KR102137027B1 - 미생물 발효로부터 중성 모유 올리고당(HMOs)의 효율적인 정제공정 - Google Patents

미생물 발효로부터 중성 모유 올리고당(HMOs)의 효율적인 정제공정 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미생물 발효에 의해 생성되는 중성 모유 올리고당(HMO)의 간단한 정제공정에 대하여 기재하고 있다. 본 공정은 양이온교환기 처리, 음이온교환기 처리 및 나노여과 및/또는 전기투석 단계의 조합을 이용하며, 이는 고순도로 많은 양의 중성 모유 올리고당을 효율적으로 정제할 수 있게 한다. 중성 모유 올리고당의 발효 생성물에 사용되는 현재의 정제공정에 반해서, 본 공정은 크로마토그래피 분리의 필요없이 모유 올리고당의 제공을 가능하게 한다. 이렇게 정제된 모유 올리고당은 분무건조에 의해 결정성 물질 또는 무균여과된 농축물로써 고체 형태로 수득될 수 있다. 제공되는 모유 올리고당은 사용된 재조합 미생물 균주로부터 발생되는 단백질 및 재조합 물질을 함유하지 않으며, 따라서 식품, 의료 식품 및 사료(예를 들어, 애완동물용 사료) 적용 용도로 매우 적합하다.

Description

미생물 발효로부터 중성 모유 올리고당(HMOs)의 효율적인 정제공정{PROCESS FOR EFFICIENT PURIFICATION OF NEUTRAL HUMAN MILK OLIGOSACCHARIDES (HMOs) FROM MICROBIAL FERMENTATION}
본 발명은 미생물 발효에 의해 생성되는 중성 모유 올리고당(HMOs)의 간단한 정제공정에 대하여 기재하고 있다. 본 공정은 양이온교환기 처리, 음이온교환기 처리 및 나노여과 및/또는 전기투석 단계의 조합을 이용하며, 이는 고순도로 많은 양의 중성 모유 올리고당을 효율적으로 정제할 수 있게 한다.
중성 모유 올리고당의 발효 생성물에 사용되는 현재의 정제공정에 반해서, 본 공정은 크로마토그래피 분리의 필요없이 모유 올리고당의 제공을 가능하게 한다. 이렇게 정제된 모유 올리고당은 분무건조에 의해 결정성 물질 또는 무균여과된 농축물로써 고체 형태로 수득될 수 있다. 제공되는 모유 올리고당은 사용된 재조합 미생물 균주로부터 발생되는 단백질 및 재조합 물질을 함유하지 않으며, 따라서 식품, 의료 식품 및 사료(예를 들어, 애완동물용 사료) 적용 용도로 매우 적합하다.
모유는 탄수화물, 지방, 단백질, 비타민, 미네랄 및 미량 원소의 복합 혼합물을 나타낸다. 지금까지 가장 주된 분획은 탄수화물로 나타내어지며, 이는 추가적으로 락토오스 및 더 많은 복합 올리고당으로 나누어질 수 있다. 락토오스는 에너지원으로 이용되는 반면에, 복합 올리고당은 유아에 의해 대사되지 않는다. 복합 올리고당의 분획은 전체 탄수화물 분획의 최대 1/10을 차지하고, 약 150개의 상이한 올리고당으로 이루어진다. 이러한 복합 올리고당의 발생 및 농도는 인간 특이적이며, 따라서 사육되는 낙농 동물(dairy animal)과 같은 다른 포유동물의 젖에서는 다량으로 발견될 수 없다.
모유 내 이러한 복합 올리고당의 존재는 이미 장시간 동안 알려져있으며, 상기 올리고당의 생리작용은 수십 년 동안 의학 연구의 대상이었다(Gura, T.(2014) Nature's first functional food. Science 345(6198) 747-749). 더욱 풍부한 모유 올리고당의 일부에 대한 특정 기능이 이미 확인되었다(Bode, L.(2012) Human milk oligosaccharides: every baby needs a sugar mama. Glycobiology 22(9), 1147-1162.; Bode L, Jantscher-Krenn E(2012) Structure-function relationships of human milk oligosaccharides. Adv Nutr 3(3) 383S-391S; Morrow AL, Ruiz-Palacios GM, Altaye M, Jiang X, Guerrero ML, Meinzen-Derr JK, Farkas T, Chaturvedi P, Pickering LK, Newburg DS(2004) Human milk oligosaccharides are associated with protection against diarrhea in breast-fed infants. J Pediatr 145(3) 297-303).
개별적인 모유 올리고당의 순수한 분획 수득의 제한된 공급 및 어려움은 이러한 복합 분자의 일부에 대한 화학적 경로의 개발로 이어진다. 그러나, 화학적 합성, 효소적 합성 또는 발효에 의한 모유 올리고당의 합성은 입증되어야 할 과제이다. 오늘날까지도 최소한의 대규모 수량뿐만 아니라 식품 적용을 위한 충분한 품질이 제공되지 못하고 있다. 이와 관련하여, 특히 모유 올리고당(예를 들어, 2'-푸코실락토오스; WO 2010/115935 Al 참조)에 대한 화학적 합성 경로는 여러 유해한 화학물질을 수반하며, 이는 최종 생성물을 오염시키는 위험요소를 부과한다.
모유 올리고당의 화학적 합성과 관련된 과제에 기인하여, 여러 효소적 방법 및 발효적 접근이 개발되었다(Miyazaki et al.,(2010) Methods in Enzymol . 480, 511-524; Murata et al.,(1999) Glycoconj . J. 16, 189-195; Baumgartner, F. et al.,(2013) Microb. Cell Fact. 12, 40; Lee et al.,(2012) Microb . Cell Fact. 11, 48; US 7,521,212 Bl 또는 Albermann et al.,(2001) Carbohydr . Res. 334(2) p 97-103). 그러나, 이러한 방법들은 올리고당의 복합 혼합물을 수득한다. 즉, 목적하는 생성물이 락토오스와 같은 출발물질, 각각의 단당류 및 폴리펩티드와 같은 생합성 중간체와 기질로 오염되는 것이다.
상기 복합 혼합물로부터 개별의 올리고당 생성물을 정제하기 위한 종래 기술의 공정은 기술적으로 복잡하며, 또한 식품 적용에 비경제적이다. 유청(whey) 또는 당밀(molasses)과 같은 복합 혼합물로부터 이당류 락토오스 또는 수크로오스를 정제하기 위해서, 공업적 규모의 공정이 개발되었으며, 이는 다수의 결정화(crystallization)를 수반한다. 언급된 방법은 정교하지만 낮은 수득률을 야기한다는 단점이 있다.
미생물 발효로부터 복합 올리고당, 예컨대 특정 모유 올리고당의 정제를 위해 현재까지 선택되는 방법은 겔 여과 크로마토그래피이다. 겔 여과 크로마토그래피는 효율적으로 확장(scaled up)될 수 없으며, 연속적인 작업에 부적합하다는 단점이 있다. 따라서, 겔 여과 크로마토그래피는 경제적이지 않으며, 특정 모유 올리고당, 예컨대 2'-푸코실락토오스 또는 락토-N-테트라오스를 식품 또는 동물 사료(예를 들어, 애완동물용 사료) 같은 다른 적용 용도에 합리적인 금액과 품질로 제공할 수 없게 한다.
동물 사료 또는 애완동물용 사료로의 적용은 다른 포유동물 또한 모유와 동일하거나 유사한 중성 복합 올리고당을 함유한다는 근거에 이해관계가 있다(예를 들어, 2'-푸코실락토오스는 개, 돼지, 침팬지의 젖에서도 발견된다)(Castanys-Munzo, E., Martin, J.M & Prieto, P.A.(2013) 2'-fucosyllactose: an abundant, genetically determined soluble glycan present in human milk. Nutr. Rev. 71(12) 773-789).
다른 문제는 발효물과 재조합 물질의 오염을 야기하는 미생물 발효 내 재조합 균주(재조합 박테리아 또는 효모 균주)의 사용으로 나타난다. 그러나, 재조합 DNA 또는 단백질과의 오염은 오늘날, 규제 기관 및 소비자들에게 허용되지 않는다. 특히 재조합 DNA 분자에 대한 검출 한계는 매우 낮다. qPCR에 기반 검출이 사용되는 경우, 이는 현재 검출을 위한 골드 스탠다드(gold standard)로 간주되어 사용되며, 작은 단일 DNA 분자조차 검출이 가능하다. 또한, 단백질은 알러지 반응의 위험이 있으며, 그러므로 목적하는 올리고당 생성물로부터 효율적으로 제거되어야 한다.
전기투석(ED)은 투석 및 전기분해가 조합된 기술을 나타내며, 용액 내에 이온의 분리 또는 농축에 사용될 수 있으며, 이는 반투막을 통한 이온의 선택적 전자 이동에 기반한다. 전기투석의 최초의 산업적 적용으로는 1960년대 초기 유아용 분유에 사용된 치즈 유청의 탈회화(demineralization)가 있다. 추가적으로 개발된 전기투석의 적용으로는 와인, 포도액, 사과주스 및 오렌지주스와 같은 음료의 pH 조절을 포함한다.
식수의 생산을 위한 기수(brackish water)의 탈염화(desalination)와 유아용 분유의 생산을 위한 우유 유청의 탈회화는 오늘날 가장 큰 적용분야를 나타낸다.
기본 전기투석의 원리는 직류발전기에 연결된 이온의 전도를 위한 전해질에 잠기는 전극 쌍으로 구성되는 전해전지(electrolytic cell)로 이루어진다. 직류발전기의 양극에 연결된 전극을 애노드(anode), 음극에 연결된 전극을 캐소드(cathode)라고 한다. 또한 전해질 용액은 각각 애노드과 캐소드 쪽으로 이동하는 음전하 및 양전하 이온의 이동으로 인한 전류 흐름을 지원한다. 전기투석에 사용되는 막은 기본적으로 음 전하기 또는 양 전하기에 의한 다공성 이온 교환 수지의 시트이며, 따라서 각각, 양이온성 또는 음이온성 막이라 한다. 이온교환기 막은 보통 디비닐벤젠과 가교된 적합한 작용기(예컨대, 각각 양이온 또는 음이온성 막에 대한 설폰산 또는 사차암모늄기)를 수반하는 폴리스티렌으로 제조된다. 전해질로써, 소듐 클로라이드 또는 소듐 아세테이트, 소듐 프로피오네이트 등이 사용될 수 있다. 이어서, 전기투석조(electrodialysis stack)는 음이온 및 양이온성 막이 두 개의 전극 블럭 사이 필터 프레스에서 평행이 되는 방식으로 조립되며, 이온 결핍(ion depletion)이 진행되는 스트림(stream)이 이온 과다(ion enrichment)가 진행되는 스트림으로부터 잘 분리된다(두 용액은 (이온 결핍이 진행되는) 희석액 및 (이온 과다가 진행되는) 농축물으로도 불린다). 전기투석 공정의 핵심은 막 스택(membrane stack)이며, 이는 스페이서(spacers)에 의해 분리되는 여러 음이온 및 양이온 교환막으로 이루어지고, 두 개의 전극 사이에 설치된다. 직접적 전류(direct electric current)를 적용함으로써, 음이온 및 양이온이 (탈염된) 희석액(diluate)과 농축 스트림을 생성하는 전극 쪽으로 막을 통해 이전된다.
일반적으로, 사용되는 막의 기공 크기는 두 스트림 간의 종종 높은 농도 차이에 의해 구동되는 농축 스트림의 희석액으로부터 생성물의 확산을 방지하기 위해 비교적 작다. 바이오매스의 분리 이후에, 단백질 및 특히 재조합 DNA 분자(전체 게놈의 크기에서)는 목적하는 생성물로부터 정량적으로 제거되어야 한다. 이러한 대형 분자(모유 올리고당의 분자의 크기에 비하여)의 모든 가능한 전기투석시에, 오히려 오랫동안 확실하게 농축물로의 희석액으로부터 원하는 생성물의 상당한 손실을 수반할 것이다.
정용여과(diafiltration)는 막 투과성 구성성분을 "세척(wash out)" 또는 제거하기 위해 용액에 신선한 물을 첨가하는 것을 포함하는 공정이다. 따라서, 정용여과는 하나 이상의 종(species)이 효율적으로 유지되고 다른 종이 막 투과성인 적합한 막을 사용하여 분자 크기를 기반으로 구성성분을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 나노여과막을 사용하는 정용여과는 염으로부터 저분자 화합물을 분리하는데 효과적이다. 일반적으로, 나노여과막은 150 내지 300달톤의 범위에서 분자량 컷-오프를 갖는다. 오늘날, 나노여과(NF)는 낙농업에서 유청의 농축 및 탈회화를 위해서 널리 사용된다. 나노여과는 이미 모유 올리고당 분획 형태 모유의 농축(enrichment)에 이용되고 있다. 이러한 접근법에서, 나노여과는 락토오스의 효소분해와 조합하여 사용되어 우유 락토오스로부터 모유 올리고당 분획을 분리한다(Sarney D.B, Hale, C, Frankel, G & Vulfson, E.N.(2000) A novel approach to the recovery of biological active oligosaccharide from milk using a combination of enzymatic treatment and nanofiltration. Biotechnol. Bioeng 69, 461-467).
미생물 발효로부터 식용 모유 올리고당의 효율적인 정제를 위해 개발된 공정에서, 목적하는 생성물을 농축하고, 또한 막 투과성 염을 제거하기 위해서 나노여과가 도입된다.
이러한 종래 기술로부터, 기술적 과제는 중성 모유 올리고당을 많은 양, 고순도 및 우수한 수득률로 제공하기 위한 신규한 공정을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제는 제 1항에 따른 공정, 제 15항에 따른 모유 올리고당(HMOs) 및 제 19항에 따른 모유 올리고당의 용도에 의해 해결된다. 종속항은 바람직한 실시예를 나타낸다.
본 발명은 미생물 발효에 의해 수득되는 발효액으로부터 배치 방식(batch manner) 또는 연속 방식(continuous manner)으로 중성 모유 올리고당(HMOs)을 정제하는 공정으로서, 상기 발효액이 중성 모유 올리고당, 바이오매스(biomass), 배지 성분 및 오염물질을 포함한다. 상기 발효액 내에 중성 모유 올리고당의 순도는 <80%이다.
공정 동안, 발효액은 다음의 정제 단계에 적용된다:
i) 발효액으로부터 바이오매스를 분리하는 단계;
ii) 양으로 하전된 물질의 제거를 위해 양이온교환기 처리하는 단계;
iii) 음으로 하전된 물질의 제거를 위해 음이온교환기 처리하는 단계; 및
iv) (중성 모유 올리고당의 농축 및/또는 정용여과를 포함하거나 이들로 이루어진) 나노여과 단계 및/또는 (특히 염 및 다른 저분자 화합물을 제거하기 위한) 전기투석 단계.
무세포 발효액에 존재하는 오염물질은 예를 들어 목적하는 중성 모유 올리고당 이외에 다른 올리고당이며, 1가 및 2가 염, 아미노산, 폴리펩타이드, 단백질, 유기산, 핵산 등과 같다. 목적하는 중성 모유 올리고당을 정제된 용액 내 ≥80%의 순도로 수득할 수 있다.
본 출원인은 본 발명의 정제공정으로, 미생물 발효로부터 중성 모유 올리고당을 효율적으로 정제할 수 있고, 이는 식품 및 사료 적용에 적합한 순도의 모유 올리고당이 제공된다는 것을 발견하였다. 또한, 본 공정은 크로마토그래피 분리 단계를 필요로 하지 않기 때문에 매우 비용 효과적이다. 또한, ≥80%의 순도는 전기투석 공정 또는 나노여과 공정이 단계 iv)에서 수행되거나, 두 단계가 연속적으로 수행되는지에 따라 달성된다는 것을 발견하였다.
본 발명에 따른 공정의 일 이점으로는 사용되는 재조합 미생물 발효 균주로부터 DNA 및 단백질을 함유하지 않는 목적하는 중성 모유 올리고당이 수득된다는 것이다. 특히 양이온교환기 처리(단계 ii)의 수행은 예를 들어, 양으로 하전된 단백질과 같이 양으로 하전된 물질을 제거할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명의 방법은 양이온교환기 처리를 실행하지 않는 종래 기술에 공지된 통상적인 정제방식에 비해 적은 양의 양으로 하전된 오염물질을 포함하는 모유 올리고당을 제공한다. 이는 (양성자 형태인) 양이온교환기로 (바람직하게는 한외여과에 의해) 바이오매스로부터 분리된 발효액을 통과한 이후에 수득되는 용액은 안정하며, 실온 또는 냉각하에서 몇 주 동안 보관될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 수득되는 중성 모유 올리고당은 재조합 물질을 함유하지 않으며, 이는 최대 50 증폭 사이클로 정량적 PCR에 의해 판단된다. 더욱이, 본 발명에 따른 공정으로 수득되는 생성물은 소량의 단백질만이 있거나, 또는 단백질이 결여된다는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 중성 모유 올리고당 정제는 (무세포 발효 배지로부터 모유 올리고당 농축물로 확인된) 정제된 모유 올리고당의 수득률 >70%(아직까지 정확이 확인되지 않음, 임의적으로 >75%)로 매우 효율적이다.
따라서, 복합 가공(hybrid process)은 바이오매스, 이온교환기 및 나노여과 및/또는 전기투석을 분리하는 단계를 포함하고, 바람직하게는 재조합 발효 균주를 이용한 발효 공정으로부터 형성되는 재조합 유전물질, 내독소 및 단백질을 함유하지 않는 고순도로 중성 모유 올리고당의 효율적인 제공을 위한 활성탄소 처리를 추가적으로 포함한다.
중성 모유 올리고당은 재조합 미생물, 바람직하게는 박테리아 또는 효모, 더욱 바람직하게는 화학적 한정 배지에서 성장시킨 재조합 미생물을 이용한 미생물 발효에 의해 수득되는 발효액으로부터 정제되고, 임의적으로 단계 i)에서 분리되는 바이오매스가 미생물 발효에 재사용된다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 발효액 내에 중성 모유 올리고당의 순도는 ≤70%,≤60%,≤50%,≤40%,≤30%,≤20%,≤10% 또는 ≤5%이고/이거나, 정제된 용액은 ≥85%, 바람직하게는 ≥90%의 순도로 중성 모유 올리고당을 함유한다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 중성 모유 올리고당의 수득률은 >70%(임의적으로 >75%)이고/이거나 정제된 용액은 DNA, 단백질 및/또는 재조합 유전 물질을 함유하지 않는다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 중성 모유 올리고당은 2'-푸코실락토오스, 3-푸코실락토오스, 2',3-디푸코실락토오스, 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-네오푸코펜타오스, 락토-N-푸코펜타오스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토-N-푸코펜타오스 V, 락토-N-네오푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸코헥사오스 I, 락토-N-디푸코헥사오스 II, 6'-갈락토실락토오스, 3'-갈락토실락토오스, 락토-N-헥사오스 및 락토-N-네오헥사오스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 중성 모유 올리고당은 2'-푸코실락토오스이다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 발효액으로부터 바이오매스의 분리는
a) 바람직하게는 >500kDa, 더욱 바람직하게는 >150kDa로 바이오매스 및 물질을 분리하는 한외여과; 및/또는
b) 바람직하게는 컷-오프(cut-off) ≤100kDa, 더욱 바람직하게는 컷-오프 ≤10kDa, 더욱더 바람직하게는 컷-오프 ≤5kDa로 크로스-플로우 필터(cross-flow filter)를 통한 여과를 통해 달성되며;
바람직하게는 단계 a)가 단계 b) 이전에 시행된다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 정제 단계 ii) 내지 iv) 중 하나 이상의 단계가 공정 동안 한 번 이상 반복된다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 정제 단계 i) 내지 iv) 중 하나 이상의 단계 이후에, 활성탄소로 색소(colour giving material) 및 더 큰 올리고당(larger oligosaccharides)을 흡착하기 위해서 발효액을 한 번 이상 활성탄소 처리한다. 이 추가적인 정제 단계에 발효액을 적용하여, 색소 및 더 큰 올리고당을 발효액으로부터 제거할 수 있다.
본 발명의 공정은
a) 정제 단계 i) 내지 iv) 중 하나 이상의 단계 이후에; 또는
b) 활성탄소로 색소 및 더 큰 올리고당을 흡착하기 위한 한 번 이상의 활성탄소 처리 이후에; 또는
c) 정제 단계 i) 내지 iv) 중 하나 이상의 단계 이후에 시행되는 농축 단계 이전에;
중성 모유 올리고당을 포함하는 용액을 정용여과(diafiltration)하고/하거나 농축하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 용액을 나노여과막, 더욱 바람직하게는 ≤20Å의 크기 배제한계(size exclusion limit)를 갖는 나노여과막으로 정용여과하고/하거나 농축하고, 가장 바람직하게는 용액을 ≤15mS/cm, 바람직하게는 ≤10mS/cm, 더욱 바람직하게는 ≤5mS/cm의 전도도가 도달될 때까지 정용여과한다.
나노여과를 사용하는 정용여과는 모유 올리고당 함유 용액의 전기투석 처리 이전에 상당한 양의 오염물질을 제거하기 위한 전처리로 효율적이라는 것이 밝혀졌다. 게다가, 나노여과 또한, 한외여과 단계 이후에 저분자 오염물질의 제거에 효율적임이 밝혀졌으며, 상기 제거는 이온교환기 처리 이전에 모유 올리고당 용액을 농축 및 탈회화하는데 유용하다. 모유 올리고당의 정제에서 농축 및 정용여과를 위한 나노여과막의 사용은 낮은 에너지 및 낮은 가공 비용뿐만 아니라 감소된 열 노출로 인한 향상된 제품 품질을 야기하며, 감소된 메일라드 반응(Maillard reaction) 및 알돌 반응(aldol reaction)으로 이어진다.
단계 i) 이전 단계에서, 글리코시다아제 처리, 바람직하게는 β-글루코시다아제 처리를 발효액에 수행할 수 있고, 상기 처리는 바람직하게는
a) 불필요한 중간체, 기질 및/또는 올리고당 부산물의 분해에 적합한 하나 이상의 글리코시다아제 효소를 발현할 수 있는 미생물 균주를 첨가하고/하거나;
b) 바람직하게는 발효액에 유도물질을 첨가하고/하거나 발효액의 온도를 이동시켜, 하나 이상의 글리코시다아제 효소를 발현하는 발효 균주를 사용하고/하거나;
c) 미정제 효소 또는 정제된 효소로써 하나 이상의 글리코시다아제, 바람직하게는 하나 이상의 β-글루코시다아제를 발효액에 첨가하여 수행한다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 발효액을 정제 단계 i) 내지 iv) 중 어느 하나의 단계 이후에, 바람직하게는 정제 단계 iv) 이후에, 진공증착(vacuum evaporation) 또는 역삼투 또는 나노여과(예를 들어, ≤20Å의 크기 배제한계를 갖는 나노여과막을 통한 나노여과)를 이용하여 농축한다.
a) ≥100g/L, 바람직하게는 ≥200g/L, 더욱 바람직하게는 ≥300g/L의 농도로 농축하고/하거나;
b) 진공증착 또는 역삼투 동안, <80℃ 바람직하게는 <50℃, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 50℃, 더욱더 바람직하게는 30℃ 내지 45℃, 가장 바람직하게는 35℃ 내지 45℃의 (진공증착 또는 역삼투에 대해 구체적으로 관련된) 온도에서 농축하고/하거나;
c) <80℃ 바람직하게는 <50℃, 더욱 바람직하게는 4℃ 내지 40℃의 (나노여과에 대해 구체적으로 관련된) 온도에서 농축하는 것을 특징으로 하는, 공정.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 정제된 용액을 바람직하게는 3kDa 필터를 통한 정제된 용액의 여과로 무균여과하고/하거나 내독소 제거한다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 1가 및 2가 염과 같이 하전된 물질을 추가적으로 제거하기 위해 중성 모유 올리고당 함유 용액에 전기투석을 가한다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 정제된 용액을 >1.5M의 농도로 농축하고, <25℃, 더욱 바람직하게는 <8℃의 온도로 냉각하여 중성 모유 올리고당의 결정성 물질을 수득한다.
본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예에서, 정제된 용액을 특히 20-60(w/v), 바람직하게는 30-50(w/v), 더욱 바람직하게는 35-45(w/v)의 중성 모유 올리고당 농도에서 분무건조하고, 110-150℃의 노즐 온도, 바람직하게는 120-140℃, 더욱 바람직하게는 125-135℃의 노즐 온도 및/또는 60-80℃의 배출구 온도, 바람직하게는 65-70℃의 배출구 온도에서 분무건조한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 공정으로 제조될 수 있는 중성 모유 올리고당을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 모유 올리고당은 예를 들어, ≥30%(w/v), 더욱 바람직하게는 ≥40%(w/v)의 농도를 갖는 중성 모유 올리고당 생성물을 함유하는 멸균 농축물과 같은 무균여과된 농축물 내에 존재한다.
다른 바람직한 구현예에서, 모유 올리고당은 분무건조 또는 결정화된다.
다른 바람직한 구현예에서, 모유 올리고당은 2'-푸코실락토오스, 3-푸코실락토오스, 2',3-디푸코실락토오스, 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-네오푸코펜타오스, 락토-N-푸코펜타오스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토- /V-푸코펜타오스 V, 락토-N-네오푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸코헥사오스 I, 락토-N-디푸코헥사오스 II, 6'-갈락토실락토오스, 3'-갈락토실락토오스, 락토-N-헥사오스 및 락토-N-네오헥사오스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 바람직한 구현예에서, 모유 올리고당은 2'-푸코실락토오스이다.
다른 바람직한 구현예에서, 모유 올리고당은
a) 300g/L 용액에서 1mSi/cm 미만의 전도도를 가지고;
b) 재조합 DNA 물질을 함유하지 않으며, 임의적으로 어떠한 DNA도 함유하지 않고/않거나;
c) 재조합 미생물에서 유래되는 단백질을 함유하지 않으며, 임의적으로 어떠한 단백질도 함유하지 않는다.
다른 바람직한 구현예는 약제용 모유 올리고당으로, 바람직하게는 위장질환의 예방 또는 치료용 모유 올리고당에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 모유 올리고당의 용도로, 식품 첨가제, 바람직하게는 식품 및/또는 애완동물용 사료 첨가제, 더욱 바람직하게는 유아용 식품 첨가제로써 사용되는 모유 올리고당의 용도를 포함한다.
본 발명은 동반된 도면 및 실시예를 참조하여 상세하게 설명되며, 특정 구현예로 본 발명을 제한하지 않는다.
도 1은 본 발명에 따른 공정의 바람직한 구현예의 도식을 나타낸 것으로, 발효액으로부터 2'-푸코실락토오스를 정제하기 위한 다음의 단계를 포함한다: 한외여과, 양이온 및 음이온교환기 처리, 활성탄소 처리, 나노여과, 전기투석 및 농축.
도 2는 본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예의 도식을 나타낸 것으로, 발효액으로부터 2'-푸코실락토오스를 정제하기 위한 다음의 단계를 포함한다: 한외여과, 나노여과, 양이온 및 음이온교환기 처리, 활성탄소 처리, 전기투석 및 농축.
도 3은 본 발명에 따른 공정의 다른 바람직한 구현예의 도식을 나타낸 것으로, 발효액으로부터 2'-푸코실락토오스를 정제하기 위한 다음의 단계를 포함한다: 한외여과, 양이온 및 음이온교환기 처리, 나노여과, 활성탄소 처리, 전기투석 및 농축.
실시예 1: 재조합 미생물 제조 균주 I을 이용한 발효로부터 2'- 푸코실락토오 스의 정제
재조합 2'-푸코실락토오스 합성 E. coli 균주(E. coli BL21(DE3) ΔlacZ)를 이용한 2'-푸코실락토오스 피드-배치(feed-batch) 발효는 wbgL 유전자로 코딩된 유전자 삽입(genomic integration) 2'-푸코실트랜스페라제를 함유하고(EP 11 1151 571.4 참조), 한정 염 배지(defined salt medium)에서 성장시킨 galM , galK , galT 및 galE 유전자를 포함하는 기능적 gal 오페론을 함유하는 강력한 구성요소인 테트라사이클린 프로모터의 모든 제어하에 E. coli lacY , manB , manC , gmd 및 fcl의 추가적인 복제를 갖는다. 한정 염 배지는 7g L-1 NH4H3PO4, 7g L-1 K2HPO4, 2g L-1 KOH, 0.37g L-1 시트르산, 1㎖ L-1 소포제(Struktol J673, Schill+Seilacher), 1mM CaCl2, 4mM MgS04, 미량 원소 및 탄소원으로써 2% 글리세롤을 포함한다.
미량 원소는 0.101g L-1 니트릴로트리아세트산, pH 6.5, 0.056g L-1 구연산철암모늄, 0.01g L-1 MnCl2x4H20, 0.002g L-1 CoCl2x6H20, O.OOlg L-1 CuCl2x2H20, 0.002g L-1 붕산, 0.009g L-1 ZnS04x7H20, 0.001g L-1 Na2Mo04x2H20, 0.002g L-1 Na2Se03, 0.002g L-1 NiS04x6H20로 이루어진다.
글리세롤-피드(glycerol feed)는 글리세롤 800g L-1, MgS04 2.64g L-1 및 미량 원소 용액 4㎖ L-1로 이루어진다. 2'-푸코실락토오스 형성을 위해, 216g L-1의 락토오스 피드를 사용하였다. pH를 암모니아 용액(25% v/v)을 이용하여 조절하였다. 피드-배치 발효를 30℃에서 일정한 에어레이션(aeration) 및 교반(agitation)하에 90시간 동안 배양하였다. 발효 시작 90시간 이후에, 첨가된 락토오스 대부분이 2'-푸코실락토오스로 전환되었다. 발효 상등액에 여전히 존재하는 락토오스를 제거하기 위해, 발효 시작 90시간 이후에 두 번째 박테리아 균주를 발효관에 첨가하였다.
첨가된 두 번째 박테리아 균주는 첫 번째 사용된 박테리와 균주와 유전적으로 동일하지만, 유전자 삽입 베타-갈락토시다아제의 발현만이 상이하다. 첨가된 두 번째 박테리아 균주의 배양은 5시간 이내로 잔여의 락토오스를 소실되게 한다. 박테리아 균주를 발현하는 두 번째 베타-갈락토시다아제의 약 10㎖ 종균 배양(starter culture)을 1L 발효액 당 첨가하였다.
이후에, 바이오매스를 발효 배지로부터 10kDa의 컷-오프를 갖는 크로스-플로우 필터(Microdyn Nardir)를 사용하여 한외여과로 분리하였다.
42g/L 2'-푸코실락토오스를 함유하는 약 1m3 무세포 발효 배지를 수득하였다. 이어서, 양으로 하전된 오염물질을 제거하기 위해서, 무세포 발효 배지를 강력한 양이온교환기에 통과시켰다(Lewatit S 6368 A(Lanxess)는 H+ 형태이고, 이온교환기의 흡착제 부피의 크기는 100L이다). 이어서, 수득한 용액에 2M 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH 7로 설정하였다.
이어서(지체하지 않고), 상기 용액을 음이온교환기 컬럼에 통과시켰다(이온교환기의 흡착제 부피는 100L이다). 사용된 강력한 음이온교환기 Lewatit S 2568(Lanxess)는 클로라이드(Cl-) 형태이다. 수득한 용액을 다시 pH 7로 중화하였다. 이어서, 이렇게 수득한 용액을 Alfa-Laval NF99HF 나노여과막 및 6배 용량의 멸균 탈이온수을 사용하여 정용여과하였다. 추가적으로 용액을 나노여과막을 사용하여 농축하였고, 200g/L 및 전도도 7mS/cm의 2'-푸코실락토오스 용액을 수득하였다.
이어서 메일라드 반응(Maillard reaction) 생성물 및 알돌 반응(Aldol reaction) 생성물과 같은 색소(color giving material)를 제거하기 위해 2'-푸코실락토오스 농축액을 활성탄소로 처리하였다. 2'-푸코실락토오스 농축액 L 당 활성탄소로 20g Norit GAC EN을 사용하였고, 유의하게 탈색된 용액을 수득하였다.
이어서, 이렇게 2'-푸코실락토오스 농축액을 PC-Cell E200 막 스택(membrane stack)이 장착된 PC-Cell BED 1-3 전기투석 장치(PC-Cell, Heusweiler, Germany)를 사용하여 0.3mS/cm로 전기투석하였다. 상기 스택은 다음의 막을 함유한다: 양이온교환막 CEM: PC SK 및 음이온교환막 AEM: 60Da의 크기 배제한계를 갖는 PcAcid60. ED 공정에서 0.025M 술팜산(아미도술폰산) 용액을 전해질로 사용하였다.
이후에, 수득한 용액을 진공하에 40℃에서 농축하여 45% 2'-푸코실락토오스 용액을 수득하였다. 이어서, 농축액을 다시 Na+ 형태의 이온교환기 Lewatit S 6368 A(Lanxess)로 처리하였고(사용된 이온교환기의 흡착제 부피는 10L이다), 이후에 Cl- 형태의 음이온교환기 Lewatit S 2568(Lanxess)로 중화하였다(사용된 이온교환기의 흡착제 부피는 10L이다).
이어서, 수득한 2'-푸코실락토오스 용액을 활성탄소(Norit DX1 Ultra)로 처리하였다. 45% 2'-푸코실락토오스 용액 1L에 대하여 활성탄소 30g을 적용하였다.
이어서, 0.3mSi/cm 미만의 전도도를 얻을 때까지 용액에 전기투석을 가하였다.
그후에, 용액을 3kDa 필터(Pall Microza ultrafiltration hollow fiber module SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich)에 통과시켜 무균여과하였다.
이어서, 수득한 2'-푸코실락토오스 용액 일부를 분석하기 위해 분무건조하였다.
NMR 스펙트럼 기록을 위해, 분무건조한 생성물을 헥사듀테로디메틸 술폭사이드(hexadeuterodimethyl sulfoxide; DMSO-d6)에 용해시켰다. 양성자 및 13C 분석을 위해 하기와 같이 특징적인 화학적 이동을 관찰하였다:
1H NMR(500MHz, DMSO-d6) δ6.63(d, J=6.5Hz, 1H), 6.28(d, J=4.7Hz, 1H), 5.21(d, J=2.4Hz, 1H), 5.19(d, J=2.4Hz, 1H), 5.01(d, J=2.2, 2H), 4.92(d, J=5.0Hz, 1H), 4.89(dd, J=4.6, 1.3Hz, 2H), 4.78(d, J=5.3Hz, 1H), 4.74(d, J=5.1Hz, 1H), 4.63(m, 6H), 4.53(t, d, J=5.5, 1H), 4.46(d, J=5.2Hz, 1H), 4.44(d, J=5.0Hz, 1H), 4.38-4.26(m, 5H), 4.23(d, J=0.9, 1H), 4.05(d, J=0.9, 1H), 4.00(quin, J=3.3, 1H), 3.68-3.60(m, 7H), 3.59-3.50(m, 13H), 3.50-3.37(m, 6H), 3.24(dt, J=8.8, 2.2Hz, 1H), 3.14(m, 2H), 2.96(td, J=8.4, 4.7Hz, 1H), 1.04(d, J=6.1Hz, 3H), 1.03(d, J=6.1Hz, 3H).
13C NMR(126MHz, DMSO-d6) δ100.99, 100.85, 100.35, 100.25, 96.59, 92.02, 78.13, 77.78, 77.16, 77.01, 75.27 75.05, 74.67, 73.70, 72.33, 71.62, 71.56, 70.91, 69.90, 69.64, 68.75, 68.16, 66.33, 60.17, 59.82, 59.67, 16.37, 16.36.
화학적 이동이 2'-푸코실락토오스 구조와 일치하는 것으로 밝혀졌다.
본 프로토콜을 사용하여 94.5%의 순도를 갖는 45% 2'-푸코실락토오스 농축물을 수득할 수 있다(HPLC 분석을 통해 확인된다). 주된 오염물질은 3'-푸코실락토오스(1.8%), 디푸코실락토오스(2.9%) 및 락토오스(0.3%)이다.
정제 수득률은 약 70%이다.
중요한 것은, 어떠한 재조합 물질도 50 사이클의 qPCR을 이용하여 10g의 동결물질(freeze material)로 결정될 수 없다는 것이다. 수득한 물질의 단백질 양을 nano-Bradford assay(Roth, Karlsruhe Germany)를 사용하여 <50㎍/g 동결건조 물질로 결정하였다. 회분의 전체 양을 0.19%로 하였다. 중금속(비소, 카드뮴, 납 및 수은)의 농도는 0.1㎍/g 물질 미만이다. 내독소 레벨을 <0.005EU/㎖ 2'-푸코실락토오스 농축물이 되도록 하였다.
실시예 2: 재조합 미생물 제조 균주 II를 이용한 발효로부터 2'-푸코실락토오스 의 정제
무세포 발효 배지를 수득하기 위하여 47g/L의 농도에서 2'-푸코실락토오스를 포함하는 1m3 미생물 발효를 100kDa의 컷-오프를 갖는 크로스-플로우 필터(Microdyn Nadir)를 통하여 여과하였다.
발효 배지로 다음의 배지를 사용하였다: 주요 배지 구성성분: 글리세롤 30g/L, NH4H2P04 7g/L, K2HP04 7g/L, 시트르산염 0.3g/L, KOH 2g/L, MgS04·7H20 2g/L; 미량 원소: CaCl2·6H20 20㎎/L, 니트릴로트리아세트산 101㎎/L, 구연산철암모늄 56㎎/L, MnCl2·4H20 9.8㎎/L, CoCl2·6H20 1.6㎎/L, CuCl2·2H20 1㎎/L, H3B03 1.6㎎/L, ZnS04·7H20 9㎎/L, Na2Mo04·2H20 1.2㎎/L, Na2Se03 1.2㎎/L; 피드 성분: 글리세롤 및 락토오스.
이어서, 양으로 하전된 오염물질을 제거하기 위해서, 무세포 발효 배지를 H+ 형태의 양이온 교환기(Lewatit S 6368 A(Lanxess)에 통과시켰다(이온교환기의 흡착제 부피는 100L이다). 이어서, 수득한 용액에 2M 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH 7로 설정하였다. 이어서, 용액을 지체하지 않고 클로라이드(Cl-) 형태의 강력한 음이온교환기 Lewatit S 2568(Lanxess)를 포함하는 음이온교환기 컬럼에 통과시켰다(이온교환기의 흡착제 부피는 100L이다). 수득한 용액을 다시 pH 7로 중화시켰다. 이어서, 이렇게 수득한 용액을 (10배 용량의 멸균 탈이온수를 사용하여) 정용여과하였고, 나노여과막(Alfa-Laval NF99HF)으로 농축하여 200g/L 및 전도도 약 7mSi/cm의 2'-푸코실락토오스 용액을 수득하였다.
이어서 2'-푸코실락토오스 농축액을 2'-푸코실락토오스 농축액 L 당 20g Norit GAC EN을 사용하여 활성탄소 처리하였다. 여과된 2'-푸코실락토오스 용액에 40g/L에 Norit DX1 Ultra 활성탄소를 첨가하였다. 이어서 용액을 활성탄소에 4℃에서 약 18시간 동안 노출시켰다. 18시간 이후에, 활성탄소를 여과하여 2'-푸코실락토오스 용액으로부터 제거하였다.
이어서, 용액을 PC-Cell E200 막 스택이 장착된 PC-Cell BED 1-3 전기투석 장치(PC-Cell, Heusweiler, Germany)를 사용하여 전도도 <0.3mS/cm로 전기투석하였다. 상기 스택은 다음의 막을 함유한다: 양이온교환막 CEM: PC SK 및 음이온교환막 AEM: 60Da의 크기 배제한계를 갖는 PcAcid60. ED 공정에서 0.025M 술팜산(아미도술폰산) 용액을 전해질로 사용하였다.
이어서, 수득한 용액을 농축하여 40% 2'-푸코실락토오스 용액을 수득하였다. 이어서, 수득한 2'-푸코실락토오스 용액을 Cl- 형태(흡착제 부피 10L)의 Lewatit S 2568(Lanxess)에 통과시키고, 활성탄소(Norit DX1 Ultra)로 8℃에서 18시간 동안 처리하였다. 이어서, 용액을 3kDa 필터(Pall Microza ultrafiltration hollow fiber module SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich)에 통과시켜 무균여과하고, NUBILOSA LTC-GMP 분무건조기(NUBILOSA, Konstanz, Germany)를 사용하여 분무건조하였다.
본 프로토콜을 이용하여, 94%의 순도를 갖는 2'-푸코실락토오스를 수득할 수 있다(HPLC 분석을 통해 확인된다). 주된 오염물질은 3'-푸코실락토오스(1.8%), 디푸코실락토오스(3.2%) 및 락토오스(0.2%)이다. 정제 수득률은 약 70%이다.

Claims (19)

  1. 미생물 발효에 의해 수득되는 발효액으로부터 배치 방식(batch manner) 또는 연속 방식(continuous manner)으로 중성 모유 올리고당(HMOs)을 정제하는 공정으로서, 상기 발효액이 중성 모유 올리고당, 바이오매스(biomass), 배지 성분 및 오염물질을 포함하고, 상기 발효액 내에 중성 모유 올리고당의 순도가 <80%이고,
    i) 발효액으로부터 바이오매스를 분리하는 단계;
    ii) 양으로 하전된 물질의 제거를 위해 양이온교환기 처리하는 단계;
    iii) 음으로 하전된 물질의 제거를 위해 음이온교환기 처리하는 단계; 및
    iv) 나노여과 단계 및 전기투석 단계 중 하나 이상을 포함하는 정제공정에 발효액이 적용되는 것을 특징으로 하며,
    ≥80%의 순도로 중성 모유 올리고당을 포함하는 정제된 용액을 분무건조하여 제공하는, 중성 모유 올리고당의 정제공정.
  2. 제 1항에 있어서,
    중성 모유 올리고당이 박테리아 및 효모로 이루어지는 군에서 선택된 재조합 미생물을 이용한 미생물 발효에 의해 수득되는 발효액으로부터 정제되는 것을 특징으로 하는, 공정.
  3. 제 1항에 있어서,
    발효액 내에 중성 모유 올리고당의 순도가 ≤70%, ≤60%, ≤50%, ≤40%, ≤30%, ≤20%, ≤10% 또는 ≤5% 이거나, 정제된 용액이 ≥85% 의 순도로 중성 모유 올리고당을 함유하는 것을 특징으로 하는, 공정.
  4. 제 1항 에 있어서,
    중성 모유 올리고당의 수득률이 >75% 이거나, 정제된 용액이 DNA, 단백질 및 재조합 유전 물질 중 하나 이상을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 공정.
  5. 제 1항에 있어서,
    중성 모유 올리고당이 2'-푸코실락토오스, 3-푸코실락토오스, 2',3-디푸코실락토오스, 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-네오푸코펜타오스, 락토-N-푸코펜타오스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토-N-푸코펜타오스 V, 락토-N-네오푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸코헥사오스 I, 락토-N-디푸코헥사오스 II, 6'-갈락토실락토오스, 3'-갈락토실락토오스, 락토-N-헥사오스 및 락토-N-네오헥사오스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 공정.
  6. 제 1항 에 있어서,
    발효액으로부터 바이오매스의 분리가
    a) 한외여과; 및
    b) 크로스-플로우 필터(cross-flow filter)를 통한 여과 중 하나 이상을 통해 달성되는 것을 특징으로 하는, 공정.
  7. 제 1항 에 있어서,
    정제 단계 ii) 내지 iv) 중 하나 이상의 단계가 공정 동안 한 번 이상 반복되는 것을 특징으로 하는, 공정.
  8. 제 1항 에 있어서,
    정제 단계 i) 내지 iv) 중 하나 이상의 단계 이후에, 활성탄소로 색소(color giving material) 및 더 큰 올리고당(larger oligosaccharides)을 흡착하기 위해서 발효액을 한 번 이상 활성탄소 처리하는 것을 특징으로 하는, 공정.
  9. 제 8항 에 있어서,
    상기 활성탄소 처리 이후에, 중성 모유 올리고당을 포함하는 용액에 대해 정용여과(diafiltration) 및 농축 중 하나 이상을 수행하는 것을 특징으로 하는, 공정.
  10. 제 1항 에 있어서,
    a) 정제 단계 i) 내지 iv) 중 하나 이상의 단계 이후에; 또는
    b) 정제 단계 i) 내지 iv) 중 하나 이상의 단계 이후에 시행되는 농축 단계 이전에;
    중성 모유 올리고당을 포함하는 용액에 대해 정용여과(diafiltration) 및 농축 중 하나 이상을 수행하는 것을 특징으로 하는, 공정.
  11. 제 1항 에 있어서,
    단계 i) 이전 단계에서, 글리코시다아제 처리를 발효액에 수행하는 것을 특징으로 하는, 공정.
  12. 제 1항 에 있어서,
    발효액을 정제 단계 i) 내지 iv) 중 어느 하나의 단계 이후에, 진공증착(vacuum evaporation) 또는 역삼투 또는 나노여과를 이용하여
    a) ≥100g/L의 농도로 농축하거나;
    b) <80℃의 온도에서 농축하거나;
    c) ≥100g/L의 농도로 <80℃의 온도에서 농축하는 것을 특징으로 하는, 공정.
  13. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    정제된 용액에 대해 무균여과 및 내독소 제거 중 하나 이상을 행하는 것을 특징으로 하는, 공정.
  14. 제 1항에 있어서,
    정제된 용액을 >1.5M의 농도로 농축하고, <25℃의 온도로 냉각하여 중성 모유 올리고당의 결정성 물질을 수득하는 것을 특징으로 하는, 공정.
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