KR20160132009A - 미생물 발효로부터 중성 모유 올리고당(HMOs)의 효율적인 정제공정 - Google Patents

미생물 발효로부터 중성 모유 올리고당(HMOs)의 효율적인 정제공정 Download PDF

Info

Publication number
KR20160132009A
KR20160132009A KR1020167022587A KR20167022587A KR20160132009A KR 20160132009 A KR20160132009 A KR 20160132009A KR 1020167022587 A KR1020167022587 A KR 1020167022587A KR 20167022587 A KR20167022587 A KR 20167022587A KR 20160132009 A KR20160132009 A KR 20160132009A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lacto
neutral
fucopentaose
fermentation
fermentation broth
Prior art date
Application number
KR1020167022587A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102137027B1 (ko
Inventor
슈테판 젠와인
Original Assignee
젠와인 바이오테크놀로지 게엠바하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49949589&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20160132009(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 젠와인 바이오테크놀로지 게엠바하 filed Critical 젠와인 바이오테크놀로지 게엠바하
Publication of KR20160132009A publication Critical patent/KR20160132009A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102137027B1 publication Critical patent/KR102137027B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/163—Sugars; Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/30—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols, e.g. xylitol; containing starch hydrolysates, e.g. dextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/20—Reducing nutritive value; Dietetic products with reduced nutritive value
    • A23L33/21—Addition of substantially indigestible substances, e.g. dietary fibres
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pediatric Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Dairy Products (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 미생물 발효에 의해 생성되는 중성 모유 올리고당(HMO)의 간단한 정제공정에 대하여 기재하고 있다. 본 공정은 양이온교환기 처리, 음이온교환기 처리 및 나노여과 및/또는 전기투석 단계의 조합을 이용하며, 이는 고순도로 많은 양의 중성 모유 올리고당을 효율적으로 정제할 수 있게 한다. 중성 모유 올리고당의 발효 생성물에 사용되는 현재의 정제공정에 반해서, 본 공정은 크로마토그래피 분리의 필요없이 모유 올리고당의 제공을 가능하게 한다. 이렇게 정제된 모유 올리고당은 분무건조에 의해 결정성 물질 또는 무균여과된 농축물로써 고체 형태로 수득될 수 있다. 제공되는 모유 올리고당은 사용된 재조합 미생물 균주로부터 발생되는 단백질 및 재조합 물질을 함유하지 않으며, 따라서 식품, 의료 식품 및 사료(예를 들어, 애완동물용 사료) 적용 용도로 매우 적합하다.

Description

미생물 발효로부터 중성 모유 올리고당(HMOs)의 효율적인 정제공정{PROCESS FOR EFFICIENT PURIFICATION OF NEUTRAL HUMAN MILK OLIGOSACCHARIDES (HMOs) FROM MICROBIAL FERMENTATION}
본 발명은 미생물 발효에 의해 생성되는 중성 모유 올리고당(HMOs)의 간단한 정제공정에 대하여 기재하고 있다. 본 공정은 양이온교환기 처리, 음이온교환기 처리 및 나노여과 및/또는 전기투석 단계의 조합을 이용하며, 이는 고순도로 많은 양의 중성 모유 올리고당을 효율적으로 정제할 수 있게 한다.
중성 모유 올리고당의 발효 생성물에 사용되는 현재의 정제공정에 반해서, 본 공정은 크로마토그래피 분리의 필요없이 모유 올리고당의 제공을 가능하게 한다. 이렇게 정제된 모유 올리고당은 분무건조에 의해 결정성 물질 또는 무균여과된 농축물로써 고체 형태로 수득될 수 있다. 제공되는 모유 올리고당은 사용된 재조합 미생물 균주로부터 발생되는 단백질 및 재조합 물질을 함유하지 않으며, 따라서 식품, 의료 식품 및 사료(예를 들어, 애완동물용 사료) 적용 용도로 매우 적합하다.
모유는 탄수화물, 지방, 단백질, 비타민, 미네랄 및 미량 원소의 복합 혼합물을 나타낸다. 지금까지 가장 주된 분획은 탄수화물로 나타내어지며, 이는 추가적으로 락토오스 및 더 많은 복합 올리고당으로 나누어질 수 있다. 락토오스는 에너지원으로 이용되는 반면에, 복합 올리고당은 유아에 의해 대사되지 않는다. 복합 올리고당의 분획은 전체 탄수화물 분획의 최대 1/10을 차지하고, 약 150개의 상이한 올리고당으로 이루어진다. 이러한 복합 올리고당의 발생 및 농도는 인간 특이적이며, 따라서 사육되는 낙농 동물(dairy animal)과 같은 다른 포유동물의 젖에서는 다량으로 발견될 수 없다.
모유 내 이러한 복합 올리고당의 존재는 이미 장시간 동안 알려져있으며, 상기 올리고당의 생리작용은 수십 년 동안 의학 연구의 대상이었다(Gura, T.(2014) Nature's first functional food. Science 345(6198) 747-749). 더욱 풍부한 모유 올리고당의 일부에 대한 특정 기능이 이미 확인되었다(Bode, L.(2012) Human milk oligosaccharides: every baby needs a sugar mama. Glycobiology 22(9), 1147-1162.; Bode L, Jantscher-Krenn E(2012) Structure-function relationships of human milk oligosaccharides. Adv Nutr 3(3) 383S-391S; Morrow AL, Ruiz-Palacios GM, Altaye M, Jiang X, Guerrero ML, Meinzen-Derr JK, Farkas T, Chaturvedi P, Pickering LK, Newburg DS(2004) Human milk oligosaccharides are associated with protection against diarrhea in breast-fed infants. J Pediatr 145(3) 297-303).
개별적인 모유 올리고당의 순수한 분획 수득의 제한된 공급 및 어려움은 이러한 복합 분자의 일부에 대한 화학적 경로의 개발로 이어진다. 그러나, 화학적 합성, 효소적 합성 또는 발효에 의한 모유 올리고당의 합성은 입증되어야 할 과제이다. 오늘날까지도 최소한의 대규모 수량뿐만 아니라 식품 적용을 위한 충분한 품질이 제공되지 못하고 있다. 이와 관련하여, 특히 모유 올리고당(예를 들어, 2'-푸코실락토오스; WO 2010/115935 Al 참조)에 대한 화학적 합성 경로는 여러 유해한 화학물질을 수반하며, 이는 최종 생성물을 오염시키는 위험요소를 부과한다.
모유 올리고당의 화학적 합성과 관련된 과제에 기인하여, 여러 효소적 방법 및 발효적 접근이 개발되었다(Miyazaki et al.,(2010) Methods in Enzymol . 480, 511-524; Murata et al.,(1999) Glycoconj . J. 16, 189-195; Baumgartner, F. et al.,(2013) Microb. Cell Fact. 12, 40; Lee et al.,(2012) Microb . Cell Fact. 11, 48; US 7,521,212 Bl 또는 Albermann et al.,(2001) Carbohydr . Res. 334(2) p 97-103). 그러나, 이러한 방법들은 올리고당의 복합 혼합물을 수득한다. 즉, 목적하는 생성물이 락토오스와 같은 출발물질, 각각의 단당류 및 폴리펩티드와 같은 생합성 중간체와 기질로 오염되는 것이다.
상기 복합 혼합물로부터 개별의 올리고당 생성물을 정제하기 위한 종래 기술의 공정은 기술적으로 복잡하며, 또한 식품 적용에 비경제적이다. 유청(whey) 또는 당밀(molasses)과 같은 복합 혼합물로부터 이당류 락토오스 또는 수크로오스를 정제하기 위해서, 공업적 규모의 공정이 개발되었으며, 이는 다수의 결정화(crystallization)를 수반한다. 언급된 방법은 정교하지만 낮은 수득률을 야기한다는 단점이 있다.
미생물 발효로부터 복합 올리고당, 예컨대 특정 모유 올리고당의 정제를 위해 현재까지 선택되는 방법은 겔 여과 크로마토그래피이다. 겔 여과 크로마토그래피는 효율적으로 확장(scaled up)될 수 없으며, 연속적인 작업에 부적합하다는 단점이 있다. 따라서, 겔 여과 크로마토그래피는 경제적이지 않으며, 특정 모유 올리고당, 예컨대 2'-푸코실락토오스 또는 락토-N-테트라오스를 식품 또는 동물 사료(예를 들어, 애완동물용 사료) 같은 다른 적용 용도에 합리적인 금액과 품질로 제공할 수 없게 한다.
동물 사료 또는 애완동물용 사료로의 적용은 다른 포유동물 또한 모유와 동일하거나 유사한 중성 복합 올리고당을 함유한다는 근거에 이해관계가 있다(예를 들어, 2'-푸코실락토오스는 개, 돼지, 침팬지의 젖에서도 발견된다)(Castanys-Munzo, E., Martin, J.M & Prieto, P.A.(2013) 2'-fucosyllactose: an abundant, genetically determined soluble glycan present in human milk. Nutr. Rev. 71(12) 773-789).
다른 문제는 발효물과 재조합 물질의 오염을 야기하는 미생물 발효 내 재조합 균주(재조합 박테리아 또는 효모 균주)의 사용으로 나타난다. 그러나, 재조합 DNA 또는 단백질과의 오염은 오늘날, 규제 기관 및 소비자들에게 허용되지 않는다. 특히 재조합 DNA 분자에 대한 검출 한계는 매우 낮다. qPCR에 기반 검출이 사용되는 경우, 이는 현재 검출을 위한 골드 스탠다드(gold standard)로 간주되어 사용되며, 작은 단일 DNA 분자조차 검출이 가능하다. 또한, 단백질은 알러지 반응의 위험이 있으며, 그러므로 목적하는 올리고당 생성물로부터 효율적으로 제거되어야 한다.
전기투석(ED)은 투석 및 전기분해가 조합된 기술을 나타내며, 용액 내에 이온의 분리 또는 농축에 사용될 수 있으며, 이는 반투막을 통한 이온의 선택적 전자 이동에 기반한다. 전기투석의 최초의 산업적 적용으로는 1960년대 초기 유아용 분유에 사용된 치즈 유청의 탈회화(demineralization)가 있다. 추가적으로 개발된 전기투석의 적용으로는 와인, 포도액, 사과주스 및 오렌지주스와 같은 음료의 pH 조절을 포함한다.
식수의 생산을 위한 기수(brackish water)의 탈염화(desalination)와 유아용 분유의 생산을 위한 우유 유청의 탈회화는 오늘날 가장 큰 적용분야를 나타낸다.
기본 전기투석의 원리는 직류발전기에 연결된 이온의 전도를 위한 전해질에 잠기는 전극 쌍으로 구성되는 전해전지(electrolytic cell)로 이루어진다. 직류발전기의 양극에 연결된 전극을 애노드(anode), 음극에 연결된 전극을 캐소드(cathode)라고 한다. 또한 전해질 용액은 각각 애노드과 캐소드 쪽으로 이동하는 음전하 및 양전하 이온의 이동으로 인한 전류 흐름을 지원한다. 전기투석에 사용되는 막은 기본적으로 음 전하기 또는 양 전하기에 의한 다공성 이온 교환 수지의 시트이며, 따라서 각각, 양이온성 또는 음이온성 막이라 한다. 이온교환기 막은 보통 디비닐벤젠과 가교된 적합한 작용기(예컨대, 각각 양이온 또는 음이온성 막에 대한 설폰산 또는 사차암모늄기)를 수반하는 폴리스티렌으로 제조된다. 전해질로써, 소듐 클로라이드 또는 소듐 아세테이트, 소듐 프로피오네이트 등이 사용될 수 있다. 이어서, 전기투석조(electrodialysis stack)는 음이온 및 양이온성 막이 두 개의 전극 블럭 사이 필터 프레스에서 평행이 되는 방식으로 조립되며, 이온 결핍(ion depletion)이 진행되는 스트림(stream)이 이온 과다(ion enrichment)가 진행되는 스트림으로부터 잘 분리된다(두 용액은 (이온 결핍이 진행되는) 희석액 및 (이온 과다가 진행되는) 농축물으로도 불린다). 전기투석 공정의 핵심은 막 스택(membrane stack)이며, 이는 스페이서(spacers)에 의해 분리되는 여러 음이온 및 양이온 교환막으로 이루어지고, 두 개의 전극 사이에 설치된다. 직접적 전류(direct electric current)를 적용함으로써, 음이온 및 양이온이 (탈염된) 희석액(diluate)과 농축 스트림을 생성하는 전극 쪽으로 막을 통해 이전된다.
일반적으로, 사용되는 막의 기공 크기는 두 스트림 간의 종종 높은 농도 차이에 의해 구동되는 농축 스트림의 희석액으로부터 생성물의 확산을 방지하기 위해 비교적 작다. 바이오매스의 분리 이후에, 단백질 및 특히 재조합 DNA 분자(전체 게놈의 크기에서)는 목적하는 생성물로부터 정량적으로 제거되어야 한다. 이러한 대형 분자(모유 올리고당의 분자의 크기에 비하여)의 모든 가능한 전기투석시에, 오히려 오랫동안 확실하게 농축물로의 희석액으로부터 원하는 생성물의 상당한 손실을 수반할 것이다.
정용여과(diafiltration)는 막 투과성 구성성분을 "세척(wash out)" 또는 제거하기 위해 용액에 신선한 물을 첨가하는 것을 포함하는 공정이다. 따라서, 정용여과는 하나 이상의 종(species)이 효율적으로 유지되고 다른 종이 막 투과성인 적합한 막을 사용하여 분자 크기를 기반으로 구성성분을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 나노여과막을 사용하는 정용여과는 염으로부터 저분자 화합물을 분리하는데 효과적이다. 일반적으로, 나노여과막은 150 내지 300달톤의 범위에서 분자량 컷-오프를 갖는다. 오늘날, 나노여과(NF)는 낙농업에서 유청의 농축 및 탈회화를 위해서 널리 사용된다. 나노여과는 이미 모유 올리고당 분획 형태 모유의 농축(enrichment)에 이용되고 있다. 이러한 접근법에서, 나노여과는 락토오스의 효소분해와 조합하여 사용되어 우유 락토오스로부터 모유 올리고당 분획을 분리한다(Sarney D.B, Hale, C, Frankel, G & Vulfson, E.N.(2000) A novel approach to the recovery of biological active oligosaccharide from milk using a combination of enzymatic treatment and nanofiltration. Biotechnol. Bioeng 69, 461-467).
미생물 발효로부터 식용 모유 올리고당의 효율적인 정제를 위해 개발된 공정에서, 목적하는 생성물을 농축하고, 또한 막 투과성 염을 제거하기 위해서 나노여과가 도입된다.
이러한 종래 기술로부터, 기술적 과제는 중성 모유 올리고당을 많은 양, 고순도 및 우수한 수득률로 제공하기 위한 신규한 공정을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제는 제 1항에 따른 공정, 제 15항에 따른 모유 올리고당(HMOs) 및 제 19항에 따른 모유 올리고당의 용도에 의해 해결된다. 종속항은 바람직한 실시예를 나타낸다.
본 발명은 미생물 발효에 의해 수득되는 발효액으로부터 배치 방식(batch manner) 또는 연속 방식(continuous manner)으로 중성 모유 올리고당(HMOs)을 정제하는 공정으로서, 상기 발효액이 중성 모유 올리고당, 바이오매스(biomass), 배지 성분 및 오염물질을 포함한다. 상기 발효액 내에 중성 모유 올리고당의 순도는 <80%이다.
공정 동안, 발효액은 다음의 정제 단계에 적용된다:
i) 발효액으로부터 바이오매스를 분리하는 단계;
ii) 양으로 하전된 물질의 제거를 위해 양이온교환기 처리하는 단계;
iii) 음으로 하전된 물질의 제거를 위해 음이온교환기 처리하는 단계; 및
iv) (중성 모유 올리고당의 농축 및/또는 정용여과를 포함하거나 이들로 이루어진) 나노여과 단계 및/또는 (특히 염 및 다른 저분자 화합물을 제거하기 위한) 전기투석 단계.
무세포 발효액에 존재하는 오염물질은 예를 들어 목적하는 중성 모유 올리고당 이외에 다른 올리고당이며, 1가 및 2가 염, 아미노산, 폴리펩타이드, 단백질, 유기산, 핵산 등과 같다. 목적하는 중성 모유 올리고당을 정제된 용액 내 >80%의 순도로 수득할 수 있다.
본 출원인은 본 발명의 정제공정으로, 미생물 발효로부터 중성 모유 올리고당을 효율적으로 정제할 수 있고, 이는 식품 및 사료 적용에 적합한 순도의 모유 올리고당이 제공된다는 것을 발견하였다. 또한, 본 공정은 크로마토그래피 분리 단계를 필요로 하지 않기 때문에 매우 비용 효과적이다. 또한, >80%의 순도는 전기투석 공정 또는 나노여과 공정이 단계 iv)에서 수행되거나, 두 단계가 연속적으로 수행되는지에 따라 달성된다는 것을 발견하였다.
본 발명에 따른 공정의 일 이점으로는 사용되는 재조합 미생물 발효 균주로부터 DNA 및 단백질을 함유하지 않는 목적하는 중성 모유 올리고당이 수득된다는 것이다. 특히 양이온교환기 처리(단계 ii)의 수행은 예를 들어, 양으로 하전된 단백질과 같이 양으로 하전된 물질을 제거할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명의 방법은 양이온교환기 처리를 실행하지 않는 종래 기술에 공지된 통상적인 정제방식에 비해 적은 양의 양으로 하전된 오염물질을 포함하는 모유 올리고당을 제공한다. 이는 (양성자 형태인) 양이온교환기로 (바람직하게는 한외여과에 의해) 바이오매스로부터 분리된 발효액을 통과한 이후에 수득되는 용액은 안정하며, 실온 또는 냉각하에서 몇 주 동안 보관될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 수득되는 중성 모유 올리고당은 재조합 물질을 함유하지 않으며, 이는 최대 50 증폭 사이클로 정량적 PCR에 의해 판단된다. 더욱이, 본 발명에 따른 공정으로 수득되는 생성물은 소량의 단백질만이 있거나, 또는 단백질이 결여된다는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 중성 모유 올리고당 정제는 (무세포 발효 배지로부터 모유 올리고당 농축물로 확인된) 정제된 모유 올리고당의 수득률 >70%(아직까지 정확이 확인되지 않음, 임의적으로 >75%)로 매우 효율적이다.
따라서, 복합 가공(hybrid process)은 바이오매스, 이온교환기 및 나노여과 및/또는 전기투석을 분리하는 단계를 포함하고, 바람직하게는 재조합 발효 균주를 이용한 발효 공정으로부터 형성되는 재조합 유전물질, 내독소 및 단백질을 함유하지 않는 고순도로 중성 모유 올리고당의 효율적인 제공을 위한 활성탄소 처리를 추가적으로 포함한다.
중성 모유 올리고당은 재조합 미생물, 바람직하게는 박테리아 또는 효모, 더욱 바람직하게는 화학적 한정 배지에서 성장시킨 재조합 미생물을 이용한 미생물 발효에 의해 수득되는 발효액으로부터 정제되고, 임의적으로 단계 i)에서 분리되는 바이오매스가 미생물 발효에 재사용된다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 발효액 내에 중성 모유 올리고당의 순도는 ≤70%,≤60%,≤50%,≤40%,≤30%,≤20%,≤10% 또는 ≤5%이고/이거나, 정제된 용액은 ≥85%, 바람직하게는 ≥90%의 순도로 중성 모유 올리고당을 함유한다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 중성 모유 올리고당의 수득률은 >70%(임의적으로 >75%)이고/이거나 정제된 용액은 DNA, 단백질 및/또는 재조합 유전 물질을 함유하지 않는다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 중성 모유 올리고당은 2'-푸코실락토오스, 3-푸코실락토오스, 2',3-디푸코실락토오스, 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-네오푸코펜타오스, 락토-N-푸코펜타오스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토-N-푸코펜타오스 V, 락토-N-네오푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸코헥사오스 I, 락토-N-디푸코헥사오스 II, 6'-갈락토실락토오스, 3'-갈락토실락토오스, 락토-N-헥사오스 및 락토-N-네오헥사오스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 중성 모유 올리고당은 2'-푸코실락토오스이다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 발효액으로부터 바이오매스의 분리는
a) 바람직하게는 >500kDa, 더욱 바람직하게는 >150kDa로 바이오매스 및 물질을 분리하는 한외여과; 및/또는
b) 바람직하게는 컷-오프(cut-off) ≤100kDa, 더욱 바람직하게는 컷-오프 ≤10kDa, 더욱더 바람직하게는 컷-오프 ≤5kDa로 크로스-플로우 필터(cross-flow filter)를 통한 여과를 통해 달성되며;
바람직하게는 단계 a)가 단계 b) 이전에 시행된다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 정제 단계 ii) 내지 iv) 중 하나 이상의 단계가 공정 동안 한 번 이상 반복된다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 정제 단계 i) 내지 iv) 중 하나 이상의 단계 이후에, 활성탄소로 색소(colour giving material) 및 더 큰 올리고당(larger oligosaccharides)을 흡착하기 위해서 발효액을 한 번 이상 활성탄소 처리한다. 이 추가적인 정제 단계에 발효액을 적용하여, 색소 및 더 큰 올리고당을 발효액으로부터 제거할 수 있다.
본 발명의 공정은
a) 정제 단계 i) 내지 iv) 중 하나 이상의 단계 이후에; 또는
b) 활성탄소로 색소 및 더 큰 올리고당을 흡착하기 위한 한 번 이상의 활성탄소 처리 이후에; 또는
c) 정제 단계 i) 내지 iv) 중 하나 이상의 단계 이후에 시행되는 농축 단계 이전에;
중성 모유 올리고당을 포함하는 용액을 정용여과(diafiltration)하고/하거나 농축하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 용액을 나노여과막, 더욱 바람직하게는 ≤20Å의 크기 배제한계(size exclusion limit)를 갖는 나노여과막으로 정용여과하고/하거나 농축하고, 가장 바람직하게는 용액을 ≤15mS/cm, 바람직하게는 ≤10mS/cm, 더욱 바람직하게는 ≤5mS/cm의 전도도가 도달될 때까지 정용여과한다.
나노여과를 사용하는 정용여과는 모유 올리고당 함유 용액의 전기투석 처리 이전에 상당한 양의 오염물질을 제거하기 위한 전처리로 효율적이라는 것이 밝혀졌다. 게다가, 나노여과 또한, 한외여과 단계 이후에 저분자 오염물질의 제거에 효율적임이 밝혀졌으며, 상기 제거는 이온교환기 처리 이전에 모유 올리고당 용액을 농축 및 탈회화하는데 유용하다. 모유 올리고당의 정제에서 농축 및 정용여과를 위한 나노여과막의 사용은 낮은 에너지 및 낮은 가공 비용뿐만 아니라 감소된 열 노출로 인한 향상된 제품 품질을 야기하며, 감소된 메일라드 반응(Maillard reaction) 및 알돌 반응(aldol reaction)으로 이어진다.
단계 i) 이전 단계에서, 글루코시다아제 처리, 바람직하게는 β-글루코시다아제 처리를 발효액에 수행할 수 있고, 상기 처리는 바람직하게는
a) 불필요한 중간체, 기질 및/또는 올리고당 부산물의 분해에 적합한 하나 이상의 글리코시다아제 효소를 발현할 수 있는 미생물 균주를 첨가하고/하거나;
b) 바람직하게는 발효액에 유도물질을 첨가하고/하거나 발효액의 온도를 이동시켜, 하나 이상의 글리코시다아제 효소를 발현하는 발효 균주를 사용하고/하거나;
c) 미정제 효소 또는 정제된 효소로써 하나 이상의 글리코시다아제, 바람직하게는 하나 이상의 β-글루코시다아제를 발효액에 첨가하여 수행한다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 발효액을 정제 단계 i) 내지 iv) 중 어느 하나의 단계 이후에, 바람직하게는 정제 단계 iv) 이후에, 진공증착(vacuum evaporation) 또는 역삼투 또는 나노여과(예를 들어, ≤20Å의 크기 배제한계를 갖는 나노여과막을 통한 나노여과)를 이용하여 농축한다.
a) >100g/L, 바람직하게는 >200g/L, 더욱 바람직하게는 >300g/L의 농도로 농축하고/하거나;
b) 진공증착 또는 역삼투 동안, <80℃ 바람직하게는 <50℃, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 50℃, 더욱더 바람직하게는 30℃ 내지 45℃의 (진공증착 또는 역삼투에 대해 구체적으로 관련된) 온도에서 농축하고/하거나;
c) <80℃ 바람직하게는 <50℃, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 50℃의 (나노여과에 대해 구체적으로 관련된) 온도에서 농축하는 것을 특징으로 하는, 공정.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 정제된 용액을 바람직하게는 3kDa 필터를 통한 정제된 용액의 여과로 무균여과하고/하거나 내독소 제거한다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 1가 및 2가 염과 같이 하전된 물질을 추가적으로 제거하기 위해 중성 모유 올리고당 함유 용액에 전기투석을 가한다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 정제된 용액을 >1.5M의 농도로 농축하고, <25℃, 더욱 바람직하게는 <8℃의 온도로 냉각하여 중성 모유 올리고당의 결정성 물질을 수득한다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 정제된 용액을 특히 20-60(w/v), 바람직하게는 30-50(w/v), 더욱 바람직하게는 35-45(w/v)의 중성 모유 올리고당 농도에서 분무건조하고, 110-150℃의 노즐 온도, 바람직하게는 120-140℃, 더욱 바람직하게는 125-135℃의 노즐 온도 및/또는 60-80℃의 배출구 온도, 바람직하게는 65-70℃의 배출구 온도에서 분무건조한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 공정으로 제조될 수 있는 중성 모유 올리고당을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 모유 올리고당은 예를 들어, >30%(w/v), 더욱 바람직하게는 >40%(w/v)의 농도를 갖는 중성 모유 올리고당 생성물을 함유하는 멸균 농축물과 같은 무균여과된 농축물 내에 존재한다.
다른 바람직한 구현예에서, 모유 올리고당은 분무건조 또는 결정화된다.
다른 바람직한 구현예에서, 모유 올리고당은 2'-푸코실락토오스, 3-푸코실락토오스, 2',3-디푸코실락토오스, 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-네오푸코펜타오스, 락토-N-푸코펜타오스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토- /V-푸코펜타오스 V, 락토-N-네오푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸코헥사오스 I, 락토-N-디푸코헥사오스 II, 6'-갈락토실락토오스, 3'-갈락토실락토오스, 락토-N-헥사오스 및 락토-N-네오헥사오스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 바람직한 구현예에서, 모유 올리고당은 2'-푸코실락토오스이다.
다른 바람직한 구현예에서, 모유 올리고당은
a) 300g/L 용액에서 1mSi/cm 미만의 전도도를 가지고;
b) 재조합 DNA 물질을 함유하지 않으며, 임의적으로 어떠한 DNA도 함유하지 않고/않거나;
c) 재조합 미생물에서 유래되는 단백질을 함유하지 않으며, 임의적으로 어떠한 단백질도 함유하지 않는다.
다른 바람직한 구현예는 약제용 모유 올리고당으로, 바람직하게는 위장질환의 예방 또는 치료용 모유 올리고당에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 모유 올리고당의 용도로, 식품 첨가제, 바람직하게는 식품 및/또는 애완동물용 사료 첨가제, 더욱 바람직하게는 유아용 식품 첨가제로써 사용되는 모유 올리고당의 용도를 포함한다.
본 발명은 동반된 도면 및 실시예를 참조하여 상세하게 설명되며, 특정 구현예로 본 발명을 제한하지 않는다.
도 1은 본 발명에 따른 공정의 바람직한 구현예의 도식을 나타낸 것으로, 발효액으로부터 2'-푸코실락토오스를 정제하기 위한 다음의 단계를 포함한다: 한외여과, 양이온 및 음이온교환기 처리, 활성탄소 처리, 나노여과, 전기투석 및 농축.
도 2는 본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예의 도식을 나타낸 것으로, 발효액으로부터 2'-푸코실락토오스를 정제하기 위한 다음의 단계를 포함한다: 한외여과, 나노여과, 양이온 및 음이온교환기 처리, 활성탄소 처리, 전기투석 및 농축.
도 3은 본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예의 도식을 나타낸 것으로, 발효액으로부터 2'-푸코실락토오스를 정제하기 위한 다음의 단계를 포함한다: 한외여과, 양이온 및 음이온교환기 처리, 나노여과, 활성탄소 처리, 전기투석 및 농축.
실시예 1: 재조합 미생물 제조 균주 I을 이용한 발효로부터 2'- 푸코실락토오 스의 정제
재조합 2'-푸코실락토오스 합성 E. coli 균주(E. coli BL21(DE3) ΔlacZ)를 이용한 2'-푸코실락토오스 피드-배치(feed-batch) 발효는 wbgL 유전자로 코딩된 유전자 삽입(genomic integration) 2'-푸코실트랜스페라제를 함유하고(EP 11 1151 571.4 참조), 한정 염 배지(defined salt medium)에서 성장시킨 galM , galK , galT 및 galE 유전자를 포함하는 기능적 gal 오페론을 함유하는 강력한 구성요소인 테트라사이클린 프로모터의 모든 제어하에 E. coli lacY , manB , manC , gmd 및 fcl의 추가적인 복제를 갖는다. 한정 염 배지는 7g L-1 NH4H3PO4, 7g L-1 K2HPO4, 2g L-1 KOH, 0.37g L-1 시트르산, 1㎖ L-1 소포제(Struktol J673, Schill+Seilacher), 1mM CaCl2, 4mM MgS04, 미량 원소 및 탄소원으로써 2% 글리세롤을 포함한다.
미량 원소는 0.101g L-1 니트릴로트리아세트산, pH 6.5, 0.056g L-1 구연산철암모늄, 0.01g L-1 MnCl2x4H20, 0.002g L-1 CoCl2x6H20, O.OOlg L-1 CuCl2x2H20, 0.002g L-1 붕산, 0.009g L-1 ZnS04x7H20, 0.001g L-1 Na2Mo04x2H20, 0.002g L-1 Na2Se03, 0.002g L-1 NiS04x6H20로 이루어진다.
글리세롤-피드(glycerol feed)는 글리세롤 800g L-1, MgS04 2.64g L-1 및 미량 원소 용액 4㎖ L-1로 이루어진다. 2'-푸코실락토오스 형성을 위해, 216g L-1의 락토오스 피드를 사용하였다. pH를 암모니아 용액(25% v/v)을 이용하여 조절하였다. 피드-배치 발효를 30℃에서 일정한 에어레이션(aeration) 및 교반(agitation)하에 90시간 동안 배양하였다. 발효 시작 90시간 이후에, 첨가된 락토오스 대부분이 2'-푸코실락토오스로 전환되었다. 발효 상등액에 여전히 존재하는 락토오스를 제거하기 위해, 발효 시작 90시간 이후에 두 번째 박테리아 균주를 발효관에 첨가하였다.
첨가된 두 번째 박테리아 균주는 첫 번째 사용된 박테리와 균주와 유전적으로 동일하지만, 유전자 삽입 베타-갈락토시다아제의 발현만이 상이하다. 첨가된 두 번째 박테리아 균주의 배양은 5시간 이내로 잔여의 락토오스를 소실되게 한다. 박테리아 균주를 발현하는 두 번째 베타-갈락토시다아제의 약 10㎖ 종균 배양(starter culture)을 1L 발효액 당 첨가하였다.
이후에, 바이오매스를 발효 배지로부터 10kDa의 컷-오프를 갖는 크로스-플로우 필터(Microdyn Nardir)를 사용하여 한외여과로 분리하였다.
42g/L 2'-푸코실락토오스를 함유하는 약 1m3 무세포 발효 배지를 수득하였다. 이어서, 양으로 하전된 오염물질을 제거하기 위해서, 무세포 발효 배지를 강력한 양이온교환기에 통과시켰다(Lewatit S 6368 A(Lanxess)는 H+ 형태이고, 이온교환기의 흡착제 부피의 크기는 100L이다). 이어서, 수득한 용액에 2M 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH 7로 설정하였다.
이어서(지체하지 않고), 상기 용액을 음이온교환기 컬럼에 통과시켰다(이온교환기의 흡착제 부피는 100L이다). 사용된 강력한 음이온교환기 Lewatit S 2568(Lanxess)는 클로라이드(Cl-) 형태이다. 수득한 용액을 다시 pH 7로 중화하였다. 이어서, 이렇게 수득한 용액을 Alfa-Laval NF99HF 나노여과막 및 6배 용량의 멸균 탈이온수을 사용하여 정용여과하였다. 추가적으로 용액을 나노여과막을 사용하여 농축하였고, 200g/L 및 전도도 7mS/cm의 2'-푸코실락토오스 용액을 수득하였다.
이어서 메일라드 반응(Maillard reaction) 생성물 및 알돌 반응(Aldol reaction) 생성물과 같은 색소(color giving material)를 제거하기 위해 2'-푸코실락토오스 농축액을 활성탄소로 처리하였다. 2'-푸코실락토오스 농축액 L 당 활성탄소로 20g Norit GAC EN을 사용하였고, 유의하게 탈색된 용액을 수득하였다.
이어서, 이렇게 2'-푸코실락토오스 농축액을 PC-Cell E200 막 스택(membrane stack)이 장착된 PC-Cell BED 1-3 전기투석 장치(PC-Cell, Heusweiler, Germany)를 사용하여 0.3mS/cm로 전기투석하였다. 상기 스택은 다음의 막을 함유한다: 양이온교환막 CEM: PC SK 및 음이온교환막 AEM: 60Da의 크기 배제한계를 갖는 PcAcid60. ED 공정에서 0.025M 술팜산(아미도술폰산) 용액을 전해질로 사용하였다.
이후에, 수득한 용액을 진공하에 40℃에서 농축하여 45% 2'-푸코실락토오스 용액을 수득하였다. 이어서, 농축액을 다시 Na+ 형태의 이온교환기 Lewatit S 6368 A(Lanxess)로 처리하였고(사용된 이온교환기의 흡착제 부피는 10L이다), 이후에 Cl- 형태의 음이온교환기 Lewatit S 2568(Lanxess)로 중화하였다(사용된 이온교환기의 흡착제 부피는 10L이다).
이어서, 수득한 2'-푸코실락토오스 용액을 활성탄소(Norit DX1 Ultra)로 처리하였다. 45% 2'-푸코실락토오스 용액 1L에 대하여 활성탄소 30g을 적용하였다.
이어서, 0.3mSi/cm 미만의 전도도를 얻을 때까지 용액에 전기투석을 가하였다.
그후에, 용액을 3kDa 필터(Pall Microza ultrafiltration hollow fiber module SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich)에 통과시켜 무균여과하였다.
이어서, 수득한 2'-푸코실락토오스 용액 일부를 분석하기 위해 분무건조하였다.
NMR 스펙트럼 기록을 위해, 분무건조한 생성물을 헥사듀테로디메틸 술폭사이드(hexadeuterodimethyl sulfoxide; DMSO-d6)에 용해시켰다. 양성자 및 13C 분석을 위해 하기와 같이 특징적인 화학적 이동을 관찰하였다:
1H NMR(500MHz, DMSO-d6) δ6.63(d, J=6.5Hz, 1H), 6.28(d, J=4.7Hz, 1H), 5.21(d, J=2.4Hz, 1H), 5.19(d, J=2.4Hz, 1H), 5.01(d, J=2.2, 2H), 4.92(d, J=5.0Hz, 1H), 4.89(dd, J=4.6, 1.3Hz, 2H), 4.78(d, J=5.3Hz, 1H), 4.74(d, J=5.1Hz, 1H), 4.63(m, 6H), 4.53(t, d, J=5.5, 1H), 4.46(d, J=5.2Hz, 1H), 4.44(d, J=5.0Hz, 1H), 4.38-4.26(m, 5H), 4.23(d, J=0.9, 1H), 4.05(d, J=0.9, 1H), 4.00(quin, J=3.3, 1H), 3.68-3.60(m, 7H), 3.59-3.50(m, 13H), 3.50-3.37(m, 6H), 3.24(dt, J=8.8, 2.2Hz, 1H), 3.14(m, 2H), 2.96(td, J=8.4, 4.7Hz, 1H), 1.04(d, J=6.1Hz, 3H), 1.03(d, J=6.1Hz, 3H).
13C NMR(126MHz, DMSO-d6) δ100.99, 100.85, 100.35, 100.25, 96.59, 92.02, 78.13, 77.78, 77.16, 77.01, 75.27 75.05, 74.67, 73.70, 72.33, 71.62, 71.56, 70.91, 69.90, 69.64, 68.75, 68.16, 66.33, 60.17, 59.82, 59.67, 16.37, 16.36.
화학적 이동이 2'-푸코실락토오스 구조와 일치하는 것으로 밝혀졌다.
본 프로토콜을 사용하여 94.5%의 순도를 갖는 45% 2'-푸코실락토오스 농축물을 수득할 수 있다(HPLC 분석을 통해 확인된다). 주된 오염물질은 3'-푸코실락토오스(1.8%), 디푸코실락토오스(2.9%) 및 락토오스(0.3%)이다.
정제 수득률은 약 70%이다.
중요한 것은, 어떠한 재조합 물질도 50 사이클의 qPCR을 이용하여 10g의 동결물질(freeze material)로 결정될 수 없다는 것이다. 수득한 물질의 단백질 양을 nano-Bradford assay(Roth, Karlsruhe Germany)를 사용하여 <50㎍/g 동결건조 물질로 결정하였다. 회분의 전체 양을 0.19%로 하였다. 중금속(비소, 카드뮴, 납 및 수은)의 농도는 0.1㎍/g 물질 미만이다. 내독소 레벨을 <0.005EU/㎖ 2'-푸코실락토오스 농축물이 되도록 하였다.
실시예 2: 재조합 미생물 제조 균주 II를 이용한 발효로부터 2'-푸코실락토오스 의 정제
무세포 발효 배지를 수득하기 위하여 47g/L의 농도에서 2'-푸코실락토오스를 포함하는 1m3 미생물 발효를 100kDa의 컷-오프를 갖는 크로스-플로우 필터(Microdyn Nadir)를 통하여 여과하였다.
발효 배지로 다음의 배지를 사용하였다: 주요 배지 구성성분: 글리세롤 30g/L, NH4H2P04 7g/L, K2HP04 7g/L, 시트르산염 0.3g/L, KOH 2g/L, MgS04·7H20 2g/L; 미량 원소: CaCl2·6H20 20㎎/L, 니트릴로트리아세트산 101㎎/L, 구연산철암모늄 56㎎/L, MnCl2·4H20 9.8㎎/L, CoCl2·6H20 1.6㎎/L, CuCl2·2H20 1㎎/L, H3B03 1.6㎎/L, ZnS04·7H20 9㎎/L, Na2Mo04·2H20 1.2㎎/L, Na2Se03 1.2㎎/L; 피드 성분: 글리세롤 및 락토오스.
이어서, 양으로 하전된 오염물질을 제거하기 위해서, 무세포 발효 배지를 H+ 형태의 양이온 교환기(Lewatit S 6368 A(Lanxess)에 통과시켰다(이온교환기의 흡착제 부피는 100L이다). 이어서, 수득한 용액에 2M 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH 7로 설정하였다. 이어서, 용액을 지체하지 않고 클로라이드(Cl-) 형태의 강력한 음이온교환기 Lewatit S 2568(Lanxess)를 포함하는 음이온교환기 컬럼에 통과시켰다(이온교환기의 흡착제 부피는 100L이다). 수득한 용액을 다시 pH 7로 중화시켰다. 이어서, 이렇게 수득한 용액을 (10배 용량의 멸균 탈이온수를 사용하여) 정용여과하였고, 나노여과막(Alfa-Laval NF99HF)으로 농축하여 200g/L 및 전도도 약 7mSi/cm의 2'-푸코실락토오스 용액을 수득하였다.
이어서 2'-푸코실락토오스 농축액을 2'-푸코실락토오스 농축액 L 당 20g Norit GAC EN을 사용하여 활성탄소 처리하였다. 여과된 2'-푸코실락토오스 용액에 40g/L에 Norit DX1 Ultra 활성탄소를 첨가하였다. 이어서 용액을 활성탄소에 4℃에서 약 18시간 동안 노출시켰다. 18시간 이후에, 활성탄소를 여과하여 2'-푸코실락토오스 용액으로부터 제거하였다.
이어서, 용액을 PC-Cell E200 막 스택이 장착된 PC-Cell BED 1-3 전기투석 장치(PC-Cell, Heusweiler, Germany)를 사용하여 전도도 <0.3mS/cm로 전기투석하였다. 상기 스택은 다음의 막을 함유한다: 양이온교환막 CEM: PC SK 및 음이온교환막 AEM: 60Da의 크기 배제한계를 갖는 PcAcid60. ED 공정에서 0.025M 술팜산(아미도술폰산) 용액을 전해질로 사용하였다.
이어서, 수득한 용액을 농축하여 40% 2'-푸코실락토오스 용액을 수득하였다. 이어서, 수득한 2'-푸코실락토오스 용액을 Cl- 형태(흡착제 부피 10L)의 Lewatit S 2568(Lanxess)에 통과시키고, 활성탄소(Norit DX1 Ultra)로 8℃에서 18시간 동안 처리하였다. 이어서, 용액을 3kDa 필터(Pall Microza ultrafiltration hollow fiber module SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich)에 통과시켜 무균여과하고, NUBILOSA LTC-GMP 분무건조기(NUBILOSA, Konstanz, Germany)를 사용하여 분무건조하였다.
본 프로토콜을 이용하여, 94%의 순도를 갖는 2'-푸코실락토오스를 수득할 수 있다(HPLC 분석을 통해 확인된다). 주된 오염물질은 3'-푸코실락토오스(1.8%), 디푸코실락토오스(3.2%) 및 락토오스(0.2%)이다. 정제 수득률은 약 70%이다.

Claims (19)

  1. 미생물 발효에 의해 수득되는 발효액으로부터 배치 방식(batch manner) 또는 연속 방식(continuous manner)으로 중성 모유 올리고당(HMOs)을 정제하는 공정으로서, 상기 발효액이 중성 모유 올리고당, 바이오매스(biomass), 배지 성분 및 오염물질을 포함하고, 상기 발효액 내에 중성 모유 올리고당의 순도가 <80%이고,
    i) 발효액으로부터 바이오매스를 분리하는 단계;
    ii) 양으로 하전된 물질의 제거를 위해 양이온교환기 처리하는 단계;
    iii) 음으로 하전된 물질의 제거를 위해 음이온교환기 처리하는 단계; 및
    iv) 나노여과 단계 및/또는 전기투석 단계를 포함하는 정제공정에 발효액이 적용되는 것을 특징으로 하며,
    >80%의 순도로 중성 모유 올리고당을 포함하는 정제된 용액을 제공하는, 중성 모유 올리고당의 정제공정.
  2. 제 1항에 있어서,
    중성 모유 올리고당이 재조합 미생물, 바람직하게는 박테리아 또는 효모, 더욱 바람직하게는 화학적 한정 배지에서 성장시킨 재조합 미생물을 이용한 미생물 발효에 의해 수득되는 발효액으로부터 정제되고, 임의적으로 단계 i)에서 분리되는 바이오매스가 미생물 발효에 재사용되는 것을 특징으로 하는, 공정.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    발효액 내에 중성 모유 올리고당의 순도가 ≤70%, ≤60%, ≤50%, ≤40%, ≤30%, ≤20%, ≤10% 또는 ≤5%이고/이거나, 정제된 용액이 ≥85%, 바람직하게는 ≥90%의 순도로 중성 모유 올리고당을 함유하는 것을 특징으로 하는, 공정.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    중성 모유 올리고당의 수득률이 >75%이고/이거나 정제된 용액이 DNA, 단백질 및/또는 재조합 유전 물질을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 공정.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    중성 모유 올리고당이 2'-푸코실락토오스, 3-푸코실락토오스, 2',3-디푸코실락토오스, 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-네오푸코펜타오스, 락토-N-푸코펜타오스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토-N-푸코펜타오스 V, 락토-N-네오푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸코헥사오스 I, 락토-N-디푸코헥사오스 II, 6'-갈락토실락토오스, 3'-갈락토실락토오스, 락토-N-헥사오스 및 락토-N-네오헥사오스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 공정.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    발효액으로부터 바이오매스의 분리가
    a) 바람직하게는 >500kDa, 더욱 바람직하게는 >150kDa로 바이오매스 및 물질을 분리하는 한외여과; 및/또는
    b) 바람직하게는 컷-오프(cut-off) ≤100kDa, 더욱 바람직하게는 컷-오프 ≤10kDa, 더욱더 바람직하게는 컷-오프 ≤5kDa로 크로스-플로우 필터(cross-flow filter)를 통한 여과를 통해 달성되며;
    바람직하게는 단계 a)가 단계 b) 이전에 시행되는 것을 특징으로 하는, 공정.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    정제 단계 ii) 내지 iv) 중 하나 이상의 단계가 공정 동안 한 번 이상 반복되는 것을 특징으로 하는, 공정.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    정제 단계 i) 내지 iv) 중 하나 이상의 단계 이후에, 활성탄소로 색소(color giving material) 및 더 큰 올리고당(larger oligosaccharides)을 흡착하기 위해서 발효액을 한 번 이상 활성탄소 처리하는 것을 특징으로 하는, 공정.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 정제 단계 i) 내지 iv) 중 하나 이상의 단계 이후에; 또는
    b) 활성탄소로 색소 및 더 큰 올리고당을 흡착하기 위한 한 번 이상의 활성탄소 처리 이후에; 또는
    c) 정제 단계 i) 내지 iv) 중 하나 이상의 단계 이후에 시행되는 농축 단계 이전에;
    중성 모유 올리고당을 포함하는 용액을 바람직하게는 나노여과막, 더욱 바람직하게는 ≤20Å의 크기 배제한계(size exclusion limit)를 갖는 나노여과막으로 정용여과(diafiltration)하고/하거나 농축하고, 가장 바람직하게는 용액을 ≤15mS/cm, 바람직하게는≤10mS/cm, 더욱 바람직하게는 ≤5mS/cm의 전도도가 도달될 때까지 정용여과하는 것을 특징으로 하는, 공정.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 i) 이전 단계에서, 글루코시다아제 처리, 바람직하게는 β-글루코시다아제 처리를 발효액에 수행하고, 상기 처리는 바람직하게는
    a) 불필요한 중간체, 기질 및/또는 올리고당 부산물의 분해에 적합한 하나 이상의 글리코시다아제 효소를 발현할 수 있는 미생물 균주를 첨가하고/하거나;
    b) 바람직하게는 발효액에 유도물질을 첨가하고/하거나 발효액의 온도를 이동시켜, 하나 이상의 글리코시다아제 효소를 발현하는 발효 균주를 사용하고/하거나;
    c) 미정제 효소 또는 정제된 효소로써 하나 이상의 글리코시다아제, 바람직하게는 하나 이상의 β-글루코시다아제를 발효액에 첨가하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 공정.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
    발효액을 정제 단계 i) 내지 iv) 중 어느 하나의 단계 이후에, 바람직하게는 정제 단계 iv) 이후에, 진공증착(vacuum evaporation) 또는 역삼투 또는 나노여과를 이용하여
    a) >100g/L, 바람직하게는 >200g/L, 더욱 바람직하게는 >300g/L의 농도로 농축하고/하거나;
    b) 진공증착 또는 역삼투 동안, <80℃ 바람직하게는 <50℃, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 50℃, 더욱더 바람직하게는 30℃ 내지 45℃의 온도에서 농축하고/하거나;
    c) <80℃ 바람직하게는 <50℃, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 50℃의 온도에서 농축하는 것을 특징으로 하는, 공정.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    정제된 용액을 바람직하게는 3kDa 필터를 통한 정제된 용액의 여과로 무균여과하고/하거나 내독소 제거하는 것을 특징으로 하는, 공정.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    정제된 용액을 >1.5M의 농도로 농축하고, <25℃, 더욱 바람직하게는 <8℃의 온도로 냉각하여 중성 모유 올리고당의 결정성 물질을 수득하는 것을 특징으로 하는, 공정.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    정제된 용액을 특히 20-60(w/v), 바람직하게는 30-50(w/v), 더욱 바람직하게는 35-45(w/v)의 중성 모유 올리고당 농도에서 분무건조하고, 110-150℃의 노즐 온도, 바람직하게는 120-140℃, 더욱 바람직하게는 125-135℃의 노즐 온도 및/또는 60-80℃의 배출구 온도, 바람직하게는 65-70℃의 배출구 온도에서 분무건조하는 것을 특징으로 하는, 공정.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 공정으로 제조될 수 있는 중성 모유 올리고당으로, 중성 모유 올리고당을 바람직하게는 분무건조 또는 결정화하는, 모유 올리고당.
  16. 제 15항에 있어서,
    중성 모유 올리고당이 2'-푸코실락토오스, 3-푸코실락토오스, 2',3-디푸코실락토오스, 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-네오푸코펜타오스, 락토-N-푸코펜타오스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토-N-푸코펜타오스 V, 락토-N-네오푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸코헥사오스 I, 락토-N-디푸코헥사오스 II, 6'-갈락토실락토오스, 3'-갈락토실락토오스, 락토-N-헥사오스 및 락토-N-네오헥사오스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 모유 올리고당.
  17. 제 15항 또는 제 16항에 있어서,
    모유 올리고당이
    a) 300g/L 용액에서 1mSi/cm 미만의 전도도를 가지고;
    b) 재조합 DNA 물질을 함유하지 않으며, 임의적으로 어떠한 DNA도 함유하지 않고/않거나;
    c) 재조합 미생물에서 유래되는 단백질을 함유하지 않으며, 임의적으로 어떠한 단백질도 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 모유 올리고당.
  18. 제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따른 약제용 모유 올리고당으로, 바람직하게는 위장질환의 예방 또는 치료용 모유 올리고당.
  19. 제 15항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 따른 모유 올리고당의 용도로, 식품 첨가제, 바람직하게는 식품 및/또는 애완동물용 사료 첨가제, 더욱 바람직하게는 유아용 식품 첨가제로써 사용되는, 모유 올리고당의 용도.
KR1020167022587A 2014-01-20 2014-12-23 미생물 발효로부터 중성 모유 올리고당(HMOs)의 효율적인 정제공정 KR102137027B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14151737.5A EP2896628B1 (en) 2014-01-20 2014-01-20 Process for efficient purification of neutral human milk oligosaccharides (HMOs) from microbial fermentation
EP14151737.5 2014-01-20
PCT/EP2014/079212 WO2015106943A1 (en) 2014-01-20 2014-12-23 PROCESS FOR EFFICIENT PURIFICATION OF NEUTRAL HUMAN MILK OLIGOSACCHARIDES (HMOs) FROM MICROBIAL FERMENTATION

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160132009A true KR20160132009A (ko) 2016-11-16
KR102137027B1 KR102137027B1 (ko) 2020-07-23

Family

ID=49949589

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167022587A KR102137027B1 (ko) 2014-01-20 2014-12-23 미생물 발효로부터 중성 모유 올리고당(HMOs)의 효율적인 정제공정

Country Status (18)

Country Link
US (4) US10377787B2 (ko)
EP (5) EP2896628B1 (ko)
JP (2) JP6901857B2 (ko)
KR (1) KR102137027B1 (ko)
CN (1) CN106132977B (ko)
AT (2) AT17418U1 (ko)
AU (1) AU2014377374B2 (ko)
BR (1) BR112016016705A8 (ko)
CZ (2) CZ35289U1 (ko)
DE (2) DE202014011399U1 (ko)
DK (6) DK2896628T3 (ko)
ES (4) ES2701163T3 (ko)
FI (2) FI3680249T3 (ko)
MX (2) MX369375B (ko)
PH (2) PH12016501421A1 (ko)
PL (4) PL2896628T3 (ko)
RU (1) RU2682445C2 (ko)
WO (1) WO2015106943A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220081732A1 (en) * 2019-01-21 2022-03-17 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process for making l-fucose

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2896628B1 (en) 2014-01-20 2018-09-19 Jennewein Biotechnologie GmbH Process for efficient purification of neutral human milk oligosaccharides (HMOs) from microbial fermentation
WO2016086947A1 (en) * 2014-12-05 2016-06-09 Glycom A/S Crystalline difucosyllactose
EP3390652A4 (en) 2015-12-18 2019-06-12 Glycom A/S Fermentative preparation of oligosaccharides
US10899782B2 (en) 2016-03-07 2021-01-26 Glycom A/S Separation of oligosaccharides from fermentation broth
DE202017007248U1 (de) 2016-04-19 2020-04-23 Glycom A/S Abtrennung von Oligosacchariden aus der Fermentationsbrühe
WO2019003135A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 Glycom A/S PURIFICATION OF OLIGOSACCHARIDES
EP3652189A4 (en) 2017-07-12 2021-04-21 Glycom A/S AMORPHIC MIXTURE CONSISTING OF A NEUTRAL MONO- OR OLIGOSACCHARIDE AND A NON-GLUCIDIC ACID COMPONENT
EP3450443A1 (en) 2017-08-29 2019-03-06 Jennewein Biotechnologie GmbH Process for purifying sialylated oligosaccharides
US11377462B2 (en) 2017-09-29 2022-07-05 Frieslandcampina Nederland B.V. Process for the purification of a neutral human milk oligosaccharide (HMO) from microbial fermentation
EP3486326A1 (en) * 2017-11-21 2019-05-22 Jennewein Biotechnologie GmbH Method for the purification of n-acetylneuraminic acid from a fermentation broth
EP3494804A1 (en) 2017-12-08 2019-06-12 Jennewein Biotechnologie GmbH Spray-dried 3-fucosyllactose
BR112020011236A2 (pt) 2017-12-08 2020-11-17 Jennewein Biotechnologie Gmbh lacto-n-fucopentaose seca por pulverização
EP3494807A1 (en) 2017-12-11 2019-06-12 Jennewein Biotechnologie GmbH Spray-dried sialyllactose
EP3524067A1 (en) * 2018-02-08 2019-08-14 Jennewein Biotechnologie GmbH Spray-dried mixture of human milk oligosaccharides
EP3494806A1 (en) 2017-12-08 2019-06-12 Jennewein Biotechnologie GmbH Spray-dried lacto-n-fucopentaose
EP3494805A1 (en) 2017-12-08 2019-06-12 Jennewein Biotechnologie GmbH Spray-dried tetrasaccharides
EP3546060A1 (en) * 2018-03-27 2019-10-02 DuPont Nutrition Biosciences ApS Process for spray drying fucosyllactose solutions and related product compositions
JP2021522817A (ja) * 2018-05-07 2021-09-02 クリスチャン・ハンセン・ハーエムオー・ゲーエムベーハーＣｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ ＨＭＯ ＧｍｂＨ 微生物発酵によって得られた炭水化物からラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）を精製するための簡素な方法
JP2021524238A (ja) * 2018-05-23 2021-09-13 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ．Ｄｓｍ Ｉｐ Ａｓｓｅｔｓ Ｂ．Ｖ． オリゴ糖の生成
CN109111043B (zh) * 2018-09-16 2021-11-09 苏州渭中科技发展有限公司 一种高盐高cod废水的处理方法
MX2021007456A (es) 2018-12-19 2021-08-05 Basf Se Metodo para separar la biomasa de una solucion que comprende biomasa y al menos un oligosacarido.
EP3686210A1 (en) * 2019-01-24 2020-07-29 DuPont Nutrition Biosciences ApS Process for purifying a human milk oligosaccharide and related compositions
WO2020174386A1 (en) 2019-02-25 2020-09-03 Nutribam Bvba Composition, food supplement and method for supporting and/or improving intestinal health
BE1027078A9 (nl) * 2019-02-25 2020-09-28 Nutribam Bvba Samenstelling, voedingssupplement en werkwijze voor het ondersteunen en/of verbeteren van de darmgezondheid
EP3741770A1 (en) * 2019-05-21 2020-11-25 Jennewein Biotechnologie GmbH Purification of oligosaccharides from a fermentation broth by using filtration
EP4286014A3 (en) * 2019-06-04 2024-02-21 N.V. Nutricia Nutritional composition comprising 2'fucosyllactose and 3'galactosyllactose
EP3822282A1 (en) * 2019-11-18 2021-05-19 DuPont Nutrition Biosciences ApS Process for removing an antifoam agent from a solution comprising a human milk oligosaccharide and related compositions
EP4025072A4 (en) * 2019-09-04 2023-12-20 Inbiose N.V. METHOD FOR REMOVAL OF AN ANTIFOAM AGENT FROM A HUMAN MILK OLIGOSACCHARIDE SOLUTION AND ASSOCIATED COMPOSITIONS
MX2022002949A (es) 2019-09-24 2022-04-06 Prolacta Bioscience Inc Composiciones y metodos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias e inmunes.
KR20220133930A (ko) * 2020-01-29 2022-10-05 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 인간 모유 올리고당을 회수 및 정제하는 방법
CN111540125B (zh) * 2020-04-20 2021-01-05 中国人民解放军火箭军工程设计研究院 一种充电桩的充电管理方法、设备及计算机可读存储介质
CN116075517A (zh) 2020-06-12 2023-05-05 巴斯夫欧洲公司 改进的发酵液的脱矿化与诸如寡糖的精细化学品的纯化
MX2023001743A (es) 2020-08-14 2023-04-21 Prolacta Bioscience Inc Composiciones de oligosacáridos de la leche humana para usarse con bacterioterapias.
CN112568439A (zh) * 2020-12-21 2021-03-30 湖北福星生物科技有限公司 一种从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法及其应用
KR20230131228A (ko) 2021-01-12 2023-09-12 프롤랙타 바이오사이언스, 인코포레이티드 신바이오틱 치료 요법
CN112920234B (zh) * 2021-01-27 2022-03-29 南开大学 一种2′-岩藻糖基乳糖的富集纯化方法
WO2022229316A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 Dsm Ip Assets B.V. Infant formula with low level of arsenic
BE1029434B1 (nl) 2021-06-15 2023-07-31 Dsm Ip Assets Bv Scheiding van moedermelkoligosachariden uit een fermentatiebouillon
WO2022263424A1 (en) 2021-06-15 2022-12-22 Dsm Ip Assets B.V. Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth
WO2022263425A1 (en) 2021-06-15 2022-12-22 Dsm Ip Assets B.V. Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth
WO2022263426A1 (en) 2021-06-15 2022-12-22 Dsm Ip Assets B.V. Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth
WO2023066907A1 (en) 2021-10-18 2023-04-27 Dsm Ip Assets B.V. A method for providing an amorphous hmo product by drying
CN114539433B (zh) * 2021-12-29 2022-11-01 北京三元食品股份有限公司 一种乳低聚糖的制备方法及制备的低聚糖粉、食品
WO2023182527A1 (ja) * 2022-03-25 2023-09-28 キリンホールディングス株式会社 ラクトジフコテトラオース（ｌｄｆｔ）の製造法
CN115873051A (zh) * 2022-05-17 2023-03-31 山东恒鲁生物科技有限公司 三糖的新晶型
WO2023242184A1 (en) 2022-06-14 2023-12-21 Dsm Ip Assets B.V. Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth
WO2024047096A1 (en) 2022-08-30 2024-03-07 Inbiose N.V. Process for purification of an oligosaccharide
CN115651039A (zh) * 2022-12-27 2023-01-31 保龄宝生物股份有限公司 一种高密度2’-岩藻糖基乳糖的生产方法
CN116425810B (zh) * 2023-06-14 2023-08-11 山东合成远景生物科技有限公司 一种混合液中3-岩藻糖基乳糖的纯化方法
CN117089503B (zh) * 2023-10-17 2024-01-02 保龄宝生物股份有限公司 一种大肠杆菌k-12 mg1655 blbyzt6及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003047402A (ja) * 2001-08-06 2003-02-18 Meiji Milk Prod Co Ltd 中性オリゴ糖含有育児用調製乳
EP2479263A1 (en) * 2011-01-20 2012-07-25 Jennewein Biotechnologie GmbH Novel Fucosyltransferases and their applications
WO2012112777A2 (en) * 2011-02-16 2012-08-23 Glycosyn LLC Biosynthesis of human milk oligosaccharides in engineered bacteria

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61271296A (ja) 1985-05-28 1986-12-01 Kyogyo Kumiai N F I Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造方法
JPH0614870B2 (ja) * 1986-12-15 1994-03-02 株式会社ヤクルト本社 ガラクトオリゴ糖の製造法
US6454946B1 (en) 1996-10-10 2002-09-24 Neose Technologies, Inc. Carbohydrate purification using ultrafiltration, reverse osmosis and nanofiltration
US5945314A (en) 1997-03-31 1999-08-31 Abbott Laboratories Process for synthesizing oligosaccharides
US6323008B1 (en) * 1997-08-14 2001-11-27 Neose Technologies, Inc. Methods for producing sialyloligosaccharides in a dairy source
US6017433A (en) 1997-11-12 2000-01-25 Archer Daniels Midland Company Desalting aqueous streams via filled cell electrodialysis
AU1234400A (en) 1998-10-27 2000-05-15 Cargill Incorporated Method for purifying a polyol product stream
DE19906865C2 (de) 1999-02-18 2003-03-13 Infineon Technologies Ag Verfahren und Einrichtung zur Entzerrung und Decodierung eines Datensignals
FR2796082B1 (fr) 1999-07-07 2003-06-27 Centre Nat Rech Scient Procede de production d'oligosaccharides
FR2799754A1 (fr) 1999-10-18 2001-04-20 Roquette Freres Procede de separation et de purification d'acide lactique a partir d'un milieu de fermentation
US6288222B1 (en) 2000-02-16 2001-09-11 Neose Technologies, Inc. Method of filtration of a dairy stream
US6618584B1 (en) 2000-08-30 2003-09-09 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Terminal authentication procedure timing for data calls
JP2003048901A (ja) 2001-08-09 2003-02-21 Oji Paper Co Ltd 長鎖キシロオリゴ糖組成物およびその製造方法
FR2844209B1 (fr) 2002-09-06 2007-10-19 Applexion Ste Nouvelle De Rech Procede de purification par nanofiltration d'une solution aqueuse sucree contenant des anions et cations monovalents et polyvalents
WO2004101479A2 (en) 2003-05-06 2004-11-25 E.I. Dupont De Nemours And Company Purification of biologically-produced 1,3-propanediol
ES2284028T5 (es) * 2003-06-30 2014-12-04 Clasado Inc. Nueva composición de galactooligosacárido y la preparación de la misma
WO2006034225A2 (en) 2004-09-17 2006-03-30 Neose Technologies, Inc. Production of oligosaccharides by microorganisms
CA2580529A1 (en) * 2004-10-01 2006-04-13 Eisai R & D Management Co., Ltd. Fine particle-containing composition and manufacturing method therefor
EA012165B1 (ru) 2005-02-11 2009-08-28 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Ферментативное получение витамина с
US20070256936A1 (en) 2006-05-04 2007-11-08 Robert Jansen Method for Deashing Syrup by Electrodialysis
WO2009008362A1 (ja) * 2007-07-12 2009-01-15 Yotsuba Milk Products Co., Ltd. シアル酸化合物含有組成物の製造方法
BRPI0923433B1 (pt) 2008-12-19 2021-06-01 Jennewein Biotechnologie Gmbh Método para produzir uma célula geneticamente modificada tendo a capacidade de produzir compostos fucosilados e método para fazer um composto fucosilado
GB0904562D0 (en) 2009-03-17 2009-04-29 Separation Technologies Invest Isolation and purification of components of whey
BRPI1013822A2 (pt) * 2009-04-07 2015-08-25 Glycom As Método para síntese de um trissacarídeo.
AU2009347610B2 (en) 2009-06-08 2013-02-21 Chr. Hansen HMO GmbH HMO synthesis
JP2012532195A (ja) * 2009-07-06 2012-12-13 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 乳オリゴ糖による炎症の阻害
IT1395068B1 (it) 2009-08-07 2012-09-05 Inalco Spa Processo per la produzione di galatto-oligosaccaridi ultrapuri
CN101691538B (zh) 2009-09-29 2012-05-09 保龄宝生物股份有限公司 一种米曲霉菌种及其制备高纯度低聚半乳糖的方法
WO2011090926A1 (en) * 2010-01-19 2011-07-28 Abbott Laboratories Nutritional formulas containing synbiotics
WO2013096420A1 (en) 2011-12-19 2013-06-27 The Coca-Cola Company Methods for purifying steviol glycosides and uses of the same
CN103025749B (zh) 2010-06-01 2016-06-01 格礼卡姆股份公司 2’-o-岩藻糖基乳糖的多晶型物及其制备
PL2944690T3 (pl) 2010-10-11 2018-05-30 Jennewein Biotechnologie Gmbh Nowe fukozylotransferazy i ich zastosowanie
EP2455387A1 (en) 2010-11-23 2012-05-23 Nestec S.A. Oligosaccharide mixture and food product comprising this mixture, especially infant formula
TW201233340A (en) * 2010-12-31 2012-08-16 Abbott Lab Human milk oligosaccharides for modulating inflammation
MY174542A (en) * 2010-12-31 2020-04-24 Abbott Lab Human milk oligosaccharides to promote growth of beneficial bacteria
CN102154163A (zh) 2010-12-31 2011-08-17 朱莉 一种3′-唾液酸乳糖的制备方法
EP2658548B1 (en) 2010-12-31 2018-02-21 Abbott Laboratories Human milk oligosaccharides for modulating inflammation
CN102095181A (zh) 2011-03-16 2011-06-15 黎昌兴 Led强光源流体巡回散热装置
US9567361B2 (en) * 2011-05-13 2017-02-14 Glycosyn LLC Use of purified 2′-fucosyllactose, 3-fucosyllactose and lactodifucotetraose as prebiotics
EP2526784A1 (en) 2011-05-24 2012-11-28 Nestec S.A. Milk oligosaccharide-galactooligosaccharide composition for infant formula containing the soluble oligosaccharide fraction present in milk, and having a low level of monosaccharides, and a process to produce the composition
PL2722394T3 (pl) * 2011-06-07 2018-09-28 Hero Ag Otrzymywanie oligosacharydów za pomocą procesu biotechnologicznego
NL2007268C2 (en) * 2011-08-16 2013-02-19 Friesland Brands Bv Nutritional compositions comprising human milk oligosaccharides and uses thereof.
JP6017133B2 (ja) * 2011-12-12 2016-10-26 Ｍｃフードスペシャリティーズ株式会社 風味改良剤
WO2013182206A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Glycom A/S Method for producing oligosaccharides and oligosaccharide glycosides by fermentation
CN104428307A (zh) 2012-06-14 2015-03-18 格礼卡姆股份公司 增强人乳寡糖或其前体或掺合物的稳定性和纯度以及增加其生物利用度
ITFI20120143A1 (it) * 2012-07-12 2014-01-13 Inalco S A S Di Giovanni Cipollett I & C Polimorfi idrati e anidri del 2'-o-fucosillattosio e loro metodi di produzione.
US9029136B2 (en) 2012-07-25 2015-05-12 Glycosyn LLC Alpha (1,2) fucosyltransferases suitable for use in the production of fucosylated oligosaccharides
WO2014086373A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Glycom A/S Crystallisation of human milk oligosaccharides (hmo)
EP2845905B8 (en) 2013-09-10 2021-07-14 Chr. Hansen HMO GmbH Production of oligosaccharides
CN103468766B (zh) 2013-09-18 2015-07-01 恩施天天佳生物科技有限公司 一种高纯度甘露低聚糖的制备方法
EP2857410A1 (en) 2013-10-04 2015-04-08 Jennewein Biotechnologie GmbH Process for purification of 2´-fucosyllactose using simulated moving bed chromatography
EP2896628B1 (en) 2014-01-20 2018-09-19 Jennewein Biotechnologie GmbH Process for efficient purification of neutral human milk oligosaccharides (HMOs) from microbial fermentation
EP2927316B1 (en) 2014-03-31 2018-11-07 Jennewein Biotechnologie GmbH Total fermentation of oligosaccharides
ES2932304T3 (es) 2014-04-17 2023-01-17 Biogen Ma Inc Composiciones y métodos para la modulación del empalme de SMN2 en un sujeto
DK3154995T3 (da) 2014-06-11 2023-11-20 Glycom As Separation of 2'-o-fucosyllactose from fermentation broth
EP3141610A1 (en) 2015-09-12 2017-03-15 Jennewein Biotechnologie GmbH Production of human milk oligosaccharides in microbial hosts with engineered import / export

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003047402A (ja) * 2001-08-06 2003-02-18 Meiji Milk Prod Co Ltd 中性オリゴ糖含有育児用調製乳
EP2479263A1 (en) * 2011-01-20 2012-07-25 Jennewein Biotechnologie GmbH Novel Fucosyltransferases and their applications
WO2012112777A2 (en) * 2011-02-16 2012-08-23 Glycosyn LLC Biosynthesis of human milk oligosaccharides in engineered bacteria

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220081732A1 (en) * 2019-01-21 2022-03-17 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process for making l-fucose

Also Published As

Publication number Publication date
EP3131912A1 (en) 2017-02-22
FI3686211T3 (fi) 2023-04-26
EP3680249A2 (en) 2020-07-15
US20190177352A1 (en) 2019-06-13
DE202014011358U1 (de) 2019-09-26
DE202014011399U1 (de) 2020-02-12
US10882880B2 (en) 2021-01-05
CZ35288U1 (cs) 2021-08-03
CZ35289U1 (cs) 2021-08-03
RU2682445C2 (ru) 2019-03-19
MX369375B (es) 2019-11-07
DK3686211T3 (da) 2023-04-24
JP2017506065A (ja) 2017-03-02
US11597740B2 (en) 2023-03-07
US20210061836A1 (en) 2021-03-04
US20160333042A1 (en) 2016-11-17
BR112016016705A8 (pt) 2022-10-11
AU2014377374B2 (en) 2019-07-04
CN106132977B (zh) 2020-05-12
EP2896628A1 (en) 2015-07-22
EP3680249A3 (en) 2021-01-20
WO2015106943A1 (en) 2015-07-23
PH12016501421B1 (en) 2016-08-22
US20200231618A1 (en) 2020-07-23
DK3680249T3 (da) 2023-04-24
DK201900054Y4 (da) 2019-09-26
US10377787B2 (en) 2019-08-13
PL3680249T3 (pl) 2023-05-15
AU2014377374A1 (en) 2016-08-04
MX2019013267A (es) 2020-01-13
RU2016128955A3 (ko) 2018-05-21
EP3375786A1 (en) 2018-09-19
AT17418U1 (de) 2022-03-15
ES2942630T3 (es) 2023-06-05
PH12016501421A1 (en) 2016-08-22
DK2896628T3 (en) 2019-01-14
JP7000396B2 (ja) 2022-02-10
JP6901857B2 (ja) 2021-07-14
PH12020500199A1 (en) 2021-03-15
JP2020014482A (ja) 2020-01-30
PL3131912T3 (pl) 2020-06-15
KR102137027B1 (ko) 2020-07-23
MX2016009394A (es) 2017-02-08
DK201900072U1 (en) 2019-09-27
CN106132977A (zh) 2016-11-16
BR112016016705A2 (ko) 2017-08-08
ES2701163T3 (es) 2019-02-21
PL3686211T3 (pl) 2023-06-05
EP3686211B1 (en) 2023-03-01
DK3131912T3 (da) 2020-02-10
ES2942586T3 (es) 2023-06-02
EP3131912B1 (en) 2020-01-22
AT17271U1 (de) 2021-10-15
EP3686211A2 (en) 2020-07-29
DK201900054U1 (en) 2019-07-02
ES2779414T3 (es) 2020-08-17
EP3680249B1 (en) 2023-03-01
FI3680249T3 (fi) 2023-04-25
EP2896628B1 (en) 2018-09-19
US11661435B2 (en) 2023-05-30
RU2016128955A (ru) 2018-02-26
EP3686211A3 (en) 2021-01-20
PL2896628T3 (pl) 2019-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11661435B2 (en) Spray-dried, high-purity, neutral human milk oligosaccharides (HMOs) from microbial fermentation
CN111094311A (zh) 纯化唾液酸化的低聚糖的方法
EP3801037A1 (en) A simple method for the purification of a sialyllactose
RU2793469C2 (ru) Простой способ очистки сиалиллактозы

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right