CN112568439A - 一种从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法及其应用 - Google Patents
一种从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法及其应用 Download PDFInfo
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- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Abstract
本发明公开一种从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法及其应用，该方法包括以下步骤：S10、将含有母乳低聚糖的微生物发酵液进行离心，分别收集上清液和下层的菌体；S20、将菌体重悬，并加入溶菌酶反应，再进行超声处理，使菌体破壁，过滤，得到滤液A；S30、将滤液A与上清液混合，得到混合液，将混合液浓缩醇沉，抽滤，再将抽滤得到的产物旋蒸，最后加水复溶，得到溶液B；S40、将溶液B用活性炭处理后，再用阳离子交换剂处理，得到溶液C；S50、将溶液C纳滤浓缩，得到浓缩液，将浓缩液进行喷雾干燥，即可得到母乳低聚糖。该方法通过步骤和实验条件的设计，提高了得到的母乳低聚糖的收率和纯度；最后一步为喷雾干燥，提高了其作为食品成分的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学分离提取技术领域，特别涉及一种从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法及其应用。
背景技术
母乳低聚糖(HMO)是一种自然存在于母乳中的复杂混合低聚糖，是人类母乳中仅次于乳糖、脂类的第三大营养物质。母乳低聚糖跟一般的碳水化合物不同，它无法提供能量，却可以为宝宝带来诸多其他的益处：促进肠道益生菌菌群定植，维持肠道健康；阻挡病原菌，对抗感染；增强宝宝免疫力等。其中，母乳低聚糖主要以游离形式存在于母乳中，由3～10个单糖单位通过糖苷键链接起来形成直链或支链的一类低聚碳水化合物。
目前国内外HMO奶粉中，添加的主要是2’-岩藻糖基乳糖、3’-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖、3’-半乳糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖中的一种或多种。其中2’-岩藻糖基乳糖、3’-岩藻糖基乳糖、乳糖-N新四糖、3’-半乳糖基乳糖属于中性低聚糖，3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖属于酸性低聚糖。
其中，化学法合成母乳低聚糖的路线复杂且糖苷供体昂贵，长期以来限于实验室小规模制备；酶法合成需要利用多酶反应体系从单糖开始催化，合成对应的糖核苷酸继而完成HMOs的合成，反应过程需要多种酶的纯化，不利于工业化生产；基于大肠杆菌、酵母菌等生物工程菌的生物合成途径具有生产成本低、环境污染小等优势，是当今商业化产品中积极采用的合成方法，目前多采用生物工程菌的生物合成途径来制备母乳低聚糖，但是含有母乳低聚糖的生物发酵液的提取工艺却受到限制，最终提取得到的母乳低聚糖的纯度和收率较低。此外，现有提取方法通常采用结晶来获得固体糖，结晶涉及使用有机溶剂，如醇、有机酸等，而母乳低聚糖是用作食品成分，用有机溶剂来获得固体母乳低聚糖的最后一步具有食品安全隐患。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法及其应用，旨在提供一种安全性较好，且纯度和收率高的母乳低聚糖。
为实现上述目的，本发明提出一种从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法，包括以下步骤：
S10、将含有母乳低聚糖的微生物发酵液进行离心，分别收集上清液和下层的菌体；
S20、将所述菌体重悬，并加入溶菌酶反应，再进行超声处理，使所述菌体破壁，过滤，得到滤液A；
S30、将所述滤液A与所述上清液混合，得到混合液，将所述混合液浓缩醇沉，抽滤，再将抽滤得到的产物旋蒸，最后加水复溶，得到溶液B；
S40、将所述溶液B用活性炭处理后，再用阳离子交换剂处理，得到溶液C；
S50、将所述溶液C纳滤浓缩，得到浓缩液，将所述浓缩液进行喷雾干燥，即可得到母乳低聚糖。
可选地，步骤S10中，所述微生物发酵液包括重组大肠杆菌发酵液，其中，所述重组大肠杆菌发酵可合成母乳低聚糖。
可选地，步骤S10中，所述离心的转速为4000～8000rpm，离心时间为10～15min。
可选地，步骤S20包括：
将所述菌体用磷酸缓冲液重悬，并加入溶菌酶在25～30℃下反应15～20min，再进行超声处理，使所述菌体破壁，得到溶液A。
可选地，所述磷酸缓冲液的pH值为6.2～7.0；和/或，
所述溶菌酶的浓度为0.1～0.2mg/mL。
可选地，所述超声处理的条件为：功率为100～200W，处理时间为5～10min。
可选地，步骤S30中，所述浓缩醇沉步骤包括：
将所述混合液真空浓缩至体积的1/3，再加入乙醇，得到混合溶液，并使所述混合溶液中所述乙醇的体积浓度为70～80％，将所述混合溶液静置12～24h。
可选地，步骤S50中，所述纳滤浓缩的步骤中：
所述纳滤浓缩的纳滤膜的材质包括醋酸纤维素、磺化聚砜、磺化聚醚砜和聚乙烯醇中的任意一种；和/或，
所述纳滤浓缩的纳滤膜的截留分子量为80～1000。
可选地，步骤S50中，所述喷雾干燥的条件为：
所述喷雾干燥的喷嘴温度为100～150℃；和/或，
所述喷雾干燥的出口温度为50～80℃。
此外，本发明还提出一种婴幼儿奶粉，包括母乳低聚糖，所述母乳低聚糖是从微生物发酵液中分离纯化获得的，所述分离纯化方法为如上所述的从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法。
本发明提供的从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法，采用超声波辅助溶菌酶使菌体破壁，释放出胞内母乳低聚糖，再过滤，得到了含有母乳低聚糖的滤液A，将滤液A与上清液混合后浓缩醇沉、抽滤，得到了母乳低聚糖，再对母乳低聚糖进行阳离子交换和纳滤浓缩，最后进行喷雾干燥，得到了母乳低聚糖粉末。该方法同时提取了胞内母乳低聚糖和胞外母乳低聚糖，且通过步骤的设计，降低了母乳低聚糖的损失率和最终产物中的杂质，从而提高了得到的母乳低聚糖的收率和纯度；此外，最后一步为喷雾干燥，提高了其作为食品成分的安全性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提出的从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法的一实施例的流程示意图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前多采用生物工程菌的生物合成途径来制备母乳低聚糖，但是含有母乳低聚糖的生物发酵液的提取工艺却受到限制，最终提取得到的母乳低聚糖的纯度和收率较低。此外，现有提取方法通常采用结晶来获得固体糖，结晶涉及使用有机溶剂，如醇、有机酸等，而母乳低聚糖是用作食品成分，用有机溶剂来获得固体母乳低聚糖的最后一步具有食品安全隐患。
鉴于此，本发明提出一种从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法，旨在从微生物发酵液中提取得到安全性高，且纯度和收率高的母乳低聚糖。结合图1提出的从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法的一实施例的流程示意图，所述从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法包括以下步骤：
步骤S10、将含有母乳低聚糖的微生物发酵液进行离心，分别收集上清液和下层的菌体。
本发明不限制所述微生物发酵液的具体种类，在本实施例中，所述微生物发酵液为重组大肠杆菌发酵液。其中，所述重组大肠杆菌为市面购买的通过基因技术改造的可以合成母乳低聚糖的生物工程菌。具体地，所述重组大肠杆菌发酵液为将重组大肠杆菌接种于液体LB培养基中，培养条件为35℃，摇床转速为150rpm，培养24h后得到大肠杆菌发酵液。
此外，将所述微生物发酵液离心的步骤中，所述离心的转速为4000～8000rpm，离心时间为10～15min，如此，使菌体能够较好的使菌体沉降于离心管璧上，菌体与上清液分离效果好。
步骤S20、将所述菌体重悬，并加入溶菌酶反应，再进行超声处理，使所述菌体破壁，过滤，得到滤液A。
具体地，将所述菌体用磷酸缓冲液重悬，并加入溶菌酶在25～30℃下反应15～20min，再进行超声处理，使所述菌体破壁，过滤，得到滤液A。如此，用超声波辅助溶菌酶对菌体进行破壁，破壁效果较好，使胞内的母乳低聚糖能够较好的释放出来，提高了最终的母乳低聚糖的收率。
进一步地，在本实施例中，所述磷酸缓冲液的pH值为6.2～7.0。在另一实施例中，所述溶菌酶的浓度为0.1～0.2mg/m/L。此外，所述超声处理的条件为功率为100～200W，处理时间为5～10min，较优地，超声处理为工作10s，间隔10s的工作方式。通过上述实验参数的设计，以更好的对菌体进行破壁，从而较好的释放胞内母乳低聚糖。通过过滤，去除了菌壁等杂质。
步骤S30、将所述滤液A与所述上清液混合，得到混合液，将所述混合液浓缩醇沉，抽滤，再将抽滤得到的产物旋蒸，最后加水复溶，得到溶液B。
为了同时提取胞外的母乳低聚糖，在本实施例中，先将所述滤液A与步骤S10中得到的所述上清液混合，得到混合液，再进行浓缩醇沉。其中，所述浓缩醇沉步骤包括：将所述混合液真空浓缩至体积的1/3，再加入乙醇，得到混合溶液，并使所述混合溶液中所述乙醇的体积浓度为70～80％，将所述混合溶液静置12～24h。本发明不限制加入的乙醇的具体种类，可以为加入无水乙醇，也可以为高浓度含水乙醇。此外，所述加水复溶步骤中，加水的体积为加入抽滤后的溶液的体积的1/3。
步骤S40、将所述溶液B用活性炭处理后，再用阳离子交换剂处理，得到溶液C。
通过活性炭处理至少一次，以去除所述溶液B中的色素及其他大分子多糖、寡糖或蛋白质；再通过阳离子交换剂处理，除去了阳离子物质，例如带正电荷的蛋白质，从而得到含有中性母乳低聚糖和酸性母乳低聚糖的溶液C。
步骤S50、将所述溶液C纳滤浓缩，得到浓缩液，将所述浓缩液进行喷雾干燥，即可得到母乳低聚糖。
其中，所述纳滤浓缩的纳滤膜的材质包括醋酸纤维素(CA)、磺化聚砜(SPS)、磺化聚醚砜(SPES)和聚乙烯醇(PVA)中的任意一种。较优地，所述纳滤膜的截留分子量为80～1000。此外，所述纳滤浓缩在50℃以下进行。通过纳滤浓缩，进一步去除所述溶液C中的杂质，得到浓缩液，此时，浓缩液中母乳低聚糖的浓度≥70％(M/V)。
将所述浓缩液通过喷雾干燥，得到母乳低聚糖粉末。其中，所述喷雾干燥的条件为：所述喷雾干燥的喷嘴温度为100～150℃；和/或，所述喷雾干燥的出口温度为50～80℃。如此，避免了结晶带来的有机溶剂对食品安全性造成的影响。
本发明提供的从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法，采用超声波辅助溶菌酶使菌体破壁，释放出胞内母乳低聚糖，再过滤，得到了含有母乳低聚糖的滤液A，将滤液A与上清液混合后浓缩醇沉、抽滤，得到了母乳低聚糖，再对母乳低聚糖进行阳离子交换和纳滤浓缩，最后进行喷雾干燥，得到了母乳低聚糖粉末。该方法同时提取了胞内母乳低聚糖和胞外母乳低聚糖，且通过步骤的设计，降低了母乳低聚糖的损失率和最终产物中的杂质，从而提高了得到的母乳低聚糖的收率和纯度；此外，最后一步为喷雾干燥，提高了其作为食品成分的安全性。
进一步地，本发明还提出一种婴幼儿奶粉，包括母乳低聚糖，所述母乳低聚糖是从微生物发酵液中分离纯化获得的，所述分离纯化方法为如上所述的从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法。
将所述母乳低聚糖加入婴幼儿奶粉中，为婴幼儿带来诸多益处，如：促进肠道益生菌菌群定植，维持肠道健康；阻挡病原菌，对抗感染；增强宝宝免疫力等。所述从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的具体方法参照上述实施例，由于本发明母乳低聚糖采用了上述所有实施例的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
(1)将含有母乳低聚糖的微生物发酵液在4000rpm下离心15min，分别收集上清液和下层的菌体。
(2)将菌体用磷酸缓冲液(pH值为7.0)重悬，并加入溶菌酶(浓度为0.1mg/mL)在25℃下反应20min，再超声处理(超声功率为100W，工作10s，间隔10s)10min，使菌体破壁，过滤，得到滤液A。
(3)将滤液A与步骤(1)的上清液混合，得到混合液，将混合液真空浓缩至体积的1/3，再加入浓度≥99.7％的无水乙醇，得到乙醇终浓度为70％的混合溶液，静置沉降12h，将沉降后的溶液进行抽滤，再将抽滤得到的产物旋蒸，最后加水复溶，得到溶液B。
(4)将溶液B用活性炭处理后，再用阳离子交换剂处理，得到溶液C。
(5)将溶液C用截留分子量为80～1000的纳滤膜(纳滤膜材质为醋酸纤维素)纳滤浓缩，得到浓缩液，将浓缩液进行喷雾干燥(其中，喷嘴温度为100℃，出口温度为50℃)，即可得到纯度为95％(经HPLC分析测定)的母乳低聚糖粉末，收率为72％。
实施例2
(1)将含有母乳低聚糖的微生物发酵液在8000rpm下离心10min，分别收集上清液和下层的菌体。
(2)将菌体用磷酸缓冲液(pH值为6.2)重悬，并加入溶菌酶(浓度为0.2mg/mL)在28℃下反应18min，再超声处理(超声功率为200W，工作10s，间隔10s)5min，使菌体破壁，过滤，得到滤液A。
(3)将滤液A与步骤(1)的上清液混合，得到混合液，将混合液真空浓缩至体积的1/3，再加入浓度≥99.7％的无水乙醇，得到乙醇终浓度为75％的混合溶液，静置沉降24h，将沉降后的溶液进行抽滤，再将抽滤得到的产物旋蒸，最后加水复溶，得到溶液B。
(4)将溶液B用活性炭处理后，再用阳离子交换剂处理，得到溶液C。
(5)将溶液C用截留分子量为80～1000的纳滤膜(纳滤膜材质为醋酸纤维素)纳滤浓缩，得到浓缩液，将浓缩液进行喷雾干燥(其中，喷嘴温度为150℃，出口温度为80℃)，即可得到纯度为90％(经HPLC分析测定)的母乳低聚糖粉末，收率为70％。
实施例3
(1)将含有母乳低聚糖的微生物发酵液在6000rpm下离心12min，分别收集上清液和下层的菌体。
(2)将菌体用磷酸缓冲液(pH值为6.5)重悬，并加入溶菌酶(浓度为0.15mg/mL)在30℃下反应15min，再超声处理(超声功率为150W，工作10s，间隔10s)8min，使菌体破壁，过滤，得到滤液A。
(3)将滤液A与步骤(1)的上清液混合，得到混合液，将混合液真空浓缩至体积的1/3，再加入浓度≥99.7％的无水乙醇，得到乙醇终浓度为80％的混合溶液，静置沉降18h，将沉降后的溶液进行抽滤，再将抽滤得到的产物旋蒸，最后加水复溶，得到溶液B。
(4)将溶液B用活性炭处理后，再用阳离子交换剂处理，得到溶液C。
(5)将溶液C用截留分子量为80～1000的纳滤膜(纳滤膜材质为醋酸纤维素)纳滤浓缩，得到浓缩液，将浓缩液进行喷雾干燥(其中，喷嘴温度为120℃，出口温度为60℃)，即可得到纯度为90％(经HPLC分析测定)的母乳低聚糖粉末，收率为72％。
实施例4
(1)将含有母乳低聚糖的微生物发酵液在5000rpm下离心13min，分别收集上清液和下层的菌体。
(2)将菌体用磷酸缓冲液(pH值为7.0)重悬，并加入溶菌酶(浓度为0.1mg/mL)在28℃下反应20min，再超声处理(超声功率为100W，工作10s，间隔10s)10min，使菌体破壁，过滤，得到滤液A。
(3)将滤液A与步骤(1)的上清液混合，得到混合液，将混合液真空浓缩至体积的1/3，再加入浓度≥99.7％的无水乙醇，得到乙醇终浓度为75％的混合溶液，静置沉降12h，将沉降后的溶液进行抽滤，再将抽滤得到的产物旋蒸，最后加水复溶，得到溶液B。
(4)将溶液B用活性炭处理后，再用阳离子交换剂处理，得到溶液C。
(5)将溶液C用截留分子量为80～1000的纳滤膜(纳滤膜材质为醋酸纤维素)纳滤浓缩，得到浓缩液，将浓缩液进行喷雾干燥(其中，喷嘴温度为110℃，出口温度为70℃)，即可得到纯度为95％(经HPLC分析测定)的母乳低聚糖粉末，收率为73％。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10、将含有母乳低聚糖的微生物发酵液进行离心，分别收集上清液和下层的菌体；
S20、将所述菌体重悬，并加入溶菌酶反应，再进行超声处理，使所述菌体破壁，过滤，得到滤液A；
S30、将所述滤液A与所述上清液混合，得到混合液，将所述混合液浓缩醇沉，抽滤，再将抽滤得到的产物旋蒸，最后加水复溶，得到溶液B；
S40、将所述溶液B用活性炭处理后，再用阳离子交换剂处理，得到溶液C；
S50、将所述溶液C纳滤浓缩，得到浓缩液，将所述浓缩液进行喷雾干燥，即可得到母乳低聚糖。
2.如权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法，其特征在于，步骤S10中，所述微生物发酵液包括重组大肠杆菌发酵液，其中，所述重组大肠杆菌发酵可合成母乳低聚糖。
3.如权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法，其特征在于，步骤S10中，所述离心的转速为4000～8000rpm，离心时间为10～15min。
4.如权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法，其特征在于，步骤S20包括：
将所述菌体用磷酸缓冲液重悬，并加入溶菌酶在25～30℃下反应15～20min，再进行超声处理，使所述菌体破壁，得到溶液A。
5.如权利要求4所述的从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液的pH值为6.2～7.0；和/或，
所述溶菌酶的浓度为0.1～0.2mg/mL。
6.如权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法，其特征在于，所述超声处理的条件为：功率为100～200W，处理时间为5～10min。
7.如权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法，其特征在于，步骤S30中，所述浓缩醇沉步骤包括：
将所述混合液真空浓缩至体积的1/3，再加入乙醇，得到混合溶液，并使所述混合溶液中所述乙醇的体积浓度为70～80％，将所述混合溶液静置12～24h。
8.如权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法，其特征在于，步骤S50中，所述纳滤浓缩的步骤中：
所述纳滤浓缩的纳滤膜的材质包括醋酸纤维素、磺化聚砜、磺化聚醚砜和聚乙烯醇中的任意一种；和/或，
所述纳滤浓缩的纳滤膜的截留分子量为80～1000。
9.如权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法，其特征在于，步骤S50中，所述喷雾干燥的条件为：
所述喷雾干燥的喷嘴温度为100～150℃；和/或，
所述喷雾干燥的出口温度为50～80℃。
10.一种婴幼儿奶粉，其特征在于，包括母乳低聚糖，所述母乳低聚糖是从微生物发酵液中分离纯化获得的，所述分离纯化方法为如权利要求1至9任意一项所述的从微生物发酵液中分离纯化母乳低聚糖的方法。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210330 |
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