CN105255772B - 一株产菊糖果糖转移酶的菌株及其生产菊糖果糖转移酶的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一株产菊糖果糖转移酶的菌株及其生产菊糖果糖转移酶的方法和应用，属于食品生物技术领域。本发明涉及一株产菊糖果糖转移酶的菌株，分类命名为链霉菌（Streptomyces davawensis）SK 39.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015352。以此链霉菌为出发菌株，以菊糖为碳源，与氮源及无机盐组成发酵培养基，发酵生产菊糖果糖转移酶。发酵培养基以菊糖，硝酸钠为主要碳源和氮源，发酵后经检测，在发酵液中菊糖果糖转移酶酶活达2‑100U/mL。将菊糖果糖转移酶添加到1%‑50%的菊糖溶液中生产双果糖酐I，转化3‑24h，转化率达到75%以上。本发明所得双果糖酐I产品安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性甜味剂。
Description
技术领域
本发明涉及能够生产菊糖果糖转移酶的一种新的微生物及其培养发酵生产菊糖果糖转移酶，并将该酶用于转化菊糖制备双果糖酐I的方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
近年来，功能食品成为广大消费者关注的热点，其开发更是广大食品从业者研发的焦点。而糖尿病、肥胖和心血管疾病人群的逐年增加和低龄化，使得低热量、具有更多功能营养特性的功能性甜味剂成为关注的热点。
双果糖酐I（Difructose anhydride）是一种新型的非还原性双糖，在自然界中少量存在于菊苣、菊芋等植物中，少量出现于蜂蜜、咖啡等的加工过程中。其相对甜度为蔗糖的52%，而热量值却只有蔗糖的1/15 (0.263 kcal/g)；双果糖酐I对热和酸十分稳定，在一般食品加工条件下几乎不会出现褐变或分解现象，能耐硬糖生产时的高温熬煮而不褐变。同时双果糖酐I还具有良好的功能特性，如在消化道不吸收，且不产生能量，可作为一种甜味剂被用作减肥辅助治疗；作为一种增歧因子，可促进肠道微生物的生长，明显改善排便、利尿功能；作为促进矿物质元素吸收的功能性糖，可使得Ca、Mg、Zn、Cu等矿物质元素被人体吸收利用的程度大大提高，增进骨骼生长。这些优点使其在食品工业中的应用有广阔的前景。
由于双果糖酐I在自然界的含量极低，天然提取分离成本高，不适宜工业化大生产的要求，化学催化法有形成许多副产物和化学污染物等不利的因素，使得价格低廉，转化率高的生物转化技术成为生产双果糖酐I的研究热点。
自1989年Seki首次从节杆菌属中发现了一种新型菊糖酶（inulase），使用生物转化法制备双果糖酐I的研究已经有20余年的历史。迄今为止， 已发现几种微生物可以产生此酶，主要集中在节杆菌属，包括Arthrobacter sp MCI-2493、Arthrobacter spB69-5、 Arthrobacter globiformis S14-3、Arthrobacter ureafaciens A51-1、Arthrobacter pascens a62-1，另外在链霉菌属中也发现了此酶，如Strptomyces sp.MCI-2524。
本发明人深入调查和研究了现有技术并对各种高收率生产双果糖酐I的方法进行了研究，最终我们筛选到一株能够产生菊糖果糖转移酶的新微生物，证明了通过此酶与高浓度的菊糖反应能够得到高转化率的双果糖酐I，并通过浓缩、喷雾干燥、结晶的方法得到了糖浆、粉末或晶体三种形式的双果糖酐I。 基于上述发现提出了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的微生物，它能够生产高酶活的菊糖果糖转移酶。
本发明的另一个目的是提供一种该菊糖果糖转移酶与高浓度菊糖溶液反应的方法，以得到高转化率的双果糖酐I。
本发明的再一个目的是提供一种双果糖酐I提纯与精制的方法，以得到双果糖酐I糖浆、粉末或晶体。
本发明的技术方案，本发明提供一种由实验室保藏的Streptomyces davawensisSK 39.001，能够产生菊糖果糖转移酶的菌株，并利用该菊糖果糖转移酶转化菊糖生成双果糖酐I。本发明采用的Streptomyces davawensis SK 39.001发酵生产的菊糖果糖转移酶，酶活较高，能够将菊糖转化为双果糖酐I，且双果糖酐I转化率高达75%以上，副产物少，除双果糖酐I和未转化的菊糖外，只有少量的低聚果糖。
一株产菊糖果糖转移酶的菌株，其分类命名为链霉菌（Streptomyces davawensis）SK 39.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015352。
所述菌株发酵生产菊糖果糖转移酶的方法，步骤为：
（1）种子培养：
种子培养基：可溶性淀粉10g/L，酵母提取物2g/L，NaNO3 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，用去离子水配制；
种子培养条件：将（Streptomyces davawensis）SK 39.001接入种子培养基中，于25-30℃、160-240 r/min振荡条件下培养12-24h；
（2）发酵培养：
发酵培养基：菊糖 10g/L，酵母提取物2g/L，NaNO3 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，用去离子水配制；
发酵条件：在25-30℃、搅拌速度为200-500rpm、空气流量为5-30m3/(L·h)的条件下在发酵培养基中发酵12-84h得到生成菊糖果糖转移酶的发酵液；
（3）发酵后处理：通过离心法（即转速10000rpm，时间20min）除去步骤（2）所得发酵液中的菌体，得到菊糖果糖转移酶粗酶液；将菊糖果糖转移酶粗酶液进一步超滤浓缩，即用10KDa的超滤膜，转速3000-3300rpm，时间30-60min，进行浓缩；用3倍浓缩液体积的工业酒精沉淀蛋白质，离心（转速10000rpm，时间20min）和冷冻干燥（真空度0.03Mbar，温度-55℃）得到菊糖果糖转移酶粗酶粉。
制备得到的菊糖果糖转移酶转化菊糖生产双果糖酐I的方法，向质量浓度1%-50%菊糖溶液中添加菊糖果糖转移酶催化转化；
转化反应条件为：底物菊糖浓度范围为1%-50%，酶对底物的用量为0.01-10U/g，pH4.0-8.0，转化反应温度为30-50℃，转化反应时间3-24h，得到含有双果糖酐I的酶反应液，用于制备双果糖酐I糖浆、双果糖酐I粉末或双果糖酐I晶体。
所述双果糖酐I糖浆的制备方法如下：
（1）脱色：在含有双果糖酐I的酶反应液中添加酶反应液固形物含量0.2%-2%的活性炭，在80℃下温育30min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；
（2）浓缩：将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为60%-95%，即得双果糖酐I糖浆。
所述双果糖酐I粉末的制备方法如下：
（1）脱色：在含有双果糖酐I的酶反应液中添加酶反应液固形物含量0.2%-2%的活性炭，在80℃下温育30min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；
（2）浓缩：将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为20%-40%的浓缩液；
（3）喷雾干燥：将麦芽糊精与以固形物含量干基计的双果糖酐I浓缩液按照重量比1︰1-5 的比例混合，控制进风温度170-180℃、出风温度为70-80℃，喷雾干燥，得到含麦芽糊精的双果糖酐I粉末。
所述双果糖酐I晶体的制备方法如下：
（1）脱色：在含有双果糖酐I的酶反应液中添加酶反应液固形物含量0.2%-2%的活性炭，在80℃下温育30min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；
（2）结晶：将脱色液浓缩至固形物含量为60%-95%的浓缩液，快速降温至50℃，缓慢均匀添加双果糖酐I晶种，向浓缩液中缓慢加入0.2-2倍浓缩液体积的乙醇，通过12h的缓慢降温过程温度降至10℃，得含双果糖酐I晶体的糖膏，用乙醇清洗去除晶体表面的杂质，离心分离，真空干燥至恒重，得双果糖酐I晶体。
检测双果糖酐I含量的方法：取酶反应液离心，上清液微孔滤膜过滤（0.22μm），滤液上HPLC分析。HPLC条件：Sugarpakl，6.5 mmid*300mm 钙型阳离子交换柱，纯水作流动相，示差折光检测器，85℃柱温，流速：0.4mL/min，进样量：10μL，双果糖酐I标样浓度：0.5%。
本发明的有益效果：本发明筛选到一株能够产生菊糖果糖转移酶的新微生物CCTCC NO：M 2015352，证明了通过菊糖果糖转移酶与高浓度的菊糖反应能够得到高转化率的双果糖酐I，并通过浓缩、喷雾干燥、结晶的方法得到了糖浆、粉末或晶体三种形式的双果糖酐I。
生物材料样品保藏：一株用于微生物转化发酵生产菊糖果糖转移酶的菌株，其分类命名为Streptomyces davawensis SK 39.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为 CCTCC NO：M 2015352，保藏日期为2015年6月2日。
具体实施方式
以下是Streptomyces davawensis SK 39.001进行发酵生产菊糖果糖转移酶及酶法转化生产双果糖酐I的实施实例，但本发明并不限于所列出的几个实例。
实施例1发酵时间对产菊糖果糖转移酶的影响
按说明书所述的发酵条件，通过对Streptomyces davawensis SK 39.001在不同发酵时间产菊糖果糖转移酶IFTase的检测，发现发酵24h IFTase酶活最高，随着发酵时间延长，IFTase酶活仅稍有升高，故确定发酵时间为24h左右。发酵时间对产菊糖果糖转移酶的影响如表1所示。酶活力定义为在温度70℃，pH6.0条件下1min产生 1.0μmol双果糖酐I（DFAI）所需的酶量为1个酶活力单位。
表1发酵时间对产菊糖果糖转移酶的影响
实施例2菊糖浓度对酶法转化生产双果糖酐I的影响
按说明书所述的酶法转化条件，将菊糖配制成不同浓度的水溶液，70℃、pH 6.0条件下反应24h，结果发现随着菊糖浓度的增加，转化率不断下降，但在250mg/mL菊糖水溶液浓度下转化率仍可保证在75%左右。菊糖浓度对酶法转化生产双果糖酐I的影响如表2所示。
表2菊糖浓度对酶法转化生产双果糖酐I的影响
实施例3双果糖酐I糖浆的制备
（1）脱色：将含有双果糖酐I的酶反应液中添加酶反应液固形物含量0.2%-2%的活性炭，在80℃下温育30min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；
（2）浓缩：将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为60%-95%，即得双果糖酐I糖浆。
实施例4双果糖酐I粉末的制备
（1）脱色：将含有双果糖酐I的酶反应液中添加酶反应液固形物含量0.2%-2.0%的活性炭，在80℃下温育30min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；
（2）浓缩：将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为20%-40%的浓缩液；
（3）喷雾干燥：将麦芽糊精与以固形物含量干基计的双果糖酐I浓缩液按照重量比1:1-1:5 的比例混合，控制进风温度170-180℃、出风温度为70-80℃，喷雾干燥，得到含麦芽糊精的双果糖酐I粉末。
实施例5乙醇添加量对双果糖酐I晶体的晶核形态的影响
对不同乙醇添加量的起晶过程的现象及晶核的描述见表3，从起晶后制备的双果糖酐I晶核的悬浮液中选取适量样液，用经双果糖酐I饱和的甘油将样液稀释至适当浓度，再取少量稀释样液，在显微镜下观察晶核形态。
表3乙醇添加量对双果糖酐I晶核形态的影响
Claims (5)
1.一株产菊糖果糖转移酶的菌株，其分类命名为Streptomyces davawensis SK39.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015352。
2.权利要求1所述菌株发酵生产菊糖果糖转移酶及转化菊糖生产双果糖酐I的方法，其特征在于步骤为：
（1）种子培养：
种子培养基：可溶性淀粉10g/L，酵母提取物2g/L，NaNO3 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，用去离子水配制；
种子培养条件：将Streptomyces davawensis SK 39.001接入种子培养基中，于25-30℃、160-240 r/min振荡条件下培养12-24h；
（2）发酵培养：
发酵培养基：菊糖 10g/L，酵母提取物2g/L，NaNO3 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，用去离子水配制；
发酵条件：在25-30℃、搅拌速度为200-500rpm、空气流量为5-30m3/(L·h)的条件下在发酵培养基中发酵12-84h得到生产菊糖果糖转移酶的发酵液；
（3）发酵后处理：通过离心法10000rpm离心20min除去步骤（2）所得发酵液中的菌体，得到菊糖果糖转移酶粗酶液；将菊糖果糖转移酶粗酶液进一步超滤浓缩，即用10KDa的超滤膜，转速3000-3300rpm，时间30-60min，进行浓缩，用3倍浓缩液体积的工业酒精沉淀蛋白质，10000rpm离心20min，真空度0.03Mbar温度-55℃冷冻干燥得到菊糖果糖转移酶粗酶粉；
（4）催化转化生产双果糖酐I：向质量浓度1%-50%菊糖溶液中添加菊糖果糖转移酶催化转化；
转化反应条件为：底物菊糖浓度范围为1%-50%，酶对底物的用量为0.01-10U/g，pH4.0-8.0，转化反应温度为30-50℃，转化反应时间3-24h，得到含有双果糖酐I的酶反应液，用于制备双果糖酐I糖浆、双果糖酐I粉末或双果糖酐I晶体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述双果糖酐I糖浆的制备方法如下：
（1）脱色：在含有双果糖酐I的酶反应液中添加酶反应液固形物含量0.2%-2%的活性炭，在80℃下温育30min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；
（2）浓缩：将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为60%-95%，即得双果糖酐I糖浆。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述双果糖酐I粉末的制备方法如下：
（1）脱色：在含有双果糖酐I的酶反应液中添加酶反应液固形物含量0.2%-2%的活性炭，在80℃下温育30min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；
（2）浓缩：将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为20%-40%的浓缩液；
（3）喷雾干燥：将麦芽糊精与以固形物含量干基计的双果糖酐I浓缩液按照重量比1︰1-5 的比例混合，控制进风温度170-180℃、出风温度为70-80℃，喷雾干燥，得到含麦芽糊精的双果糖酐I粉末。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述双果糖酐I晶体的制备方法如下：
（1）脱色：在含有双果糖酐I的酶反应液中添加酶反应液固形物含量0.2%-2%的活性炭，在80℃下温育30min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；
（2）结晶：将脱色液浓缩至固形物含量为60%-95%的浓缩液，快速降温至50℃，缓慢均匀添加双果糖酐I晶种，向浓缩液中缓慢加入0.2-2倍浓缩液体积的乙醇，通过12h的缓慢降温过程温度降至10℃，得含双果糖酐I晶体的糖膏，用乙醇清洗去除晶体表面的杂质，离心分离，真空干燥至恒重，得双果糖酐I晶体。
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