CZ35288U1 - Neutrální lidské mléčné oligosacharidy (HMO) z mikrobiální fermentace - Google Patents

Neutrální lidské mléčné oligosacharidy (HMO) z mikrobiální fermentace Download PDF

Info

Publication number
CZ35288U1
CZ35288U1 CZ2019-36834U CZ201936834U CZ35288U1 CZ 35288 U1 CZ35288 U1 CZ 35288U1 CZ 201936834 U CZ201936834 U CZ 201936834U CZ 35288 U1 CZ35288 U1 CZ 35288U1
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
lacto
hmo
concentrate
concentrate according
solution
Prior art date
Application number
CZ2019-36834U
Other languages
English (en)
Inventor
Stefan Jennewein
Original Assignee
Chr. Hansen HMO GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49949589&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ35288(U1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chr. Hansen HMO GmbH filed Critical Chr. Hansen HMO GmbH
Publication of CZ35288U1 publication Critical patent/CZ35288U1/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/163—Sugars; Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/30—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols, e.g. xylitol; containing starch hydrolysates, e.g. dextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/20—Reducing nutritive value; Dietetic products with reduced nutritive value
    • A23L33/21—Addition of substantially indigestible substances, e.g. dietary fibres
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pediatric Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Dairy Products (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Předkládané řešení popisuje purifikované neutrální lidské mléčné oligosacharidy (HMO) získané mikrobiální fermentací. Tento způsob používá kombinaci zpracování s kationtovým iontoměničem, zpracování s aniontovým iontoměničem a kroku nanofiltrace a/nebo elektrodialýzy, což umožňuje účinnou purifikaci velkých množství neutrálních HMO ve vysoké čistotě. Na rozdíl od purifikace, která se používá v dnešní době při fermentační výrobě neutrálních HMO, předkládaný způsob umožňuje poskytnutí HMO bez potřeby chromatografické separace. Takto purifikované HMO podle předkládaného technického řešení se mohou získat v pevné formě prostřednictvím sprejového sušení, jako krystalický materiál nebo jako sterilní zfiltrovaný koncentrát. Poskytnuté HMO podle předkládaného technického řešení jsou bez proteinů a rekombinantního materiálu, který vzniká z používaných rekombinantních mikrobiálních kmenů, a proto jsou velmi dobře vhodné pro použití v aplikacích v oblasti potravin, lékařských potravin a krmiv (např. krmivo pro domácí zvířata).
Dosavadní stav techniky
Lidské mléko představuje složitou směs sacharidů, tuků, proteinů, vitaminů, minerálních látek a stopových prvků. Zdaleka převládající podíl představují sacharidy, které se mohou dále rozdělit na laktózu a složitější oligosacharidy. Zatímco se laktóza používá jako zdroj energie, nejsou složité oligosacharidy novorozenci metabolizovány. Frakce složitých oligosacharidů tvoří až 1/10 z celkové sacharidové frakce a sestává pravděpodobně zvíce než 150 různých oligosacharidů. Výskyt a koncentrace těchto složitých oligosacharidů jsou specifické pro lidi, a proto je nelze nalézt ve velkých množstvích v mléku ostatních savcům, jako jsou, například, domestikovaná mléčná zvířata.
Existence těchto složitých oligosacharidů v lidském mléku je známá již dlouhou dobu a fýziologické funkce těchto oligosacharidů byly podrobeny lékařskému výzkumu po mnoho desetiletí (Gura, T. (2014) Nature's first functional food. Science 345(6198) 747-749). Pro některé z nejhojnějších lidských mléčných oligosacharidů byly již identifikovány specifické funkce (Bode, L. (2012) Human milk oligosaccharides: every baby needs a sugar mama.
Glycobiology 22(9), 1147-1162.; Bode L, Jantscher-Krenn E (2012) Structure-function relationships of human milk oligosaccharides. Adv Nutr 3(3) 3835-3915; Morrow AL, RuizPalacios GM, Altaye M, Jiang X, Guerrero ML. Meinzen-Derr JK, Farkas T, Chaturvedi P, Pickering LK, Newburg DS (2004) Human milk oligosaccharides are associated with protection against diarrhea in breast-fed infants. J Pediatr 145(3) 297-303).
Omezená zásoba a složitosti při získání čistých frakcí jednotlivých lidských mléčných oligosacharidů vedou k rozvoji chemických cest k některým z těchto složitých molekul. Nicméně, syntéza lidských mléčných oligosacharidů prostřednictvím chemické syntézy, enzymatické syntézy nebo fermentace dokázala být náročná. Až do dnešního dne nebylo možné poskytnutou alespoň množství ve velkém měřítku, jakož i kvality dostatečné pro potravinářské aplikace. V tomto ohledu zahrnují zejména chemické syntetické cesty k lidským mléčným oligosacharidům (např., 2'-fúkosyllaktóza; viz WO 2010/115935 AI) několik škodlivých chemických látek, které představují riziko kontaminace konečného produktu.
Kvůli výzvám spojeným s chemickou syntézou lidských mléčných oligosacharidů se vyvinuly některé enzymatické způsoby a fermentační přístupy (Miyazaki et al., (2010) Methods in Enzymol. 480, 51 1-524: Murata et al., (1999) Glycoconj. J. 16, 189-195; Baumgartner, F. et al., (2013) Microb. Cell Fact. 12, 40; Lee et al., (2012) Microb. Cell Fact. 11, 48; US 7 521 212 B1 nebo
- 1 CZ 35288 UI
Albermann et al, (2001) Carbohydr. Res. 334(2) p 97- 103). Nicméně, tyto způsoby dávají složité směsi oligosacharidů, tj. požadovaný produkt je kontaminovaný výchozím materiálem, jako je laktóza, biosyntetické meziprodukty a substráty, jako jsou jednotlivé monosacharidy a polypeptidy atd.
Způsoby z dosavadního stavu techniky pro purifikaci jednotlivých oligosacharidových produktů z těchto složitých směsí jsou technicky složité a také neekonomické pro potravinářské aplikace. Pro purifikaci disacharidů, laktózy nebo sacharózy, ze složitých směsí, jako je syrovátka nebo melasa, se vyvinuly způsoby v průmyslovém měřítku, které zahrnují násobné krystalizace. Nevýhoda uvedených způsobů je, že jsou komplikované a vedou pouze k nízkým výtěžkům.
Pro purifikaci složitých oligosacharidů z mikrobiální fermentace, jako jsou určité lidské mléčné oligosacharidy, je gelová filtrační chromatografie způsobem volby, až do teď.
Nevýhoda gelové filtrační chromatografie je, že u ní nelze účinně zvýšit měřítko a je nevhodná pro kontinuální operaci. A proto není gelová filtrační chromatografie ekonomická a znemožňuje poskytnutí určitých lidských mléčných oligosacharidů - jako je 2'-fúkosyllaktóza nebo lakto-N-tetraóza - v rozumných množstvích a kvalitě pro jejich použití v lidských potravinách a dalších aplikacích, jako je krmivo pro zvířata (např., krmivo pro domácí zvířata). Aplikace jako krmivo pro zvířata nebo krmivo pro domácí zvířata je zajímavá na základě toho, že také další savci obsahují stejné nebo podobné neutrální složité oligosacharidy v jejich mléku jako lidé (např., 2'-fúkosyllaktózu lze také nalézt v mléku psů, prasat, šimpanzů) (Castanys-Munzo , E., Martin, J. M & Prieto, P. A. (2013) 2'-fukosyllaktóza: an abundant, genetically determined soluble glycan present in human milk. Nutr. Rev. 71(12) 773-789).
Jiný problém je představovaný použitím rekombinantních kmenů (rekombinantní bakteriální nebo kvasinkové kmeny) při mikrobiální fermentaci, což má za následek kontaminaci fermentačního produktu rekombinantním materiálem. Nicméně, kontaminace rekombinantní DNA nebo proteiny není v dnešní době přijatelná nařízeními a spotřebiteli. Detekční limity jsou konkrétně pro rekombinantní DNA molekuly velmi nízké. V případě, že se použije detekce na základě qPCR, která se v současné době považuje za zlatý standard pro detekci, se může detekovat i malé množství jednotlivých DNA molekul. Proteiny, navíc k tomu, představují riziko alergických reakcí, a proto by se měly účinně odstranit z požadovaného oligosacharidového produktu.
Elektrodialýza (ED) představuje techniku, která kombinuje dialýzu a elektrolýzu, a může se použít pro separaci nebo koncentraci iontů v roztocích na základě jejich selektivní elektromigrace přes semipermeabilní membrány. První průmyslové aplikace elektrodialýzy se datují do raných 1960 s demineralizací sýrové syrovátky pro použití v umělé kojenecké výživě. Další vyvinuté aplikace elektrodialýzy zahrnují úpravu pH nápojů, jako jsou vína, hroznový mošt, jablečný džus a pomerančový džus.
Odsolení poloslané vody pro výrobu pitné vody a demineralizace mléčné syrovátky pro výrobu umělé kojenecké výživy představují v dnešní době největší oblasti aplikace.
Základní princip elektrodialýzy sestává z elektrolytického článku složeného z páru elektrod ponořených do elektrolytu pro vedení iontů spojeného s generátorem stejnosměrného proudu.
Elektroda připojená ke kladnému pólu generátoru stejnosměrného proudu je anoda, a elektroda připojená k zápornému pólu je katoda. Elektrolytevý roztok pak podporuje tok proudu, který vychází z pohybu iontů se záporným a kladným nábojem směrem k anodě nebo katodě, v daném pořadí. Membrány používané při elektrodialýze jsou v podstatě desky porézních iontově výměnných pryskyřic, které mají skupiny se záporným nebo kladným nábojem, a proto se popisují jako kationtová nebo aniontová membrána, v daném pořadí. Iontově výměnné membrány jsou obvykle vyrobené z polystyrenu, který nese vhodnou fimkční skupinu (jako je kyselina sulfonová nebo kvartémí amoniová skupina pro kationtové a aniontové membrány, v daném pořadí)
- 2 CZ 35288 UI zesíťovaného divinylbenzenem. Jako elektrolyt se může použít chlorid sodný nebo octan sodný, propionát sodný atd. Elektrodialýzní stoh se pak sestaví takovým způsobem, že jsou aniontové a kationtové membrány paralelní jako ve filtračním lisu mezi dvěma elektrodovými bloky, tak, že se proud podstupující iontovou depleci dobře separuje od proudu podstupujícího iontovým obohacením (tyto dva roztoky se také označují jako diluát (podstupující iontovou depleci) a koncentrát (podstupující iontové obohacení)). Podstatou elektrodialýzního procesu je membránový stoh, který sestává z několika aniontové a kationtové výměnných membrán oddělených pomocí spacerů, instalovaných mezi dvěma elektrodami. Aplikováním stejnosměrného elektrického proudu budou anionty a kationty migrovat přes membrány směrem k elektrodám, které generují proud diluátu (odsolený) a koncentrátu.
Obecně je velikost pórů použitých membrán spíše malá, aby se zabránilo difúzi produktu z diluátu do proudu koncentrátu, poháněnou často vysokými koncentračními rozdíly mezi těmito dvěma proudy. Po separaci z biomasy se musí proteiny a zejména rekombinantní DNA molekuly (ve velikosti celých genomů) odstranit kvantitativně z požadovaného produktu. Jestli je to vůbec možné, byla by elektrodialýza takových velkých molekul (ve srovnání s molekulární velikostí UMO) poměrně zdlouhavá a jistě doprovázená s významnými ztrátami požadovaného produktu z diluátu do koncentrátu.
Diafiltrace je procesem, který zahrnuje přidání čerstvé vody do roztoku za účelem „vypláchnutí“ nebo odstranění membránově permeabilních složek. A tak se diafiltrace může použít pro separaci složek na základě jejich molekulární velikosti prostřednictvím použití vhodných membrán, s tím, že se účinně zadrží jedna nebo více látek, a ostatní látky jsou membránově permeabilní. Zejména je pro separaci sloučenin s nízkou molekulární hmotností ze solí účinná diafiltrace pomocí použití nanofiltrační membrány. Obecně mají nanofiltrační membrány mezní molekulární hmotnost v rozmezí 150 až 300 Daltonů. Dnes se nanofiltrace (NF) široce používá v mlékárenském průmyslu pro zakoncentrování a demineralizaci syrovátky. Nanofiltrace se již používá pro obohacení frakce lidských mléčných oligosacharidů z lidského mléka. Při tomto přístupu se nanofiltrace používá v kombinaci s enzymatickou degradací laktózy, aby se oddělila UMO frakce od mléčné laktózy (Samey D.B, Hale, C., Frankel, G & Vulfson, E.N. (2000) A novel approach to the recovery of biological active oligossacharides from milk using a combination of enzymatic treatment and nanofiltration. Biotechnol. Bioeng 69, 461-467).
Ve vyvinutém způsobu pro účinnou purifikaci lidských mléčných oligosacharidů v potravinářské kvalitě z mikrobiální fermentace se použije nanofiltrace za účelem zakoncentrování požadovaného produktu a také aby se odstranily membránově permeabilní soli.
Pokud se vychází z tohoto stavu techniky je technickým problémem poskytnutí nového způsobu pro získání neutrálních HMO ve vysokých množstvích, vysoké čistotě a výborných výtěžcích.
Podstata technického řešení
Tento technický problém je vyřešený pomocí lidského mléčného oligosacharidů (HMO) a pomocí jeho použití.
Předkládané technické řešení poskytuje způsob pro purifikaci neutrálních lidských mléčných oligosacharidů (HMO) vsádkovým způsobem nebo kontinuálním způsobem z fermentačního bujónu získaného prostřednictvím mikrobiální fermentace, s tím, že se poskytuje purifikovaný roztok, který obsahuje neutrální HMO v čistotě 80 %. Tento fermentační bujón obsahuje neutrální HMO, biomasu, složky z média a kontaminanty. Čistota neutrálního HMO ve fermentačním bujónu je < 80 %.
- 3 CZ 35288 UI
V průběhu tohoto způsobu se fermentační bujón aplikuje do následujících purifikačních kroků:
i) Separace biomasy z fermentačního bujónu, ii) Zpracování s kationtovým iontoměničem pro odstranění kladně nabitého materiálu, iii) Zpracování s aniontovým iontoměničem pro odstranění záporně nabitého materiálu.
iv) Nanofiltrační krok (který zahrnuje nebo sestává z koncentrace a/nebo diafiltrace neutrálního HMO) a/nebo elektrodialýzní krok (obzvláště pro odstranění solí a dalších sloučenin s nízkou molekulární hmotností).
Kontaminanty přítomné ve fermentačním bujónu bez buněk jsou, například, další oligosacharidy jiné než požadovaný neutrální HMO, třeba monovalentní a divalentní soli, aminokyseliny, polypeptidy, proteiny, organické kyseliny, nukleové kyseliny atd. Požadovaný neutrální HMO se může získat v čistotě > 80 %v purifikovaném roztoku.
Původci zjistili, že s požadovaným purifikačním způsobem se může dosáhnout účinné purifikace neutrálních HMO z mikrobiální fermentace, která dodává HMO v čistotě vhodné pro aplikace v potravinách a krmivech. Navíc je tento způsob vysoce nákladově efektivní, protože není potřeba žádaný chromatografický separační krok. Navíc se zjistilo, že se dosahuje čistoty > 80 %, ať už se provádí elektrodialýzní krok, nebo nanofiltrační krok v kroku iv), nebo pokud se provádějí oba kroky za sebou.
Jednou výhodou způsobu podle předkládaného technického řešení je, že se požadované neutrální HMO získají bez DNA a proteinů z použitého rekombinantního mikrobiálního fermentačního kmene. Obzvláště implementace zpracování s kationtovým iontoměničem (krok ii) umožňuje odstranění kladně nabitého materiálu, jako jsou, např., kladně nabité proteiny. V důsledku toho poskytuje inventivní způsob HMO, který zahrnuje méně kladně nabitý kontaminující materiál ve srovnání se schématy běžné purifikace, které jsou známé v dosavadní stavu techniky, které neimplementují zpracování s kationtovým měničem. Dále se zjistilo, že po průchodu fermentačního bujónu separovaného z biomasy (výhodně pomocí ultrafiltrace) přes kationtový iontoměnič (v protonové formě), byl získaný roztok stabilní a mohl se skladovat pří pokojové teplotě nebo za ochlazování po několik týdnů. Navíc je získaný neutrální HMO bez rekombinantního materiálu, jak se hodnotí kvantitativní PCR s až 50 amplifikačními cykly. Navíc je tento produkt podle technického řešení charakterizovaný nízkými množstvími nebo nepřítomností proteinů.
Navíc je neutrální HMO purifikace podle tohoto technického řešení vysoce účinná s ještě neznámými výtěžky > 70 % (případně > 75 %) purifikováného HMO (stanoveno z fermentačního média bez buněk až do HMO koncentrátu).
A proto se poskytuje hybridní způsob, který zahrnuje kroky separace biomasy, iontoměniče, a krok nanofiltrace a/nebo elektrodialýzy, a výhodně který dále zahrnuje zpracování s aktivním uhlím, pro účinné poskytnutí neutrálních HMO ve vysoké čistotě bez rekombinantního genetického materiálu, endotoxinů a proteinů z fermentačních způsobů za použití rekombinantních fermentačních kmenů. Pomocí způsobu podle technického řešení se mohou poskytovat vysoká množství lidských mléčných oligosacharidů s vysokou kvalitou velmi výhodným a ekonomickým způsobem.
Neutrální HMO se může purifikovat z fermentačního bujónu získatelného mikrobiální fermentací za použití rekombinantního mikroorganismu, výhodně bakterie nebo kvasinky, výhodněji za použití rekombinantního mikroorganismu, který roste v chemicky definovaném médiu. Případně se biomasa separovaná v kroku i) recykluje do mikrobiální fermentace.
V jiném výhodném provedení způsobu podle technického řešení je čistota neutrálního HMO ve fermentačním bujónu < 70 %, < 60 %, < 50 %, < 40 %, < 30 %, < 20 %, < 10 % nebo < 5 % a/nebo purifikovaný roztok obsahuje neutrální HMO v čistotě > 85 %, výhodně > 90 %.
- 4 CZ 35288 UI
V jiném výhodném provedení způsobu podle technického řešení je výtěžek neutrálního HMO > 70 % (případně > 75 %) a/nebo je purifikovaný roztok bez DNA, proteinů a/nebo rekombinantního genetického materiálu.
V jiném výhodném provedení je neutrální HMO vybraný ze skupiny sestávající z 2-fukosyllaktózy, 3-fůkosyllaktózy, 2',3-difukosyllaktózy, lakto-N-triózy II, lakto-N-tetraózy, lakto-N-neotetraózy, lakto-N-fůkopentaózy I, lakto-N-neofůkopentaózy, lakto-N-fůkopentaózy II, lakto-N-fůkopentaózy III, lakto-N-fůkopentaózy V, lakto-N-neofukopentaózy V, lakto-N-difůko-hexaózy I, lakto-N-difukohexaózy II, 6'-galaktosyllaktózy, 3'-galaktosyllaktózy, lakto-N-hexaózy a lakto-N-neohexaózy.
V zejména výhodném provedení je neutrálním HMO 2'-fůkosyllaktóza.
V jiném výhodném provedení způsobu podle technického řešení se dosáhne separace biomasy z fermentačního bujónu
a) ultrafiltrací, výhodně separací biomasy a materiálů > 500 kDa, výhodněji > 150 kDa; a/nebo
b) filtrací přes cross-flow filtr, výhodně s mezní hodnotou < 100 kDa, výhodněji s mezní hodnotou <10 kDa, ještě výhodněji s mezní hodnotou < 5 kDa;
s tím, že je krok a) výhodně implementovaný před krokem b).
V jiném výhodném provedení způsobu podle technického řešení se alespoň jeden z purifikačních kroků ii) až v) ze způsobu opakuje alespoň jednou v průběhu tohoto způsobu.
V jiném výhodném provedení způsobu podle technického řešení se fermentační bujón aplikuje alespoň jednou do zpracování s aktivním uhlím po alespoň jednom z purifikačních kroků i) až iv) pro adsorpci materiálu, který dává barvu, a větších oligosacharidů do aktivního uhlí. Aplikováním fermentačního bujónu do tohoto dodatečného purifikačního kroku se z fermentačního bujónu může odstranit materiál, který dává barvu, a větší oligosacharidy.
Způsob podle technického řešení se může vyznačovat tím, že
a) po alespoň jednom z purifikačních kroků i) až iv); nebo
b) po alespoň jednom zpracování s aktivním uhlím pro adsorpci materiálu, který dává barvu, a větších oligosacharidů do aktivního uhlí; nebo
c) před krokem zakoncentrování, který je implementovaný po alespoň jednom z purifikačních kroků i) až iv);
se ten roztok, který obsahuje neutrální lidský mléčný oligosacharid, diafiltruje a/nebo zakoncentruje. Výhodně se uvedený roztok diafiltruje a/nebo zakoncentruje pomocí nanofiltrační membrány, výhodněji pomocí nanofiltrační membrány, která má limit propustnosti SEL (z angl. size exclusion limit) < 20 Á. Nejvýhodněji se tento roztok diafiltruje, až dokud se nedosáhne vodivosti < 15 mS/cm, výhodně < 10 mS/cm, výhodněji < 5 mS/cm.
Zjistilo se, že je diafiltrace za použití nanofiltrace účinná jako předzpracování pro odstranění významných množství kontaminantů před elekrodialýzním zpracováním roztoku, který obsahuje HMO. Kromě toho se zjistilo, že nanofiltrace je také účinná při odstraňování nízkomolekulámích kontaminantů po ultra filtračním kroku, s tím, že uvedené odstranění je prospěšné pro zakoncentrování a demineralizaci HMO roztoku před zpracováním s iontoměničem. Použití nanofiltračních membrán pro zakoncentrování a diafiltraci při purifikaci lidských mléčných oligosacharidů má za následek nižší energetické a provozní náklady, jakož i vylepšenou kvalitu produktu, kvůli sníženému tepelnému vystavení, což vede k redukovaným Maillardovým reakcím a aldolovým reakcím.
- 5 CZ 35288 UI
V kroku před krokem i) se může s fermentačním bujónem provádět zpracování s glukosidázou, výhodně zpracování s β-glukosidázou, přičemž se uvedené zpracování výhodně provádí
a) přidáním kmene mikroorganismu, který je schopný exprimovat jeden nebo více glykosidázových enzymů, které jsou vhodné pro degradaci nežádoucích meziproduktů, substrátů a/nebo oligosacharidových vedlejších produktů; a/nebo
b) za použití fermentačního kmene, který exprimuje jeden nebo více glykosidázových enzymů, výhodně přidáním induktoru do fermentačního bujónu a/nebo posunováním teploty fermentačního bujónu; a/nebo
c) přidáním jedné nebo více glykosidáz, výhodně alespoň β-glukosidázy, do fermentačního bujónu jako surový enzym nebo jako puntíkovaný enzym.
V jiném výhodném provedení způsobu podle technického řešení se fermentační bujón zakoncentruje po alespoň jednom z purifikačních kroků i) až iv), výhodně po purifikačním kroku iv), za použití vakuového odpaření nebo reverzní osmózy nebo nanofiltrace (např., nanofiltrace pomocí nanofiltrační membrány, která má limit propustnosti SEL < 20 Á)
a) na koncentraci >100 g/1, výhodně > 200 g/1, výhodněji > 300 g/1; a/nebo
b) při teplotě < 80 °C, výhodně < 50 °C. výhodněji 20 °C až 50 °C, ještě výhodněji 30 °C až 45 °C, nejvýhodněji 35 °C až 45 °C (obzvláště důležité pro vakuové odpaření nebo reverzní osmózu); a/nebo
c) při teplotě < 80 °C, výhodně < 50°C, výhodněji 4 °C až 40 °C (obzvláště důležité pro nanofiltraci).
V jiném výhodném provedení způsobu podle technického řešení se puntíkovaný roztok sterilně zfiltruje a/nebo podrobí endotoxinovému odstranění, výhodně pomocí filtrace purifikovaného roztoku přes 3kDa filtr.
V jiném výhodném provedení způsobu podle technického řešení se roztok, který obsahuje neutrální HMO, podrobí elektrodialýze za účelem dalšího odstranění nabitých materiálů, jako jsou monoa divalentní soli.
V jiném výhodném provedení způsobu podle technického řešení se purifikovaný roztok zakoncentruje na koncentraci > 1,5 M a ochladí na teplotu < 25 °C, výhodněji < 8 °C, aby se získal krystalický materiál neutrálního HMO.
V jiném výhodném provedení způsobu podle technického řešení se purifikovaný roztok sprejově suší, zejména sprejově suší při koncentraci neutrálního HMO 20 až 60 (hmotn./obj.), výhodně 30 až 50 (hmotn./obj.), výhodněji 35 az 45 (hmotn./obj.), při teplotě trysky 110 až 150 °C, výhodně 120 až 140 °C, výhodněji 125 až 135 °C a/nebo při výstupní teplotě 60 až 80 °C, výhodně 65 až 70 °C.
Navíc předkládané technické řešení zahrnuje neutrální lidský mléčný oligosacharid (HMO), který je vyrobitelný způsobem zde popsaným.
Ve výhodném provedení je HMO přítomný ve sterilní zfiltrovaném koncentrátu, např. sterilní koncentrát, který obsahuje neutrální HMO produkt s koncentrací > 30 % (hmotn./obj.), výhodněji > 40 % (hmotn./obj.).
V jiném výhodném provedení se HMO sprejově suší nebo krystalizuje.
V jiném výhodném provedení se HMO vybere ze skupiny sestávající z 2'-fukosyllaktózy, 3-fúkosyllaktózy, 2',3-difukosyllaktózy, lakto-N-triózy II, lakto-N-tetraózy, lakto-N-neotetraózy, lakto-N-fúkopentaózy I, lakto-N-neofúkopentaózy, lakto-N-fúkopentaózy II, lakto-N-fúko-pentaózy III, lakto-N-fúkopentaózy V, lakto-N-neofúkopentaózy V, lakto-N-difúkohexaózy I, lakto-N-difukohexaózy II, 6'-galaktosyllaktózy, 3'-galaktosyllaktózy,
-6CZ 35288 UI lakto-N-hexaózy a lakto-N-neohexaózy.
V zejména výhodném provedení je HMO 2'-fukosyllaktóza.
V jiném výhodném provedení má HMO
a) vodivost menší než 1 mSi/cm v 300 g/1 roztoku;
b) je bez rekombinantního DNA materiálu, případně bez jakékoliv DNA; a/nebo
c) je bez proteinů odvozených z rekombinantního mikroorganismu, případně bez jakýchkoliv proteinů.
Jiné výhodné provedení je zaměřené na HMO pro použití v lékařství, výhodně pro použití při profylaxi nebo terapii gastrointestinální poruchy.
Navíc, předkládané technické řešení zahrnuje použití HMO podle technického řešení jako potravinový doplněk v potravinách, výhodně jako potravinový doplněk v lidských potravinách a/nebo v krmivu pro domácí zvířata, výhodněji jako aditivum v lidské dětské výživě.
Objasnění výkresů
Má se zato, že předmět podle technického řešení je vysvětlený podrobněji s odkazem na následující výkresy a příklady, aniž bychom si přáli omezit uvedený předmět na zvláštní provedení.
Obr. 1 ukazuje schéma výhodného provedení způsobu podle předkládaného technického řešení pro purifikaci 2'-fukosyllaktózy z fermentačního bujónu, který zahrnuje tyto kroky; ultrafiltrace, zpracování s kationtovým a aniontovým iontoměničem, zpracování s aktivním uhlím, nanofiltrace. elektrodialýza a zakoncentrování.
Obr. 2 ukazuje schéma jiného výhodného provedení způsobu podle předkládaného technického řešení pro purifikaci 2'-fukosyllaktózy z fermentačního bujónu, který zahrnuje tyto kroky; ultrafiltrace, nanofiltrace. zpracování s kationtovým a aniontovým iontoměničem, zpracování s aktivním uhlím, elektrodialýza a zakoncentrování.
Obr. 3 ukazuje schéma jiného výhodného provedení způsobu podle předkládaného technického řešení pro purifikaci 2'-fukosyllaktózy z fermentačního bujónu, který zahrnuje tyto kroky; ultrafiltrace, zpracování s kationtovém a aniontovým iontoměničem, nanofiltrace. zpracování s aktivním uhlím, elektrodialýza a zakoncentrování.
Příklady uskutečnění technického řešení
Příklad 1: Purifikace 2'-fůkosyllaktózy z fermentace za použití rekombinantního mikrobiálního produkčního kmene I.
Vsádková fermentace s přívodem 2'-fukosyllaktózy za použití rekombinantního 2'-fukosyllaktózu syntetizujícího E. coli kmene (E. coli BL21(DE3) illacZ), který obsahoval genomovou integrační 2'-fůosyltranferázu, kódovanou wbgL genem (viz EP 11 1151 571.4), a který měl další kopii E. coli lacY, monB. manC, gmd a fcl, vše pod kontrolou silného konstitutivního tetracyklinového promotoru, který obsahoval funkční gal operon, který zahrnoval geny galM, galK, galT a galE, se nechala růst v definovaném solném médiu. Toto definované solné médium zahrnovalo 7 gl1 NH4H3PO4, 7 gl1 K2HPO4, 2 gl1 KOH, 0,37 gl1 citrónové kyseliny, 1 mil1 protipěnidla (Struktol J673, Schill + Seilacher), 1 mM CaCE, 4 mM MgSO4, stopové prvky a 2 % glycerolu jako zdroj uhlíku.
- 7 CZ 35288 UI
Stopové prvky sestávaly z 0,101 gl1 nitrilotrioctové kyseliny, pH 6,5, 0,056 gl1 citronanu amonno-železitého, 0,01 gl1 MnCl2 x 4 H2O, 0,002 gl1 CoCI2 x 6 H2O, 0,001 gl1 CuCl2 x 2 H2O 0,002 gl-1 kyseliny borité, 0,009 gl1 ZnSO4 x 7 H2O, 0,001 gl1 Na2MoO4 x 2 H2O, 0,002 g!1 Na2SeO3, 0,002 gl1 NiSO4 x 6 H2O.
Přívod glycerolu sestával z glycerolu 800 gl1, MgSO4 2.64 gl1 a roztoku stopových prvků 4 mil1. Pro tvorbu 2'-fukosyllaktózy se použil laktózový přívod 216 gl1. pH se kontrolovalo použitím roztoku amoniaku (25% v/v). Vsádková fermentace přívodu se kultivovala při 30 °C pod konstantním provzdušňováním a mícháním po dobu 90 hodin. V 90 hodinách po začátku fermentace se většina přidané laktózy převedla na 2'-fůkosyllaktózu. Za účelem odstranění laktózy, která byla stále přítomná ve fermentačním supematantu, se do fermentační nádoby přidal druhý bakteriální kmen 90 hodin po začátku fermentace.
Přidaný druhý bakteriální kmen byl geneticky identický s prvním použitým bakteriálním kmenem, který se však lišil pouze v expresi genomově integrované beta-galaktosidázy. Inkubace přidaného sekundárního bakteriálního kmene měla za následek vymizení zbytkové laktózy během 5 hodin. Přibližně 10 ml startovací kultury druhého bakteriálního kmene, který exprimoval beta-galaktosidázu, se přidalo na 11 fermentační ho bujónu.
Biomasa se pak oddělila z fermentačního média pomocí ultrafíltrace za použití cross-flow filtru s mezní hodnotou 10 kDa (Microdyn Nardir).
Získalo se přibližně 1 m3 fermentačního média bez buněk, který obsahoval 42 g/12'-fúkosyllaktózy. Fermentační médium bez buněk se pak nechalo procházet přes silný kationtový iontoměnič (Lewatit S 6368 A (Lanxess) v H+ formě, velikost objemu lože iontoměniče byla 100 1), za účelem odstranění kladně nabitých kontaminantů. Získaný roztok se pak upravil na pH 7 přidáním 2M roztoku hydroxidu sodného.
Tento roztok se pak (bez prodlení) nechal procházet přes kolonu aniontového iontoměniče (objem lože iontoměniče byl 100 1). Použitý silný aniontový iontoměnič Lewatit S 2568 (Lanxess) byl v chloridové (Cl ) formě. Získaný roztok se znovu neutralizoval na pH 7. Takto získaný roztok se pak diafiltroval za použití Alfa-Laval NF99HF nanofíltrační membrány a šesti objemů sterilní deionizované vody. Tento roztok se pak dále koncentroval za použití nanofíltrační membrány, přičemž se získal 2'-fukosyllaktózový roztok 200 g/1 a vodivost 7 mS/cm.
Zakoncentrovaný 2'-fukosyllaktózový roztok se pak zpracoval s aktivním uhlím, aby se odstranil materiál, který dává barvu, j ako j sou produkty Maillardových reakcí a produkty aldolových reakcí. Jako aktivní uhlí se použilo 20 g Nořit GAC EN na I zakoncentrovaný 2'-fúkosyllaktózový roztok za zisku výrazně odbarveného roztoku.
Takto získaný zakoncentrovaný 2'-fukosyllaktózový roztok se pak elektrodialyzoval na 0,3 mS/cm za použití PC-Cell BED 1-3 elektrodialýzního přístroje (PC-Cell, Heusweiler, Německo) vybaveného PC-Cell E200 membránovým stohem. Uvedený stoh obsahoval následující membrány: kationtově výměnná membrána CEM: PC SK a aniontově výměnná membrána AEM:PcAcid60, která má limit propustnosti SEL 60 Da. 0,025M roztok sulfamové kyseliny (amidosulfonová kyselina) se použil jako elektrolyt při ED procesu.
Pak, získaný roztok se pak zakoncentroval za vakua při 40 °C za zisku 45% roztoku 2'-fúkosyl-laktózy. Zakoncentrovaný roztok se pak znovu zpracoval s iontoměniči, Lewatit S6368 A (Lanxess) vNa+ formě (objem lože použitého iontoměniče byl 10 1) a po neutralizaci s aniontovým iontoměničem Lewatit S 2568 (Lanxess) v CF formě (objem lože použitého iontoměniče byl 101).
-8CZ 35288 UI
Získaný 2'-fukosyllaktózový roztok se pak zpracoval s aktivním uhlím (Nořit DX1 Ultra). Pro 1 1 45% roztoku 2'-fukosyllaktózy se použilo 30 g aktivního uhlí.
Tento roztok se pak znovu podrobil elektrodialýze, až dokud se nezískala vodivost menší než 0,3 mSi/cm.
Následně se roztok podrobil sterilní filtraci procházením tohoto roztoku přes 3kDa filtr (Pali Microza ultrafiltrační modul s dutými vlákny SEP-2013, Pali Corporation, Dreieich).
Část získaného 2'-fiikosyllaktózového roztoku se pak sprejově sušil pro analýzu.
[Pro zaznamenání NMR spekter se sprejově sušený produkt rozpustil v hexadeuterodimethyl sulfoxidu (DMSO-d6). Pro proton a 13C analýzu se pozorovaly následující charakteristické chemické posuny:
ÍH NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 6,63 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 6,28 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 5,21 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,19 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,01 (d, J = 2,2, 2H), 4,92 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4,89 (dd, J = 4,6, 1,3 Hz, 2H), 4,78 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 4,74 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 4.63 (m, 6H), 4,53 (t, d, J= 5,5, 1H), 4,46 (d, J= 5,2 Hz, 1H), 4,44 (d, J= 5,0 Hz, 1H), 4,38 - 4,26 (m, 5H), 4,23 (d, J = 0,9, 1H), 4,05 (d, J= 0,9, 1H), 4,00 (kvin, J = 3,3, 1H), 3,68 - 3,60 (m, 7H), 3,59 - 3,50 (m, 13H), 3,50 -3,37(m, 6H), 3,24 (dt, J= 8,8. 2,2 Hz, 1H), 3,14 (m, 2H), 2,96 (td, J= 8,4, 4,7 Hz, 1H), 1,04 (d, 7=6,1 Hz, 3H), 1,03 (d, J = 6,1 Hz, 3H), 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 100,99, 100,85, 100,35, 100,25, 96,59, 92,02, 78,13, 77,78, 77,16, 77,01, 75,27, 75,05, 74,67, 73,70, 72,33, 71,62, 71,56, 70,91, 69,90, 69,64, 68,75, 68,16, 66,33, 60,17, 59,82, 59,67, 16,37, 16,36.
Zjistilo se, že chemické posuny byly konzistentní s 2'-fiikosyllaktózovou strukturou.
Za použití tohoto protokolu se mohl získat 45% 2'-fiikosyllaktózový koncentrát s čistotou 94,5 % (stanoveno pomocí HPLC analýzy). Hlavními kontaminanty byly 3'-fiikosyllaktóza (1,8 %), difiikosyllaktóza (2,9 %) a laktóza (0,3 %).
Výtěžek z purifikace byl přibližně 70 %.
Důležité je to, že se nemohl stanovit žádný rekombinantní materiál v 10 g zmrzlého materiálu za použití 50 cyklů qPCR. Množství proteinů získaného materiálu se stanovilo jako <50 pg/g mrazem sušeného materiálu použitím nano-Bradfordova testu (Roth, Karlsruhe Německo). Celkové množství popela se stanovilo s 0,19%. Koncentrace těžkých kovů byla (arzen, kadmium, olovo a rtuť) pod 0,1 pg/g materiálu. Hladiny endotoxinu se stanovily na < 0,005 EU/ml 2'-fukosyl-laktózového koncentrátu.
Příklad 2: Purifikace 2'-fukosyllaktózy z fermentace za použití rekombinantního mikrobiálního produkčního kmene Π.
m3 mikrobiální fermentace, která zahrnovala 2'-fukosyllaktózu v koncentraci 47 g/1, se zfiltrovala přes cross-flow filtr s mezní hodnou 100 kDa (Microdyn Nadir) za zisku fermentačního média bez buněk.
Jako fermentační médium se použilo následující médium: Hlavní složky média: glycerol 30 g/1, NH4H2PO4 7 g/1. K2HPO4 7 g/1, citronan 0,3 g/1, KOH 2 g/1, MgSO4-7H2O 2 g/1: stopové prvky: CaCL 6H2O 20 mg/1, nitrilotrioctová kyselina 101 mg/1, citronan amonno-železitý 56 mg/1, MnCL 4H2O 9,8 mg/1, C0CI2 6H2O 1,6 mg/1, CuCl2 2H2O 1 mg/1, H3BO3 1,6 mg/1, ZnSO4-7H2O 9 mg/1, Na2MoO4-2H2O 1,2 mg/1, Na2SeO3 1,2 mg/1; přívodní látky: glycerol a laktóza.
Fermentační médium bez buněk se pak nechalo procházet před kationtový iontoměnič (Lewatit S 6368 A (Lanxess) v H+ formě (objem lože iontoměniče byl 100 1) za účelem odstranění kladně
-9CZ 35288 UI nabitých kontaminantů. Získaný roztok se pak upravil na pH 7 přidáním 2M roztoku hydroxidu sodného. Tento roztok se pak, bez prodlení, nechal procházet přes aniontově výměnnou kolonu (objem lože iontoměniče byl 100 1), která zahrnovala silný aniontový iontoměnič Lewatit S 2568 (Lanxess) v chloridové (Cl ) formě. Získaný roztok se znovu neutralizoval na pH 7. Takto získaný roztok se pak diafiltroval (za použití 10 objemů sterilní deionizované vody) a zakoncentroval za použití nanofiltrační membrány (Alfa-Laval NF99HF) za zisku 2'-fukosyllaktózového roztoku 200 g/1 a vodivost přibližně 7 mSi/cm.
Zakoncentrovaný 2'-fůkosyllaktózový roztok se pak zpracoval s aktivním uhlím, za použití 20 g Nořit GAC EN na I zakoncentrovaný 2'-fůkosyllaktózový roztok.
Do zfiltrovaného 2'-fůkosyl-laktózového roztoku se přidalo 40 g/1 Nořit DX1 Ultra aktivního uhlí. Tento roztok se pak vystavil aktivnímu uhlí při 4 °C po dobu přibližně 18 h. Po 18 h se aktivní uhlí odstranilo z 2'-fůkosyl-laktózového roztoku pomocí filtrace.
Tento roztok se pak elektrodialyzoval na vodivost < 0,3 mS/cm za použití PC-Cell BED 1-3 elektrodialýzního přístroje (PC-Cell, Heusweiler, Německo) vybaveného PC-Cell E200 membránovým stohem. Uvedený stoh obsahoval následující membrány: kationtově výměnná membrána CEM: PC SK a aniontově výměnná membrána AEM:PcAcid60, která má limit propustnosti SEL 60 Da. 0.025M roztok sulfamové kyseliny (amidosulfonová kyselina) se použil jako elektrolyt v ED procesu.
Získaný roztok se pak zakoncentroval za zisku 40% 2'-fukosyllaktózového roztoku.
Získaný 2'-fukosyllaktózový roztok se pak nechal projít přes Lewatit S 2568 (Lanxess) CL forma (objem lože 10 1) a zpracoval s aktivním uhlím (Nořit DX1 Ultra) při 8 °C po dobu 18 h. Tento roztok se pak podrobil sterilní filtraci procházením tohoto roztoku přes 3kDa filtr (Pali Microza ultrafiltrační modul s dutými vlákny SEP-2013, Pali Corporation, Dreieich) a sprejově sušil za použití NUBILOSA LTC-GMP sprejové sušárny (NUBILOSA, Konstanz, Německo).
Za použití tohoto protokolu se mohla získat 2'-fukosyllaktóza s čistotou 94 % (stanoveno pomocí HPLC analýzy). Hlavními kontaminanty byly 3'-fukosyllaktóza (1,8 %), difůkosyllaktóza (3,2 %) a laktóza (0,2 %). Výtěžek z purifikace byl přibližně 70 %.
Toto technické řešení se může charakterizovat následujícími aspekty:
Způsob pro purifikaci neutrálních lidských mléčných oligosacharidů (HMO) vsádkovým způsobem nebo kontinuálním způsobem z fermentačního bujónu získaného mikrobiální fermentací, s tím, že tento fermentační bujón obsahuje neutrální HMO, biomasu, složky z hmotn./obj .média a kontaminanty, přičemž čistota neutrálního HMO ve fermentačním bujónu je < 80 %, vyznačující se tím, že se fermentační bujón aplikuje do následujících purifikačních kroků:
i) Separace biomasy z fermentačního bujónu, ii) Zpracování s kationtovým iontoměničem pro odstranění kladně nabitého materiálu, iii) Zpracování s aniontovým iontoměničem pro odstranění záporně nabitého materiálu, iv) Nanofiltrační krok a/nebo elektrodialýzní krok, s tím, že se poskytuje purifikovaný roztok, který obsahuje neutrální HMO v čistotě > 80 %.
2. Způsob podle aspektu 1, vyznačující se tím, že se neutrální HMO purifikuje z fermentačního bujónu získaného mikrobiální fermentací za použití rekombinantního mikroorganismu, výhodně bakterie nebo kvasinky, výhodněji rekombinantního mikroorganismu, který vyrostl v chemicky definované médiu, přičemž se biomasa separovaná v kroku i) případně recykluje do mikrobiální fermentace.
- 10 CZ 35288 UI
3. Způsob podle jednoho z aspektů 1 nebo 2, vyznačující se tím, že je čistota neutrálního HMO ve fermentačního bujónu < 70 %, < 60 %, < 50 %, < 40 %, < 30 %, < 20 %, < 10 % nebo < 5 % a/nebo purifikovaný roztok obsahuje neutrální HMO v čistotě > 85 %, výhodně > 90 %.
4. Způsob podle jednoho z aspektů 1 až 3, vyznačující se tím, že je výtěžek neutrálního HMO > 75 % a/nebo purifikovaný roztok je bez DNA, proteinů a/nebo rekombinantního genetického materiálu.
5. Způsob podle jednoho z aspektů 1 až 4, vyznačující se tím, že se neutrální HMO vybere ze skupiny sestávající z 2'-fůkosyllaktózy, 3-fukosyllaktózy, 2',3-difukosyllaktózy, lakto-N-triózy II. lakto-N-tetraózy, lakto-N-neotetraózy, lakto-N-fůkopentaózy I, lakto-N-neofůkopentaózy. lakto-N-fůkopentaózy II, lakto-N-fukopentaózy III, lakto-N-fukopentaózy V, lakto-N-neofukopentaózy V, lakto-N-difukohexaózy I, lakto-N-difůkohexaózy II, 6'-galaktosyllaktózy, 3'-galaktosyllaktózy. lakto-N-hexaózy a lakto-N-neohexaózy.
6. Způsob podle jednoho z aspektů 1 až 5, vyznačující se tím, že se dosáhne separace biomasy z fermentačního bujónu pomocí
a) ultrafiltrace, výhodně separací biomasy a materiálů > 500 kDa. výhodněji >150 kDa; a/nebo
b) filtrace přes cross-flow filtr, výhodně s mezní hodnotou <100 kDa, výhodněji s mezní hodnotou <10 kDa, ještě výhodněji s mezní hodnotou < 5 kDa;
přičemž krok a) je výhodně implementovaný před krokem b).
7. Způsob podle jednoho z aspektů 1 až 6, vyznačující se tím, že se alespoň jeden z purifikačních kroků ii) až iv) opakuje alespoň jednou v průběhu tohoto způsobu.
8. Způsob podle jednoho z aspektů 1 až 7, vyznačující se tím, že se fermentační bujón aplikuje alespoň jednou do zpracování s aktivním uhlím po alespoň jednom z purifikačních kroků i) až iv) pro adsorpci materiálu, který dává barvu, a větších oligosacharidů do aktivního uhlí.
9. Způsob podle jednoho z aspektů 1 až 8. vyznačující se tím, že
a) po alespoň jednom z purifikačních kroků i) až iv); nebo
b) po alespoň jednom zpracování s aktivním uhlím pro adsorpci materiálu, který dává barvu, a větších oligosacharidů do aktivního uhlí;
nebo
c) před krokem zakoncentrování, který je implementovaný po alespoň jednom z purifikačních kroků i) až i v);
se roztok, který obsahuje neutrální lidský mléčný oligosacharid, diafiltruje a/nebo zakoncentruje, výhodně pomocí nanofiltrační membrány, výhodněji pomocí nanofiltrační membrány, která má limit propustnosti SEL< 20 Á, přičemž nejvýhodněji se tento roztok diafiltruje, až dokud se nedosáhne vodivosti < 15 mS/cm. výhodně < 10 mS/cm, výhodněji < 5 mS/cm.
10. Způsob podle jednoho z aspektů 1 až 9, vyznačující se tím, že v kroku před krokem i), se s fermentačním bujónem provádí glukosidázové zpracování, výhodně β-glukosidázové zpracování, přičemž uvedené zpracování se výhodně provádí
a) přidáním kmene mikroorganismu, který je schopný exprimovat jeden nebo více glykosidázových enzymů, které jsou vhodné pro degradaci nežádoucích meziproduktů, substrátů a/nebo oligosacharidových vedlejších produktů; a/nebo
b) použitím fermentačního kmene, který exprimuje jeden nebo více glykosidázových enzymů, výhodně přidáním induktoru do fermentačního bujónu a/nebo posouváním teploty fermentačního bujónu; a/nebo
- 11 CZ 35288 UI
c) přidáním jedné nebo více glykosidáz, výhodně alespoň β-glukosidázy, do fermentačního bujónu jako surový enzym nebo jako puntíkovaný enzym.
11. Způsob podle jednoho z aspektů 1 až 10, vyznačující se tím, že se fermentační bujón zakoncentruje po alespoň jednom z purifikačních kroků i) až iv), výhodně po purifikačním kroku iv), za použití vakuového odpaření nebo reverzní osmózy nebo nanofiltrace
a) na koncentraci >100 g/1, výhodně > 200 g/1, výhodněji > 300 g/1; a/nebo
a) při teplotě < 80 °C, výhodně < 50 °C, výhodněji 20 °C až 50 °C, ještě výhodněji 30 °C až 45 °C, v průběhu vakuového odpaření nebo reverzní osmózy; a/nebo
b) při teplotě < 80°C, výhodně < 50 °C, výhodněji 20 °C až 50 °C.
12. Způsob podle jednoho z aspektů 1 až 11, vyznačující se tím, že se puntíkovaný roztok sterilně zfiltruje a/nebo se podrobí endotoxinovému odstranění, výhodně filtrací purifikované roztoku přes 3kDa filtr.
13. Způsob podle jednoho z aspektů 1 až 12, vyznačující se tím, že se puntíkovaný roztok koncentruje na koncentraci > 1,5 M a ochladí na teplotu < 25 °C, výhodněji < 8 °C, za zisku krystalického materiálu neutrálního HMO.
14. Způsob podle j ednoho z aspektů 1 až 13, vyznačuj ící se tím, že se purifikovaný roztok sprej ově suší, zejména sprejově suší při koncentraci neutrálního HMO 20 až 60 (hmotn./obj.), výhodně 30 až 50 (hmotn./obj.), výhodněji 35 až 45 (hmotn./obj.), při teplotě trysky 110 až 150 °C, výhodně 120 až 140 °C, výhodněji 125 až 135 °C a/nebo při výstupní teplotě 60 až 80 °C, výhodně až 70 °C.
15. Neutrální lidský mléčný oligosacharid (HMO) vyrobitelný způsobem podle j ednoho z aspektů 1 až 14, s tím, že tento neutrální HMO se výhodně sprejově suší nebo krystalizuje.
16. HMO podle aspektu 15, vyznačující se tím, že je neutrální HMO vybraný ze skupiny sestávající z 2'-fukosylIaktózy, 3-fůkosyllaktózy, 2',3-difůkosyllaktózy, lakto-N-triózy II, lakto-N-tetraózy, lakto-N-neotetraózy, lakto-N-fůkopentaózy I, lakto-N-neofůkopentaózy, lakto-N-fůkopentaózy II, lakto-N-fukopentaózy III, lakto-N-fukopentaózy V, lakto-N-neofukopentaózy V, lakto-N-difuko-hexaózy I, lakto-N-difukohexaózy II, 6'-galaktosyllaktózy, 3'-galaktosyllaktózy, lakto-N-hexaózy a lakto-N-neohexaózy.
17. HMO podle jednoho z aspektů 15 nebo 16, vyznačující se tím, že HMO
a) má vodivost menší než 1 mSi/cm v 300 g/1 roztoku;
b) je bez rekombinantního DNA materiálu, případně bez jakékoliv DNA; a/nebo
c) je bez proteinů odvozených z rekombinantního mikroorganismu, případně bez jakýchkoliv proteinů.
18. HMO podle jednoho z aspektů 15 až 17 pro použití v lékařství, výhodně pro použití při profylaxi nebo terapii gastrointestinální poruchy.
19. Použití HMO podle jednoho z aspektů 15 až 18 jako potravinový doplněk v potravinách, výhodně jako potravinový doplněk v lidských potravinách a/nebo krmivu pro domácí zvířata, výhodněji jako potravinový doplněk v lidské dětské výživě.

Claims (14)

  1. NÁROKY NA OCHRANU
    1. Koncentrát neutrálního lidského mléčného oligosacharidového (HMO) produktu, který obsahuje požadovaný HMO v koncentraci >100 g/1 a jednu nebo více nečistot ve vodném roztoku, uvedený HMO produkt získaný z mikrobiálního fermentačního bujónu, ve kterém je mikroorganismem rekombinantní mikroorganismus, vyznačující se tím, že požadovaný HMO je vybrán ze skupiny sestávající z 2'-fukosyllaktózy, 3'-fukosyllaktózy, 2',3'-difukosyllaktózy, lakto-N-triózy II, lakto-N-tetraózy, lakto-N-neotetraózy, lakto-N-fukopentaózy I, lakto-N-neofukopentaózy, lakto-N-fukopentaózy II, lakto-N-fukopentaózy III, lakto-N-fukopentaózy V, lakto-N-neofukopentaózy V, lakto-N-difukohexaózy I, lakto-N-difukohexaózy II, 6'-galaktosyllaktózy, 3'-galaktosyllaktózy, lakto-N-hexaózy a lakto-N-neohexaózy, s tím, že čistota požadovaného HMO je větší než, nebo rovna 80 procentům, a nečistotami jsou jeden nebo více jiných oligosacharidů než požadovaný neutrální HMO, a kde uvedený HMO produkt je bez rekombinantního DNA materiálu .
  2. 2. Koncentrát podle nároku 1, vyznačující se tím, že koncentrace HMO je > 200 g/1.
  3. 3. Koncentrát podle nároku 2, vyznačující se tím, že koncentrace HMO je > 300 g/1.
  4. 4. Koncentrát podle nároku 2, vyznačující se tím, že HMO je přítomno v koncentraci 20 až 60 % hmotn/obj.
  5. 5. Koncentrát podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že tímto HMO je 2'-fukosyllaktóza.
  6. 6. Koncentrát podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že koncentrát je bez endotoxinů.
  7. 7. Koncentrát podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že koncentrát je bez proteinů odvozených z rekombinantního mikroorganismu.
  8. 8. Koncentrát podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že koncentrát je bez proteinů.
  9. 9. Koncentrát podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že koncentrát má vodivost menší než 1 mSi/cm v 300 g/1 roztoku.
  10. 10. Koncentrát podle kteréhokoli z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že koncentrát HMO je sterilní.
  11. 11. Koncentrát podle kteréhokoli z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že nečistoty zahrnují laktózu.
  12. 12. Koncentrát podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že zahrnuje 3'-fukosyllaktózu, difukosyllaktózu a/nebo laktózu.
  13. 13. Koncentrát podle kteréhokoli z nároků 1 až 12 pro použití v medicíně, výhodné pro použití při profylaxi nebo terapii gastrointestinální poruchy.
  14. 14. Přísada do potravin výhodně lidských, vyznačující se tím, že obsahuje koncentrát podle kteréhokoli z nároků 1 až 13 a stím, že přísadou v potravinách je výhodně přísada v lidských potravinách a/nebo v kmuvu pro domácí zvířata, výhodněji v lidské dětské výživě.
CZ2019-36834U 2014-01-20 2014-12-23 Neutrální lidské mléčné oligosacharidy (HMO) z mikrobiální fermentace CZ35288U1 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14151737.5A EP2896628B1 (en) 2014-01-20 2014-01-20 Process for efficient purification of neutral human milk oligosaccharides (HMOs) from microbial fermentation
EP14151737 2014-01-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ35288U1 true CZ35288U1 (cs) 2021-08-03

Family

ID=49949589

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2019-36834U CZ35288U1 (cs) 2014-01-20 2014-12-23 Neutrální lidské mléčné oligosacharidy (HMO) z mikrobiální fermentace
CZ2019-36835U CZ35289U1 (cs) 2014-01-20 2014-12-23 Neutrální lidské mléčné oligosacharidy (HMO) z mikrobiální fermentace

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2019-36835U CZ35289U1 (cs) 2014-01-20 2014-12-23 Neutrální lidské mléčné oligosacharidy (HMO) z mikrobiální fermentace

Country Status (18)

Country Link
US (4) US10377787B2 (cs)
EP (5) EP2896628B1 (cs)
JP (2) JP6901857B2 (cs)
KR (1) KR102137027B1 (cs)
CN (1) CN106132977B (cs)
AT (2) AT17418U1 (cs)
AU (1) AU2014377374B2 (cs)
BR (1) BR112016016705A8 (cs)
CZ (2) CZ35288U1 (cs)
DE (2) DE202014011399U1 (cs)
DK (6) DK2896628T3 (cs)
ES (4) ES2701163T3 (cs)
FI (2) FI3680249T3 (cs)
MX (2) MX369375B (cs)
PH (2) PH12016501421A1 (cs)
PL (4) PL2896628T3 (cs)
RU (1) RU2682445C2 (cs)
WO (1) WO2015106943A1 (cs)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2896628B1 (en) 2014-01-20 2018-09-19 Jennewein Biotechnologie GmbH Process for efficient purification of neutral human milk oligosaccharides (HMOs) from microbial fermentation
US10500221B2 (en) 2014-12-05 2019-12-10 Glycom A/S Crystalline difucosyllactose
EP3141610A1 (en) 2015-09-12 2017-03-15 Jennewein Biotechnologie GmbH Production of human milk oligosaccharides in microbial hosts with engineered import / export
ES3011213T3 (en) 2015-12-18 2025-04-07 Glycom As Fermentative production of oligosaccharides
US10899782B2 (en) * 2016-03-07 2021-01-26 Glycom A/S Separation of oligosaccharides from fermentation broth
DE202017007248U1 (de) 2016-04-19 2020-04-23 Glycom A/S Abtrennung von Oligosacchariden aus der Fermentationsbrühe
US11214588B2 (en) 2017-06-30 2022-01-04 Glycom A/S Synthesis of oligosaccharides
EP3652189A4 (en) 2017-07-12 2021-04-21 Glycom A/S AMORPHIC MIXTURE CONSISTING OF A NEUTRAL MONO- OR OLIGOSACCHARIDE AND A NON-GLUCIDIC ACID COMPONENT
EP3450443A1 (en) * 2017-08-29 2019-03-06 Jennewein Biotechnologie GmbH Process for purifying sialylated oligosaccharides
CA3073332A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Frieslandcampina Nederland B.V. Process for the purification of a neutral human milk oligosaccharide (hmo) from microbial fermentation
EP3486326A1 (en) * 2017-11-21 2019-05-22 Jennewein Biotechnologie GmbH Method for the purification of n-acetylneuraminic acid from a fermentation broth
EP3494806B1 (en) 2017-12-08 2025-08-06 Chr. Hansen HMO GmbH Spray-dried lacto-n-fucopentaose
CN111447845B (zh) * 2017-12-08 2022-10-28 科汉森母乳低聚糖股份有限公司 喷雾干燥的唾液酸乳糖
EP3494805B1 (en) 2017-12-08 2025-08-13 Chr. Hansen HMO GmbH Spray-dried tetrasaccharides
EP3494804B1 (en) 2017-12-08 2025-08-13 Chr. Hansen HMO GmbH Spray-dried 3-fucosyllactose
EP3494807A1 (en) 2017-12-11 2019-06-12 Jennewein Biotechnologie GmbH Spray-dried sialyllactose
DK3524067T3 (da) * 2018-02-08 2025-05-19 Chr Hansen Hmo Gmbh Spraytørret blanding af modermælksoligosaccharider
EP3546060A1 (en) * 2018-03-27 2019-10-02 DuPont Nutrition Biosciences ApS Process for spray drying fucosyllactose solutions and related product compositions
KR20210006916A (ko) 2018-05-07 2021-01-19 젠와인 바이오테크놀로지 게엠바하 미생물 발효에 의해 수득된 탄수화물로부터 락토-Ｎ-네오테트라오스 (LNnT)를 정제하기 위한 간단한 방법
CN112154150A (zh) * 2018-05-23 2020-12-29 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 寡糖的生产
FI3801037T3 (fi) * 2018-06-01 2023-01-13 Yksinkertainen menetelmä sialylaktooinin puhdistamiseen
CN109111043B (zh) * 2018-09-16 2021-11-09 苏州渭中科技发展有限公司 一种高盐高cod废水的处理方法
WO2020127140A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Basf Se Method for separating biomass from a solution comprising biomass and at least one oligosaccaride
CN113574062A (zh) * 2019-01-21 2021-10-29 杜邦营养生物科学有限公司 用于制备l-岩藻糖的方法
EP3686210A1 (en) * 2019-01-24 2020-07-29 DuPont Nutrition Biosciences ApS Process for purifying a human milk oligosaccharide and related compositions
ES3036228T3 (en) 2019-02-25 2025-09-16 Nutribam Bv Composition comprising human milk oligosaccharide for use in supporting and/or improving intestinal health
BE1027078A9 (nl) * 2019-02-25 2020-09-28 Nutribam Bvba Samenstelling, voedingssupplement en werkwijze voor het ondersteunen en/of verbeteren van de darmgezondheid
EP3741770A1 (en) * 2019-05-21 2020-11-25 Jennewein Biotechnologie GmbH Purification of oligosaccharides from a fermentation broth by using filtration
WO2020245313A1 (en) * 2019-06-04 2020-12-10 N.V. Nutricia Nutritional composition comprising 2'fucosyllactose and 3'galactosyllactose
EP4025072B1 (en) * 2019-09-04 2025-08-20 Inbiose N.V. Process for removing an antifoam agent from a solution comprising a human milk oligosaccharide and related compositions
EP3822282A1 (en) * 2019-11-18 2021-05-19 DuPont Nutrition Biosciences ApS Process for removing an antifoam agent from a solution comprising a human milk oligosaccharide and related compositions
CN114364389A (zh) 2019-09-24 2022-04-15 普罗莱克塔生物科学公司 用于治疗炎性和免疫疾病的组合物和方法
US20230074506A1 (en) * 2020-01-29 2023-03-09 Dsm Ip Assets B.V. Process for recovering & purifying human milk oligosaccharides
CN111540125B (zh) * 2020-04-20 2021-01-05 中国人民解放军火箭军工程设计研究院 一种充电桩的充电管理方法、设备及计算机可读存储介质
EP4165057A1 (en) * 2020-06-12 2023-04-19 Basf Se Improved demineralization of fermentation broths and purification of fine chemicals such as oligosaccharides
KR20230088680A (ko) 2020-08-14 2023-06-20 프롤랙타 바이오사이언스, 인코포레이티드 박테리아 요법에 사용하기 위한 인간 모유 올리고당 조성물
CN112568439A (zh) * 2020-12-21 2021-03-30 湖北福星生物科技有限公司 一种从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法及其应用
EP4277634A1 (en) 2021-01-12 2023-11-22 Prolacta Bioscience, Inc. Synbiotic treatment regimens
CN112920234B (zh) * 2021-01-27 2022-03-29 南开大学 一种2′-岩藻糖基乳糖的富集纯化方法
WO2022229316A1 (en) * 2021-04-30 2022-11-03 Dsm Ip Assets B.V. Infant formula with low level of arsenic
DK181242B1 (en) 2021-05-17 2023-05-30 Dsm Ip Assets Bv GENETICALLY ENGINEERED CELLS COMPRISING A RECOMBINANT NUCLEIC ACID SEQUNCE ENCODING AN α-1,2-FUCOSYLTRANSFERASE CAPABLE OF PRODUCING LNFP-I, NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING SAME AND METHODS FOR USE OF SAME
US20250128210A1 (en) 2021-06-15 2025-04-24 Dsm Ip Assets B.V. Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth
WO2022263425A1 (en) 2021-06-15 2022-12-22 Dsm Ip Assets B.V. Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth
EP4355465A1 (en) 2021-06-15 2024-04-24 DSM IP Assets B.V. Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth
BE1029435B1 (nl) 2021-06-15 2023-07-31 Dsm Ip Assets Bv Scheiding van moedermelkoligosachariden uit een fermentatiebouillon
WO2023066907A1 (en) 2021-10-18 2023-04-27 Dsm Ip Assets B.V. A method for providing an amorphous hmo product by drying
CN114539433B (zh) * 2021-12-29 2022-11-01 北京三元食品股份有限公司 一种乳低聚糖的制备方法及制备的低聚糖粉、食品
JPWO2023182527A1 (cs) * 2022-03-25 2023-09-28
CN117003803A (zh) * 2022-05-07 2023-11-07 山东恒鲁生物科技有限公司 一种三糖的新晶型
CN115873051B (zh) * 2022-05-17 2024-06-25 山东恒鲁生物科技有限公司 三糖的新晶型
EP4539967A1 (en) 2022-06-14 2025-04-23 DSM IP Assets B.V. Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth
WO2024047096A1 (en) 2022-08-30 2024-03-07 Inbiose N.V. Process for purification of an oligosaccharide
WO2024130119A2 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Prolacta Bioscience, Inc. Synbiotic compositions for short chain fatty acid production
CN115651039A (zh) * 2022-12-27 2023-01-31 保龄宝生物股份有限公司 一种高密度2’-岩藻糖基乳糖的生产方法
CN116425810B (zh) * 2023-06-14 2023-08-11 山东合成远景生物科技有限公司 一种混合液中3-岩藻糖基乳糖的纯化方法
CN117089503B (zh) 2023-10-17 2024-01-02 保龄宝生物股份有限公司 一种大肠杆菌k-12 mg1655 blbyzt6及其应用
WO2025114343A2 (en) * 2023-11-29 2025-06-05 Frieslandcampina Nederland B.V. Process for the production of human milk oligosaccharides

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61271296A (ja) 1985-05-28 1986-12-01 Kyogyo Kumiai N F I Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造方法
JPH0614870B2 (ja) * 1986-12-15 1994-03-02 株式会社ヤクルト本社 ガラクトオリゴ糖の製造法
WO1998015581A1 (en) 1996-10-10 1998-04-16 Cytel Corporation Carbohydrate purification using ultrafiltration, reverse osmosis and nanofiltration
US5945314A (en) 1997-03-31 1999-08-31 Abbott Laboratories Process for synthesizing oligosaccharides
US6323008B1 (en) 1997-08-14 2001-11-27 Neose Technologies, Inc. Methods for producing sialyloligosaccharides in a dairy source
US6017433A (en) 1997-11-12 2000-01-25 Archer Daniels Midland Company Desalting aqueous streams via filled cell electrodialysis
AU1234400A (en) 1998-10-27 2000-05-15 Cargill Incorporated Method for purifying a polyol product stream
DE19906865C2 (de) 1999-02-18 2003-03-13 Infineon Technologies Ag Verfahren und Einrichtung zur Entzerrung und Decodierung eines Datensignals
FR2796082B1 (fr) 1999-07-07 2003-06-27 Centre Nat Rech Scient Procede de production d'oligosaccharides
FR2799754A1 (fr) 1999-10-18 2001-04-20 Roquette Freres Procede de separation et de purification d'acide lactique a partir d'un milieu de fermentation
US6288222B1 (en) 2000-02-16 2001-09-11 Neose Technologies, Inc. Method of filtration of a dairy stream
US6618584B1 (en) 2000-08-30 2003-09-09 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Terminal authentication procedure timing for data calls
JP2003047402A (ja) * 2001-08-06 2003-02-18 Meiji Milk Prod Co Ltd 中性オリゴ糖含有育児用調製乳
JP2003048901A (ja) 2001-08-09 2003-02-21 Oji Paper Co Ltd 長鎖キシロオリゴ糖組成物およびその製造方法
FR2844209B1 (fr) 2002-09-06 2007-10-19 Applexion Ste Nouvelle De Rech Procede de purification par nanofiltration d'une solution aqueuse sucree contenant des anions et cations monovalents et polyvalents
WO2004101479A2 (en) 2003-05-06 2004-11-25 E.I. Dupont De Nemours And Company Purification of biologically-produced 1,3-propanediol
CA2520043C (en) 2003-06-30 2009-09-01 Clasado Inc. Novel galactooligosaccharide composition and the preparation thereof
EP1789570A2 (en) 2004-09-17 2007-05-30 Neose Technologies, Inc. Production of oligosaccharides by microorganisms
CA2580529A1 (en) * 2004-10-01 2006-04-13 Eisai R & D Management Co., Ltd. Fine particle-containing composition and manufacturing method therefor
EP1846554A1 (en) 2005-02-11 2007-10-24 DSMIP Assets B.V. Fermentive vitamin c production
US20070256936A1 (en) 2006-05-04 2007-11-08 Robert Jansen Method for Deashing Syrup by Electrodialysis
AU2008273417A1 (en) * 2007-07-12 2009-01-15 Yotsuba Milk Products Co., Ltd. Method for producing composition containing sialic acid compound
NZ593448A (en) 2008-12-19 2012-06-29 Jennewein Biotechnologie Gmbh Synthesis of fucosylated compounds
GB0904562D0 (en) * 2009-03-17 2009-04-29 Separation Technologies Invest Isolation and purification of components of whey
US9012625B2 (en) 2009-04-07 2015-04-21 Glycom A/S Method for the synthesis of a trisaccharide
NZ597129A (en) * 2009-06-08 2012-12-21 Jennewein Biotechnologie Gmbh Hmo synthesis
CA2767043C (en) * 2009-07-06 2020-07-14 Children's Hospital Medical Center Inhibiting inflammation with milk oligosaccharides
IT1395068B1 (it) 2009-08-07 2012-09-05 Inalco Spa Processo per la produzione di galatto-oligosaccaridi ultrapuri
CN101691538B (zh) 2009-09-29 2012-05-09 保龄宝生物股份有限公司 一种米曲霉菌种及其制备高纯度低聚半乳糖的方法
BR112012017978A2 (pt) * 2010-01-19 2016-05-03 Abbott Lab fórmulas nutricionais contendo simbióticos
WO2011150939A1 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Glycom A/S Polymorphs of 2'-o-fucosyllactose and producing thereof
DK2439264T3 (en) 2010-10-11 2015-08-03 Jennewein Biotechnologie Gmbh Novel fucosyltransferases and their use
EP2455387A1 (en) 2010-11-23 2012-05-23 Nestec S.A. Oligosaccharide mixture and food product comprising this mixture, especially infant formula
TW201233340A (en) * 2010-12-31 2012-08-16 Abbott Lab Human milk oligosaccharides for modulating inflammation
CA3038073C (en) 2010-12-31 2021-05-25 Abbott Laboratories Human milk oligosaccharides for modulating inflammation
CN102154163A (zh) 2010-12-31 2011-08-17 朱莉 一种3′-唾液酸乳糖的制备方法
MX355780B (es) * 2010-12-31 2018-04-30 Abbott Lab Fórmula pediátrica sintética para estimular células nerviosas entéricas en el tracto gastrointestinal.
DK2479263T3 (da) 2011-01-20 2014-02-03 Jennewein Biotechnologie Gmbh Nye fucosyltransferaser og deres anvendelser
CA3098403C (en) * 2011-02-16 2022-05-10 Glycosyn LLC Biosynthesis of human milk oligosaccharides in engineered bacteria
CN102095181A (zh) 2011-03-16 2011-06-15 黎昌兴 Led强光源流体巡回散热装置
JP6129821B2 (ja) * 2011-05-13 2017-05-17 グリコシン リミテッド ライアビリティー カンパニー プレバイオティクスとしての、精製された２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、およびラクトジフコテトラオースの使用
EP2526784A1 (en) 2011-05-24 2012-11-28 Nestec S.A. Milk oligosaccharide-galactooligosaccharide composition for infant formula containing the soluble oligosaccharide fraction present in milk, and having a low level of monosaccharides, and a process to produce the composition
DK2722394T3 (en) * 2011-06-07 2018-06-18 Hero Ag OBJECTIVES OF OLIGOSACCHARIDES BY A BIOTECHNOLOGICAL PROCEDURE
NL2007268C2 (en) * 2011-08-16 2013-02-19 Friesland Brands Bv Nutritional compositions comprising human milk oligosaccharides and uses thereof.
JP6017133B2 (ja) * 2011-12-12 2016-10-26 Ｍｃフードスペシャリティーズ株式会社 風味改良剤
US20160031924A9 (en) 2011-12-19 2016-02-04 The Coca-Cola Company Methods for purifying steviol glycosides and uses of the same
WO2013139344A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Glycom A/S Synthesis of the trisaccharide 3-o-fucosyllactose and intermediates thereof
EP2859112A4 (en) 2012-06-08 2015-10-28 Glycom As PROCESS FOR THE PREPARATION OF OLIGOSACCHARIDES AND OLIGOSACCHARIDE GLYCOSIDES BY FERMENTATION
DE202013012829U1 (de) 2012-06-14 2020-03-04 Glycom A/S Verbesserung der Stabilität und Reinheit sowie Erhöhung der Bioverfügbarkeit von menschlichen Milch-Oligosacchariden oder Vorläufern oder Mischungen davon
ITFI20120143A1 (it) * 2012-07-12 2014-01-13 Inalco S A S Di Giovanni Cipollett I & C Polimorfi idrati e anidri del 2'-o-fucosillattosio e loro metodi di produzione.
US9029136B2 (en) 2012-07-25 2015-05-12 Glycosyn LLC Alpha (1,2) fucosyltransferases suitable for use in the production of fucosylated oligosaccharides
WO2014086373A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Glycom A/S Crystallisation of human milk oligosaccharides (hmo)
ES2875327T3 (es) 2013-09-10 2021-11-10 Chr Hansen Hmo Gmbh Producción de oligosacáridos
CN103468766B (zh) 2013-09-18 2015-07-01 恩施天天佳生物科技有限公司 一种高纯度甘露低聚糖的制备方法
EP2857410A1 (en) 2013-10-04 2015-04-08 Jennewein Biotechnologie GmbH Process for purification of 2´-fucosyllactose using simulated moving bed chromatography
EP2896628B1 (en) 2014-01-20 2018-09-19 Jennewein Biotechnologie GmbH Process for efficient purification of neutral human milk oligosaccharides (HMOs) from microbial fermentation
EP2927316B1 (en) 2014-03-31 2018-11-07 Jennewein Biotechnologie GmbH Total fermentation of oligosaccharides
ES2932304T3 (es) 2014-04-17 2023-01-17 Biogen Ma Inc Composiciones y métodos para la modulación del empalme de SMN2 en un sujeto
DE202015009782U1 (de) 2014-06-11 2020-02-10 Glycom A/S Trennung von 2'-O-Fucosyllactose aus Fermentationsbrühe
EP3141610A1 (en) 2015-09-12 2017-03-15 Jennewein Biotechnologie GmbH Production of human milk oligosaccharides in microbial hosts with engineered import / export

Also Published As

Publication number Publication date
EP3680249B1 (en) 2023-03-01
CN106132977A (zh) 2016-11-16
PH12020500199A1 (en) 2021-03-15
PL3680249T3 (pl) 2023-05-15
DK3680249T3 (da) 2023-04-24
DK201900072U1 (en) 2019-09-27
DK201900054Y4 (da) 2019-09-26
FI3686211T3 (fi) 2023-04-26
KR102137027B1 (ko) 2020-07-23
US20200231618A1 (en) 2020-07-23
ES2942630T3 (es) 2023-06-05
EP2896628A1 (en) 2015-07-22
CN106132977B (zh) 2020-05-12
RU2016128955A3 (cs) 2018-05-21
WO2015106943A1 (en) 2015-07-23
EP3686211A3 (en) 2021-01-20
EP3686211B1 (en) 2023-03-01
PH12016501421B1 (en) 2016-08-22
EP3680249A2 (en) 2020-07-15
BR112016016705A2 (cs) 2017-08-08
DE202014011358U1 (de) 2019-09-26
DK3131912T3 (da) 2020-02-10
MX2016009394A (es) 2017-02-08
US11661435B2 (en) 2023-05-30
RU2682445C2 (ru) 2019-03-19
PL2896628T3 (pl) 2019-03-29
EP3131912A1 (en) 2017-02-22
JP2020014482A (ja) 2020-01-30
DK3686211T3 (da) 2023-04-24
US20160333042A1 (en) 2016-11-17
US11597740B2 (en) 2023-03-07
MX394692B (es) 2025-03-24
AU2014377374A1 (en) 2016-08-04
PL3131912T3 (pl) 2020-06-15
ES2942586T3 (es) 2023-06-02
DK201900054U1 (en) 2019-07-02
ES2779414T3 (es) 2020-08-17
EP3131912B1 (en) 2020-01-22
DE202014011399U1 (de) 2020-02-12
AT17418U1 (de) 2022-03-15
JP7000396B2 (ja) 2022-02-10
US10882880B2 (en) 2021-01-05
MX369375B (es) 2019-11-07
EP3680249A3 (en) 2021-01-20
PH12016501421A1 (en) 2016-08-22
EP3375786A1 (en) 2018-09-19
DK2896628T3 (en) 2019-01-14
JP6901857B2 (ja) 2021-07-14
RU2016128955A (ru) 2018-02-26
AT17271U1 (de) 2021-10-15
EP3686211A2 (en) 2020-07-29
KR20160132009A (ko) 2016-11-16
MX2019013267A (es) 2020-01-13
AU2014377374B2 (en) 2019-07-04
CZ35289U1 (cs) 2021-08-03
ES2701163T3 (es) 2019-02-21
JP2017506065A (ja) 2017-03-02
US10377787B2 (en) 2019-08-13
US20190177352A1 (en) 2019-06-13
PL3686211T3 (pl) 2023-06-05
US20210061836A1 (en) 2021-03-04
BR112016016705A8 (pt) 2022-10-11
FI3680249T3 (fi) 2023-04-25
EP2896628B1 (en) 2018-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11661435B2 (en) Spray-dried, high-purity, neutral human milk oligosaccharides (HMOs) from microbial fermentation
JP7330171B2 (ja) シアリル化オリゴ糖を精製する工程
AU2020279483B2 (en) Purification of oligosaccharides from a fermentation broth by using filtration
RU2799091C2 (ru) Способ очистки сиалилированных олигосахаридов
HK40019083A (en) Process for purifying sialylated oligosaccharides

Legal Events

Date Code Title Description
FG1K Utility model registered

Effective date: 20210803

ND1K First or second extension of term of utility model

Effective date: 20210917

ND1K First or second extension of term of utility model

Effective date: 20211216

MK1K Utility model expired

Effective date: 20241223