BR112020023639A2 - produção de oligossacarídeos - Google Patents

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Arthur Maurits Christiaan Janse
Michael Benjamin JOHNSON
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Abstract

É fornecido um método para produzir e purificar oligossacarídeos do leite humano (OLHs). O método inclui a fermentação de um organismo microbiano geneticamente modificado, de preferência uma cepa de levedura geneticamente modificada, e o processamento a jusante do produto de fermentação usando um ou mais entre um tratamento enzimático, filtração e uma etapa de cromatografia em leito móvel simulado (LMS). É também fornecido o uso do OLH resultante em alimentos ou aplicações de alimentação, de preferência em alimento e/ou fórmula infantil.

Description

“PRODUÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido Provisório de Patente dos Estados Unidos no°62/675.393, depositado em 23 de maio de 2018, cuja revelação é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES
[0002] A presente revelação se refere a processos para produzir e purificar oligossacarídeos do leite humano (OLHs). O processo inclui a fermentação de um organismo microbiano geneticamente modificado, de preferência uma cepa de levedura geneticamente modificada, e o processamento a jusante do produto de fermentação usando um ou mais entre um tratamento enzimático, filtração e cromatografia em coluna única ou cromatografia em coluna múltipla, em particular, no modo de cromatografia em leito móvel simulado (LMS).
[0003] O leite humano contém uma família de oligossacarídeos exclusivos, os OLHs, que são glicanos não conjugados estruturalmente diferentes. Apesar de ser o terceiro componente sólido do leite humano mais abundante (após a lactose e a gordura), os bebês não conseguem, de fato, digerir os OLHs. Em vez disso, eles funcionam como prebióticos para ajudar a estabelecer as bactérias comensais. Os OLHs também funcionam como antiadesivos que ajudam a impedir a fixação de patógenos microbianos às superfícies de mucosa. A ocorrência e a concentração desses oligossacarídeos complexos são específicas de humanos e não são encontradas em grandes quantidades no leite de outros mamíferos, por exemplo, animais de leite domesticados.
[0004] Devido aos desafios envolvidos na síntese química de oligossacarídeos do leite humano, vários métodos enzimáticos e abordagens fermentativas foram desenvolvidos, principalmente em cepas bacterianas como E. coli. Entretanto, esses métodos resultam em misturas complexas de oligossacarídeos, por exemplo, o produto desejado é contaminado com material de partida, por exemplo, lactose, intermediários biossintéticos, e substratos como monossacarídeos individuais, polipeptídeos etc.
[0005] Os processos do estado da técnica para purificar produtos oligossacarídeos individuais a partir dessas misturas são tecnicamente complexos. Diversas operações de cristalização são usadas na indústria açucareira para separar dissacarídeos, como lactose ou sacarose, de misturas complexas, como soro ou melaços. A desvantagem desses métodos é que eles são elaborados e geram baixo rendimento. Para a purificação de oligossacarídeos complexos, como certos OLHs, a cromatografia por exclusão de tamanho tem sido a mais amplamente usada. Entretanto, a cromatografia por exclusão de tamanho não é de baixo custo para aplicações em alimentos e certos OLHs, por exemplo, 2’-fucosilactose (2’FL), não podem ser produzidos em quantidades adequadas.
[0006] Assim, permanece uma necessidade de fornecer processos aprimorados para a produção e purificação de OLHs, e em particular 2’FL, a custos menores e com maior eficiência e/ou pureza.
[0007] A solução para esse problema técnico é fornecida pelas modalidades caracterizadas abaixo.
BREVE SUMÁRIO
[0008] O presente pedido fornece métodos para produzir e purificar oligossacarídeos do leite humano (OLHs). Em particular, o método da invenção inclui a fermentação de um organismo microbiano que foi geneticamente modificado para produzir o OLH desejado em um meio de fermentação adequado e purificação do produto de fermentação resultante para remover subprodutos e obter o OLH desejado.
[0009] Em algumas modalidades, o organismo microbiano é uma levedura que foi geneticamente modificada para produzir o OLH desejado.
[0010] O OLH desejado, por exemplo, 2’-fucosilactose (2’FL), é purificado a partir do meio de fermentação por cromatografia em leito móvel simulado (LMS). Após a fermentação, um meio de fermentação contendo o OLH desejado é aplicado à cromatografia LMS. De preferência, antes de aplicar o meio de fermentação à cromatografia LMS, o meio de fermentação é submetido a um ou mais dos seguintes:
[0011] i) tratamento enzimático do produto de fermentação;
[0012] ii) remoção da biomassa;
[0013] iii) ultrafiltração do produto de fermentação;
[0014] e/ou iv) nanofiltração do produto de fermentação.
[0015] Em algumas modalidades, o tratamento enzimático do produto de fermentação é usado para converter lactose e/ou sacarose em monossacarídeos.
[0016] Em algumas modalidades, o tratamento enzimático compreende a incubação do produto de fermentação com uma ou mais enzimas. Em algumas modalidades, a enzima é uma lactase, uma β-galactosidase, uma trealase e/ou uma invertase.
[0017] Em algumas modalidades, a remoção da biomassa é realizada por centrifugação, filtração, ultrafiltração, nanofiltração ou combinações destas.
[0018] Em algumas modalidades, a remoção da biomassa é realizada por centrifugação.
[0019] Em algumas modalidades, a remoção da biomassa é realizada por filtração.
[0020] Em algumas modalidades, a ultrafiltração do produto de fermentação é usada para remover proteínas e/ou outras moléculas de alto peso molecular, como DNA.
[0021] Em algumas modalidades, a nanofiltração do produto de fermentação é usada para remover moléculas de baixo peso molecular, como oligossacarídeos maiores que o composto-alvo e/ou componentes de açúcar menores e peptídeos.
[0022] Em algumas modalidades, o produto de fermentação é submetido a mais que uma etapa de nanofiltração. Por exemplo, uma primeira etapa de nanofiltração pode ser realizada para remover moléculas que são discretamente maiores ou maiores que o OLH desejado, como, por exemplo, oligossacarídeos maiores. Uma segunda etapa de nanofiltração pode ser realizada para remover moléculas que são menores que o OLH desejado, como, por exemplo, monossacarídeos, aminoácidos e íons. Em algumas modalidades, as etapas de nanofiltração são realizadas consecutivamente.
[0023] Em algumas modalidades, o método da invenção compreende adicionalmente um ou mais dos seguintes:
[0024] a) descoloração;
[0025] b) filtração adicional; e/ou
[0026] c) concentração e/ou secagem da solução de OLH resultante.
[0027] Em uma modalidade preferencial, a descoloração, a filtração adicional e/ou a secagem são realizadas após a etapa de cromatografia LMS.
[0028] Será compreendido que as etapas do método da invenção, com exceção da etapa de secagem, podem ser realizadas em qualquer ordem. Em algumas modalidades, uma ou mais etapas do método da invenção podem ser realizadas mais que uma vez. Em uma modalidade preferencial, as etapas do método da invenção são realizadas na ordem listada acima.
[0029] É também fornecido o OLH obtido de acordo com o método da invenção.
[0030] Em algumas modalidades, o OLH obtido de acordo com o método da invenção está em um alimento, suplemento ou composição farmacêutica. A composição farmacêutica pode conter um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0031] Em algumas modalidades, o OLH obtido de acordo com o método da invenção pode ser usado em um produto alimentar. Um produto alimentar é qualquer alimento para animais não humanos ou para consumo humano e inclui composições sólidas e líquidas. Um produto alimentar pode ser um aditivo para alimentos animais e humanos. Alimentos incluem, sem limitação, alimentos comuns; produtos líquidos, incluindo leites, bebidas, bebidas terapêuticas e bebidas nutricionais; alimentos funcionais; suplementos;
produtos nutracêuticos; fórmulas infantis, incluindo fórmulas para bebês prematuros; alimentos para gestantes ou lactantes; alimentos para adultos; alimentos geriátricos; e alimentos para animais.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0032] Para uma compreensão adicional da natureza, dos objetivos e das vantagens da presente revelação, deve ser feita referência à descrição detalhada a seguir, lida em conjunto com os desenhos a seguir, nos quais referências numéricas semelhantes denotam elementos semelhantes.
[0033] A FIG. 1 mostra etapas exemplificativas da invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0034] Antes que a revelação em questão seja adicionalmente descrita, deve-se compreender que a revelação não é limitada às modalidades particulares da revelação descrita abaixo, já que variações das modalidades particulares podem ser feitas e ainda estarem dentro do escopo das reivindicações anexas. Também deve ser entendido que a terminologia empregada tem uma finalidade de descrever modalidades particulares e não se destina a ser limitativa. Em vez disso, o escopo da presente revelação será estabelecido pelas reivindicações anexas.
[0035] Neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, “a” e “o” incluem várias referências a menos que o contexto indique claramente o contrário. A menos que seja definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que aquele comumente entendido por um indivíduo de habilidade comum na técnica a que esta revelação pertence.
[0036] O termo “produto de fermentação”, conforme aqui usado, se refere ao produto obtido a partir da fermentação do organismo microbiano. Assim, o produto de fermentação compreende células, o meio de fermentação, material de substrato residual, e quaisquer moléculas/subprodutos gerados durante a fermentação, por exemplo, o OLH desejado. Após cada etapa do método de purificação, um ou mais dos componentes do produto de fermentação é removido, resultando em um OLH mais purificado.
[0037] A revelação em questão apresenta, em um aspecto, um método para produzir e purificar oligossacarídeos do leite humano compreendendo um ou mais dos seguintes: fermentação de um organismo microbiano geneticamente modificado; tratamento enzimático para converter lactose e sacarose em monossacarídeos; centrifugação e/ou filtração para remover biomassa (por exemplo, células, moléculas de alto peso molecular); ultrafiltração para remover proteínas e/ou outras moléculas de maior peso molecular, como DNA; uma ou mais etapas de nanofiltração para remover moléculas que são discretamente maiores e/ou menores que o OLH desejado; e cromatografia em leito móvel simulado (LMS).
[0038] O OLH desejado produzido e purificado de acordo com o método da invenção é selecionado do grupo que consiste em: 2’-fucosilactose, 3-fucosilactose, 2’,3- difucosilactose, lacto-N-triose II, lacto-N-tetrose, lacto- N-neotetrose, lacto-N-fucopentose I, lacto-N- neofucopentose, lacto-N-fucopentose II, lacto-N-fucopentose III, lacto-N-fucopentose V, lacto-N-neofucopentose V, lacto-N-difucohexose I, lacto-N-difucohexose II, 6’-
galactosilactose, 3’-galactosilactose, lacto-N-hexose e lacto-N-neohexose.
[0039] Em uma modalidade preferencial, o OLH desejado produzido e purificado de acordo com o método da invenção é 2’-fucosilactose (2’FL).
[0040] O OLH desejado, por exemplo, 2’FL, é produzido pela fermentação de um organismo microbiano geneticamente modificado. A fermentação pode ser realizada em qualquer meio de fermentação adequado, como, por exemplo, um meio de fermentação quimicamente definido. O meio de fermentação pode variar com base no organismo microbiano usado.
[0041] Em uma modalidade preferencial, o organismo microbiano é uma levedura geneticamente modificada. A levedura pode ser, por exemplo, uma cepa de Saccharomyces, uma cepa de Candida, uma cepa de Hansenula, uma cepa de Kluyveromyces, uma cepa de Pichia, uma cepa de Schizosaccharomyces, uma cepa de Schwanniomyces, uma cepa de Torulaspora, uma cepa de Yarrowia ou uma cepa de Zygosaccharomyces.
[0042] Em algumas modalidades, a levedura é, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia stipites, Candida boidinii, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Torulaspora delbrueckii, Yarrowia lipolytica, Zygosaccharomyces rouxii, ou Zygosaccharomyces bailii.
[0043] A separação de biomassa do produto de fermentação pode ser realizada por quaisquer meios adequados. Em uma modalidade, o produto de fermentação é centrifugado para separar e remover a biomassa. Em uma outra modalidade, o produto de fermentação é filtrado para separar e remover a biomassa. Em algumas modalidades, uma combinação de centrifugação e filtração é usada para separar e remover a biomassa do produto de fermentação. Em algumas modalidades, o meio de fermentação é filtrado usando filtração em membrana. Em uma modalidade preferencial, a filtração em membrana é microfiltração, ultrafiltração ou combinações destas.
[0044] Em uma modalidade preferencial, o produto de fermentação é filtrado através de uma microfiltração de fluxo cruzado, de preferência com um corte de 10 mícrons, de preferência com um corte de 5 mícrons, de preferência com um corte de 0,2 mícron, para separar e remover a biomassa.
[0045] Em algumas modalidades, a ultrafiltração é realizada para remover do produto de fermentação proteínas e outros compostos de alto peso molecular, como DNA. Em algumas modalidades, o tamanho de poro da membrana de ultrafiltração é de 100 kD de corte de peso molecular (“MWCO”) ou menos, 90 kD de MWCO, 80 kD de MWCO, 70 kD de MWCO, 60 kD de MWCO, 50 kD de MWCO, 40 kD de MWCO, 35 kD de MWCO, 30 kD de MWCO, 25 kD de MWCO, 20 kD de MWCO, 15 kD de MWCO, 10 kD de MWCO, 9 kD de MWCO, 8 kD de MWCO, 7 kD de MWCO, 6 kD de MWCO ou 5 kD de MWCO ou menos.
[0046] Em algumas modalidades, uma primeira etapa de nanofiltração é realizada para remover do produto de fermentação, moléculas que têm um peso molecular discretamente maior que o OLH desejado. Em algumas modalidades, o tamanho de poro da membrana de nanofiltração é de 0,5 kD de MWCO, 0,6 kD de MWCO, 0,7 kD de MWCO, 0,8 kD de MWCO, 0,9 kD de MWCO, 1 kD de MWCO, 1,2 kD de MWCO, 1,4 kD de MWCO, 1,6 kD de MWCO, 1,8 kD de MWCO, 2 kD de MWCO ou mais, ou tem um MDWCO maior que a molécula-alvo de interesse.
[0047] Em algumas modalidades, uma segunda etapa de nanofiltração é realizada para remover moléculas de baixo peso molecular, como monossacarídeos e íons. Em algumas modalidades, o tamanho de poro da segunda membrana de nanofiltração é de 500 dalton (Da) ou menos de corte de peso molecular (“MWCO”), 450 Da de MWCO, 400 Da de MWCO, 350 Da de MWCO, 300 Da de MWCO, 250 Da de MWCO ou 200 Da de MWCO ou menos.
[0048] Usando as técnicas de ultrafiltração e nanofiltração descritas na presente invenção, dois fluxos separados são produzidos após cada filtração, sendo um fluxo conhecido como retentato e um segundo fluxo conhecido como permeato.
[0049] Em algumas modalidades, o rendimento do OLH desejado no permeato após uma etapa de ultrafiltração é maior que 50 %, maior que 60 %, maior que 70 %, maior que 80 %, maior que 90 %, maior que 91 %, maior que 92 %, maior que 93 %, maior que 94 %, maior que 95 %, maior que 96 %, maior que 97 %, maior que 98 % ou maior que 99 %.
[0050] Em algumas modalidades, o rendimento do OLH desejado no permeato após uma etapa de nanofiltração é maior que 50 %, maior que 60 %, maior que 70 %, maior que 80 %, maior que 90 %, maior que 91 %, maior que 92 %, maior que 93 %, maior que 94 %, maior que 95 %, maior que 96 %, maior que 97 %, maior que 98 % ou maior que 99 %.
[0051] Em algumas modalidades, o rendimento do OLH desejado no retentato após uma etapa de nanofiltração é maior que 50 %, maior que 60 %, maior que 70 %, maior que 80 %, maior que 90 %, maior que 91 %, maior que 92 %, maior que 93 %, maior que 94 %, maior que 95 %, maior que 96 %, maior que 97 %, maior que 98 % ou maior que 99 %.
[0052] O rendimento (Y) no retentato é calculado por: Yr= CrVr/CfVf, onde Cr é a concentração daquele soluto no retentato, Cf é a concentração daquele soluto na alimentação inicial, Vr é o volume do retentato e Vf é o volume da alimentação inicial.
[0053] O rendimento (Y) no permeato é calculado por: Yp= CpVp/CfVf, onde Cp é a concentração daquele soluto no permeato, Cf é a concentração daquele soluto na alimentação inicial, Vp é o volume do permeato e Vf é o volume da alimentação inicial.
[0054] Em algumas modalidades, é realizada uma etapa de dessalinização. Essa etapa pode usar uma membrana e/ou uma etapa de eletrodiálise. A etapa de dessalinização também pode ser a mesma que a segunda etapa de nanofiltração.
[0055] O processo da invenção inclui submeter o produto de fermentação a cromatografia em leito móvel simulado (LMS) para purificar o OLH desejado, por exemplo, 2’FL, de impurezas, outras moléculas similares, moléculas indesejadas e outras moléculas carregadas. A cromatografia LMS é de preferência realizada após uma ou mais etapas de filtração. Em uma modalidade preferencial, o produto de fermentação é submetido a centrifugação, microfiltração, ultrafiltração e a uma ou mais etapas de nanofiltração antes de realizar a cromatografia LMS.
[0056] A etapa de cromatografia LMS pode compreender:
[0057] i) pelo menos 4 colunas, de preferência pelo menos 8 colunas, com mais preferência pelo menos 12 colunas, em que pelo menos uma coluna compreende uma resina de troca catiônica fraca ou forte, de preferência uma resina de troca catiônica na forma de H+ ou na forma de Ca2+; e/ou
[0058] ii) quatro zonas I, II, III e IV com diferentes taxas de fluxo; e/ou
[0059] iii) um eluente compreendendo ou consistindo em água, de preferência etanol e água, com mais preferência de 5-15 % em volume de etanol e de 85-95 % em volume água, com a máxima preferência de 9-11 % em volume de etanol e de 89- 91 % em volume de água, em que o eluente opcionalmente compreende, adicionalmente, ácido sulfúrico, de preferência ácido sulfúrico a ≤ 10 mM; com mais preferência ácido sulfúrico a ≤ 2-5 mM; e/ou
[0060] iv) uma temperatura de operação de 15° a 60 °C, de preferência de 20° a 55 °C, com mais preferência de 25° a 50 °C.
[0061] Se o OLH a ser purificado for 2’FL, a etapa de cromatografia LMS pode compreender
[0062] i) quatro zonas I, II, III e IV com diferentes taxas de fluxo, em que as taxas de fluxo são de preferência: de 28-32 ml/min na zona I, de 19-23 ml/min na zona II, de 21-25 ml/min na zona III e/ou de 16-20 ml/min na zona IV; e/ou
[0063] ii) uma velocidade de alimentação de 2-4 ml/min, de preferência 3 ml/min; e/ou
[0064] iii) uma taxa de fluxo de eluente de 10- 13 ml/min, de preferência 11,5 ml/min; e/ou
[0065] iv) um tempo de troca de 16-20 min, de preferência de 17-19 min, com mais preferência 18 min.
[0066] De preferência, pelo menos uma das colunas compreende de 0,1 a 5000 kg de resina de troca catiônica, de preferência de 0,2 a 500 kg de resina de troca catiônica, com mais preferência de 0,5 a 50 kg de resina de troca catiônica, com a máxima preferência de 1,0 a 20 kg de resina de troca catiônica.
[0067] A quantidade de material de troca catiônica, a taxa de fluxo nas diferentes zonas, a velocidade de alimentação, a taxa de fluxo do eluente e/ou o tempo de troca podem ser aumentados conforme necessário. O aumento pode ser de um fator de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000 ou todos os possíveis fatores de aumento entre os ditos valores.
[0068] Nas colunas, uma resina de troca catiônica forte pode ser usada como fase estacionária. De preferência, a resina de troca catiônica é uma resina de ácido sulfônico, com mais preferência uma resina Purolite® PCR833H (Purolite, Ratingen, Alemanha), Lewatit MDS 2368 e/ou Lewatit MDS 1368. Se uma resina de troca iônica catiônica for empregada nas colunas, esta pode ser regenerada com ácido sulfúrico. O ácido sulfúrico pode ser empregado no eluente, de preferência ácido sulfúrico a uma concentração de 10 mM ou menos. A resina de troca catiônica (forte) pode estar presente na forma de H+ ou na forma de Ca2+.
[0069] Em algumas modalidades, a pureza percentual dos OLHs produzidos é maior ou igual a 88 %. Em algumas modalidades, a pureza dos OLHs produzidos é maior ou igual a 90 %, maior que 91 %, maior que 92 %, maior que 93 %,
maior que 94 %, maior que 95 %, maior que 96 %, maior que 97 %, maior que 98 %, maior que 99 %. A seguinte fórmula é usada:
[0070] Pureza percentual = (CHMO/CDM) * 100, em que CHMO é a concentração do OLH desejado e CDM é a concentração de matéria seca total.
[0071] Em algumas modalidades, o processo da invenção inclui uma ou mais etapas de descoloração. A descoloração pode ser realizada por quaisquer meios adequados. Por exemplo, a descoloração pode ser realizada pelo tratamento do produto de fermentação com carvão ativado. A uma ou mais etapas de descoloração podem ser realizadas em qualquer ponto durante o processo da invenção. Em uma modalidade preferencial, a descoloração é realizada após a cromatografia LMS.
[0072] A solução resultante contendo o OLH desejado pode ser concentrada e/ou seca. Em algumas modalidades, a solução resultante é evaporada, liofilizada ou submetida a qualquer combinação destas.
[0073] Os OLHs obtidos usando o processo da invenção são adequados para uso em alimentos e aplicações de alimentação. Em algumas modalidades, os OLHs obtidos são usados em alimento infantil, fórmula infantil e/ou suplementos infantis. Em uma modalidade preferencial, os OLHs obtidos são usados em alimento infantil humano, fórmula infantil humana e/ou em suplementos infantis humanos.
[0074] Em outras modalidades, os OLHs obtidos usando o processo da invenção são usados na medicina, por exemplo, como um tratamento para um distúrbio gastrointestinal e/ou como um prebiótico.
[0075] Os exemplos a seguir são apresentados para ilustrar, porém não limitar a invenção reivindicada.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
[0076] Células microbianas que foram geneticamente modificadas para expressar um ou mais oligossacarídeos do leite humano são cultivadas em um meio de fermentação adequado, resultando em um produto de fermentação contendo os oligossacarídeos do leite humano. Esse produto de fermentação é, então, tratado com uma ou mais enzimas, como lactase, β-galactosidase, trealase e/ou invertase. A biomassa, por exemplo, as células, é removida do produto de fermentação usando quaisquer meios adequados, como centrifugação seguida de filtração, ou quaisquer combinações destas. O produto de fermentação é, então, submetido a ultrafiltração para remover proteínas e outros compostos de alto peso molecular, por exemplo, DNA. Uma etapa de nanofiltração é, então, realizada para remover do produto de fermentação as moléculas tendo um peso molecular discretamente maior que o(s) OLH(s) desejado(s). Uma segunda etapa de nanofiltração é realizada para remover moléculas de baixo peso molecular, como monossacarídeos e íons.
[0077] Em seguida, o produto de fermentação é submetido a uma etapa de cromatografia em leito móvel simulado (LMS) para purificar adicionalmente o(s) OLH(s) desejado(s). O sistema usado para a cromatografia LMS contém pelo menos 4 colunas contendo uma resina de troca catiônica. As taxas de fluxo usadas nas diferentes zonas são de 28-32 ml/min na zona I, de 19-23 ml/min na zona II, de 21-25 ml/min na zona III e/ou de 16-20 ml/min na zona IV. O eluente usado pode ser etanol 10 % em água. A solução resultante contendo o(s) OLH(s) purificado(s) pode ser opcionalmente submetida a descoloração, filtração e/ou secagem.
[0078] Todas as referências citadas neste relatório descritivo são incorporadas no presente documento a título de referência, como se cada referência fosse específica e individualmente indicada como incorporada por referência. A citação de qualquer referência é, para sua revelação, anterior à data de depósito e não deve ser interpretada como um reconhecimento de que a presente revelação não está autorizada a anteceder tal referência em virtude de invenção anterior.
[0079] Deve ser compreendido que cada um dos elementos descritos acima, ou dois ou mais juntos, também pode ter uma aplicação útil em outros tipos de métodos diferentes do tipo descrito acima. Sem análise adicional, o que foi dito acima revelará, então, totalmente a essência da presente revelação que outras pessoas podem, ao aplicar o conhecimento atual, adaptar prontamente para várias aplicações sem omitir recursos que, a partir do ponto de vista do estado da técnica, constituem adequadamente características essenciais dos aspectos genéricos ou específicos desta revelação, estabelecidos nas reivindicações anexas. As modalidades anteriores são apresentadas com fins exemplificativos apenas; o escopo da presente revelação deve ser limitado apenas pelas reivindicações a seguir.

Claims (32)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para a produção de um ou mais oligossacarídeos do leite humano (OLHs), sendo o método caracterizado por compreender: a) fermentação de um organismo microbiano que foi geneticamente modificado para produzir um ou mais OLHs em um meio de fermentação adequado para formar um produto de fermentação; b) tratamento enzimático do produto de fermentação; c) remoção da biomassa do produto de fermentação; d) ultrafiltração; e) nanofiltração; e f) uma etapa de cromatografia em coluna.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o um ou mais OLHs é(são) 2’- fucosilactose.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o organismo microbiano é uma levedura.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a levedura é selecionada a partir do grupo que consiste em: Saccharomyces, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, Torulaspora, Yarrowia e Zygosaccharomyces.
5. Método, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a levedura é selecionada a partir do grupo que consiste em: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia stipites, Candida boidinii, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Torulaspora delbrueckii, Yarrowia lipolytica, Zygosaccharomyces rouxii e Zygosaccharomyces bailii.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que o tratamento enzimático compreende a incubação do produto de fermentação com uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em: lactase, β-galactosidase, trealase e invertase.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que o tratamento enzimático converte lactose e/ou sacarose em monossacarídeos.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado pelo fato de que a remoção da biomassa do produto de fermentação compreende centrifugação, filtração ou combinações destas.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que a etapa de cromatografia em coluna é uma coluna única ou uma coluna múltipla.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de que a etapa de cromatografia em coluna é cromatografia em leito móvel simulado.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo fato de que a etapa de nanofiltração é realizada mais que uma vez.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, caracterizado pelo fato de que a nanofiltração é realizada duas vezes.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as etapas de nanofiltração são realizadas consecutivamente.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, sendo o método caracterizado por compreender adicionalmente um ou mais entre: a) descoloração; b) filtração; e/ou c) secagem.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a secagem compreende evaporação.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-15, caracterizado pelo fato de que a cromatografia em leito móvel simulado compreende i) pelo menos 4 colunas, em que pelo menos uma coluna compreende uma resina de troca catiônica fraca ou forte; e/ou ii) quatro zonas I, II, III e IV com diferentes taxas de fluxo; e/ou iii) um eluente compreendendo água; e/ou iv) uma temperatura de operação de 15° a 60 °C.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o eluente compreende adicionalmente etanol e/ou ácido sulfúrico.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que a taxa de fluxo na zona I é de 28-32 ml/min, a taxa de fluxo na zona II é de 19- 23 ml/min, a taxa de fluxo na zona III é de 21-25 ml/min e/ou a taxa de fluxo na zona IV é de 16-20 ml/min.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-18, caracterizado pelo fato de que a temperatura de operação é de 25° a 50 °C.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-19, caracterizado por compreender uma velocidade de alimentação de 2-4 ml/min.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-20, caracterizado por compreender uma taxa de fluxo de eluente de 10-13 ml/min.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-21, caracterizado por compreender um tempo de troca de 16-20 minutos.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-22, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma coluna compreende de 0,1 a 5000 kg de resina de troca catiônica.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-23, caracterizado pelo fato de que a resina de troca catiônica é uma resina de ácido sulfônico.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-24, caracterizado pelo fato de que a) - f) são realizadas em qualquer ordem.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-25, caracterizado pelo fato de que a) - f) são realizadas na ordem fornecida na reivindicação 1.
27. OLH caracterizado por ser obtido segundo o método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-26.
28. Uso do OLH obtido segundo o método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-26 caracterizado por ser em um alimento ou preparação de alimentação.
29. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o alimento é um alimento humano.
30. Uso, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o alimento é um alimento infantil.
31. Uso, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que o alimento é uma fórmula infantil ou um suplemento infantil.
32. Uso do OLH obtido segundo o método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-26 caracterizado por ser em um suplemento dietético.
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