CN110241151A - 一种海藻糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海藻糖的制备方法，以土豆粉为原料，通过加入β‑淀粉酶可将土豆粉中的淀粉分解成麦芽糖，麦芽糖在麦芽糖磷酸化酶的作用下添加上磷酸基团，并通过海藻糖合成酶合成海藻糖。另外，通过截留分子量为500～600Da、200～300Da的纳滤膜进行分离，经大孔吸附树脂脱色，离子交换柱洗脱除盐，浓缩结晶，可显著提高海藻糖的纯度，且产品均一性好、质量稳定。
Description
技术领域
本发明涉及海藻糖领域，尤其是一种海藻糖的制备方法。
背景技术
海藻糖又称漏芦糖、蕈糖，是一种安全、可靠的天然糖类，其是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，在自然界中许多可食用动植物及微生物体内都广泛存在，如人们日常生活中食用的蘑菇类、海藻类、豆类、虾、面包、啤酒及酵母发酵食品。
海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下其在细胞表面能形成独特的保护膜，可有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。许多对外界恶劣环境表现出非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。而自然界中如麦芽糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料，大大拓展了海藻糖作为天然食用甜味糖的功能。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种海藻糖的制备方法，具有高的收率和纯度。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种海藻糖的制备方法，包括以下步骤：
1)将土豆粉加入到水中，在温度为50～80℃下研磨成浆，得到土豆粉浆料；
2)将步骤2)得到的土豆粉浆料中加入淀粉酶，在40～50℃下酶解4～5h，得到酶解液；
3)将步骤2)得到的酶解液在温度为100～120℃下进行灭酶，离心取上层清液；
4)将步骤3)得到的上层清液中加入麦芽糖磷酸化酶在温度为40～50℃下反应10～15h，并在100～120℃下灭酶，得到麦芽糖磷酸化酶解产物；
5)将步骤4)得到的麦芽糖磷酸化酶解产物中加入海藻糖合成酶在20～30℃下反应15～20h，并在100～120℃下灭酶，得到海藻糖合成酶酶解产物；
6)向步骤5)得到的海藻糖合成酶酶解产物中加入乙醇，将温度升至50～60℃后离心得到上层清液；
7)将步骤6)得到的上层清液依次采用截留分子量为500～600Da、200～300Da的纳滤膜分离得到过滤液；
8)将步骤7)得到的过滤液经大孔吸附树脂脱色，再经离子交换柱洗脱除盐，得到洗脱液；
9)将步骤8)得到的洗脱液浓缩、结晶、干燥，即得海藻糖。
优选地，步骤1)中，所述土豆粉与所述水的质量比为1：(4～5)。
优选地于，步骤2)中，所述淀粉酶的加入量为每100g土豆粉浆料中加入活性单位为100～150U的纤维素酶。
优选地，步骤4)中，所述麦芽糖磷酸化酶的加入量为每100g上层清液中加入活性单位为80～100U的麦芽糖磷酸化酶。
优选地，步骤5)中，所述海藻糖合成酶的加入量为每100g麦芽糖磷酸化酶解产物中加入活性单位为80～100U的海藻糖合成酶。
优选地，步骤7)具体为，将上层清液10～15倍后得到稀释液，稀释液通入截留分子量为500～600Da的纳滤膜，分离得到一级过滤液；
向一级过滤液中加入去离子水后通入截留分子量为200～300Da的纳滤膜，分离得到过滤液。
优选地，步骤8)具体为经大孔吸附树脂在室温下以0.5～2.5ml/min的流速洗脱脱色，流动相为温度为50～60℃乙醇，收集洗脱液；将大孔吸附树脂洗脱脱色处理的洗脱液依次经阳离子交换柱和阴离子交换柱洗脱除盐，洗脱流速均为0.5～2.5ml/min，流动相为温度为50～60℃乙醇，得到洗脱液。
优选地，步骤9)具体为，所述浓缩温度为60～80℃，将洗脱液浓缩至质量浓度为60～80％后，开始降温，降温梯度为每隔2～3h降温4～6℃；
本发明提供的一种海藻糖的制备方法，以土豆粉为原料，通过加入β-淀粉酶可将土豆粉中的淀粉分解成麦芽糖，麦芽糖在麦芽糖磷酸化酶的作用下添加上磷酸基团，并通过海藻糖合成酶合成海藻糖。另外，通过截留分子量为500～600Da、200～300Da的纳滤膜进行分离，经大孔吸附树脂脱色，离子交换柱洗脱除盐，浓缩结晶，可显著提高海藻糖的纯度，且产品均一性好、质量稳定。
具体实施方式
本发明提供的一种海藻糖的制备方法，包括以下步骤：
1)将土豆粉加入到水中，在温度为50～80℃下研磨成浆，得到土豆粉浆料；
2)将步骤2)得到的土豆粉浆料中加入淀粉酶，在40～50℃下酶解4～5h，得到酶解液；
3)将步骤2)得到的酶解液在温度为100～120℃下进行灭酶，离心取上层清液；
4)将步骤3)得到的上层清液中加入麦芽糖磷酸化酶在温度为40～50℃下反应10～15h，并在100～120℃下灭酶，得到麦芽糖磷酸化酶解产物；
5)将步骤4)得到的麦芽糖磷酸化酶解产物中加入海藻糖合成酶在20～30℃下反应15～20h，并在100～120℃下灭酶，得到海藻糖合成酶酶解产物；
6)向步骤5)得到的海藻糖合成酶酶解产物中加入乙醇，将温度升至50～60℃后离心得到上层清液；
7)将步骤6)得到的上层清液依次采用截留分子量为500～600Da、200～300Da的纳滤膜分离得到过滤液；
8)将步骤7)得到的过滤液经大孔吸附树脂脱色，再经离子交换柱洗脱除盐，得到洗脱液；
9)将步骤8)得到的洗脱液浓缩、结晶、干燥，即得海藻糖。
将土豆粉加入到水中，在温度为50～80℃下研磨成浆，得到土豆粉浆料；在本发明的实施例中，土豆粉与水的质量比为1：(4～5)。
将得到的土豆粉浆料中加入β-淀粉酶，在40～50℃下酶解4～5h，得到酶解液；上述中β-淀粉酶能够将土豆粉浆料中的淀粉分解成麦芽糖；在本发明的实施例中，淀粉酶的加入量为每100g土豆粉浆料中加入活性单位为100～150U的淀粉酶。
将酶解液在温度为100～120℃下进行灭酶，离心取上层清液；该步骤能够将β-淀粉酶失活，避免β-淀粉酶影响后续步骤。
将上层清液中加入麦芽糖磷酸化酶在温度为40～50℃下反应10～15h，并在100～120℃下灭酶，得到麦芽糖磷酸化酶解产物；上述步骤能够使得麦芽糖上添加磷酸基团；在本发明的实施例中，麦芽糖磷酸化酶的加入量为每100g上层清液中加入活性单位为80～100U的麦芽糖磷酸化酶。
将麦芽糖磷酸化酶解产物中加入海藻糖合成酶在20～30℃下反应15～20h，并在100～120℃下灭酶，得到海藻糖合成酶酶解产物；上述步骤使得含磷酸基团的麦芽糖能够在海藻糖合成酶的作用下合成海藻糖。在本发明的实施例中，海藻糖合成酶的加入量为每100g麦芽糖磷酸化酶解产物中加入活性单位为80～100U的海藻糖合成酶。
海藻糖合成酶酶解产物中加入乙醇，将温度升至50～60℃后离心得到上层清液；上述中，海藻糖合成酶酶解产物中除含有海藻糖之外，还含有其他物质，该步骤能够有效除去不溶于乙醇的杂质。
将上层清液依次采用截留分子量为500～600Da、200～300Da的纳滤膜分离得到过滤液；上述步骤能够提高海藻糖的纯度。在本发明的实施例中，将上层清液10～15倍后得到稀释液，稀释液通入截留分子量为500～600Da的纳滤膜，分离得到一级过滤液；向一级过滤液中加入去离子水后通入截留分子量为200～300Da的纳滤膜，分离得到过滤液。
需要说明的是，向一级过滤液中加入去离子水后的体积与稀释液的体积相同，这样可提高海藻糖的纯度。
将过滤液经大孔吸附树脂脱色，再经离子交换柱洗脱除盐，得到洗脱液；在本发明的实施例中，经大孔吸附树脂在室温下以0.5～2.5ml/min的流速洗脱脱色，流动相为温度为50～60℃乙醇，收集洗脱液；将大孔吸附树脂洗脱脱色处理的洗脱液依次经阳离子交换柱和阴离子交换柱洗脱除盐，洗脱流速均为0.5～2.5ml/min，流动相为温度为50～60℃乙醇，得到洗脱液。
将洗脱液浓缩、结晶、干燥，即得海藻糖；在本发明的实施例中，浓缩温度为60～80℃，将洗脱液浓缩至质量浓度为60～80％后，开始降温，降温梯度为每隔2～3h降温4～6℃；通过结晶步骤可进一步提高海藻糖的纯度。
本发明以土豆粉为原料，通过加入β-淀粉酶可将土豆粉中的淀粉分解成麦芽糖，麦芽糖在麦芽糖磷酸化酶的作用下添加上磷酸基团，并通过海藻糖合成酶合成海藻糖。另外，通过截留分子量为500～600Da、200～300Da的纳滤膜进行分离，经大孔吸附树脂脱色，离子交换柱洗脱除盐，浓缩结晶，可显著提高海藻糖的纯度，且产品均一性好、质量稳定。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种海藻糖的制备方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1)将土豆粉加入到水中，在温度为50℃下研磨成浆，得到土豆粉浆料；土豆粉与水的质量比为1：4。
2)将步骤2)得到的土豆粉浆料中加入淀粉酶，在40℃下酶解5h，得到酶解液；淀粉酶的加入量为每100g土豆粉浆料中加入活性单位为100U的淀粉酶；
3)将步骤2)得到的酶解液在温度为100℃下进行灭酶，离心取上层清液；
4)将步骤3)得到的上层清液中加入麦芽糖磷酸化酶在温度为40℃下反应10h，并在100℃下灭酶，得到麦芽糖磷酸化酶解产物；麦芽糖磷酸化酶的加入量为每100g上层清液中加入活性单位为80U的麦芽糖磷酸化酶；
5)将步骤4)得到的麦芽糖磷酸化酶解产物中加入海藻糖合成酶在20℃下反应15h，并在100℃下灭酶，得到海藻糖合成酶酶解产物；海藻糖合成酶的加入量为每100g麦芽糖磷酸化酶解产物中加入活性单位为80U的海藻糖合成酶；
6)向步骤5)得到的海藻糖合成酶酶解产物中加入乙醇，将温度升至50℃后离心得到上层清液；
7)将步骤6)得到的上层清液稀释10倍后得到稀释液，稀释液通入截留分子量为500Da的纳滤膜，分离得到一级过滤液；向一级过滤液中加入去离子水，加入去离子后的体积与稀释液的体积相同，再通入截留分子量为200Da的纳滤膜，分离得到过滤液；
8)将步骤7)得到的过滤液经大孔吸附树脂在室温下以0.5ml/min的流速洗脱脱色，流动相为温度为50℃乙醇，收集洗脱液；将大孔吸附树脂洗脱脱色处理的洗脱液依次经阳离子交换柱和阴离子交换柱洗脱除盐，洗脱流速均为0.5ml/min，流动相为温度为50℃乙醇，得到洗脱液；
9)将步骤8)得到的洗脱液在温度为60℃下浓缩，将洗脱液浓缩至质量浓度为60％后，开始降温，降温梯度为每隔2h降温4℃，直至温度为30℃，最后干燥，即得海藻糖。
实施例2
1)将土豆粉加入到水中，在温度为80℃下研磨成浆，得到土豆粉浆料；土豆粉与水的质量比为1：5。
2)将步骤2)得到的土豆粉浆料中加入淀粉酶，在50℃下酶解4h，得到酶解液；淀粉酶的加入量为每100g土豆粉浆料中加入活性单位为150U的淀粉酶；
3)将步骤2)得到的酶解液在温度为120℃下进行灭酶，离心取上层清液；
4)将步骤3)得到的上层清液中加入麦芽糖磷酸化酶在温度为50℃下反应15h，并在120℃下灭酶，得到麦芽糖磷酸化酶解产物；麦芽糖磷酸化酶的加入量为每100g上层清液中加入活性单位为100U的麦芽糖磷酸化酶；
5)将步骤4)得到的麦芽糖磷酸化酶解产物中加入海藻糖合成酶在30℃下反应20h，并在120℃下灭酶，得到海藻糖合成酶酶解产物；海藻糖合成酶的加入量为每100g麦芽糖磷酸化酶解产物中加入活性单位为100U的海藻糖合成酶；
6)向步骤5)得到的海藻糖合成酶酶解产物中加入乙醇，将温度升至60℃后离心得到上层清液；
7)将步骤6)得到的上层清液稀释15倍后得到稀释液，稀释液通入截留分子量为600Da的纳滤膜，分离得到一级过滤液；向一级过滤液中加入去离子水，加入去离子后的体积与稀释液的体积相同，再通入截留分子量为300Da的纳滤膜，分离得到过滤液；
8)将步骤7)得到的过滤液经大孔吸附树脂在室温下以2.5ml/min的流速洗脱脱色，流动相为温度为60℃乙醇，收集洗脱液；将大孔吸附树脂洗脱脱色处理的洗脱液依次经阳离子交换柱和阴离子交换柱洗脱除盐，洗脱流速均为2.5ml/min，流动相为温度为60℃乙醇，得到洗脱液；
9)将步骤8)得到的洗脱液在温度为80℃下浓缩，将洗脱液浓缩至质量浓度为80％后，开始降温，降温梯度为每隔3h降温6℃，直至温度为30℃，最后干燥，即得海藻糖。
实施例3
1)将土豆粉加入到水中，在温度为65℃下研磨成浆，得到土豆粉浆料；土豆粉与水的质量比为1：4.5。
2)将步骤2)得到的土豆粉浆料中加入淀粉酶，在45℃下酶解5h，得到酶解液；淀粉酶的加入量为每100g土豆粉浆料中加入活性单位为120U的淀粉酶；
3)将步骤2)得到的酶解液在温度为110℃下进行灭酶，离心取上层清液；
4)将步骤3)得到的上层清液中加入麦芽糖磷酸化酶在温度为45℃下反应12h，并在110℃下灭酶，得到麦芽糖磷酸化酶解产物；麦芽糖磷酸化酶的加入量为每100g上层清液中加入活性单位为90U的麦芽糖磷酸化酶；
5)将步骤4)得到的麦芽糖磷酸化酶解产物中加入海藻糖合成酶在25℃下反应18h，并在120℃下灭酶，得到海藻糖合成酶酶解产物；海藻糖合成酶的加入量为每100g麦芽糖磷酸化酶解产物中加入活性单位为90U的海藻糖合成酶；
6)向步骤5)得到的海藻糖合成酶酶解产物中加入乙醇，将温度升至55℃后离心得到上层清液；
7)将步骤6)得到的上层清液稀释12倍后得到稀释液，稀释液通入截留分子量为500Da的纳滤膜，分离得到一级过滤液；向一级过滤液中加入去离子水，加入去离子后的体积与稀释液的体积相同，再通入截留分子量为200Da的纳滤膜，分离得到过滤液；
8)将步骤7)得到的过滤液经大孔吸附树脂在室温下以2ml/min的流速洗脱脱色，流动相为温度为55℃乙醇，收集洗脱液；将大孔吸附树脂洗脱脱色处理的洗脱液依次经阳离子交换柱和阴离子交换柱洗脱除盐，洗脱流速均为2ml/min，流动相为温度为55℃乙醇，得到洗脱液；
9)将步骤8)得到的洗脱液在温度为70℃下浓缩，将洗脱液浓缩至质量浓度为70％后，开始降温，降温梯度为每隔2.5h降温5℃，直至温度为30℃，最后干燥，即得海藻糖。
对比例1
1)将土豆粉加入到水中，在温度为65℃下研磨成浆，得到土豆粉浆料；土豆粉与水的质量比为1：4.5。
2)将步骤2)得到的土豆粉浆料中加入淀粉酶，在45℃下酶解5h，得到酶解液；淀粉酶的加入量为每100g土豆粉浆料中加入活性单位为120U的淀粉酶；
3)将步骤2)得到的酶解液在温度为110℃下进行灭酶，离心取上层清液；
4)将步骤3)得到的上层清液中加入麦芽糖磷酸化酶在温度为45℃下反应12h，并在110℃下灭酶，得到麦芽糖磷酸化酶解产物；麦芽糖磷酸化酶的加入量为每100g上层清液中加入活性单位为90U的麦芽糖磷酸化酶；
5)将步骤4)得到的麦芽糖磷酸化酶解产物中加入海藻糖合成酶在25℃下反应18h，并在120℃下灭酶，得到海藻糖合成酶酶解产物；海藻糖合成酶的加入量为每100g麦芽糖磷酸化酶解产物中加入活性单位为90U的海藻糖合成酶；
6)向步骤5)得到的海藻糖合成酶酶解产物中加入乙醇，将温度升至55℃后离心得到上层清液；
7)将步骤6)得到的上层清液稀释12倍后得到稀释液，稀释液依次通入截留分子量为500Da的纳滤膜及截留分子量为200Da的纳滤膜，分离得到过滤液；
8)将步骤7)得到的过滤液经大孔吸附树脂在室温下以2ml/min的流速洗脱脱色，流动相为温度为55℃乙醇，收集洗脱液；将大孔吸附树脂洗脱脱色处理的洗脱液依次经阳离子交换柱和阴离子交换柱洗脱除盐，洗脱流速均为2ml/min，流动相为温度为55℃乙醇，得到洗脱液；
9)将步骤8)得到的洗脱液在温度为70℃下浓缩，将洗脱液浓缩至质量浓度为70％后，开始降温，降温梯度为每隔2.5h降温5℃，直至温度为30℃，最后干燥，即得海藻糖。
对比例2
1)将土豆粉加入到水中，在温度为65℃下研磨成浆，得到土豆粉浆料；土豆粉与水的质量比为1：4.5。
2)将步骤2)得到的土豆粉浆料中加入淀粉酶，在45℃下酶解5h，得到酶解液；淀粉酶的加入量为每100g土豆粉浆料中加入活性单位为120U的淀粉酶；
3)将步骤2)得到的酶解液在温度为110℃下进行灭酶，离心取上层清液；
4)将步骤3)得到的上层清液中加入麦芽糖磷酸化酶在温度为45℃下反应12h，并在110℃下灭酶，得到麦芽糖磷酸化酶解产物；麦芽糖磷酸化酶的加入量为每100g上层清液中加入活性单位为90U的麦芽糖磷酸化酶；
5)将步骤4)得到的麦芽糖磷酸化酶解产物中加入海藻糖合成酶在25℃下反应18h，并在120℃下灭酶，得到海藻糖合成酶酶解产物；海藻糖合成酶的加入量为每100g麦芽糖磷酸化酶解产物中加入活性单位为90U的海藻糖合成酶；
6)向步骤5)得到的海藻糖合成酶酶解产物中加入乙醇，将温度升至55℃后离心得到上层清液；
7)将步骤6)得到的上层清液稀释12倍后得到稀释液，稀释液通入截留分子量为500Da的纳滤膜，分离得到一级过滤液；向一级过滤液中加入去离子水，加入去离子后的体积与稀释液的体积相同，再通入截留分子量为200Da的纳滤膜，分离得到过滤液；
8)将步骤7)得到的过滤液经大孔吸附树脂在室温下以2ml/min的流速洗脱脱色，流动相为温度为30℃乙醇，收集洗脱液；将大孔吸附树脂洗脱脱色处理的洗脱液依次经阳离子交换柱和阴离子交换柱洗脱除盐，洗脱流速均为2ml/min，流动相为温度为30℃乙醇，得到洗脱液；
9)将步骤8)得到的洗脱液在温度为70℃下浓缩，将洗脱液浓缩至质量浓度为70％后，开始降温，降温梯度为每隔2.5h降温5℃，直至温度为30℃，最后干燥，即得海藻糖。
对比例3
1)将土豆粉加入到水中，在温度为65℃下研磨成浆，得到土豆粉浆料；土豆粉与水的质量比为1：4.5。
2)将步骤2)得到的土豆粉浆料中加入淀粉酶，在45℃下酶解5h，得到酶解液；淀粉酶的加入量为每100g土豆粉浆料中加入活性单位为120U的淀粉酶；
3)将步骤2)得到的酶解液在温度为110℃下进行灭酶，离心取上层清液；
4)将步骤3)得到的上层清液中加入麦芽糖磷酸化酶在温度为45℃下反应12h，并在110℃下灭酶，得到麦芽糖磷酸化酶解产物；麦芽糖磷酸化酶的加入量为每100g上层清液中加入活性单位为90U的麦芽糖磷酸化酶；
5)将步骤4)得到的麦芽糖磷酸化酶解产物中加入海藻糖合成酶在25℃下反应18h，并在120℃下灭酶，得到海藻糖合成酶酶解产物；海藻糖合成酶的加入量为每100g麦芽糖磷酸化酶解产物中加入活性单位为90U的海藻糖合成酶；
6)向步骤5)得到的海藻糖合成酶酶解产物中加入乙醇，将温度升至55℃后离心得到上层清液；
7)将步骤6)得到的上层清液稀释12倍后得到稀释液，稀释液通入截留分子量为500Da的纳滤膜，分离得到一级过滤液；向一级过滤液中加入去离子水，加入去离子后的体积与稀释液的体积相同，再通入截留分子量为200Da的纳滤膜，分离得到过滤液；
8)将步骤7)得到的过滤液经大孔吸附树脂在室温下以2ml/min的流速洗脱脱色，流动相为温度为55℃乙醇，收集洗脱液；将大孔吸附树脂洗脱脱色处理的洗脱液依次经阳离子交换柱和阴离子交换柱洗脱除盐，洗脱流速均为2ml/min，流动相为温度为55℃乙醇，得到洗脱液；
9)将步骤8)得到的洗脱液在温度为70℃下浓缩，将洗脱液浓缩至质量浓度为70％后，直接降温至30℃，最后干燥，即得海藻糖。
对比例4
1)将土豆粉加入到水中，在温度为65℃下研磨成浆，得到土豆粉浆料；土豆粉与水的质量比为1：4.5。
2)将步骤2)得到的土豆粉浆料中加入淀粉酶，在45℃下酶解5h，得到酶解液；淀粉酶的加入量为每100g土豆粉浆料中加入活性单位为80U的淀粉酶；
3)将步骤2)得到的酶解液在温度为110℃下进行灭酶，离心取上层清液；
4)将步骤3)得到的上层清液中加入麦芽糖磷酸化酶在温度为45℃下反应12h，并在110℃下灭酶，得到麦芽糖磷酸化酶解产物；麦芽糖磷酸化酶的加入量为每100g上层清液中加入活性单位为90U的麦芽糖磷酸化酶；
5)将步骤4)得到的麦芽糖磷酸化酶解产物中加入海藻糖合成酶在25℃下反应18h，并在120℃下灭酶，得到海藻糖合成酶酶解产物；海藻糖合成酶的加入量为每100g麦芽糖磷酸化酶解产物中加入活性单位为90U的海藻糖合成酶；
6)向步骤5)得到的海藻糖合成酶酶解产物中加入乙醇，将温度升至55℃后离心得到上层清液；
7)将步骤6)得到的上层清液稀释12倍后得到稀释液，稀释液通入截留分子量为500Da的纳滤膜，分离得到一级过滤液；向一级过滤液中加入去离子水，加入去离子后的体积与稀释液的体积相同，再通入截留分子量为200Da的纳滤膜，分离得到过滤液；
8)将步骤7)得到的过滤液经大孔吸附树脂在室温下以2ml/min的流速洗脱脱色，流动相为温度为55℃乙醇，收集洗脱液；将大孔吸附树脂洗脱脱色处理的洗脱液依次经阳离子交换柱和阴离子交换柱洗脱除盐，洗脱流速均为2ml/min，流动相为温度为55℃乙醇，得到洗脱液；
9)将步骤8)得到的洗脱液在温度为70℃下浓缩，将洗脱液浓缩至质量浓度为70％后，开始降温，降温梯度为每隔2.5h降温5℃，直至温度为30℃，最后干燥，即得海藻糖。
对比例5
1)将土豆粉加入到水中，在温度为65℃下研磨成浆，得到土豆粉浆料；土豆粉与水的质量比为1：4.5。
2)将步骤2)得到的土豆粉浆料中加入淀粉酶，在45℃下酶解5h，得到酶解液；淀粉酶的加入量为每100g土豆粉浆料中加入活性单位为120U的淀粉酶；
3)将步骤2)得到的酶解液在温度为110℃下进行灭酶，离心取上层清液；
4)将步骤3)得到的上层清液中加入麦芽糖磷酸化酶在温度为45℃下反应12h，并在110℃下灭酶，得到麦芽糖磷酸化酶解产物；麦芽糖磷酸化酶的加入量为每100g上层清液中加入活性单位为60U的麦芽糖磷酸化酶；
5)将步骤4)得到的麦芽糖磷酸化酶解产物中加入海藻糖合成酶在25℃下反应18h，并在120℃下灭酶，得到海藻糖合成酶酶解产物；海藻糖合成酶的加入量为每100g麦芽糖磷酸化酶解产物中加入活性单位为90U的海藻糖合成酶；
6)向步骤5)得到的海藻糖合成酶酶解产物中加入乙醇，将温度升至55℃后离心得到上层清液；
7)将步骤6)得到的上层清液稀释12倍后得到稀释液，稀释液通入截留分子量为500Da的纳滤膜，分离得到一级过滤液；向一级过滤液中加入去离子水，加入去离子后的体积与稀释液的体积相同，再通入截留分子量为200Da的纳滤膜，分离得到过滤液；
8)将步骤7)得到的过滤液经大孔吸附树脂在室温下以2ml/min的流速洗脱脱色，流动相为温度为55℃乙醇，收集洗脱液；将大孔吸附树脂洗脱脱色处理的洗脱液依次经阳离子交换柱和阴离子交换柱洗脱除盐，洗脱流速均为2ml/min，流动相为温度为55℃乙醇，得到洗脱液；
9)将步骤8)得到的洗脱液在温度为70℃下浓缩，将洗脱液浓缩至质量浓度为70％后，开始降温，降温梯度为每隔2.5h降温5℃，直至温度为30℃，最后干燥，即得海藻糖。
对比例6
1)将土豆粉加入到水中，在温度为65℃下研磨成浆，得到土豆粉浆料；土豆粉与水的质量比为1：4.5。
2)将步骤2)得到的土豆粉浆料中加入淀粉酶，在45℃下酶解5h，得到酶解液；淀粉酶的加入量为每100g土豆粉浆料中加入活性单位为120U的淀粉酶；
3)将步骤2)得到的酶解液在温度为110℃下进行灭酶，离心取上层清液；
4)将步骤3)得到的上层清液中加入麦芽糖磷酸化酶在温度为45℃下反应12h，并在110℃下灭酶，得到麦芽糖磷酸化酶解产物；麦芽糖磷酸化酶的加入量为每100g上层清液中加入活性单位为90U的麦芽糖磷酸化酶；
5)将步骤4)得到的麦芽糖磷酸化酶解产物中加入海藻糖合成酶在25℃下反应18h，并在120℃下灭酶，得到海藻糖合成酶酶解产物；海藻糖合成酶的加入量为每100g麦芽糖磷酸化酶解产物中加入活性单位为60U的海藻糖合成酶；
6)向步骤5)得到的海藻糖合成酶酶解产物中加入乙醇，将温度升至55℃后离心得到上层清液；
7)将步骤6)得到的上层清液稀释12倍后得到稀释液，稀释液通入截留分子量为500Da的纳滤膜，分离得到一级过滤液；向一级过滤液中加入去离子水，加入去离子后的体积与稀释液的体积相同，再通入截留分子量为200Da的纳滤膜，分离得到过滤液；
8)将步骤7)得到的过滤液经大孔吸附树脂在室温下以2ml/min的流速洗脱脱色，流动相为温度为55℃乙醇，收集洗脱液；将大孔吸附树脂洗脱脱色处理的洗脱液依次经阳离子交换柱和阴离子交换柱洗脱除盐，洗脱流速均为2ml/min，流动相为温度为55℃乙醇，得到洗脱液；
9)将步骤8)得到的洗脱液在温度为70℃下浓缩，将洗脱液浓缩至质量浓度为70％后，开始降温，降温梯度为每隔2.5h降温5℃，直至温度为30℃，最后干燥，即得海藻糖。
测量实施例1～3和对比例1～6得到的海藻糖的收率和纯度，结果见表1。
表1 实施例1～3和对比例1～6的实验结果
从表1可以看出，实施例1～3相比于对比例1～6，本发明提供的制备方法可同时提高海藻糖的收率和纯度；且根据实施例3与对比例1相比，通入不同截留分子量的纳滤膜之前，先进行稀释，这样可显著提高海藻糖的纯度；实施例3与对比例2相比，采用温度相对高的乙醇作为大孔吸附树脂、离子交换柱，可显著提高海藻糖的纯度，同时提高海藻糖的收率；实施例3与对比例3相比，阶梯式降温能够提高海藻糖的收率和纯度；实施例3与对比例4相比，淀粉酶的加入量低，会降低海藻糖的收率；实施例3与对比例5相比，麦芽糖磷酸化酶的加入量低，会降低海藻糖的收率；实施例3与对比例6相比，海藻糖合成酶的加入量低，会对海藻糖的收率产生影响。
上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖性特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种海藻糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将土豆粉加入到水中，在温度为50～80℃下研磨成浆，得到土豆粉浆料；
2)将步骤2)得到的土豆粉浆料中加入β-淀粉酶，在40～50℃下酶解4～5h，得到酶解液；
3)将步骤2)得到的酶解液在温度为100～120℃下进行灭酶，离心取上层清液；
4)将步骤3)得到的上层清液中加入麦芽糖磷酸化酶在温度为40～50℃下反应10～15h，并在100～120℃下灭酶，得到麦芽糖磷酸化酶解产物；
5)将步骤4)得到的麦芽糖磷酸化酶解产物中加入海藻糖合成酶在20～30℃下反应15～20h，并在100～120℃下灭酶，得到海藻糖合成酶酶解产物；
6)向步骤5)得到的海藻糖合成酶酶解产物中加入乙醇，将温度升至50～60℃后离心得到上层清液；
7)将步骤6)得到的上层清液依次采用截留分子量为500～600Da、200～300Da的纳滤膜分离得到过滤液；
8)将步骤7)得到的过滤液经大孔吸附树脂脱色，再经离子交换柱洗脱除盐，得到洗脱液；
9)将步骤8)得到的洗脱液浓缩、结晶、干燥，即得海藻糖。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，土豆粉与水的质量比为1：(4～5)。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，淀粉酶的加入量为每100g土豆粉浆料中加入活性单位为100～150U的淀粉酶。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，麦芽糖磷酸化酶的加入量为每100g上层清液中加入活性单位为80～100U的麦芽糖磷酸化酶。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中，海藻糖合成酶的加入量为每100g麦芽糖磷酸化酶解产物中加入活性单位为80～100U的海藻糖合成酶。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤7)具体为，将上层清液10～15倍后得到稀释液，稀释液通入截留分子量为500～600Da的纳滤膜，分离得到一级过滤液；
向一级过滤液中加入去离子水后通入截留分子量为200～300Da的纳滤膜，分离得到过滤液。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤8)具体为经大孔吸附树脂在室温下以0.5～2.5ml/min的流速洗脱脱色，流动相为温度为50～60℃乙醇，收集洗脱液；将大孔吸附树脂洗脱脱色处理的洗脱液依次经阳离子交换柱和阴离子交换柱洗脱除盐，洗脱流速均为0.5～2.5ml/min，流动相为温度为50～60℃乙醇，得到洗脱液。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤9)具体为，浓缩温度为60～80℃，将洗脱液浓缩至质量浓度为60～80％后，开始降温，降温梯度为每隔2～3h降温4～6℃，直至温度为30℃。
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|---|---|---|---|
| CN201910533033.5A CN110241151A (zh) | 2019-06-19 | 2019-06-19 | 一种海藻糖的制备方法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111996224A (zh) * | 2020-06-12 | 2020-11-27 | 安徽民祯生物工程有限公司 | 一种大米发酵生产海藻糖的方法 |
| CN112941130A (zh) * | 2021-04-20 | 2021-06-11 | 江苏省奥谷生物科技有限公司 | 一种多酶复配生产海藻糖的方法 |
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2019
- 2019-06-19 CN CN201910533033.5A patent/CN110241151A/zh not_active Withdrawn
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