KR20220133930A - 인간 모유 올리고당을 회수 및 정제하는 방법 - Google Patents
인간 모유 올리고당을 회수 및 정제하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
(a) 바이오매스를 포함하는 HMO-함유 발효 브로쓰를 제공하는 단계; (b) 발효 브로쓰를 분리하여 분리된 HMO-함유 스트림 및 바이오매스 폐기물 스트림을 형성하는 단계; (c) 분리된 HMO-함유 스트림을 정제하는 단계; (d) 분리된 HMO-함유 스트림을 농축하는 단계; 및 (e) 간접 건조 방법에 의해 단계 (a) 내지 (d)의 생성물을 건조시켜 정제된 HMO를 형성하는 단계를 포함하는, HMO의 회수 및 정제 방법을 제시하고, 단계 (c) 및 (d)는 임의의 순서로 수행될 수 있다.
Description
본 발명은 분리 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 발효 브로쓰(broth)로부터 인간 모유 올리고당(HMO)을 회수 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2020년 1월 29일에 출원된 US 62/967,357을 우선권 주장하는 국제 출원이고, 그 전체 내용은 본원에 참조로 혼입된다.
인간 모유는 구조적으로 다양한 비접합 글리칸인 독특한 올리고당류인 HMO를 함유한다. 인간 모유의 (락토스 및 지방 다음으로) 세 번째로 풍부한 고체 성분임에도 불구하고, 인간 유아는 실제로 HMO를 소화할 수 없다. 대신, 그들은 공생 박테리아를 확립하는 데 도움이 되는 프리바이오틱스로서 기능한다. HMO는 또한 점막 표면에 미생물 병원체의 부착을 방지하는 데 도움이 되는 항접착제 역할을 한다. 유아의 면역 체계의 대부분이 소화관에 있기 때문에, 유아의 건강한 소화관 발달을 지원하는 것은 면역 체계의 발달을 돕는다. 이러한 복합 올리고당의 발생 및 농도는 인간에게 특이적이고, 가축화된 낙동 동물과 같은 다른 포유동물의 모유에서는 다량으로 발견되지 않는다. 따라서, 이러한 유익한 효과를 제공하는 유아용 조제식(formula)과 함께 사용하기 위한 HMO-함유 보충제가 필요하다. EP 14827224.8, WO 2019/003133, WO 2019/003135, US 2017/0304375 및 WO 2019/003136에서와 같이 HMO를 생산하기 위한 개선된 시스템을 개발하기 위한 작업이 진행 중이다. 특히, 이러한 공정은, 예를 들어 WO 2019/110801, WO 2019/110806, WO 2015/106943, WO 2019/110804 및 WO 2019/110800에 나타난 바와 같이 종종 회수 공정에서 분무-건조 단계를 사용한다. 그럼에도 불구하고, 기존 공정과 관련된 HMO의 생산 및 회수를 위한 개선된 공정을 제공할 필요가 남아있다.
본 개시내용의 대상 발명은 발효 브로쓰(broth)로부터 HMO를 회수하고 정제하는 방법을 포함한다. 특정 방식으로 HMO를 회수, 정제 및 건조시킴으로써 작업(operation) 안전성을 개선하고 생성물 손실을 줄일 수 있다는 것이 예기치 않게 발견되었다.
한 양태에서, 본 개시내용은 (a) 바이오매스를 포함하는 HMO-함유 발효 브로쓰를 제공하는 단계; (b) 발효 브로쓰를 분리하여 분리된 HMO-함유 스트림(stream) 및 바이오매스 폐기물 스트림을 형성하는 단계; (c) 분리된 HMO-함유 스트림을 정제하는 단계; (d) 분리된 HMO-함유 스트림을 농축하는 단계; 및 (e) 간접 건조 방법에 의해 단계 (a) 내지 (d)의 생성물을 건조시켜 정제된 HMO를 형성하는 단계를 포함하는, HMO의 회수 및 정제 방법을 제시하고, 단계 (c) 및 (d)는 임의의 순서로 수행될 수 있다. 정제 단계 (c)는 (i) 한외여과; (ii) 나노여과(nanofiltration); (iii) 탈이온화 처리; 및 (iv) 탈색 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있고, 상기 하위 단계 (i) 내지 (iv)는 임의의 순서로 수행될 수 있다. 탈이온화 처리 단계 (iii)은 이온 흡착 또는 이온 교환 중에서 선택될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 (a) 바이오매스를 포함하는 HMO-함유 발효 브로쓰를 제공하는 단계; (b) 발효 브로쓰를 분리하여 분리된 HMO-함유 스트림 및 바이오매스 폐기물 스트림을 형성하는 단계; (c) 임의의 순서로 수행되는 한외여과, 나노여과, 이온 흡착 및 탈색 중 하나 이상으로부터 선택되는 단계에서 분리된 HMO-함유 스트림을 정제하는 단계; (d) 분리된 HMO-함유 스트림을 농축하는 단계; 및 (e) 간접 건조 방법에 의해 상기 단계 (a) 내지 (d)의 생성물을 건조시켜 정제된 HMO를 형성하는 단계를 포함하는, HMO의 회수 및 정제 방법을 제시하고, 상기 단계 (c) 및 (d)는 임의의 순서로 수행될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 (a) 바이오매스를 포함하는 HMO-함유 발효 브로쓰를 제공하는 단계; (b) 발효 브로쓰를 분리하여 분리된 HMO-함유 스트림 및 바이오매스 폐기물 스트림을 형성하는 단계; (c) 한외여과, 나노여과, 이온 교환 처리 및 탈색 중 하나 이상으로부터 선택되는 단계에서 분리된 HMO-함유 스트림을 임의의 순서로 정제하는 단계; (d) 분리된 HMO-함유 스트림을 농축하는 단계; 및 (e) 간접 건조 방법에 의해 상기 단계 (a) 내지 (d)의 생성물을 건조시켜 정제된 HMO를 형성하는 단계를 포함하는, HMO의 회수 및 정제 방법을 제시하고, 상기 단계 (c) 및 (d)는 임의의 순서로 수행될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 20 내지 80 중량%의 건조물 함량을 갖는 정제된 HMO 스트림을 간접 건조 방법에 의해 건조시킴으로써, 수분 수준이 9 중량% 이하인 건조된 HMO 생성물을 형성하는 단계를 추가로 제시한다.
또 다른 대안적인 양태에서, 본 개시내용은 펄스 전류측정 검출과 결합된 고성능 음이온-교환 크로마토그래피(high performance anion-exchange chromatography coupled with pulsed amperometric detection, HPAEC-PAD)를 통해 측정된 9% 미만의 단당류 함량을 갖는 상기 방법에 의해 생성된 건조된 HMO 생성물을 추가로 제시한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 개시내용은 하기 기재된 방법에 따라 측정된 0.3 미만의 용액 중 색상 흡수를 갖는 상기 방법에 의해 제조된 건조된 HMO를 추가로 제시한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 바이오매스를 포함하는 HMO-함유 발효 브로쓰를 제공하는 단계; 바이오매스를 제거하여 바이오매스가 고갈된 스트림을 형성하는 단계; 바이오매스가 고갈된 스트림을 정제하여 20 내지 80 중량%의 고체 및 20 내지 80 중량%의 액체를 함유하는 정제된 HMO 스트림을 형성하는 단계; 및 간접 건조 방법에 의해 정제된 HMO 스트림을 건조시켜 90 중량% 이상의 고체를 함유하는 HMO 고체 스트림을 형성하는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 (a) 바이오매스를 포함하는 HMO-함유 발효 브로쓰를 제공하는 단계; (b) 발효 브로쓰를 원심분리하여 바이오매스 농축 스트림 및 바이오매스-고갈된 생성물 스트림을 형성하는 단계; (c) 바이오매스-고갈된 생성물 스트림을 마이크로여과(microfiltration)에 의해 여과하여 저-현탁 물질 생성물 스트림을 형성하는 단계; (d) 저-현탁 물질 생성물 스트림을 한외여과에 의해 여과하여 한외여과 생성물 스트림을 형성하는 단계; (e) 나노여과에 의해 한외여과 생성물 스트림을 여과하여 나노여과 생성물 스트림을 형성하는 단계; (f) 나노여과 생성물 스트림을 양이온 교환에 적용하여 양이온 고갈된 생성물 스트림을 형성하는 단계; (g) 양이온이 고갈된 생성물 스트림을 탈색시켜 탈색된 생성물 스트림을 형성하는 단계; (h) 탈색된 생성물 스트림을 음이온 교환하여 음이온이 고갈된 생성물 스트림을 형성하는 단계; (i) 음이온이 고갈된 생성물 스트림을 농축하여 농축된 생성물 스트림을 형성하는 단계; 및 (j) 농축된 생성물 스트림을 간접 건조 방법에 의해 건조시켜 HMO-풍부 생성물을 형성하는 단계를 포함하는 방법을 제시하고, 상기 단계 (i)의 생성물은 임의적으로 단계 (i)과 (j) 사이에 열처리 단계를 거친다.
대안적인 양태에서, 본 개시내용은 (a) 바이오매스를 포함하는 HMO-함유 발효 브로쓰를 제공하는 단계; (b) 발효 브로쓰를 원심분리하여 바이오매스 농축 스트림 및 바이오매스-고갈된 생성물 스트림을 형성하는 단계; (c) 바이오매스가 고갈된 생성물 스트림을 한외여과에 의해 여과하여 한외여과 생성물 스트림을 형성하는 단계; (d) 나노여과에 의해 한외여과 생성물 스트림을 여과하여 나노여과 생성물 스트림을 형성하는 단계; (e) 나노여과 생성물 스트림을 양이온 교환하여 양이온 고갈된 생성물 스트림을 형성하는 단계; (f) 양이온이 고갈된 생성물 스트림을 탈색시켜 탈색된 생성물 스트림을 형성하는 단계; (g) 탈색된 생성물 스트림을 음이온 교환시켜 음이온이 고갈된 생성물 스트림을 형성하는 단계; (h) 음이온이 고갈된 생성물 스트림을 농축하여 농축된 생성물 스트림을 형성하는 단계; 및 (i) 농축된 생성물 스트림을 간접 건조 방법에 의해 건조시켜 HMO-풍부 생성물을 형성하는 단계를 포함하는 방법을 제시하고, 상기 단계 (h)의 생성물은 임의적으로 단계 (h)와 (i) 사이에 열처리 단계를 거친다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 임의의 순서로 나노여과, 이온 교환 또는 이온 흡착, 및 증발에 의한 농축, 이어서 간접 건조를 포함하는 HMO의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 (i) 2% 미만의 락툴로스; (ii) 3% 미만의 푸코스; (iii) 1% 미만의 갈락토스; 및 (iv) 3% 미만의 글루코스 중 하나 이상을 포함하는, 간접 건조에 의해 제조된 HMO를 제시한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 HMO-함유 스트림을 HMO-함유 스트림과 접촉하는 크롬-도금된 표면을 포함하는 드럼 건조기에서 HMO-함유 스트림을 건조시키는 것을 포함하는 HMO의 생산 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 5 중량% 미만의 물을 포함하는, 간접 건조에 의해 생성된 HMO를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 보다 바람직하게는 1% 미만, 가장 바람직하게는 0.1% 미만의 미세분 분획(fines fraction)을 포함하는, 간접 건조에 의해 생성된 HMO를 제공한다.
본 개시내용은 하기 공정 단계를 포함하는 인간 모유 올리고당(HMO)의 회수 및 정제 방법을 특징으로 한다: 유전자 변형 미생물 유기체의 발효; 원심분리 또는 여과, 및 바이오매스(예를 들어, 세포, 고분자량 분자)를 제거하기 위한 마이크로여과; 단백질 및/또는 DNA와 같은 다른 고분자량 분자를 제거하기 위한 한외여과; 목적되는 HMO보다 작은 분자를 제거하는 나노여과 단계; 유색 물질(color material) 제거를 위한 탈색; 하전된 분자를 제거하기 위한 이온 교환; 및 액체를 제거하기 위한 농축. 모든 경우에 간접 건조가 HMO 생성물을 생산하는 데 사용된다.
HMO
2'-푸코실락토스(2'-FL)와 같은 목적되는 HMO는 발효의 산물인 발효 브로쓰로부터 정제된다. 발효 후, 원하는 HMO를 포함하는 브로쓰는 하기 요약된 바와 같이 분리 공정에 적용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발효 브로쓰"는 미생물 유기체의 발효로부터 수득되는 생성물을 지칭한다. 따라서, 발효 생성물은 세포(바이오매스), 발효 배지, 잔류 기질 물질, 및 목적되는 HMO와 같은 발효 동안 생성된 임의의 분자/부산물을 포함한다. 정제 방법의 각 단계 후, 발효 생성물의 하나 이상의 성분이 제거되어 더욱 정제된 HMO가 생성된다.
바람직하게는, 본 개시내용의 방법에 따라 정제되는 목적되는 HMO는 하기로부터 선택된다: 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 2',3-디푸코실락토스, 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-네오푸코펜타오스, 락토-N-푸코펜타오스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토-N-푸코펜타오스 V, 락토-N-네오푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸코헥사오스 I, 락토-N-디푸코헥사오스 II, 6'-갈락토실락토스, 3'-갈락토실락토스, 락토-N-헥사오스 및 락토-N-네오헥사오스, 시알릴락토-N-테트라오스 a, 시알릴락토-N-테트라오스 b, 시알릴락토-N-테트라오스 c, 디시알릴락토-N-테트라오스, 3' 및 6' 시알릴락토스, 또는 이들의 혼합물. 보다 바람직하게는, 목적되는 HMO는 2'-푸코실락토스이다.
2'-FL과 같은 목적되는 HMO는 유전자 변형 미생물 유기체의 발효에 의해 생산된다. 발효는, 예를 들어 화학적으로 정의된 발효 배지와 같은 임의의 적합한 발효 배지에서 수행될 수 있다. 발효 배지는 사용되는 미생물 유기체에 따라 다를 수 있다.
바람직하게는, 미생물 유기체는 사카로마이세스(Saccharomyces) 균주, 칸디다(Candida) 균주, 한세뉼라(Hansenula) 균주, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 균주, 피키아(Pichia) 균주, 슈이조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 균주, 슈와니오마이세스(Schwanniomyces) 균주, 토룰라스포라(Torulaspora) 균주, 야로위아(Yarrowia) 균주, 또는 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces) 균주와 같은 유전자 변형 효모이다. 보다 바람직하게는, 효모는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 한세뉼라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 피키아 파스토리스(Pichia pastori), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 피키아 스티피테스(Pichia stipites), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 슈이조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 슈와니오마이세스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii), 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 자이고사카로마이세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii), 또는 자이고사카로마이세스 베일리이(Zygosaccharomyces bailii)이다.
바람직하게는, 미생물 유기체는 또한 에셔리키아 콜라이(E. coli) 또는 사카로마이세스 세레비지에, 비피도박테리움(Bifidobacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 엔테로코커스(Enterococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 클로스트리디움(Clostridium), 유박테리움(Eubacterium), 베일로넬라(Veilonella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 박테리오이데스(Bacterioides), 프레보텔라(Prevotella), 에셔리키아(Escherichia), 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 및 사카로마이세스, 비피도박테리움 아돌센티스(Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 애니멀리스(B. animalis), 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum), 비피도박테리움 브레브(B. breve), 비피도박테리움 인팬티스(B. infantis), 비피도박테리움 락티스(B. lactis), 비피도박테리움 롱검(B. longum); 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium); 에셔리키아 콜라이, 클루이베로마이세스 마르시아누스; 락토바실러스 애이시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus), 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum), 락토바실러스 가쎄리(L. gasseri), 락토바실러스 헬베티커스(L. helveticus), 락토바실러스 존스니이(L. johnsonii), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실러스 플랜타럼(L. plantarum), 락토바실러스 류테리(L. reuteri), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius), 락토바실러스 사켈(L. sakel), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)(비제한적으로 하위종 락티스, 세레모리스(cremoris) 및 디아세틸락티스(diacetylactis)를 포함함); 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)(비제한적으로 하위종 메센테로이데스를 포함함); 페디코커스 애이시딜락티시(Pedicoccus acidilactici), 페디코커스 펜토사세우스(P. pentosaceus); 프로피오니박테리움 애이시디프로피오니시(Propionibacterium acidipropionici), 프로피오니박테리움 프레우덴라이치이 spp. 셔머니이(P. freudenreichii ssp. Shermanii); 스타필로코커스 카르노서스(Staphylococcus carnosus); 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서 설명하는 공정에서 활용되는 다양한 단위 작업들은 하기 설명된다. 이러한 단위 작업의 조합은 표적 HMO의 특성과 원하는 생성물 순도에 따라 활용될 수 있다. 그러나, 각각의 경우에, 간접 건조를 사용하여 회수/정제 단계 후 수분 수준을 표적 수준으로 감소시킨다.
통상적인 여과
본 명세서의 목적상, 통상적인 여과라는 용어는 플레이트(plate) 및 프레임(frame) 여과, 리세스드 챔버(recessed chamber) 여과, 벨트 여과, 진공 여과, 수평 금속 리프(leaf) 여과, 수직 금속 리프 여과, 적층된 디스크 여과, 회전식 진공 여과 및 이들의 조합을 사용하는 공정을 지칭한다.
원심분리
원심분리를 사용하여 바이오매스와 같은 현탁 물질을 제거할 수 있다. 목적되는 HMO 생성물이 원심분리기에 의해 유지되지 않는 액체에 들어 있다. 바람직하게는, 원심분리기는 연속적으로 작동된다.
마이크로여과
직교류 여과 공정은 원심분리 단계에서 제거되지 않은 잔류 바이오매스를 제거하기 위한 보호 필터의 역할을 하도록 사용될 수 있다. 전형적으로, 마이크로여과는 10 μm의 컷 오프(cut off), 바람직하게는 2 μm의 컷 오프를 갖고; 훨씬 더 바람직하게는 마이크로여과는 0.2 내지 2.0 μm의 컷 오프를 갖고, 가장 바람직하게 마이크로여과는 0.2 내지 0.5 μm의 컷 오프를 갖는다. 생성물 스트림은 액체 투과물(permeate)이다.
한외여과
직교류 한외여과를 사용하여 단백질 및 기타 고분자량 화합물, 예를 들어 DNA 및 큰 다당류를 발효 생성물로부터 제거할 수 있다. 한외여과막의 세공 크기는 약 300 kD 분자량 컷 오프("MWCO") 이하 내지 약 1 kD MWCO 범위이다. 생성물 스트림은 투과물이다.
바람직하게는, 한외여과 단계 후 투과물에서 목적되는 HMO의 수율은 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 91% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과이다.
나노여과
직교류 나노여과를 사용하여 목적되는 HMO보다 작은 저분자량 분자, 예를 들어 단당류 및 이당류, 펩티드, 작은 유기산, 물, 및 염을 제거할 수 있다. 나노여과막의 세공 크기는 약 1000 돌턴(Da) 이하의 분자량 컷 오프 내지 200 Da MWCO 이하이다. 바람직하게는, 500 돌턴(Da) 이하 분자량 컷 오프, 450 Da MWCO, 400 Da MWCO, 350 Da MWCO, 300 Da MWCO, 250 Da MWCO 또는 200 Da MWCO 이하이다. 생성물 스트림은 보유물(retentate)이다.
바람직하게는, 나노여과 단계 후 보유물에서 목적되는 HMO의 수율은 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 91% 초과 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98초과, 또는 99% 초과이다.
탈이온화
처리
HMO-함유 스트림으로부터 하전된 분자를 분리하기 위해 탈이온화 처리가 사용될 수 있다. 탈이온화 처리는 합성 수지를 사용하는, 이온 교환 처리, 이온 흡착 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 이러한 합성 수지는 양이온 교환기, 음이온 교환기, 양쪽성 교환기, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있고, 상기 양이온 교환기는 강산성 또는 약산성일 수 있고, 상기 음이온 교환기는 강염기성 또는 약염기성일 수 있다. 이온 교환 처리에서, HMO-함유 스트림의 표적 이온은 스트림에서 수지에 의해 처음 결합된 이온으로 대체된다. 표적 이온은 수지로 흐르고 균형 이온은 수지에서 HMO-함유 스트림으로 이동하여, 이온 통행(traffic)은 양방향임으로써, 전기 중성을 달성한다. 이온 흡착에서, HMO-함유 스트림의 표적 이온은 스트림에서 제거되고 수지 표면에 농축된다. 이온 트래픽은 활성탄 층에 의한 분자의 흡착과 유사한 진행으로 단방향이다. 액체 자체는 표적 분자의 제거를 제외하고는 변하지 않는다. 이온 흡착의 예는 아민 작용기가 중성(이온화되지 않음)이고 Cl-와 같은 반대 이온으로 하전되지 않은 유리 염기 형태의 약염기성 음이온 수지에 의한 산의 포획이다. 이러한 수지의 예에는 레진디온 릴라이트 시리즈 RAM2(Resindion Relite series RAM2), 디아이온 WA 시리즈 WA20(Diaion WA series WA20)이 포함된다. 그러나, 해당 수지의 작용기가 반대 이온으로 충전되고 부하되는 경우, 이는 이온 교환 처리에 사용될 수 있다.
양이온 교환
양이온 교환을 이용한 이온 교환 처리에서, 정지상(수지)은 일반적으로 설포네이트기를 함유한다. 이러한 양이온 교환 단계는 양으로 하전된 성분, 예를 들어 잔류 암모니아, 금속 양이온 및 펩티드를 제거한다. 사용되는 수지의 결합 능력은 일반적으로 1.2 내지 2.2 eq/L이다. 양이온 교환에 사용되는 일반적인 수지는 다우 다웩스 88(Dow Dowex 88), 레진디온 JC(Resindion JC) 시리즈 JC603 및 레진디온 PK216을 포함한다.
음이온 교환
음이온 교환을 이용한 이온 교환에서, 정지상(수지)은 양으로 하전되고, 따라서 쿨롱 상호작용에 의해 음으로 하전된 분자를 보유한다. 이 단계는 황산염, 인산염, 유기산 및 음으로 하전된 입자와 같은 음으로 하전된 성분을 제거한다. 사용되는 수지의 결합능은 일반적으로 0.8 내지 2.0 eq/L이다. 음이온 교환을 위한 일반적인 수지는 레진디온 릴라이트 시리즈, 예컨대 D182 및 JA100을 포함한다.
탈색
탈색 단계는 색상 함유 성분을 제거하기 위해 수행될 수 있다. 이 단계는 노리트(Norit) CA1 활성탄과 같은 활성탄, HIC(Hydrophobic Interaction Chromatography) 또는 레진디온 릴라이트 RAD/F와 같이 작용화될 수 있는 또 다른 흡착 수지를 사용하여 수행될 수 있다. 탈색은 음이온 교환 단계 전 또는 후에 수행될 수 있다.
농축
농축 단계는 증발, 역삼투 여과 및 나노여과를 사용하여 HMO-함유 스트림으로부터 상당한 양의 액체를 경제적으로 제거하는 데 사용될 수 있다. 증발 공정은, 예를 들어 하강 필름 증발, 상승 필름 증발 및 회전 증발을 포함할 수 있다. 공정으로 유입되는 고체 농도는 약 5 내지 30 중량%이다. 이러한 공정으로부터의 출구 고체 농도는 전형적으로 30 중량% 초과, 바람직하게는 50 중량% 초과이다. 더 바람직하게는, 탈수 작업을 빠져나가는 고체 농도는 60 내지 80 중량%이다. 회수된 물질의 고체 부분은 80 중량% 초과의 HMO이고, 나머지 불순물은 주로 알디톨 또는 이당류 또는 삼당류이다.
열처리
열처리 단계는 임의의 상당한 정도로 존재할 수 있는 박테리아 또는 기타 원치 않는 미생물을 사멸시키기 위해 사용될 수 있고, 기본적으로 저온살균 공정이다. 예를 들어, 30분 동안 62.8℃까지, 20초 동안 72℃까지, 1 내지 3초 동안 100℃까지의 임의의 허용가능한 저온 살균 조건이 가능하다.
간접 건조
HMO의 고체 농도를 90 중량% 이상으로 증가시키면서 생성되는 고체 스트림에서 미세분(fine) 생성을 최소화하기 위해 간접 건조 공정이 수행된다. 바람직하게는, 건조기를 나가는 HMO의 고체 농도는 95 중량% 이상, 더 바람직하게는 96 중량% 이상이다. 본 명세서의 목적을 위해, 간접 건조기는 건조를 위해 가열된 공정 가스와 건조될 물질의 직접 접촉을 활용하지 않고, 대신 건조기의 벽, 예를 들어 드럼 건조기의 경우 쉘 벽을 통해, 또는 패들 건조기의 중공(hollow) 패들의 벽을 통해 열 전달 매체가 패들의 중공 내부에서 순환하는 동안 고체를 통해 회전할 때 교대로, 열 전달에 의존하는 장치를 포함한다. 간접 건조기의 다른 예로는 접촉식 건조기 및 진공 드럼 건조기가 있다.
열 전달 매체는 바람직하게는 증기 또는 열 전달 오일이다. 보다 바람직하게는, 열 전달 매체는 증기이다. 간접 건조는 뜨거운 공정 가스가 용기를 통해 이동하여 순환하는 고체와 직접 접촉하는 분무 건조기와 같은 직접 건조기와 뚜렷한 대조를 이룬다. 플래시 건조기(flash dryer) 또는 유동층 건조기(fluid bed dryer)는 이러한 직접 건조 방법의 추가적인 예이다.
드럼 건조
바람직하게는, 간접 건조 방법은 드럼 건조이다. 드럼 건조에서 가열된 표면은 회전하는 수평 금속 실린더의 외피이다. 실린더는 바람직하게 내부의 증기 응축에 의해 가열되어 실린더 벽의 온도를 110 내지 155℃가 되게 한다. 이러한 온도를 달성하기 위해 증기압은 약 2 내지 5 bara로 유지된다. 바람직하게는, 건조될 물질과 접촉하는 드럼 건조기의 실린더 벽은 크롬 도금된다. 이것은 주철 드럼과 같은 기존 드럼의 보호되지 않은 벽에서 침출되는 금속 성분, 또는 플레이크로 인해 드럼에 존재하는 부식 생성물로 인한 건조 생성물의 오염을 방지한다. 또한, 주철 드럼은 작업 pH가 5 미만인 경우 사용하지 않는 것이 좋으므로 크롬 도금 드럼은 작업 융통성이 훨씬 뛰어나다. 마지막으로, 주철은 HMO 생성물에 회색을 부여하지만 크롬 도금 드럼은 그렇지 않다는 것이 예기치 않게 발견되었다.
드럼 건조는 대기압 이중 드럼 건조기, 대기압 단일 드럼 건조기, 대기압 이중 드럼 건조기 및 선택적으로 진공 하에 작동되는 밀폐형 드럼 건조기를 사용하는 공정을 포함한다. 바람직하게는, 드럼 건조는 대기압 이중 드럼 건조기에서 수행된다. 액체 공급은 닙(nip) 공급, 롤러 공급, 딥(dip) 공급 또는 분무 및 스플래시(splash) 공급을 통해 회전 드럼의 표면에 적용될 수 있다. 바람직하게는, 액체 공급물은 닙 공급으로 이중 드럼 건조기로 도입된다. 닙 공급에서, 액체 공급은 인접한 역회전 드럼 사이의 공간으로 향하게 된다. 저장소 또는 액체 풀(pool)이 드럼 사이에 형성되어 "닙 너비"가 풀의 상단 표면에서 인접한 드럼 사이의 수평 선형 거리가 되도록 한다. 드럼의 중심선에 비해 이 상단 표면이 높을수록 풀에 있는 액체의 양이 더 많다. 이 양의 액체는 건조 전 액체의 추가 체류 시간을 나타내기 때문에 "액체 정체"라고도 한다. 가장 가까운 지점에서 금속 드럼 표면 사이의 수평 선형 거리는 드럼 간격으로 알려져 있다.
닙에 형성되는 액체 풀은 드럼 벽의 더 높은 온도에 노출될 때 끓기 시작할 수 있다. 드럼의 반대 회전은 액체를 닙의 액체 풀로 끌어들이는 데 도움이 되고 두 회전 드럼 사이에 분할되는 비교적 얇은 필름으로 액체를 도포한다. 드럼 건조기 작동에 영향을 미치는 변수에는 회전 속도, 드럼 간격 크기, 닙 너비, 드럼 온도, 증기압, 공급 온도 및 공급 고체 농도가 포함된다. 드럼 회전 속도는 바람직하게는 1 내지 10 rpm이다. 드럼 간격 크기는 바람직하게는 0.1 mm 내지 2.0 mm, 보다 바람직하게는 0.1 mm 내지 0.3 mm이다. 닙 너비는 바람직하게는 0 내지 50 mm, 보다 바람직하게는 0 내지 10 mm이다. 감소된 닙 너비에 대한 이러한 범위는 덩어리 형성으로 닙의 결정화/응고를 방지하여 안정적인 작동을 달성하는 데 방해가 된다. 공급 온도는 바람직하게는 4℃ 내지 110℃, 보다 바람직하게는 4℃ 내지 95℃ 또는 50℃ 내지 110℃이다. 공급 고체 농도는 바람직하게는 30 중량% 내지 70 중량%이다. 바람직하게는, 전체 드럼에 걸쳐 균일한 공급이 유지된다. 더 바람직하게는, 균일한 공급은 드럼의 길이에 걸쳐 공급 지점으로 작용하는 다중 도관 분기를 갖는 공급 헤더(header) 도관으로 유지된다. 공급 지점은 공급 액체를 안내하는 노즐 또는 기타 장치를 포함할 수 있다. 공급물 pH는 3 내지 7.5로 유지된다.
롤러 공급은 드럼의 외부에서 회전하는 적용 롤러를 포함하고, 액체 공급은 적용기와 드럼 사이에 형성된 2차 닙으로 이송된다.
침지 코팅은 드럼이 액체 저장소를 통해 회전하여 액체를 드럼 벽에 부착시키는 공정을 포함한다.
분무 및 스플래시 공급에서, 액체 공급은 드럼 아래에서 드럼 표면 위로 위쪽으로 향하게 된다.
드럼 표면의 액체 공급물은, 예를 들어 닥터 블레이드 또는 스트링의 도움으로 건조된 고체가 드럼 표면에서 결국 제거될 때까지 드럼이 회전함에 따라 건조된다. 건조된 고체의 특성(예컨대 수분 함량, 형태 및 다공성)은 주로 건조기 체류 시간에 영향을 미치는 증기압, 닙의 너비, 공급 특성 및 드럼 회전 속도를 변경하여 조정된다. 바람직하게는, HMO 물질은 3분 미만의 건조기 체류 시간을 갖는다. 후속적으로, 밀링(milling) 및/또는 체질 단계(들)는 원하는 입자 크기 범위를 얻기 위해 건조 후에 사용될 수 있다.
밀링
밀링 단계가 필요한 경우, 일반적으로 목표로 하는 고체의 유형 및 입자 크기에 적합한 임의의 밀링 방법이 사용될 수 있다. 이러한 밀링 장비는, 예를 들어 볼 밀(ball mill), 해머 밀(hammer mill), SAG 밀, 로드 밀(rod mill), 레이먼드 밀(Raymond mill) 및 수직 밀(vertical mill)을 포함할 수 있다.
본 명세서의 목적을 위해, 달리 명시되지 않는 한, 명세서에 기재된 방법을 이용하여 회수 및 정제된 HMO를 언급할 때, "순수한", "정제된" 또는 "생성물" HMO 스트림은 단일 HMO의 경우 건조물 기준으로 80% 초과 순도, 또는 조합을 위한 HMO 혼합물의 경우 건조물 기준으로 70% 초과 순도, 및 표 1 및 2의 절차에 따라 측정한 10% 이하의 락토스 함량, 및 10 중량% 이하의 수분 함량을 갖는다. 2'-FL의 바람직한 특성은 표 1에 요약되어 있다. HMO 스트림이 불순물을 제거하기 위해 처리되었지만, 완전히 건조되지 않을 때, "순수한", "정제된" 또는 "생성물"이라는 용어는 건조 기준의 물질을 지칭한다.
| 분석 | 참조 방법 | 최대 수준 |
| 외관(색상 포함) | 육안 | 흰색에서 회백색/상아색 건조 분말 |
| 용액의 외관(5%에서) | 육안 | 투명, 무색 내지 약간 황색 |
| KF 적정 | EP 2.5.12 v9 | < 5% |
| pH(20℃, 5% 용액) | EP 2.2.3 v9 | 3.0-7.5 |
| 총 회분(total ash)(회분 처리(ashing) 후 보유물) | FCC 11 부록 II | < 0.5 중량% |
| 중금속 | ||
| 수은 | EP 2.2.58 v9 | ≤ 0.1 mg/kg |
| 카드뮴 | EP 2.2.58 v9 | ≤ 0.05 mg/kg |
| 비소 | EP 2.2.58 v9 | ≤ 0.2 mg/kg |
| 납 | EP 2.2.58 v9 | ≤ 0.05 mg/kg |
| 동정 | 분석 방법 | 주성분의 RT는 표준 ± 3%의 RT에 해당 |
| 탄수화물 | ||
| 2'-푸코실락토스 | HPAEC-PAD | ≥ 83% |
| 락토스 | HPAEC-PAD | < 8 면적% |
| 디푸코실락토스 | HPAEC-PAD | < 7 면적% |
| 2-푸코실락티톨 | HPAEC-PAD | < 6% |
| 푸코스 | HPAEC-PAD | < 6% |
| 알 수 없음 1 (당알코올일 가능성 높음, RT 1.2) |
HPAEC-PAD | |
| 알 수 없음 2(당알코올일 가능성 높음, RT 1.4) | HPAEC-PAD | |
| 2'-푸코실-D-락툴로스 | HPAEC-PAD | |
| 자일리톨 | HPAEC-PAD | |
| 둘시톨 | HPAEC-PAD | |
| 만니톨 | HPAEC-PAD | |
| 소르비톨/갈락티톨 | HPAEC-PAD | |
| 트리헥소스 | HPAEC-PAD | |
| 3-푸코실락토스/푸코실 - 갈락토스 | HPAEC-PAD | |
| 글루코스/갈락토스 | HPAEC-PAD | |
| GPE | HPAEC-PAD | |
| 과당 | HPAEC-PAD | |
HPAEC-PAD 방법은 펄스 전류측정 검출 기술을 이용한다. 예시적인 HPAEC-PAD가 표 2 내지 4에 예시되어 있다.
| IEC-PAD 방법 조건 | |
| 기구: | 디오넥스 ICS-6000 AS 오토샘플러(Dionex ICS-6000 AS Autosampler)(AS-AP) |
| 디오넥스 ICS-6000 DC 컬럼 컴파트먼트(Dionex ICS-6000 DC Column Compartment)/PAD 검출기(DC) | |
| 디오넥스 ICS-6000 단일 펌프(Dionex ICS-6000 Single Pump)(SP) | |
| 분석 컬럼: | |
| 유형/공급업체/부품 번호: | 써모 피셔 사이언티픽 디오넥스 GM-4 구배 혼합기(Thermo Fisher Scientific Dionex GM-4 Gradient Mixer)/ 카보팩 PA100(CarboPac PA100)(250 x 4 mm) + 카보팩 PA100 가드 컬럼(CarboPac PA100 Guard Column)(50 x 4 mm) |
| 디오넥스 ™ ICS-6000 AS-AP 오토샘플러(AS-AP) | |
| 주입량: | 5 마이크로리터(전체 루프) |
| 오토샘플러 트레이 온도 설정: | +5℃ |
| 오토샘플러 플러시(flush) 용매: | 탈이온수 |
| 오토샘플러 플러시 용매 부피: | 250 마이크로리터 |
| 주사기 크기: | 100 마이크로리터 |
| 주사기 속도: | 5 |
| 바늘 높이: | 2 mm |
| 트레이 진동: | 켜짐, 각 주사 전 4회 |
| 디오넥스 ICS-6000 DC 컬럼 구획/PAD 검출기(DC) | |
| 컬럼 온도: | 20℃ |
| 검출기 유형: | 펄스 전류 측정 검출(PAD) |
| 방법: | 통합 전류 측정 |
| 기준 전극: | AgCl |
| 작동 전극: | PTFE 상에 금 |
| 검출기 파형: | 골드(gold), 카보(carbo), 쿼드(quad) |
| 샘플링 비율: | 2 Hz |
| 디오넥스 ™ ICS-6000 단일 펌프(SP) | |
| 유량/압력: | 1.0 mL/분/-2600psi |
| 방법 구배 : | |
| 용리액 A: | 탈이온수 |
| 용리액 B: | 100 mM 수산화나트륨/75mM 아세트산나트륨 |
| 용리액 C: | 100 mM 수산화나트륨/150 mM 아세트산나트륨 |
| 용리액 D: | 300 mM 수산화나트륨 |
본 명세서에 기재된 방법에 따라 회수 및 정제된 HMO는 비정질 또는 결정질일 수 있다. 바람직하게는, 건조 기준 HMO의 순도는 단일 HMO의 경우 건조물 기준으로 80 중량% 초과이거나, 조합을 위한 HMO 혼합물의 경우 건조물 기준으로 70% 초과 순도이다. 보다 바람직하게는, 단일 HMO 순도는 90 중량% 초과이다.
바람직하게는, HMO는 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다: 2% 미만의 락툴로스, 3% 미만의 푸코스, 1% 미만의 갈락토스, 또는 3% 미만의 글루코스.
청구되는 공정의 간접 건조는 분무 건조 또는 플래시 건조와 같은 직접 건조 공정에 비해 HMO 고체의 더 가혹한 열처리를 초래한다. 예상외로 간접 건조 공정에서 생성된 HMO는 분해에 대한 우수한 내화학성을 나타낸다. 간접 건조 공정에서 생성된 고체는 과립, 시트 물질, 플레이크 또는 분말 형태일 수 있다. 밀링은 분무 건조 작업에 의해 입자 크기 분포가 고정되는 분무 건조보다 더 유연하고 효율적인 방식으로 원하는 입자 크기 분포를 유도하기 위해 상기 물질에 대해 후속적으로 수행될 수 있는 임의적 단계이다. 이러한 간접 건조의 장점은 분무 또는 플래시 건조에 비해 에너지 활용도가 향상되고 배출 위험이 감소하고 작업자가 미세분에 노출될 수 있다는 점이다. 또한, 감소된 수준의 생성물 수율을 방지하기 위해 분무 및 플래시 건조는 전형적으로 추가 미세분 재순환-공급 작업(fines recycle-to-feed operation)을 필요로 하고, 이는 설명된 간접 건조 공정에는 불필요하다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에 따른 고체 입자의 모든 입자 크기는 영국 멀번 인스트루먼츠 리미티드(Malvern Instruments Ltd.)의 "마스터사이저 3000(Mastersizer 3000)"을 사용하는 레이저 회절 기술에 의해 결정된다. 이러한 입자 크기 특성화 방법에 대한 추가 정보는, 예컨대 문헌["Basic principles of particle size analytics," Dr. Alan Rawle, Malvern Instruments Limited, Enigma Business Part, Grovewood Road, Malvern, Worcestershire, WR14 1XZ, UK] 및 ["Manual of Malvern particle size analyzer"]에서 찾을 수 있다. 문헌[the user manual number MAN 0096, Issue 1.0, November 1994]이 특히 참조된다. 입자 크기는 건조 형태, 즉 분말 또는 현탁액으로 측정할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 고체 입자의 입자 크기는 분말로서 결정된다. d50(평균 입자 크기)이라는 용어는 부피 기준으로 크기 분포 하에 누적치의 50%에 해당하는 입자 직경을 의미한다.
바람직하게는, HMO는 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 보다 바람직하게는 1% 미만, 가장 바람직하게는 0.1% 미만의 미세분 분획(10 ㎛ 이하)을 갖는다. HMO는 또한 바람직하게는 100 ㎛ 초과, 보다 바람직하게는 150 ㎛ 초과, 더욱 더 바람직하게는 200 ㎛ 초과의 평균 입자 크기(d50)를 갖는다.
청구되는 방법에 따라 생성된 HMO는 우수한 유동성을 나타낸다. 바람직하게는, HMO는 30 미만의 카르 지수(Carr index)를 갖고, 여기서 카르 지수(C)는 공식 C = 100(1-ρ B / ρ T )에 의해 결정되고, 상기 식에서 ρ B 는 분말의 자유 침강 벌크 밀도(freely settled bulk density)이고, ρ T 는 "태핑 다운(tapping down)" 후 분말의 탭 벌크 밀도(tapped bulk density)이다. 자유 유동 고체의 경우, 벌크 및 탭 밀도 값이 유사하므로 값이 작다. 흐름이 불량한 고체의 경우, 이러한 값 간의 차이가 더 크므로 카르 지수는 더 클 것이다.
바람직하게는, HMO는, 400 nm의 파장을 사용하여 흡광도에 의해 측정 시, 용액에서 0.3 미만, 보다 바람직하게는 0.2 미만, 가장 바람직하게는 0.1 미만의 색상을 갖는다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서의 목적을 위해 색상 측정은 하기 절차를 통해 얻어진다.
샘플 용액
물 중 HMO의 10% 용액을 준비하고 용액을 조심스럽게 균질화한다. 용액이 용해 후에도 여전히 탁한 경우, 측정하기 전에 원심분리하거나 여과해야 한다.
투명한 용액을 1 cm 분광 광도계 큐벳으로 옮기고 모든 기포를 제거해야 한다.
평가
하기 공식에 따라 얻은 흡광도 값을 정규화한다:
400 A = 100 X 400 A 측정 /m
상기 식에서,
400 A는 400 nm에서 정규화된 흡광도 값이고;
400 A 측정 은 400 nm에서 얻은 흡광도 값이고;
m은 샘플의 무게(mg)이다.
바람직하게는, HMO는 5 중량% 미만의 수분 함량을 갖는다. 생성물 회수를 최적화하기 위해, 바람직하게는 HMO는 3.0 초과의 pH를 갖고, 더 바람직하게는 HMO는 4.0 초과의 pH를 갖는다. 전형적으로, 이것은 간접 건조 단계 전에 HMO-함유 스트림의 pH를 3.0 초과로 조정함으로써 달성된다.
한 양태에서, 본 개시내용은 (a) 바이오매스를 포함하는 HMO-함유 발효 브로쓰를 제공하는 단계; (b) 발효 브로쓰를 분리하여 분리된 HMO-함유 스트림 및 바이오매스 폐기물 스트림을 형성하는 단계; (c) 분리된 HMO-함유 스트림을 정제하는 단계; (d) 분리된 HMO-함유 스트림을 농축하는 단계; 및 (e) 간접 건조 방법에 의해 상기 단계 (a) 내지 (d)의 생성물을 건조시켜 정제된 HMO 고체를 형성하는 단계를 포함하는, HMO의 회수 및 정제 방법을 제시하고, 상기 단계 (c) 및 (d)는 임의의 순서로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 단계 (b)는 원심분리, 마이크로여과, 플레이트 및 프레임 여과, 리세스드 챔버 여과, 벨트 여과, 진공 여과, 수평 금속 리프 여과, 수직 금속 리프 여과, 적층된 디스크 여과, 회전식 진공 여과 및 이들의 조합으로 수행된다.
정제 단계 (c)는 (i) 한외여과; (ii) 나노여과; (iii) 탈이온화 처리; 및 (iv) 탈색 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있고, 하위 단계 (i) 내지 (iv)는 임의의 순서로 수행될 수 있다. 탈이온화 처리 단계 (iii)은 이온 흡착 또는 이온 교환 중에서 선택될 수 있다. 탈색 단계를 수행하는 경우, 이는 바람직하게는 활성탄, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 및 작용화될 수 있는 흡착 수지 중 하나 이상을 사용하여 수행되고, 여기서 단계는 임의의 순서로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 단계 (d)는 증발, 역삼투 분리 및 나노여과 중 하나 이상으로부터 선택되고, 여기서 하위 단계는 임의의 순서로 수행될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 HMO 분리 공정의 성능을 추가로 상세하게 설명한다. 당업자는 본 발명의 사상 및 청구범위의 범주 내에 있는 수많은 변형을 인식할 것이다.
실시예 1 및 2는 HMO의 고온 분해 효과를 입증한다.
실시예 1
프라이스랜드 캠피나(Friesland Campina)로부터 에퀴발(Aequival) 2'-FL로 시판되는 분말 2'-푸코실락토스("2'-FL")를 물과 혼합하여 50 중량% 혼합물을 형성하였다. 혼합물을 3개의 알루미늄 트레이에 도포하였다. 알루미늄 트레이 중 하나는 80℃에서 129분 동안, 두 번째 트레이는 95℃에서 110분 동안, 세 번째 트레이는 120℃에서 51분 동안 가열하였다. 가열 후, 건조된 샘플 각각의 2'-FL 농도를HPAEC-PAD에 의해 측정하였다. 또한, 각각의 건조된 샘플에 대해 분광광도 측정법에 의해 438 nm에서 10% 용액의 색상을 측정하였다. 2'-FL 농도 및 색상은 원래 에퀴발 2'-FL 분말의 3개 샘플에서 유사하게 측정하였다. 시험 결과는 표 5에 제시되어 있다.
| 2'-FL 농도(mg/g) | 438 nm에서 10% 용액의 색상 | |
| 시작 분말 #1 | 792 | 0.012 |
| 시작 분말 #2 | 803 | 0.010 |
| 시작 분말 #3 | 811 | n.d.(측정되지 않음) |
| 80 ℃, 129 분 | 759 | 0.017 |
| 95 ℃, 110 분 | 729 | 0.043 |
| 120 ℃, 51분 | 710 | 0.065 |
표 5의 데이터는 2'-FL 분해가 더 높은 건조 온도에서 발생함을 나타낸다. 또한, 건조 온도가 높을수록 색상이 상응하게 증가한다.
실시예 2
실시예 1에서 건조 및 시험된 2'-FL 분말을 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분석하여 가열에 따른 고체 성분의 변화를 확인하였다. 이러한 결과는 표 6에 제시되어 있다.
| 원래의 분말 |
80℃에서 가열된 분말 | 95℃에서 가열된 분말 | 120℃에서 가열된 분말 | ||
| 피크 이름 | 체류 시간 | 상대 면적 | 상대 면적 | 상대 면적 | 상대 면적 |
| 분 | % | % | % | % | |
| 푸코스 | 2.09 | 0.08 | 0.63 | 1.52 | 1.90 |
| 글루코스-갈락토스 | 3.74 | 0.56 | 1.13 | 1.59 | 1.69 |
| 락토스 | 6.92 | 1.18 | 1.31 | 1.14 | 0.94 |
| 락툴로스 | 7.16 | 1.04 | 3.30 | 4.68 | |
| 2'-FL | 8.48 | 96.05 | 93.90 | 90.47 | 88.80 |
표 6의 데이터는 더 높은 가열 온도를 수반하는 2'-FL 수준의 감소와 함께 당 푸코스, 글루코스-갈락토스 및 락툴로스가 증가함을 나타낸다. 락토스는 다소 감소하는 경향이 있다.
실시예 3
드럼 건조기를 사용하여 건조된 2'-FL 샘플에 대한 pH 증가 효과를 평가하기 위해, 50 중량%의 고체 농도에서 실시예 1에서와 같이 2개의 1-리터 2'-FL 샘플을 제조하였다. 샘플 중 하나의 pH를 부식제(caustic)를 사용하여 4.4로 조정하였다. 다른 샘플의 pH는 부식제를 사용하여 6.6으로 조정하였다. 그런 다음, 드럼 건조기 시험은 0.6 rpm의 회전 속도로 작동하는 110℃의 드럼 온도에서 드럼 건조기에서 수행하였다. 건조된 샘플을 HPLC에 의해 2'-FL 농도에 대해 시험했다. 그 결과를 표 7에 나타냈다. pH가 4.4인 샘플은 비정질이었고, pH가 6.6인 샘플은 결정질이었고, 결정도는 XRPD(X-선 분말 회절)에 의해 측정하였다.
| 2'-FL 농도(MG/G) | 건조물(%) | 건조 기준 2'-FL(mg/g) | |
| 시작 분말 #1 | 803 | 95.84 | 838 |
| 시작 분말 #2 | 811 | n.d. | n.d. |
| pH 4.4 | 794 | 96.70 | 821 |
| pH 6.6 샘플 #1 | 800 | 96.34 | 830 |
| pH 6.6 샘플 #2 | 805 | 96.13 | 837 |
표 7의 데이터는 pH의 증가가 건조된 물질의 2'-FL 농도를 향상시킨다는 것을 예시한다.
실시예 4
2'-FL의 브릭스(Brix) 58 용액을 주철 드럼(드럼 직경 500 mm/드럼 길이 500 mm)이 장착된 드럼 건조기에서 약 13 L/h의 공급 속도로 50℃ 및 pH 4.5에서 침착시켰다. "브릭스"라는 용어는 수용액의 당 함량을 정의한다. 1도 브릭스는 100 g의 용액 중 1 g의 수크로스를 나타내고 용액의 강도를 질량 백분율로 나타낸다. 수크로스를 기본으로 하지만, 다른 당에 대한 적용도 동일한 방식으로 수행된다. 증기압은 3.2 bar(g)였고, 드럼 사이의 간격 설정은 0.17 mm였고, 드럼의 회전 속도는 4.5 rpm이었고, 닙 너비는 50 mm였다. 생성물은 나이프(knife)에서 백색 플레이크 및 분진(dust)으로서 수집되었고 잔류 수분은 2.13%였다. XRPD는 물질이 결정질임을 나타냈다(형태 II).
실시예 5
브릭스 50 2'-FL 용액을 홀딩 탱크에서 약 50℃로 예열한 후, 단일 구멍 공급 파이프를 사용하여 펌프에 의해 크롬 도금 이중 드럼 건조기(드럼 직경 500 mm, 길이 500 mm)로 이송했다. 증기압은 3.3 bar(g)였고, 드럼의 회전 속도는 1.2 rpm으로 설정하였고, 간격 설정은 도선(lead wire)을 사용하여 드럼에 생성물을 놓고 측정했을 때 0.2 mm로 하였다. 드럼 사이의 평균 닙 너비는 30 mm였다. 30분의 용량 시험 동안, 공정은 안정적이었고 대부분이 플레이크로 된 부분 시트가 나이프에서 얻어졌다. 잔류 수분 함량은 평균 1.13%이다. 2'FL 공급물의 금속 함량은 ICP-MS(유도 결합 플라즈마-질량 분석기)로 분석하였다. 두 번째 시험에서, 회전 속도를 2.5 rpm으로 높였다. 또한, 보다 농축된 2'FL 용액(브릭스 58)을 하기 조건에 의해 시험하였다. 증기압은 3.0 bar(g)였고, 회전 속도는 2.5 rpm(추후 실험에서 3.5 rpm으로 증가)이었고, 풀 너비는 50 mm였고, 간격 설정은 드럼에 있는 생성물로 측정했을 때 0.15 mm였다. 또한, 상기 설정에 의해, 생성물의 금속 함량을 분석했다. 표 8은 건조된 2'FL 생성물로 철과 크롬이 누출된 것을 요약한 것으로서, 건조물 함량은 1.1 내지 2.4%로 다양했다.
| 시험 | Fe(ppm) | Cr(ppm) |
| 공급물(브릭스 58) | 0.366 | 0.033 |
| 브릭스 50, 1.2 rpm | 0.994 | 0.0995 |
| 브릭스 50, 2.5 rpm | 0.83 | 0.092 |
| 브릭스 58, 2.5 rpm | 0.781 | 0.067 |
| 브릭스 58, 3.5 rpm | 0.79 | 0.053 |
드럼 건조된 고체 및 동결 건조된 공급 용액을 또한 HPAEC-PAD(PAD 검출기가 있는 디오넥스 ICS5000, 2x30 가드 컬럼이 있는 컬럼 카보팩 PA210 4x150, 용리액 A: 500 mM NaOH, 용리액 B: 물, 용리액 C: 100 mM NaOH)에 의해 분석하였다. 선택된 피크는 표 9에 제시되어 있다. 드럼 건조 시 저하가 관찰되지 않는다.
| HPAEC-PAD RT[분] |
공급 용액 동결 건조 (건조물 중량%) |
드럼 건조 고체, 2.5 rpm (건조물 중량%) |
드럼 건조 고체, 1.2 rpm (건조물 중량%) |
|
| 푸코스 | 2.36 | 0.03 | 0.03 | 0.03 |
| 갈락토스 | 4.90 | 0.02 | 0.02 | 0.02 |
| 글루코스 | 5.33 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| DFL | 9.64 | 1.75 | 1.79 | 1.81 |
| 락토스 | 11.34 | 2.17 | 2.21 | 2.21 |
| 락툴로스 | 12.44 | 0.02 | 0.02 | 0.02 |
실시예 6
6개의 5 kg 2'-FL 브릭스 58 샘플을 준비하고, 4M 가성 용액 또는 4M 황산을 사용하여 pH를 4.66에서 다양한 값으로 조정하였다. 시험된 pH 범위는 5.85와 4.03 사이에서 다양했고, 공급 용액은 주변 조건(18 내지 20℃)에 있었다. 용액을 펌프를 사용하여 홀딩 탱크로부터 주철제 이중 드럼 건조기로 이송하였고 단일 구멍 분배 파이프를 사용하여 드럼 사이의 공간으로 분배하였다. 실험을 하기 설정에 의해 시작하였다: 3.0 bar(g) 증기압, 1.5 rpm 회전 속도, 0.15 mm 간격 및 30 내지 35 mm의 풀 너비. 수집 바구니를 사용하여 각 시험에서 생성물을 수집하고 ICP-MS로 분석했다. 샘플의 철 함량은 66.9 ppm에서 10.5 ppm으로 감소하여 명확한 시간 효과를 관찰할 수 있었다. 두 번째 일련의 시험은 회전 속도가 다양한 동일한 브릭스 58 2'FL 용액을 사용하여 수행하였다. 공급 용액의 pH(4.66)는 변경되지 않았다. 증기압은 3.2 bar(g)였고, 드럼 속도는 1.5 rpm 내지 9.5 rpm으로 변하였고 닙 너비는 30 내지 35 mm였다. 액체 공급 용액은 용적식 펌프를 사용하여 드럼 사이에 공급하였다. 표 10은 건조된 고체의 건조물 함량이 1.3% 내지 2.4%로 변하는 각각의 rpm 설정에 대해 생성물에서 측정된 철 및 크롬 함량을 나타낸다.
| 회전 속도(rpm) | Fe(ppm) | Cr(ppm) |
| 공급물 분석 | 0.34(건조물에 대해) | 0.09(건조물에 대해) |
| 1.5 | 6.43 | 0.07 |
| 3.2 | 3.07 | 0.04 |
| 4.7 | 3.65 | 0.09 |
| 5.7 | 2.58 | 0.05 |
| 9.5 | 3.75 | 0.06 |
표 9 및 10의 결과는 크롬 도금 드럼이 주철 드럼보다 생성물로의 금속 누출에 대해 더 내성이 있음을 입증한다.
실시예 7 및 8은 간접 건조기 구성(주철 대 크롬 도금)이 생성물 색상에 미치는 영향을 입증한다.
실시예 7
2'-FL 및 디푸코실락토스(총 고체 함량에 대해 14.5% DFL) 둘 다를 함유하는 혼합물 생성물의 브릭스 58 용액은 농도가 브릭스 45가 되도록 탈이온수를 첨가하여 희석하였다. 용액 pH를 pH 4.3에서 측정하고, 주변 조건에서 펌프에 의해 이중 드럼 건조기(주철, 직경 500 m, 너비 500 mm)로 이송된다. 생성물은 약간 점성이고 투명하였다. 이 시험 동안의 증기압은 2.8 bar(g)로 설정되고, 드럼 속도는 분당 5.1회전으로 설정되고, 드럼 사이의 간격 설정은 0.15 mm이고, 풀 너비는 최대 10 mm였다. 일정한 최소 공급으로 인해 나이프에서 시트가 발생했다. 드럼에 약간의 변색이 있었다. 생성물을 드럼에서 긁어 모아 수집 바구니에 수집했다. 동일한 작동 조건을 사용하여 두 번째 실험을 수행했지만, 액체 공급 pH는 4.3에서 5.2로 조정하였다. 생성된 물질에 대한 색상 결과는 표 11에 제시되어 있다. pH 5.2 공급 용액 및 동결 건조된 공급 용액을 처리하여 건조된 고체도 HPAEC-PAD(PAD 검출기가 있는 디오넥스 ICS5000, 2x30 가드 컬럼이 있는 카보팩 PA210 4x150 컬럼, 용리액 A: 500 mM NaOH, 용리액 B: 물, 용리액 C: 100 mM NaOH)로 분석했다. 선택된 피크는 표 12에 제시되어 있다. 드럼 건조 시 저하가 관찰되지 않는다.
실시예 8
크롬 도금 드럼을 사용한 것을 제외하고는 실시예 7과 동일하게 2'-FL 및 DFL의 용액을 제조하였다. 두 가지 시험을 수행하였다. 첫 번째 시험은 pH 4.3에서 브릭스 58의 공급물을 사용하였고, 두 번째 시험은 동일한 pH 4.3에서 브릭스 45의 희석된 공급물로 수행하였다. (차가움, 약 8℃) 생성물을 홀딩 탱크에 넣은 후 필요에 따라 액체를 원하는 값으로 희석한다. 그 후, 와우케샤(Waukesha) 용적식 펌프와 8 mm 구멍이 있는 공급 라인을 사용하여 생성물을 풀에 담았다. 간격은 0.15 mm(생성물로 측정한 0.21 mm)로 설정되고, 증기압은 2.8 bar(g)이고, 드럼의 회전 속도는 5.1 rpm이었다. 생성물을 수집 바구니에 수집하고, 색상을 측정했다. 생성된 물질에 대한 색상 결과는 표 11에 제시되어 있다.
| 400 A | |
| 2'FL-DFL 드럼 건조 주철 pH 4.3 브릭스 45 | 0.102 |
| 2'FL-DFL 드럼 건조 주철 pH 5.2 브릭스 45 | 0.291 |
| 2'FL-DFL 드럼 건조 크롬 도금 pH 4.3 브릭스 45 | 0.009 |
| 2'FL-DFL 드럼 건조 크롬 도금 pH 4.3 브릭스 57 | 0.015 |
| HPAEC-PAD | 동결 건조된 공급 용액 | 드럼 건조 고체 주철 드럼 pH 5.2, 브릭스 45 | |
| RT[분] | (건조물 중량 %) | (건조물 중량 %) | |
| 푸코스 | 2.36 | 0.00 | 0.01 |
| 갈락토스 | 4.90 | 0.00 | 0.00 |
| 글루코스 | 5.33 | 0.04 | 0.03 |
| DFL | 9.64 | 14.64 | 14.57 |
| 락토스 | 11.34 | 0.39 | 0.41 |
| 락툴로스 | 12.44 | 0.00 | 0.00 |
실시예 9
브릭스 33을 갖는 락토-N-테트라오스(LNT)의 공급 용액을 50℃까지 가열하고 이중 드럼 건조기(주철, 치수 직경 500 mm, 길이 50 mm)로 변위 펌프를 사용하여 펌핑하였다. 회전 속도는 1.5 rpm이었고, 증기압은 3.2 barg였고, 드럼 사이의 간격 설정은 0.10 mm였다. 닙 너비는 약 50 mm였다. 상기 설정에 의해, 생성물이 나이프에서 부분적으로 닫힌 시트를 형성하는 에스 쇼트 시험(s short test)을 수행하였다. 생성물의 잔류 수분 함량은 4.57%였다. 생성물은 90% LNT 형태 D 및 10% LNT 형태 B로 구성된 대부분 결정질인 것으로 측정되었다.
실시예 10
브릭스 40을 갖는 락토-N-네오테트라오스(LNnT)의 용액을 황산을 첨가하여 4.0으로 조정하였다. 생성물의 약간의 산성으로 인해 크롬 도금 드럼(직경 500 mm, 길이 500 mm)이 있는 이중 드럼 건조기에서 시험을 수행했다. 가열된 홀딩 탱크에서 드럼 사이에 생성물을 공급하였다. 이 시험의 설정은 다음과 같다. 3.0 bar(g); 3.5 rpm의 회전 속도; 40 mm의 닙 너비. 공정은 나이프에서 부분적인 시트와 플레이크로 안정적이었다. 잔류 수분은 6.1%로 측정하였다. 생성물의 건조물 함량을 증가시키기 위해 회전 속도를 2.5 rpm으로 감소시킨 것을 제외하고 동일한 설정 및 환경으로 두 번째 시험을 수행했다. 회전 속도가 낮을수록 나이프에서 더 많은 플레이크와 분말이 생성된다. 잔류 수분은 약 5.5%이다.
표 10의 데이터는 크롬 도금 드럼이 주철 드럼에 비해 훨씬 더 적은 생성물 발색을 야기함을 입증한다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 다른 특징, 이점 및 양태는 전술한 개시내용을 읽은 후 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다. 이와 관련하여, 본 발명의 특정 양태가 상당히 상세하게 설명되었지만, 이들 양태의 변형 및 수정은 설명되고 청구되는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 영향을 받을 수 있다.
Claims (25)
- (a) 바이오매스를 포함하는 인간 모유 올리고당(HMO)-함유 발효 브로쓰(broth)를 제공하는 단계;
(b) 발효 브로쓰를 분리하여 분리된 HMO-함유 스트림(stream) 및 바이오매스 폐기물 스트림을 형성하는 단계;
(c) 분리된 HMO-함유 스트림을 정제하는 단계;
(d) 분리된 HMO-함유 스트림을 농축하는 단계; 및
(e) 간접 건조 방법에 의해 단계 (a) 내지 (d)의 생성물을 건조시켜 정제된 HMO를 형성하는 단계
를 포함하는, HMO의 회수 및 정제 방법으로서, 단계 (c) 및 (d)가 임의의 순서로 수행될 수 있는, HMO의 회수 및 정제 방법. - 제1항에 있어서,
단계 (b)가 원심분리, 마이크로여과, 플레이트(plate) 및 프레임(frame) 여과, 리세스드 챔버(recessed chamber) 여과, 벨트 여과, 진공 여과, 수평 금속 리프(leaf) 여과, 수직 금속 리프 여과, 적층 디스크 여과, 회전식 진공 여과 또는 이들의 조합에 의해 수행되는, HMO의 회수 및 정제 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
단계 (c)가
(i) 한외여과;
(ii) 나노여과;
(iii) 탈이온화 처리; 및
(iv) 탈색
중 하나 이상으로부터 선택되는, HMO의 회수 및 정제 방법으로서, 상기 하위 단계 (i) 내지 (iv)가 임의의 순서로 수행될 수 있는, HMO의 회수 및 정제 방법. - 제3항에 있어서,
하위 단계 (iv)가 활성탄, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 및 작용화될 수 있는 흡착 수지 중 하나 이상의 방법에 의해 수행되는, HMO의 회수 및 정제 방법으로서, 임의의 순서로 수행되는 HMO의 회수 및 정제 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (d)가 증발, 역삼투 여과 및 나노여과 중 하나 이상으로부터 선택되는, HMO의 회수 및 정제 방법. - 제5항에 있어서,
증발이 하강 필름(falling film) 증발, 상승 필름(climbing film) 증발, 회전 증발 및 이들의 조합으로부터 선택되는, HMO의 회수 및 정제 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (d)와 (e) 사이에 열처리 단계를 추가로 포함하는, HMO의 회수 및 정제 방법. - 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
마이크로여과가 0.2 내지 2.0 μm 범위의 컷 오프(cut off)를 갖는, HMO의 회수 및 정제 방법. - 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
한외여과가 300 kD 이하 내지 1 kD의 MWCO를 갖는 막을 이용하는, HMO의 회수 및 정제 방법. - 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
나노여과가 1000 돌턴(dalton) 이하 내지 200 돌턴 이하의 MWCO를 갖는 막을 이용하는, HMO의 회수 및 정제 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
간접 건조 방법이 드럼(drum) 건조, 패들(paddle) 건조, 진공 드럼 건조 및 접촉 건조로부터 선택되는, HMO의 회수 및 정제 방법. - 제11항에 있어서,
간접 건조 방법이 드럼 건조인, HMO의 회수 및 정제 방법. - 제12항에 있어서,
드럼 건조가 3분 미만의 건조기 체류 시간을 갖는, HMO의 회수 및 정제 방법. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
HMO가 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 2',3-디푸코실락토스, 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-네오푸코펜타오스, 락토-N-푸코펜타오스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토-N-푸코펜타오스 V, 락토-N-네오푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸코헥사오스 I, 락토-N-디푸코헥사오스 II, 6'-갈락토실락토스, 3'-갈락토실락토스, 락토-N-헥사 오스 및 락토-N-네오헥사오스, 시알릴락토-N-테트라오스 a, 시알릴락토-N-테트라오스 b, 시알릴락토-N-테트라오스 c, 디시알릴락토-N-테트라오스, 3' 및 6' 시알릴락토스 및 이들의 혼합물로부터 선택되는, HMO의 회수 및 정제 방법. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
간접 건조 단계 후에 밀링 단계를 추가로 포함하는, HMO의 회수 및 정제 방법. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
간접 건조 전에 HMO pH가 4.0 이상으로 조정되는, HMO의 회수 및 정제 방법. - (i) 2% 미만의 락툴로스;
(ii) 3% 미만의 푸코스;
(iii) 1% 미만의 갈락토스; 및
(iv) 3% 미만의 글루코스
중 하나 이상을 포함하는, 간접 건조에 의해 생성된 인간 모유 올리고당. - 제17항에 있어서,
0.2 미만의 용액 내 색상을 갖는, 인간 모유 올리고당. - 제17항 또는 제18항에 있어서,
간접 건조가 60℃ 이상의 드럼 온도에서 드럼 건조기에 의해 수행되는, 인간 모유 올리고당. - HMO-함유 스트림과 접촉하는 크롬 도금된 표면을 포함하는 드럼 건조기에서 HMO-함유 스트림을 건조시키는 것을 포함하는, HMO의 제조 방법.
- 제20항에 있어서,
HMO가 100 ㎛ 초과의 d50을 갖는, 제조 방법. - 제20항 또는 제21항에 있어서,
HMO가 30 미만의 카르 지수(Carr index)를 갖는, 제조 방법. - 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
HMO가 10% 미만의 미세분(fine) 함량을 갖는, 제조 방법. - (a) 바이오매스를 포함하는 HMO-함유 발효 브로쓰를 제공하는 단계;
(b) 발효 브로쓰를 분리하여 분리된 HMO-함유 스트림 및 바이오매스 폐기물 스트림을 형성하는 단계;
(c) 임의의 순서로 수행되는 한외여과, 나노여과, 이온 교환 처리 및 탈색 중 하나 이상으로부터 선택되는 단계에서 분리된 HMO-함유 스트림을 정제하는 단계;
(d) 분리된 HMO-함유 스트림을 농축하는 단계; 및
(e) 간접 건조 방법에 의해 단계 (a) 내지 (d)의 생성물을 건조시켜 정제된 HMO를 형성하는 단계
를 포함하는, HMO의 회수 및 정제 방법으로서, 단계 (c) 및 (d)가 임의의 순서로 수행될 수 있는, HMO의 회수 및 정제 방법. - (a) 바이오매스를 포함하는 HMO-함유 발효 브로쓰를 제공하는 단계;
(b) 발효 브로쓰를 분리하여 분리된 HMO-함유 스트림 및 바이오매스 폐기물 스트림을 형성하는 단계;
(c) 임의의 순서로 수행되는 한외여과, 나노여과, 이온 흡착 및 탈색 중 하나 이상으로부터 선택되는 단계에서 분리된 HMO-함유 스트림을 정제하는 단계;
(d) 분리된 HMO-함유 스트림을 농축하는 단계; 및
(e) 간접 건조 방법에 의해 단계 (a) 내지 (d)의 생성물을 건조시켜 정제된 HMO를 형성하는 단계
를 포함하는, HMO의 회수 및 정제 방법으로서, 단계 (c) 및 (d)가 임의의 순서로 수행될 수 있는, HMO의 회수 및 정제 방법.
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