステップ、
   及び／又は、乾燥ステップは、凍結乾燥であり、選択可能に、凍結乾燥のステップは、脱塩後の濃縮貯留液を凍結乾燥機に入れて乾燥させるステップを含み、選択可能に、凍結乾燥は、真空凍結乾燥昇温プログラムを２０°Ｃ ２ｈ、４０°Ｃ １ｈ、５５°Ｃで終了まで乾燥するように設定し、コールドトラップ温度が－５０°Ｃであり、真空度が２．５０～６．５０ＭＰａであり、乾燥基準含水率が５％未満まで乾燥させるステップを含む、
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. クロマトグラフィー分離精製ステップにおいて、使用されるクロマトグラフィーフィラーの担体は、アガロース及びデキストラン架橋複合物又は架橋アガロースであり、選択可能に、前記クロマトグラフィーフィラーの担体は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０ ｉｎｃｒｅａｓｅプレパックカラム、又はＤＥＡＥアガロースゲル、又はＱ－アガロースゲルであり、選択可能に、クロマトグラフィー分離精製ステップは、
   ナノ濾過貯留液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０ ｉｎｃｒｅａｓｅプレパックカラムにローディングし、流速が０．５～０．８ｍＬ／ｍｉｎであり、０．５～２ｍＬ／管を収集し、選択可能に、流速が０．６ｍＬ／ｍｉｎであり、１ｍＬ／管を収集するステップ、
   又は、ナノ濾過貯留液を１．５ｃｍ×２０ｃｍのＤＥＡＥアガロースゲルＦＦクロマトグラフィーカラムにローディングし、流速が１～２ｍＬ／ｍｉｎであり、０．５～１．５ｍＬ／管を収集し、選択可能に、流速が１．５ｍＬ／ｍｉｎであり、１ｍＬ／管を収集するステップ、
   又は、ナノ濾過貯留液を１０ｃｍ×５０ｃｍのＱ－アガロースゲルＦＦクロマトグラフィーカラムにローディングし、流速が１５～２５ｍＬ／ｍｉｎであり、４０～６０ｍＬ／管を収集し、選択可能に、流速が２０ｍＬ／ｍｉｎであり、５０ｍＬ／管を収集するステップを含む、
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記ホエイ液は、チーズを作る際に生じる副生成物であるホエイ液、又は脱塩ホエイ粉末の再溶解後のホエイ液、又は脱脂後の動物乳の精密濾過により製造される透過液であり、選択可能に、前記動物乳は、牛乳であり、選択可能に、脱塩ホエイ粉末と水との質量比は、１：４～２０であり、
   選択可能に、前記動物乳をマイクロエマルジョン化して透過液を製造する方法は、脱脂後の動物乳を少なくとも３回精密濾過することで精密濾過透過液を得ることであり、選択可能に、前記脱脂後の動物乳における脂肪の質量百分含有量は、０．１％以下であり、好ましくは０．０２％～０．１％であり、
   選択可能に、動物乳を脱脂するステップは、原料乳を殺菌した後、プレート式熱交換器により４５℃～５５℃に冷却して脱脂するステップを含み、
   選択可能に、少なくとも３回の精密濾過の方法は、脱脂後の動物乳を精密濾過して２～５倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第１回の精密濾過透過液を得、第１回の精密濾過貯留液に水を添加して希釈し、再度精密濾過して２～５倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第２回の精密濾過透過液を得、第２回の精密濾過貯留液に水を添加して希釈し、再度精密濾過して２～５倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第３回の精密濾過透過液を得、以下同様のことであり、選択可能に、精密濾過の回数は、５回であり、選択可能に、精密濾過前の脱脂後の動物乳の質量と近くなるように水を添加して希釈し、
   選択可能に、精密濾過濃縮において、採用される精密濾過膜の孔径は、５０ｎｍ～１４０ｎｍであり、選択可能に、精密濾過膜は、管状セラミック膜を採用し、
   選択可能に、精密濾過条件は、供給液の温度が４５℃～５５℃であり、入口圧力が２～５ｂａｒであり、出口圧力が１～４ｂａｒであり、背圧が０．５～３ｂａｒであり、膜間圧力差が３ｂａｒを超えないことである、
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 少なくとも３回の限外濾過の方法は、精密濾過透過液を限外濾過して２～７倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第１回の限外濾過透過液を得、第１回の限外濾過貯留液に水を添加して希釈し、再度限外濾過して２～７倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第２回の限外濾過透過液を得、第２回の限外濾過貯留液に水を添加して希釈し、再度限外濾過して２～７倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第３回の限外濾過透過液を得、以下同様のことであり、選択可能に、限外濾過の回数は、６回であり、選択可能に、水を添加して希釈する水の添加量は、希釈対象の限外濾過貯留液の量と近く、
   及び／又は、限外濾過ステップにおいて、使用される限外濾過膜の貯留分子量は、５ＫＤａ～３０Ｋｄａであり、選択可能に、限外濾過膜は、複合管式の有機膜であり、
   及び／又は、限外濾過条件は、供給液の温度が２０℃～４５℃であり、入口圧力が６～９ｂａｒであり、出口圧力が５～８ｂａｒであることであり、選択可能に、膜間圧力差が３ｂａｒを超えない、
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 複数回のナノ濾過濃縮の方法は、限外濾過透過液をナノ濾過して２～１３倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第１回のナノ濾過貯留液を得、第１回のナノ濾過貯留液に水を添加して希釈し、再度限外濾過して２～１３倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第２回のナノ濾過貯留液を得、第２回のナノ濾過貯留液に水を添加して希釈し、再度ナノ濾過して２～１３倍の濃縮倍率まで濃縮した時に第３回のナノ濾過貯留液を得、以下同様のことであり、選択可能に、ナノ濾過の回数は、６回であり、選択可能に、水を添加して希釈する水の添加量は、希釈対象のナノ濾過貯留液の量と近く、
   及び／又は、ナノ濾過ステップにおいて、使用されるナノ濾過膜の貯留分子量は、１００Ｄａ～３０００Ｄａであり、選択可能に、ナノ濾過ステップにおいて、ナノ濾過膜は、複合管式の有機膜であり、
   及び／又は、ナノ濾過条件は、供給液の温度が２０～４５℃であり、入口圧力が１６～２０ｂａｒであり、出口圧力が１４～１８ｂａｒであることであり、選択可能に、膜間圧力差が３ｂａｒを超えない、
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 脱塩ステップは、ナノ濾過脱塩又は電気透析脱塩を採用し、
   選択可能に、ナノ濾過脱塩ステップは、色層分析収集液をナノ濾過して分離し、伝導率が低下しないまで脱イオン水で洗浄濾過し、機器の最小循環体積まで濃縮してナノ濾過濃縮貯留液を得、ナノ濾過濃縮が終了するステップを含み、選択可能に、ナノ濾過脱塩において、採用されるナノ濾過膜の貯留分子量が１００Ｄａ～５００Ｄａであり、選択可能に、ナノ濾過脱塩において、採用されるナノ濾過膜は、複合管式の有機膜であり、選択可能に、ナノ濾過脱塩において、条件は、供給液の温度が２０～４５℃であり、入口圧力が１０～１５ｂａｒであり、出口圧力が５～１０ｂａｒであるように設定し、選択可能に、膜間圧力差が３ｂａｒを超えなく、
   選択可能に、電気透析ステップは、色層分析収集液を電気透析機器に入れて透析を行い、電流が変化しなくなる時、脱塩が終了し、選択可能に、電気透析の条件は、電圧を８Ｖに調整し、材料流速が５０Ｌ／ｈであり、超純水流速が５０Ｌ／ｈであり、極液流速が４５Ｌ／ｈであるように設定する、
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. ナノ濾過透過液を逆浸透濃縮し、プロセス内で適用な脱イオン水を生成するステップをさらに含み、
   選択可能に、逆浸透濃縮ステップは、具体的に、前記ナノ濾過透過液を逆浸透して機器の最小循環体積まで濃縮して逆浸透透過液を得、逆浸透が終了するステップを含み、
   選択可能に、逆浸透ステップにおいて、使用される膜の安定な塩除去率は、９９．５％であり、
   選択可能に、逆浸透条件は、供給液の温度が２０～４５℃であり、入口圧力が１６～２０ｂａｒであり、出口圧力が１４～１８ｂａｒであることであり、選択可能に、膜間圧力差が３ｂａｒを超えず、
   及び／又は、前記限外濾過、ナノ濾過、逆浸透のステップは、集積化された限外濾過－ナノ濾過－逆浸透装置を採用する、
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. 請求項１～８のいずれか１項に記載の方法により製造された乳オリゴ糖粉末であり、選択可能に、前記乳オリゴ糖粉末は、シアリルラクトースを含み、選択可能に、シアリルラクトースは、３’－シアリルラクトースと６’－シアリルラクトースとを含み、選択可能に、前記乳オリゴ糖粉末における３’－シアリルラクトース及び６’－シアリルラクトースの総質量百分含有量は、２５％以上であり、選択可能に、前記乳オリゴ糖粉末における３’－シアリルラクトース及び６’－シアリルラクトースの総質量百分含有量は、５０％以上である、
   ことを特徴とするオリゴ糖粉砂糖。
10. 請求項１～８のいずれか１項に記載の方法により製造されたオリゴ糖粉末又は請求項９に記載のオリゴ糖粉砂糖を含む、
    ことを特徴とするオリゴ糖食品又は健康食品。