KR20210013138A - 올리고당의 제조 - Google Patents

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KR20210013138A
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아더 마우리츠 크리스티안 얀스
마이클 벤자민 존슨
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디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
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Abstract

인간 모유 올리고당(HMO)의 제조 및 정제 방법이 제시된다. 상기 방법은 유전자 변형된 미생물 개체, 바람직하게는 유전자 변형된 효모 균주의 발효, 및 효소적 처리, 여과 및 모의 유동층(simulated moving bed, SMB) 크로마토그래피 단계 중 하나 이상을 사용한 발효 생성물의 다운스트림 가공을 포함한다. 또한, 식품 또는 사료 적용례, 바람직하게는 유아용 식품 및/또는 제형에서, 결과적인 HMO의 용도가 제시된다.

Description

올리고당의 제조
본원은 2018년 5월 23일 출원된 미국 특허 가출원 62/675,393을 우선권 주장하고, 이의 개시는 그 전체가 본원에 참조로 혼입된다.
본 발명은 인간 모유 올리고당(HMO)의 제조 및 정제 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 유전자 변형된 미생물 개체, 바람직하게는 유전자 변형된 효모 균주를의 발효, 및 효소 처리, 여과 및 단컬럼 크로마토그래피 또는 다칼럼 크로마토그래피(특히 모의 유동층(simulated moving bed chromatography, SMB) 크로마토그래피 모드) 중 하나 이상에서 발효 생성물의 다운스트림 가공을 포함한다.
인간 모유는 특유의 올리고당의 과 HMO를 함유하는데, 이는 구조적으로 다양화된 비공액 글리칸이다. (락토스 및 지방 다음으로) 인간 모유의 가장 풍부한 고체 성분임에도, 인간 유아는 실질적으로 HMO를 소화시킬 수 없다. 대신, 이는 편리공생 박테리아를 확립하는데 도움이 되는 프리바이오틱스로서 기능한다. 또한, HMO는 미생물 병원체가 점막 표면에 부착됨을 방지하는데 도움이 되는 접착-방지제로서 기능한다. 이러한 복합 올리고당의 발생 및 농도는 인간에게 특이적이고, 다른 포유동물, 예컨대 가축화된 낙농 동물의 모유에서는 다량으로 발견되지 않는다.
인간 모유 올리고당의 화학적 합성에 관여하는 난제에 기인하여, 몇몇 효소적 방법 및 발효적 접근법이 우선적으로 박테리아 균주, 예컨대 대장균에서 개발되어 왔다. 그러나, 이러한 방법은 올리당의 복합 혼합물을 생성하는데, 즉 목적 생성물이 출발 물질, 예컨대 락토스, 생합성 중간체, 및 기질, 예컨대 개별 단당류, 폴리펩티드 등으로 오염된다.
이러한 혼합물로부터 개별 올리고당 생성물을 정제하는 최신 기술에서의 방법은 기법상 복잡하다. 다중 결정화 작업이 이당류, 예컨대 락토스 또는 수크로스를 복합 혼합물, 예컨대 유청 또는 당밀로부터 분리하기 위해 당 산업에서 사용된다. 상기 방법의 단점은 많은 노력을 요하고 저수율로 제조된다는 점이다. 복합 올리고당, 예컨대 특정 HMO의 정제의 경우, 크기 배제 크로마토그래피가 가장 널리 사용되어 왔다. 그러나, 크기 배제 크로마토그래피는 식품 적용례에 경제적이지 않고, 특정 HMO, 예컨대 2'-푸코실락토스(2'FL)가 적절량으로 생성될 수 없다.
따라서, HMO, 특히 2'FL을 보다 저비용 및 고효율 및/또는 고순도로 정제 및 제조하기 위한 향상된 방법을 제공할 필요가 있다.
이러한 기법적 문제에 대한 해결책이 하기 특징화된 양태에 의해 제공된다.
본원은 인간 모유 올리고당(HMO)의 제조 및 정제 방법을 제공한다. 특히 본 발명의 방법은 유전자 변형된 미생물 개체를 적합한 발효 배지에서 발효시켜 목적 HMO를 생성하고 생성된 발효 생성물을 정제하여 부산물을 제거하고 목적 HMO를 수득함을 포함한다.
일부 양태에서, 미생물 개체는 목적 HMO를 생성하도록 유전자 변형된 효모이다.
목적 HMO, 예컨대 2'-푸코실락토스(2'FL)는 모의 유동층(SMB) 크로마토그래피에 의해 발효 배지로부터 정제된다. 발효 후, 목적 HMO를 함유하는 발효 배지는 SMB 크로마토그래피에 적용된다. 바람직하게는, 발효 배지를 SMB 크로마토그래피에 적용하기 전, 발효 배지는 하기 중 하나 이상을 거친다:
(i) 발효 생성물의 효소적 처리;
(ii) 바이오매스의 제거;
(iii) 발효 생성물의 한외여과; 및/또는
(iv) 발효 생성물의 나노여과.
일부 양태에서, 발효 생성물의 효소적 처리는 락토스 및/또는 수크로스를 단당류로 전환하는데 사용된다.
일부 양태에서, 효소적 처리는 발효 생성물을 하나 이상의 효소에 의해 항온처리함을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 효소는 락타아제, β-갈락토시다아제, 트레할라아제 및/또는 인버타아제이다.
일부 양태에서, 바이오매스의 제거는 원심분리, 여과, 한외여과, 나노여과 또는 이의 조합에 의해 수행된다.
일부 양태에서, 바이오매스의 제거는 원심분리에 의해 수행된다.
일부 양태에서, 바이오매스의 제거는 여과에 의해 수행된다.
일부 양태에서, 발효 생성물의 한외여과는 단백질 및/또는 기타 고분자량 분자, 예컨대 DNA를 제거하는데 사용된다.
일부 양태에서, 발효 생성물의 나노여과는 저분자량 분자, 예컨대 표적 화합물보다 큰 올리고당 및/또는 보다 작은 당 성분 및 펩티드를 제거하는데 사용된다.
일부 양태에서, 발효 생성물은 하나 초과의 나노여과 단계를 거친다. 예컨대, 제1 나노여과 단계는 목적 HMO보다 약간 더 크거나 큰 분자, 예컨대 더 큰 올리고당을 제거하도록 수행될 수 있다. 제2 나노여과 단계는 목적 HMO보다 작은 분자, 예컨대 단당류, 아미노산 및 이온을 제거하도록 수행될 수 있다. 일부 양태에서, 나노여과는 연속적으로 수행될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법은 하기 중 하나 이상을 추가로 포함한다:
(a) 탈색;
(b) 추가 여과; 및/또는
(c) 생성되는 HMO 용액을 농축 및/또는 건조.
바람직한 양태에서, 탈색, 추가 여과 및/또는 건조는 SMB 크로마토그래피 단계 후 수행된다.
본 발명의 방법의 단계들이 건조 단계를 제외하고는 임의의 순서로 수행될 수 있음이 이해될 것이다. 일부 양태에서, 본 발명의 방법의 하나 이상의 단계는 1회 초과로 수행될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 방법의 단계는 상기 제시된 순서로 수행된다.
또한, 본 발명의 방법에 따라 수득된 HMO가 제시된다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법에 따라 수득된 HMO는 식품, 보충제 또는 약학 조성물이다. 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법에 따라 수득된 HMO는 식품에 사용될 수 있다. 식품은 비인간 동물 또는 인간 소비를 위한 임의의 식품일 수 있고, 고체 및 액체 조성물 둘다를 포함한다. 식품은 동물 또는 인간용 식품에 대한 첨가제일 수 있다. 식품은 비한정적으로, 공통 식품; 액체 제품, 예컨대 우유, 음료, 치료용 음료 및 영양 음료; 기능성 식품; 보충제; 약효식품(nutraceutical); 유아용 제형, 예컨대 미성숙 유아용 제형; 임산부 또는 산후조리 산모용 식품; 성인용 식품; 노인용 식품; 및 동물용 식품을 포함한다.
본 발명의 성질, 목적 및 장점의 심도있는 이해를 위해, 하기 도면과 결부하여 판독되는 하기 구체적인 내용이 참조되어야 하고, 여기서 유사한 참조 번호들은 동일한 요소들을 나타낸다.
도 1은 본 발명의 예시적인 단계들을 도시한 것이다.
본 개시가 더 심도있게 기재되기에 앞서, 본 개시가 후술되는 개시의 특정 양태들에 한정되지 않는데, 특정 양태들의 변형이 이뤄질 수 있고 여전히 첨부된 청구범위의 범주에 속함이 이해되어야 한다. 또한, 사용된 용어는 특정 양태를 설명하기 위한 것이고, 한정하도록 의도된 것이 아니다. 대신, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해 확립될 것이다.
본원 및 첨부된 청구범위에서, 맥락에 명확한 지시가 없는 한 단수형은 복수개의 참조를 포함한다. 달리 정의가 없는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.
본원에 용어 "발효 생성물"은 미생물 개체의 발효로부터 수득된 생성물을 지칭한다. 따라서, 발효 생성물은 세포, 발효 배지, 잔류 기질 물질, 및 발효 중 생성된 임의의 분자/부산물, 예컨대 목적 HMO를 포함한다. 정제 방법의 각각의 단계 후, 발효 생성물의 하나 이상의 성분이 제거되어 보다 정제된 HMO가 생성된다.
하나의 양상에서, 본 개시는 하기 중 하나 이상을 포함하는 인간 모유 올리고당의 제조 및 정제 방법을 특징으로 한다: 유전자 변형된 미생물 개체의 발효; 락토스 및 수크로스를 단당류로 전환하기 위한 효소적 처리; 바이오매스(예컨대 세포, 고분자량 분자)를 제거하기 위한 원심분리 및/또는 여과; 단백질 및/또는 기타 고분자량 분자, 예컨대 DNA를 제거하기 위한 한외여과; 목적 HMO보다 약간 더 크고/거나 작은 분자를 제거하기 위한 하나 이상의 나노여과 단계; 및 모의 유동층(SMB) 크로마토그래피.
본 발명의 방법에 따라 제조 및 정제된 목적 HMO는 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 2',3-다이푸코실락토스, 락토-N-트라이오스 II, 락토-N-테트라로스, 락토-N-네오테트라로스, 락토-N-푸코펜토스 I, 락토-N-네오푸코펜토스, 락토-N-푸코펜토스 II, 락토-N-푸코펜토스 III, 락토-N-푸코펜토스 V, 락토-N-네오푸코펜토스 V, 락토-N-다이푸코헥소스 I, 락토-N-다이푸코헥소스 II, 6'-갈락토실락토스, 3'-갈락토실락토스, 락토-N-헥소스 및 락토-N-네오헥소스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 방법에 따라 제조 및 정제된 목적 HMO는 2'-푸코실락토스(2'FL)이다.
목적 HMO, 예컨대 2'FL은 유전자 변형된 미생물 개체의 발효에 의해 제조된다. 여과는 임의의 적합한 발효 배지, 예컨대 화학적으로 규정된 발효 배지 중 수행될 수 있다. 발효 배지는 사용되는 미생물 개체에 따라 다를 수 있다.
바람직한 양태에서, 미생물 개체는 유전자 변형된 효모이다. 효모는 예컨대 사카로마이세스(Saccharomyces) 균주, 칸디다(Candida) 균주, 한세눌라(Hansenula) 균주, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 균주, 피키아(Pichia) 균주, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 균주, 슈바니오마이세스(Schwanniomyces) 균주, 토룰라스포라(Torulaspora) 균주, 야로위아(Yarrowia) 균주, 또는 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces) 균주일 수 있다.
일부 양태에서, 효모는 예컨대 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 피키아 스티피테스(Pichia stipites), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 슈바니오마이세스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 토룰라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica), 자이고사카로마이세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii), 또는 자이고사카로마이세스 바일리이(Zygosaccharomyces bailii)이다.
발효 생성물로부터 바이오매스의 분리는 임의의 적합한 수단에 의해 수행될 수 있다. 하나의 양태에서, 발효 생성물은 원심분리되어 바이오매스가 분리 및 제거된다. 또다른 양태에서, 발효 생성물은 여과되어 바이오매스가 분리 및 제거된다. 일부 양태에서, 원심분리와 여과의 조합이 발효 생성물로부터 바이오매스를 분리 및 제거하는데 사용된다. 일부 양태에서, 발효 배지는 막 여과를 사용하여 여과된다. 바람직한 양태에서, 막 여과는 마이크로여과, 한외여과 또는 이의 조합이다.
바람직한 양태에서, 발효 생성물은 직교류(cross flow) 마이크로여과를 통해, 바람직하게는 10 마이크론의 컷 오프(cut off), 바람직하게는 5 마이크론의 컷 오프, 0.2 마이크론의 컷 오프에 의해 여과되어 바이오매스가 분리 및 제거될 수 있다.
일부 양태에서, 한외여과가 수행되어 발효 생성물로부터 단백질 및 기타 고분자량 화합물, 예컨대 DNA가 제거된다. 일부 양태에서, 한외여과 막의 세공 크기는 100 kD 분자량 컷 오프(MWCO) 이하, 90 kD MWCO, 80 kD MWCO, 70 kD MWCO, 60 kD MWCO, 50 kD MWCO, 40 kD MWCO, 35 kD MWCO, 30 kD MWCO, 25 kD MWCO, 20 kD MWCO, 15 kD MWCO, 10 kD MWCO, 9 kD MWCO, 8 kD MWCO, 7 kD MWCO, 6 kD MWCO, 또는 5 kD MWCO 이하이다.
일부 양태에서, 제1 나노여과 단계가 수행되어 발효 생성물로부터 목적 HMO보다 약간 더 큰 분자량을 갖는 분자가 제거된다. 일부 양태에서, 나노여과 막의 세공 크기는 0.5 kD MWCO, 0.6 kD MWCO, 0.7 kD MWCO, 0.8 kD MWCO, 0.9 kD MWCO, 1 kD MWCO, 1.2 kD MWCO, 1.4 kD MWCO, 1.6 kD MWCO, 1.8 kD MWCO, 2 kD MWCO 이상이거나, 관심 표적 분자보다 높은 MWCO를 가진다.
일부 양태에서, 제2 나노여과 단계가 수행되어 저분자량 분자, 예컨대 단당류 및 이온이 제거된다. 일부 양태에서, 제2 나노여과 막의 세공 크기는 500 달턴(Da) MWCO 이하, 450 Da MWCO, 400 Da MWCO, 350 Da MWCO, 300 Da MWCO, 250 Da MWCO, 또는 200 Da MWCO 이하이다.
본원에 기재된 한외여과 및 나노여과 기법을 사용하여, 2개의 개별 스트림(stream)이 각각의 여과 후 생성되는데, 제1 스트림은 농축물(retentate)로 공지되어 있고 제2 스트림은 투과물(permeate)로 공지되어 있다.
일부 양태에서, 한외여과 단계 후 투과물 중 목적 HMO의 수율은 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 91% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과이다.
일부 양태에서, 나노여과 단계 후 투과물 중 목적 HMO의 수율은 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 91% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과이다.
일부 양태에서, 나노여과 단계 후 농축물 중 목적 HMO의 수율은 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 91% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과이다.
농축물 중 수율(Y)은 Yr= CrVr/CfVf(여기서 Cr은 농축물 중 용질의 농도이고, Cf는 초기 공급물 중 용질의 농도이고, Vr은 농축물의 부피이고, Vf는 초기 공급물의 부피임)에 의해 계산된다.
투과물 중 수율(Y)은 Yp= CpVp/CfVf(여기서 Cp는 투과물 중 용질의 농도이고, Cp는 초기 공급물 중 용질의 농도이고, Vp는 투과물의 부피이고, Vp는 초기 공급물의 부피임)에 의해 계산된다.
일부 양태에서, 탈염 단계가 수행된다. 상기 단계는 막 및/또는 전기투석 단계를 사용할 수 있다. 또한, 탈염 단계는 제2 나노여과 단계와 동일한 것일 수 있다.
본 발명의 방법은 발효 생성물을 모의 유동층(SMB) 크로마토그래피로 처리하여 불순물, 기타 유사 분자, 비목적 분자 및 기타 하전된 분자로부터 목적 HMO, 예컨대 2'FL을 정제함을 포함한다. SMB 크로마토그래피는 하나 이상의 여과 단계 후 바람직하게 수행된다. 바람직한 양태에서, 발효 생성물은 SMB 크로마토그래피 수행에 앞서, 원심분리, 마이크로여과, 한외여과 및 하나 이상의 나노여과 단계를 거친다.
SMB 크로마토그래피는 하기를 포함할 수 있다:
(i) 4개 이상의 컬럼, 바람직하게는 8개 이상의 컬럼, 보다 바람직하게는 12개 이상의 컬럼(여기서 하나 이상의 컬럼은 약 또는 강 양이온 교환 수지, 바람직하게는 H+-형 또는 Ca2+-형의 양이온 교환 수지를 포함함); 및/또는
(ii) 상이한 유속을 갖는 4개의 영역 I, II, Ill 및 IV; 및/또는
(iii) 물, 바람직하게는 에탄올 및 물, 보다 바람직하게는 5 내지 15 부피%의 에탄올 및 85 내지 95 부피%의 물, 가장 바람직하게는 9 내지 11 부피%의 에탄올 및 89 내지 91 부피%의 물을 포함하거나 이로 이루어진 용리액(여기서 용리액은 임의적으로 황산, 바람직하게는 10 mM 이하의 황산, 보다 바람직하게는 2 내지 5 mM 이하의 황산을 추가로 포함함); 및/또는
(iv) 15 내지 60℃, 바람직하게는 20 내지 55℃, 보다 바람직하게는 25 내지 50℃의 작동 온도.
정제되는 HMO가 2'FL인 경우, SMB 크로마토그래피 하기를 포함할 수 있다:
(i) 상이한 유속을 갖는 4개의 영역 I, II, III 및 IV(여기서 유속은 바람직하게는 영역 I에서 28 내지 32 mL/분, 영역 II에서 19 내지 23 mL/분, 영역 III에서 21 내지 25 mL/분 및/또는 영역 IV에서 16 내지 20 mL/분임); 및/또는
(ii) 2 내지 4 mL/분, 바람직하게는 3 mL/분의 공급속도; 및/또는
(iii) 10 내지 13 mL/분, 바람직하게는 11.5 mL/분의 용리액 유속; 및/또는
(iv) 16 내지 20분, 바람직하게는 17 내지 19분, 보다 바람직하게는 18분의 전환(switching) 시간.
바람직하게는, 하나 이상의 컬럼은 0.1 내지 5000 kg의 양이온 교환 수지, 바람직하게는 0.2 내지 500 kg의 양이온 교환 수지, 보다 바람직하게는 0.5 내지 50 kg의 양이온 교호나 수지, 가장 바람직하게는 1.0 내지 20 kg의 양이온 교환 수지를 포함한다.
양이온 교환 물질의 양, 상이한 영역에서의 유속, 공급속도, 용리액 유속 및/또는 전환 시간은 필요에 따라 증량될 수 있다. 증량은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000 배수 또는 상기 값들 사이의 모든 가능한 증량 배수일 수 있다.
컬럼에서, 강 양이온 교환 수지는 고정상으로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 양이온 교호나 수지는 설폰산 수지, 보다 바람직하게는 퓨로라이트(Purolite: 등록상표) PCR833H(독일 라팅겐의 퓨로라이트(Purolite)), 리와티트(Lewatit) MDS 2368 및/또는 리와티트 MDS 1368 수지이다. 양이온 교환 수지가 컬럼에서 사용되는 경우, 이는 황산에 의해 재생될 수 있다. 황산은 용리액에서 바람직하게는 10 mM 이하 황산의 농도로 사용될 수 있다. (강) 양이온 교환 수지는 H+-형 또는 Ca2+-형으로 존재할 수 있다.
일부 양태에서, 제조되는 HMO의 % 순도는 88% 이상이다. 일부 양태에서, 제조되는 HMO의 % 순도는 90% 이상, 91% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과 또는 99% 초과이다. 하기 수학식 1이 사용된다:
[수학식 1]
% 순도 = (CHMO/CDM) * 100
상기 식에서, CHMO는 목적 HMO의 농도이고, CDM은 총 건조물의 농도이다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 탈색 단게를 포함한다. 탈색은 임의의 적합한 수단에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 탈색은 발효 생성물을 활성화된 탄소로 처리함으로써 수행될 수 있다. 하나 이상의 탈색 단계는 본 발명의 방법 중 임의의 시점에 수행될 수 있다. 바람직한 양태에서, 탈색은 SMB 크로마토그래피 후 수행된다.
목적 HMO를 함유하는 생성 용액은 농축 및/또는 건조될 수 있다. 일부 양태에서, 생성 용액은 증발, 동결건조 또는 이의 임의의 조합으로 처리된다.
본 발명의 방법을 사용하여 수득된 HMO는 식품 및 사료 적용례에 사용하기에 적합하다. 일부 양태에서, 수득된 HMO는 유아용 식품, 유아용 제형 및/또는 유아용 보충제에 사용된다. 바람직한 양태에서, 수득된 HMO는 인간 유아용 식품, 인간 유아용 제형 및/또는 인간 유아용 보충제에 사용된다.
다른 양태에서, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 수득된 HMO는 의약에서, 예컨대 위장 질환용 치료 및/또는 프리바이오틱스로서 사용된다.
하기 실시예는 예시를 제공하되 청구되는 본 발명을 한정하지는 않는다.
실시예
실시예 1
하나 이상의 인간 모유 올리고당을 발현하도록 유전자 조작된 미생물 세포를 적합한 배양 배지에 배양하여 인간 모유 올리고당을 함유하는 모유 생성물을 생성한다. 이어서, 상기 발효 생성물을 하나 이상의 효소, 예컨대 락타아제, β-갈락토시다이제, 트레할라아제 및/또는 인버타아제로 처리한다. 바이오매스, 예컨대 세포를 임의의 적합한 수단, 예컨대 원심분리에 이은 여과, 또는 이의 임의의 조합을 사용하여 발효 생성물로부터 제거한다. 이어서, 발효 생성물을 한외여과하여 단백질 및 기타 고분자량 화합물, 예컨대 DNA를 제거한다. 이어서, 나노여과 단계를 수행하여 목적 HMO보다 약간 더 큰 분자량을 갖는 분자를 발효 생성물로부터 제거한다. 제2 나노여과 단계를 수행하여 저분자량 분자, 예컨대 단당류 및 이온을 제거한다.
이어서, 발효 생성물을 SMB 크로마토그래피로 처리하여 목적 HMO를 추가로 정제한다. SMB 크로마토그래피에 사용되는 시스템은 양이온 교환 수지를 함유하는 4개 이상의 컬럼을 함유한다. 상이한 영역에 사용되는 유속은 영역 I에서 28 내지 32 mL/분, 영역 II에서 19 내지 23 mL/분, 영역 III에서 21 내지 25 mL/분 및/또는 영역 IV에서 16 내지 20 mL/분이다. 사용되는 용리액은 물 중 10% 에탄올일 수 있다. 정제된 HMO를 함유하는 생성 용액은 임의적으로 탈색, 여과 및/또는 건조될 수 있다.
본원에 인용된 모든 참조는 각각의 참조가 구체적 및 개별적으로 참조로 혼입되는 것과 마찬가지로 본원에 참조로 혼입된다. 임의의 참조의 인용은 출원일 전 이의 개시에 대한 것이고, 본 개시가 선행 발명으로 인해 이러한 참조보다 선행 할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
전술된 각각의 요소 또는 2개 이상이 함께 전술한 유형과 상이한 방법의 다른 유형에 유용하게 적용될 수 있음이 이해될 것이다. 추가적인 분석 없이도, 전술한 바는 현재 지식을 적용함으로써 다른 사람들이 현재 지식을 적용함으로써 종래 기술의 관점에서 볼 때 첨부 된 청구범위에 기재된 본 개시의 포괄적 또는 특정 양상의 필수 특성을 공정하게 구성하는 특징을 생략하지 않고 다양한 적용례 쉽게 적응할 수 있도록 본 개시 내용의 요지를 완전히 드러낼 것이다. 전술한 양태들은 단지 예로써 제시된 것이고, 본 발명의 범주는 하기 청구범위에 의해서만 한정된다.

Claims (32)

  1. (a) 하나 이상의 인간 모유 올리고당(HMO)을 생성하도록 유전자 변형된 미생물 개체를 적합한 발효 배지에서 발효시켜 발효 생성물을 생성하는 단계;
    (b) 상기 발효 생성물을 효소적 처리하는 단계;
    (c) 상기 발효 생성물로부터 바이오매스를 제거하는 단계;
    (d) 한외여과 단계;
    (e) 나노여과 단계; 및
    (d) 컬럼 크로마토그래피 단계
    를 포함하는 하나 이상의 HMO의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    하나 이상의 HMO가 2'-푸코실락토스인, 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    미생물 개체가 효모인, 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    효모가 사카로마이세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 슈바니오마이세스(Schwanniomyces), 토룰라스포라(Torulaspora), 야로위아(Yarrowia) 및 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제조 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    효모가 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 피키아 스티피테스(Pichia stipites), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 슈바니오마이세스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 토룰라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica), 자이고사카로마이세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii) 및 자이고사카로마이세스 바일리이(Zygosaccharomyces bailii)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소적 처리하는 단계가 락타아제, β-갈락토시다아제, 트레할라아제 및 인버타아제로부터 선택되는 하나 이상의 효소와 발효 생성물을 항온처리함을 포함하는, 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소적 처리하는 단계가 락토스 및/또는 수크로스를 단당류로 전환하는, 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    발효 생성물로부터 바이오매스를 제거하는 단계가 원심분리, 여과 또는 이의 조합을 포함하는, 제조 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    컬럼 크로마토그래피 단계가 단컬럼 또는 다컬럼인, 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    컬럼 크로마토그래피 단계가 모의 유동층 크로마토그래피(simulated moving bed chromatography)인, 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노여과 단계가 1회 초과로 수행되는, 제조 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노여과 단계가 2회 수행되는, 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    나노여과 단계가 연속적으로 수행되는, 제조 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 탈색;
    (b) 여과; 및/또는
    (c) 건조
    중 하나 이상을 추가로 포함하는, 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    건조가 증발을 포함하는, 제조 방법.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    모의 유동층 크로마토그래피가
    (i) 하나 이상의 컬럼이 약 또는 강 양이온 교환 수지를 포함하는 4개 이상의 컬럼; 및/또는
    (ii) 상이한 유속을 갖는 4개의 영역 I, II, Ill 및 IV; 및/또는
    (iii) 물을 포함하는 용리액; 및/또는
    (iv) 15 내지 60℃의 작동 온도
    를 포함하는, 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    용리액이 에탄올 및/또는 황산을 추가로 포함하는, 제조 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    영역 I에서의 유속이 28 내지 32 mL/분, 영역 II에서의 유속이 19 내지 23 mL/분, 영역 III에서의 유속이 21 내지 25 mL/분이고/거나 영역 IV에서의 유속이 16 내지 20 mL/분인, 제조 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    작동 온도가 25 내지 50℃인, 제조 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    2 내지 4 mL/분의 공급 속도를 포함하는 제조 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    10 내지 13 mL/분의 용리액 유속을 포함하는 제조 방법.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    16 내지 20분의 전환 시간을 포함하는 제조 방법.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 컬럼이 0.1 내지 5000 kg의 양이온 교환 수지를 포함하는, 제조 방법.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    양이온 교환 수지가 설폰산 수지인, 제조 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 내지 (f)가 임의의 순서로 수행되는, 제조 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 내지 (f)가 제1항에 제시된 순서로 수행되는, 제조 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 제조 방법에 따라 수득되는 HMO.
  28. 식품 또는 사료 제조에서 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 따라 수득되는 HMO의 용도.
  29. 제28항에 있어서,
    식품이 인간용 식품인, 용도.
  30. 제29항에 있어서,
    식품이 유아용 식품인, 용도.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서,
    식품이 유아용 제형 또는 유아용 보충제인, 용도.
  32. 식이 보충제에서 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 제조 방법에 따라 수득되는 HMO의 용도.
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