AT17271U1 - Neutrale humane Milch-Oligosaccharide (HMOs) aus mikrobieller Fermentation - Google Patents

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AT17271U1 ATGM50165/2019U AT501652019U AT17271U1 AT 17271 U1 AT17271 U1 AT 17271U1 AT 501652019 U AT501652019 U AT 501652019U AT 17271 U1 AT17271 U1 AT 17271U1
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Abstract

Die vorliegende Anmeldung offenbart (ein) gereinigte(s) HMOs, die in fester Form durch Sprühtrocknung oder als kristallines Material erhalten werden können. Die bereitgestellten HMOs sind frei von Proteinen und rekombinantem Material, das aus den verwendeten rekombinanten mikrobiellen Stämmen stammt, und daher sehr gut zur Verwendung in Anwendungen für Lebensmittel, medizinische Lebensmittel und Futtermittel (z. B. Haustierfutter) geeignet.

Description

Beschreibung
[0001] Die vorliegende Anmeldung offenbart ein einfaches Verfahren zur Reinigung von neutralen humanen Milch-Oligosacchariden (HMOs), die durch mikrobielle Fermentation hergestellt wurden. Das Verfahren verwendet eine Kombination aus einer Behandlung mit einem kationischen lonenaustauscher, einer Behandlung mit einem anionischen lonenaustauscher und einem Nanofiltrations- und/oder Elektrodialyseschritt, der eine effiziente Reinigung großer Mengen neutraler HMOs hoher Reinheit erlaubt. Im Gegensatz zu der Reinigung, die gegenwärtig bei der fermentativen Herstellung von neutralen HMOs verwendet wird, ermöglicht das vorgestellte Verfahren die Bereitstellung von HMOs ohne die Notwendigkeit einer chromatographischen Trennung. Die so gereinigten HMOs gemäß der vorliegenden Leistung können in fester Form durch Sprühtrocknung, als kristallines Material oder als sterilfiltriertes Konzentrat erhalten werden. Die bereitgestellten HMOs gemäß der vorliegenden Leistung sind frei von Proteinen und rekombinantem Material, das aus den verwendeten rekombinanten Mikrobenstämmen stammt, und daher sehr gut zur Verwendung in Anwendungen für Lebensmittel, medizinische Lebensmittel und Futtermittel (z. B. Haustierfutter) geeignet.
[0002] Humane Muttermilch stellt eine komplexe Mischung aus Kohlenhydraten, Fetten, Proteinen, Vitaminen, Mineralstoffen und Spurenelementen dar. Die bei weitem überwiegende Fraktion wird durch Kohlenhydrate repräsentiert, die sich weiter in Lactose und komplexere Oligosaccharide unterteilen lassen. Während Lactose als Energiequelle verwendet wird, werden die komplexen Oligosaccharide vom Säugling nicht metabolisiert. Die Fraktion der komplexen Oligosaccharide macht bis zu 1/10 der gesamten Kohlenhydratfraktion aus und besteht wahrscheinlich aus mehr als 150 verschiedenen Oligosacchariden. Das Vorkommen und die Konzentration dieser komplexen Oligosaccharide sind für den Menschen spezifisch und können daher nicht in großen Mengen in der Milch anderer Säugetiere, wie beispielsweise domestizierten Milchtieren, gefunden werden.
[0003] Die Existenz dieser komplexen Oligosaccharide in der menschlichen Muttermilch ist bereits seit langem bekannt und die physiologischen Funktionen dieser Oligosaccharide wurden über viele Jahrzehnte medizinisch erforscht (Gura, T. (2014) Nature’s first functional food. Science 345(6198) 747-749). Für einige der am häufigsten vorkommenden humanen Milch-Oligosaccharide wurden bereits spezifische Funktionen identifiziert (Bode, L. (2012) Human milk oligosaccharides: every baby needs a sugar mama. Glycobiology 22(9), 1147-1162.; Bode L, Jantscher-Krenn E (2012) Structurefunction relationships of human milk oligosaccharides. Adv Nutr 3(3) 383S-391S; Morrow AL, Ruiz-Palacios GM, Altaye M, Jiang X, Guerrero ML, MeinzenDerr JK, Farkas T, Chaturvedi P, Pickering LK, Newburg DS (2004) Human milk oligosaccharides are associated with protection against diarrhea in breast-fed infants. J Pediatr 145(3) 297-303).
[0004] Das begrenzte Angebot und die Schwierigkeiten bei der Gewinnung reiner Fraktionen einzelner humaner Milch-Oligosaccharide führen zur Entwicklung chemischer Wege zu einigen dieser komplexen Moleküle. Die Synthese von humanen Milch-Oligosacchariden durch chemische Synthese, enzymatische Synthese oder Fermentation erwies sich jedoch als schwierig. Zumindest große Mengen sowie Qualitäten, die für Lebensmittelanwendungen ausreichend sind, können bis heute nicht bereitgestellt werden. In diesem Zusammenhang beinhalten insbesondere chemische Synthesewege zu humanen Milch-Oligosacchariden (z. B. 2-Fucosyllactose; siehe WO 2010/115935 A1) mehrere schädliche Chemikalien, die das Risiko einer Kontamination des Endprodukts mit sich bringen.
[0005] Aufgrund der Herausforderungen bei der chemischen Synthese von humanen Milch-Oligosacchariden wurden verschiedene enzymatische Methoden und fermentative Ansätze entwickelt (Miyazaki et al., (2010) Methods in Enzymol. 480, 511-524; Murata et al., (1999) Glycocon]j. J. 16, 189-195; Baumgartner, F. et al., (2013) Microb. Cell Fact. 12, 40; Lee et al., (2012) Microb. Cell Fact. 11, 48; U.S. 7 521 212 B1 oder Albermann et al., (2001) Carbohydr. Res. 334(2) S. 97103). Diese Verfahren liefern jedoch komplexe Gemische von Oligosacchariden, d. h. das gewünschte Produkt ist mit Ausgangsmaterial wie Lactose, Biosynthesezwischenprodukten und
Substraten wie einzelnen Monosacchariden und Polypeptiden usw. verunreinigt.
[0006] Verfahren nach dem Stand der Technik zur Reinigung einzelner Oligosaccharidprodukte aus diesen komplexen Gemischen sind technisch komplex und zudem für Lebensmittelanwendungen unwirtschaftlich. Zur Reinigung der Disaccharide Lactose oder Saccharose aus komplexen Gemischen wie Molke oder Melasse wurden großtechnische Verfahren entwickelt, die mehrere Kristallisationen beinhalten. Der Nachteil dieser Verfahren ist, dass sie aufwendig sind und nur zu geringen Ausbeuten führen.
[0007] Für die Reinigung von komplexen Oligosacchariden aus mikrobieller Fermentation, wie bestimmten humanen Milch-Oligosacchariden, ist Gelfiltrationschromatographie bislang die Methode der Wahl. Der Nachteil der Gelfiltrationschromatographie besteht darin, dass sie nicht effizient hochskaliert werden kann und für den kontinuierlichen Betrieb ungeeignet ist. Somit ist Gelfiltrationschromatographie nicht wirtschaftlich und macht es unmöglich, bestimmte humane MilchOligosaccharide - wie 2-Fucosyllactose oder Lacto-N-tetraose - in vernünftigen Mengen und einer Qualität zu liefern, um sie in der menschlichen Nahrung oder anderen Anwendungen, wie Tierfutter (z. B. Tiernahrung), zu verwenden. Die Anwendung als Tierfutter oder Haustiernahrung ist dahingehend interessant, dass auch andere Säugetiere in ihrer Milch die gleichen oder ähnliche neutrale komplexe Oligosaccharide wie der Mensch enthalten (z. B. kommt 2'-Fucosyllactose auch in der Milch von Hunden, Schweinen, Schimpansen vor) (Castanys-Munzo, E., Martin, J.M & Prieto, P.A. (2013) 2'-fucosyllactose: an abundant, genetically determined soluble glycan present in human milk. Nutr. Rev. 71(12) 773-789).
[0008] Ein weiteres Problem stellt sich bei der Verwendung rekombinanter Stämme (rekombinante Bakterien- oder Hefestämme) in der mikrobiellen Fermentation, was zur Kontamination des Fermentationsprodukts mit rekombinantem Material führt. Eine Kontamination mit rekombinanter DNA oder Proteinen ist jedoch heutzutage für Aufsichtsbehörden und Verbraucher nicht akzeptabel. Die Nachweisgrenzen insbesondere für rekombinante DNA-Moleküle sind sehr niedrig. Wenn ein Nachweis auf der Basis von qPCR angewendet wird, der derzeit als Goldstandard für den Nachweis angesehen wird, können selbst so wenige wie einzelne DNA-Moleküle nachgewiesen werden. Proteine bergen zusätzlich das Risiko von allergischen Reaktionen und sollten daher effizient aus dem gewünschten Oligosaccharidprodukt entfernt werden.
[0009] Die Elektrodialyse (ED) repräsentiert eine Technik, die Dialyse und Elektrolyse kombiniert und zur Trennung oder Konzentration von lonen in Lösungen auf Basis ihrer selektiven Elektromigration durch semipermeable Membranen eingesetzt werden kann. Erste industrielle Anwendungen der Elektrodialyse wurden bereits Anfang der 1960er Jahre mit der Demineralisierung von Käsemolke zum Einsatz für Säuglingsnahrung realisiert. Weiterhin entwickelte Anwendungen der Elektrodialyse umfassen die Einstellung des pH-Werts von Getränken wie Wein, Traubenmost, Apfelsaft und Orangensaft.
[0010] Die Entsalzung von Brackwasser zur Herstellung von Trinkwasser und die Demineralisierung von Milchmolke zur Herstellung von Säuglingsnahrung stellen heute das größte Anwendungsgebiet dar.
[0011] Das grundlegende Prinzip der Elektrodialyse besteht aus einer elektrolytischen Zelle, die aus einem Paar Elektroden aufgebaut ist, die zum Leiten von lonen in einen Elektrolyten eingetaucht sind, und die an einen Gleichstromgenerator angeschlossen sind. Die mit dem Pluspol (positiven Pol) des Gleichstromgenerators verbundene Elektrode ist die Anode, und die mit dem Minuspol (negativen Pol) verbundene Elektrode wird als Kathode bezeichnet. Die Elektrolytlösung unterstützt dann den Stromfluss, der sich aus der Bewegung von negativen und positiven Ladungsionen in Richtung Anode bzw. Kathode ergibt. Die bei der Elektrodialyse verwendeten Membranen sind im Wesentlichen Folien aus porösen lonenaustauscherharzen, die negative 0der positive Ladungsgruppen besitzen, und sie werden daher als kationische bzw. anionische Membran bezeichnet. Die lonenaustauschermembranen sind üblicherweise aus Polystyrol hergestellt, das eine geeignete funktionelle Gruppe (wie Sulfonsäure oder eine quaternäre Ammoniumgruppe für kationische bzw. anionische Membranen) trägt, welches mit Divinylbenzol vernetzt ist. Als Elektrolyt kann Natriumchlorid oder Natriumacetat, Natriumpropionat usw. verwendet wer-
den. Der Elektrodialysestapel wird dann so zusammengebaut, dass die anionischen und kationischen Membranen parallel, wie in einer Filterpresse, zwischen zwei Elektrodenblöcken liegen, so dass die Fließströmung, welche einer lonenabreicherung unterliegt, von der Fließströmung, die einer lonenanreicherung unterliegt, gut getrennt ist (auf die beiden Lösungen wird auch Bezug genommen als Diluat (unterliegt lonenabreicherung) und Konzentrat (unterliegt lonenanreicherung). Das Herzstück des Elektrodialyseprozesses ist der Membranstapel, der aus mehreren Anjonen- und Kationenaustauschermembranen besteht, die durch Abstandshalter voneinander getrennt sind, und zwischen zwei Elektroden installiert sind. Durch Anlegen eines elektrischen Gleichstroms wandern Anionen und Kationen durch die Membranen zu den Elektroden, wobei ein Diluat- (entsalzt) und ein Konzentrat Fluss erzeugt werden.
[0012] Im Allgemeinen ist die Porengröße der verwendeten Membranen eher klein, um eine Diffusion des Produkts aus dem Diluat in den Konzentratstrom zu verhindern, welche durch die häufig hohen Konzentrationsunterschiede zwischen den beiden Strömen angetrieben wird. Nach der Abtrennung von Biomasse müssen Proteine und insbesondere rekombinante DNA-Moleküle (in der Größe von gesamten Genomen) quantitativ aus dem gewünschten Produkt entfernt werden. Wenn überhaupt möglich, wäre die Elektrodialyse derart großer Moleküle (im Vergleich zur Molekülgröße von HMOs) langwierig und würde wohl mit erheblichen Verlusten des gewünschten Produkts aus dem Diluat in das Konzentrat einhergehen.
[0013] Diafiltration ist ein Verfahren, bei dem einer Lösung frisches Wasser zugesetzt wird, um membranpermeable Komponenten auszuwaschen oder zu entfernen. Somit kann eine Diafiltration verwendet werden, um Komponenten auf der Basis ihrer Molekülgröße unter Verwendung geeigneter Membranen zu trennen, wobei eine oder mehrere Spezies effizient zurückgehalten werden und andere Spezies membranpermeabel sind. Insbesondere ist eine Diafiltration unter Verwendung einer Nanofiltrationsmembran zur Trennung von niedermolekularen Verbindungen von Salzen wirksam. Im Allgemeinen besitzen Nanofiltrationsmembranen eine Molekulargewichtsausschlussgrenze (cut-off) im Bereich von 150 bis 300 Dalton. Heute wird Nanofiltration (NF) in der Milchindustrie häufig zur Konzentration und Demineralisierung von Molke eingesetzt. Nanofiltration wurde bereits zur Anreicherung einer humanen Milch-Oligosaccharidfraktion aus menschlicher Muttermilch eingesetzt. In diesem Ansatz wurde Nanofiltration in Kombination mit enzymatischem Abbau von Lactose verwendet, um die HMO-Fraktion von der Milchlactose abzutrennen (Sarney D.B, Hale, C., Frankel, G & Vulfson, E.N. (2000) A novel approach to the recovery of biological active oligosaccharides from milk using a combination of enzymatic treatment and nanofiltration. Biotechnol. Bioeng 69, 461-467).
[0014] In dem entwickelten Verfahren zur effizienten Reinigung von humanen Milch-Oligosacchariden in Lebensmittelqualität aus mikrobieller Fermentation wird eine Nanofiltration zum Konzentrieren des gewünschten Produkts und auch zum Entfernen membranpermeabler Salze eingesetzt.
[0015] Ausgehend von diesem Stand der Technik besteht ein technisches Problem in der Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Bereitstellung neutraler HMOs in hohen Mengen, hoher Reinheit und hervorragenden Ausbeuten.
[0016] Das technische Problem wird gelöst durch das humane Milch-Oligosaccharid (HMO) gemäß Anspruch 1 und die Verwendung des HMO gemäß Anspruch 12. Die abhängigen Ansprüche zeigen vorteilhafte Ausführungsformen. Das technische Problem wird auch gelöst durch das humane Milch-Oligosaccharid (HMO) gemäß Aspekt 15 und die Verwendung des HMO gemäß Aspekt 19. Die abhängigen Aspekte zeigen vorteilhafte Ausführungsformen.
[0017] Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren zur chargenweisen oder kontinuierlichen Reinigung von neutralen humanen Milch-Oligosacchariden (HMO) aus einer durch mikrobielle Fermentation erhaltenen Fermentationsbrühe, wobei eine gereinigte Lösung, umfassend ein neutrales HMO in einer Reinheit von = 80 % bereitgestellt wird. Die Fermentationsbrühe enthält das neutrale HMO, Biomasse, Mediumkomponenten und Kontaminanten. Die Reinheit des neutralen HMO in der Fermentationsbrühe beträgt < 80%.
[0018] Während des Prozesses wird die Fermentationsbrühe den folgenden Reinigungsschritten unterzogen:
ij) Abtrennung von Biomasse aus der Fermentationsbrühe,
il) Behandlung mit kationischem lonenaustauscher zur Entfernung von positiv geladenem Material,
il) Behandlung mit anionischem lonenaustauscher zur Entfernung von negativ geladenem Material,
iv) Nanofiltrationsschritt (umfassend oder bestehend aus Konzentration und/oder Diafiltration des neutralen HMO) und/oder Elektrodialyseschritt (insbesondere zur Entfernung von Salzen und anderen niedermolekularen Verbindungen).
[0019] In der zellfreien Fermentationsbrühe vorhandene Kontaminanten sind beispielsweise andere Oligosaccharide als das gewünschte neutrale HMO, wie einwertige und zweiwertige Salze, Aminosäuren, Polypeptide, Proteine, organische Säuren, Nukleinsäuren usw. Das gewünschte neutrale HMO kann bei einer Reinheit von = 80 % in der gereinigten Lösung erhalten werden.
[0020] Der Anmelder hat herausgefunden, dass mit dem beschriebenen Reinigungsverfahren eine effiziente Reinigung von neutralen HMOs aus der mikrobiellen Fermentation erreicht werden kann, die das HMO bei einer Reinheit liefert, die für Lebensmittel- und Futtermittelanwendungen geeignet ist. Darüber hinaus ist das Verfahren sehr kostengünstig, da kein chromatographischer Trennschritt erforderlich ist. Weiterhin wurde herausgefunden, dass die Reinheit von = 80 % erreicht wird, egal ob in Schritt iv) ein Elektrodialyseschritt oder ein Nanofiltrationsschritt durchgeführt wird oder ob beide Schritte nacheinander durchgeführt werden.
[0021] Ein Vorteil des Verfahrens gemäß der vorliegenden Offenbarung besteht darin, dass die gewünschten neutralen HMOSs frei von DNA und Proteinen aus dem verwendeten rekombinanten mikrobiellen Fermentationsstamm erhalten werden. Insbesondere die Durchführung einer kationischen lonenaustauscherbehandlung (Schritt ii) ermöglicht die Entfernung von positiv geladenem Material wie z. B. positiv geladenen Proteinen. Folglich stellt das erfindungsgemäße Verfahren ein HMO bereit, das im Vergleich zu herkömmlichen, im Stand der Technik bekannten Reinigungsschemata, die keine Kationenaustauscherbehandlung implementieren, weniger positiv geladenes Kontaminantenmaterial umfasst. Es wurde ferner festgestellt, dass nach dem Leiten der Fermentationsbrühe, die von der Biomasse (vorzugsweise durch Ultrafiltration) getrennt wurde, durch einen kationischen lonenaustauscher (in Protonenform), die erhaltene Lösung stabil war und bei Raumtemperatur oder unter Kühlung mehrere Wochen gelagert werden konnte. Darüber hinaus ist das erhaltene neutrale HMO frei von rekombinantem Material, wie durch quantitative PCR mit bis zu 50 Amplifikationszyklen beurteilt. Darüber hinaus zeichnet sich das Produkt gemäß der Leistung durch geringe Mengen oder Abwesenheit von Proteinen aus.
[0022] Weiterhin ist die Reinigung des neutralen HMO gemäß der Leistung mit bislang unbekannten Ausbeuten von > 70% (optional > 75%) gereinigtem HMO (bestimmt aus zellfreiem Fermentationsmedium zu HMO-Konzentrat) hocheffizient.
[0023] Somit wird ein Hybridverfahren bereitgestellt, das die Schritte der Trennung von Biomasse, lonenaustauscher und einen Schritt der Nanofiltration und/oder Elektrodialyse umfasst und vorzugsweise ferner eine Aktivkohlebehandlung umfasst, um neutrale HMOSs bei hoher Reinheit effizient und frei von rekombinantem genetischem Material, Endotoxinen und Proteinen aus Fermentationsprozessen unter Verwendung rekombinanter Fermentationsstämme bereitzustellen. Mit dem Verfahren gemäß der Offenbarung können auf sehr bequeme und wirtschaftliche Weise große Mengen an humanen Milch-Oligosacchariden hoher Qualität bereitgestellt werden.
[0024] Das neutrale HMO kann aus einer Fermentationsbrühe gereinigt werden, die durch mikrobielle Fermentation unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus, vorzugsweise Bakterien oder Hefe, besonders bevorzugt eines in einem chemisch definierten Medium herangezüchteten rekombinanten Mikroorganismus, erhalten wurde. Optional wird die in Schritt I) abgetrennte Biomasse in die mikrobielle Fermentation zurückgeführt.
[0025] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Offenbarung beträgt die Reinheit des neutralen HMO in der Fermentationsbrühe <70 %, <60 %, <50 %, <40 %, <30 %, <20 %, <10 % oder <=5 % und/oder die gereinigte Lösung enthält das neutrale HMO bei einer Reinheit von =85 %, vorzugsweise von =90 %.
[0026] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Offenbarung beträgt die Ausbeute des neutralen HMO >70% (optional > 75%) und/oder die gereinigte Lösung ist frei von DNA, Proteinen und/oder rekombinantem genetischem Material.
[0027] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das neutrale HMO ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2'-Fucosyllactose, 3-Fucosyllactose, 2',3-Difucosyllactose, Lacto-N-triose Il, Lacto-N-tetraose, Lacto-N-neotetraose, Lacto-N-fucopentaose I, Lacto-N-neofucopentaose, Lacto-N-fucopentaose Il, Lacto-N-fucopentaose Ill, Lacto-N-fucopentaose V, Lacto-N-neofucopentaose V, Lacto-N-difucohexaose I, Lacto-N-difucohexaose II, 6'-Galactosyllactose, 3'-Galactosyllactose, Lacto-N-hexaose und Lacto-N-neohexaose.
[0028] In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem neutralen HMO um 2'-Fucosyllactose.
[0029] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Offenbarung erfolgt die Abtrennung von Biomasse aus der Fermentationsbrühe durch
a) Ultrafiltration, vorzugsweise durch Abtrennung von Biomasse und Materialien > 500 kDa, stärker bevorzugt > 150 kDa; und/oder
b) Filtration durch ein Querstromfilter, vorzugsweise mit einem Cutoff < 100 kDa, bevorzugter mit einem Cutoff = 10 kDa, noch bevorzugter einem Cutoff = 5 kDa;
wobei Schritt a) vorzugsweise vor Schritt b) durchgeführt wird.
[0030] In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Offenbarung wird mindestens einer der Reinigungsschritte ii) bis v) des Verfahrens während des Verfahrens mindestens einmal wiederholt.
[0031] In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Offenbarung wird die Fermentationsbrühe nach mindestens einem der Reinigungsschritte i) bis iv) mindestens einmal einer Aktivkohlebehandlung zur Adsorption von farbgebendem Material und größeren Oligosacchariden an Aktivkohle unterzogen. Durch Unterziehen der Fermentationsbrühe an diesen zusätzlichen Reinigungsschritt können farbgebendes Material und größere Oligosaccharide aus der Fermentationsbrühe entfernt werden.
[0032] Das offenbarte Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass a) nach mindestens einem der Reinigungsschritte i) bis iv); oder
b) nach mindestens einer Aktivkohlebehandlung zur Adsorption von farbgebendem Material und größeren Oligosacchariden an Aktivkohle; oder
cC) vor einem Konzentrationsschritt, der nach mindestens einem der Reinigungsschritte i) bis iv) durchgeführt wird;
die Lösung, die das neutrale humane Milch-Oligosaccharid enthält, diafiltriert und/oder konzentriert wird. Vorzugsweise wird die Lösung mit einer Nanofiltrationsmembran, stärker bevorzugt mit einer Nanofiltrationsmembran mit einer Größenausschlussgrenze von <20 A, diafiltriert und/ oder konzentriert. Am meisten bevorzugt wird die Lösung diafiltriert, bis eine Leitfähigkeit von = 15 mS/cm, vorzugsweise <= 10 mS/cm, stärker bevorzugt = 5 mS/cm, erreicht wird.
[0033] Die Diafiltration unter Verwendung von Nanofiltration erwies sich als wirksam zur Vorbehandlung, um signifikante Mengen an Kontaminanten vor einer Elektrodialysebehandlung der HMO-haltigen Lösung zu entfernen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Nanofiltration auch bei der Entfernung von niedermolekularen Kontaminanten nach einem Ultrafiltrationsschritt wirksam ist, wobei die genannte Entfernung zum Konzentrieren und Demineralisieren der HMOLösung vor der lonenaustauscherbehandlung vorteilhaft ist. Die Verwendung von Nanofiltrations-
membranen zur Aufkonzentrierung und Diafiltration bei der Reinigung von humanen Milch-Oligosacchariden führt zu geringeren Energie- und Verarbeitungskosten sowie zu einer verbesserten Produktqualität aufgrund einer geringeren thermischen Belastung, was zu verringerten Maillard-Reaktionen und Aldolreaktionen führt.
In einem Schritt vor Schritt i) kann eine Glucosidasebehandlung, vorzugsweise eine ßB-Glucosidasebehandlung, mit der Fermentationsbrühe durchgeführt werden, wobei die Behandlung vorzugsweise durchgeführt wird durch
a) Zugabe eines Mikroorganismenstamms, der zum Exprimieren eines oder mehrerer Glycosidaseenzyme(s) in der Lage ist, die zum Abbau unerwünschter Zwischenprodukte, Substrate und/oder Oligosaccharid-Nebenprodukte geeignet sind; und/oder
b) Verwenden eines Fermentationsstamms, der ein oder mehrere Glycosidaseenzym(e) exprimiert, vorzugsweise durch Zugabe eines Induktors zu der Fermentationsbrühe und/oder durch Verschieben der Temperatur der Fermentationsbrühe; und/oder
c) Zugabe einer oder mehrerer Glycosidase(n), vorzugsweise mindestens einer ß-Glucosidase, zu der Fermentationsbrühe als rohes Enzym oder als gereinigtes Enzym.
[0034] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Offenbarung wird die Fermentationsbrühe nach mindestens einem der Reinigungsschritte i) bis iv), vorzugsweise nach dem Reinigungsschritt iv), unter Verwendung von Vakuumverdampfung oder Umkehrosmose oder Nanofiltration (z. B. Nanofiltration mit einer Nanofiltrationsmembran mit einer GröBenausschlussgrenze von <20 A) konzentriert
a) auf eine Konzentration von = 100 g/l, vorzugsweise = 200 g/l, stärker bevorzugt = 300 g/l; und/oder
b) bei einer Temperatur von < 80°C, bevorzugt < 50°C, stärker bevorzugt 20°C bis 50°C, noch bevorzugter 30°C bis 45°C, am meisten bevorzugt 35°C bis 45°C (speziell relevant für Vakuumverdampfung oder Umkehrosmose); und/oder
c) bei einer Temperatur von < 80°C, bevorzugt < 50°C, stärker bevorzugt 4°C bis 40°C (speziell relevant für die Nanofiltration).
[0035] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Offenbarung wird die gereinigte Lösung sterilfiltriert und/oder einer Endotoxinentfernung unterzogen, vorzugsweise durch Filtration der gereinigten Lösung durch einen 3-kDa-Filter.
[0036] In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Offenbarung wird die neutrales HMO enthaltende Lösung einer Elektrodialyse unterzogen, um geladene Materialien, wie ein- und zweiwertige Salze, weiter zu entfernen.
[0037] In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Offenbarung wird die gereinigte Lösung auf eine Konzentration von > 1,5 M konzentriert und auf eine Temperatur < 25 °, stärker bevorzugt < 8°C abgekühlt, um kristallines Material des neutralen HMO zu erhalten.
[0038] In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Offenbarung wird die gereinigte Lösung sprühgetrocknet, insbesondere bei einer Konzentration des neutralen HMO von 20-60 (w/v), vorzugsweise 30-50 (w/v), stärker bevorzugt 35-45 (w/v), einer Düsentemperatur von 110-150°C, vorzugsweise 120-140°C, stärker bevorzugt 125-135°C und/oder einer Auslasstemperatur von 60-80°C, vorzugsweise 65-70°C sprühgetrocknet.
[0039] Weiterhin umfasst die vorliegende Leistung ein neutrales humanes Milch-Oligosaccharid (HMO), das mit dem Verfahren gemäß der Offenbarung herstellbar ist.
[0040] In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das HMO in einem sterilfiltrierten Konzentrat vor, z. B. einem sterilen Konzentrat, das ein neutrales HMO-Produkt mit einer Konzentration von > 30% (w/v), stärker bevorzugt = 40% (w/v) enthält.
[0041] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das HMO sprühgetrocknet oder kristallisiert.
[0042] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das HMO ausgewählt aus der Gruppe,
bestehend aus 2'-Fucosyllactose, 3-Fucosyllactose, 2',3-Difucosyllactose, Lacto-N-triose |I, Lacto-N-tetraose, Lacto-N-neotetraose, Lacto-N-fucopentaose I, Lacto-N-neofucopentaose, Lacto-N-fucopentaose Il, Lacto-N-fucopentaose Ill, Lacto-N-fucopentaose V, Lacto-N-neofucopentaose V, Lacto-N- difucohexaose |, Lacto-N-difucohexaose Il, 6'-Galactosyllactose, 3'-Galactosyllactose, Lacto-N-hexaose und Lacto-N-neohexaose.
[0043] In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem HMO um 2'Fucosyllactose.
[0044] In einer anderen bevorzugten Ausführungsform besitzt das HMO
a) eine Leitfähigkeit von weniger als 1 mSi/cm bei einer 300-g/l-Lösung;
b) ist frei von rekombinantem DNA-Material, gegebenenfalls frei von jeglicher DNA; und/oder
c) ist frei von Proteinen, die von dem rekombinanten Mikroorganismus stammen, gegebenenfalls frei von jeglichen Proteinen.
[0045] Eine andere bevorzugte Ausführungsform betrifft ein HMO zur Verwendung in der Medizin, vorzugsweise zur Verwendung in der Prophylaxe oder Therapie einer Magen-Darm-Störung.
[0046] Weiterhin umfasst die vorliegende Leistung die Verwendung eines HMO gemäß der Leistung als Zusatzstoff in Lebensmitteln, vorzugsweise als Zusatzstoff in Nahrung für Menschen und/oder Haustiernahrung, stärker bevorzugt als Zusatzstoff in menschlicher Babynahrung.
[0047] Der anmeldungsgemäße Gegenstand soll anhand der nachfolgenden Figuren und Beispiele näher erläutert werden, ohne ihn auf die speziellen Ausführungsformen beschränken zu wollen.
[0048] Fig. 1 zeigt ein Schema einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Offenbarung zur Reinigung von 2'-Fucosyllactose aus einer Fermentationsbrühe, umfassend die Schritte: Ultrafiltration, Behandlung mit kationischem und anionischem lonenaustauscher, Aktivkohlebehandlung, Nanofiltration, Elektrodialyse und Konzentration.
[0049] Fig. 2 zeigt ein Schema einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Offenbarung zur Reinigung von 2'-Fucosyllactose aus einer Fermentationsbrühe, umfassend die Schritte: Ultrafiltration, Nanofiltration, Behandlung mit kationischem und anionischem lonenaustauscher, Aktivkohlebehandlung, Elektrodialyse und Konzentration.
[0050] Fig. 3 zeigt ein Schema einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Offenbarung zur Reinigung von 2'-Fucosyllactose aus einer Fermentationsbrühe, umfassend die Schritte: Ultrafiltration, Behandlung mit kationischem und anionischem lonenaustauscher, Nanofiltration, Aktivkohlebehandlung, Elektrodialyse und Konzentration.
BEISPIEL 1: Reinigung von 2'-Fucosyllactose aus der Fermentation unter Verwendung eines rekombinanten mikrobiellen Produktionsstamms |.
[0051] Eine 2'-Fucosyllactose-Fed-Batch-Fermentation unter Verwendung eines rekombinanten 2'-Fucosyllactose synthetisierenden E.-coli- Stamms (E. coli BL21(DE3) AlacZ), enthaltend eine genomische Integration von 2'-Fucosyltranferase, codiert durch das wbgL-Gen (siehe EP 11 1151 571.4), und aufweisend eine zusätzliche Kopie von E. coli lacY, manB, manC, gmd und fel sämtlich unter der Steuerung eines starken konstitutiven Tetracyclin-Promotors, der ein funktionelles gal-Operon enthält, das die Gene galM, galK, galT und galk umfasst, wurde in einem definierten Salzmedium herangezüchtet. Das definierte Salzmedium umfasste 7 g I-1NH4H3PO«4, 7 g II'K»HPO«, 2 g I-' KOH, 0,379g I-' Zitronensäure, 1 ml I-' Antischaummittel (Struktol J673, Schill + Seilacher), 1 mM CaCl2, 4 mM MgSO«4, Spurenelemente und 2% Glycerin als Kohlenstoffquelle.
[0052] Die Spurenelemente bestanden aus 0,101 g I-' Nitrilotriessigsäure, pH 6,5, 0,056 g I-' Ammonium-Eisen (Ill)-citrat, 0,01 g I-1 MnCI» x H;O, 0,002 g I-' CoCI» x 6 H2O, 0,0019 I-' CuCI» x 2 H2O, 0,002 g I-' Borsäure, 0,009 g I-' ZnSO4 x 7 H2O, 0,001 g I-' NazMoO«A x 2 H;O, 0,002 g I-' Na2SeO»s, 0,002 g I-' NiSO4 x 6 H;O.
[0053] Die Glycerol-Zufuhr bestand aus Glycerol 800 g I-', MgSO«4 2,64 g I- ! und Spurenelement-
lösung 4 ml I-'. Für die 2'-Fucosyllactose- Bildung wurde eine Lactose-Zufuhr von 216 g I-' verwendet. Der pH-Wert wurde unter Verwendung von Ammoniaklösung (25% v/v) reguliert. Die Fed-Batch-Fermentation wurde bei 30°C unter konstanter Belüftung und Rühren für 90 Stunden kultiviert. 90 Stunden nach Beginn der Fermentation war der größte Teil der zugesetzten Lactose in 2'-Fucosyllactose umgewandelt. Um im Fermentationsüberstand noch vorhandene Laktose zu entfernen, wurde 90 Stunden nach Fermentationsbeginn ein zweiter Bakterienstamm in das Fermentationsgefäß hinzugesetzt.
[0054] Der hinzugefügte zweite Bakterienstamm war genetisch identisch mit dem ersten verwendeten Bakterienstamm, unterschied sich jedoch nur in der Expression einer genomintegrierten Beta-Galactosidase. Die Inkubation des zugesetzten sekundären Bakterienstamms führte zum Verschwinden der restlichen Laktose innerhalb von 5 Stunden. Ungefähr 10 ml Starterkultur des zweiten, Beta-Galactosidase exprimierenden, Bakterienstamms wurden pro 1 | Fermentationsbrühe zugegeben.
[0055] Die Biomasse wurde dann durch Ultrafiltration unter Verwendung eines Querstromfilters mit einem Cut-Off (Ausschlusswert) von 10 kDa (Microdyn Nardir) vom Fermentationsmedium abgetrennt.
[0056] Es wurde ungefähr 1 m® zellfreies Fermentationsmedium erhalten, das 42 g/l 2'-Fucosyllactose enthielt. Das zellfreie Fermentationsmedium wurde dann über einen starken kationischen lonenaustauscher (Lewatit S 6368 A (Lanxess) in H*-Form, die Größe des lonenaustauscherbettvolumens betrug 100 1) geleitet, um positiv geladene Kontaminanten zu entfernen. Die erhaltene Lösung wurde dann durch Zugabe einer 2 M Natriumhydroxidlösung auf pH 7 eingestellt.
[0057] Die Lösung wurde dann (ohne Verzögerung) über eine anionische lonenaustauschersäule geleitet (Bettvolumen des lonenaustauschers betrug 100 I). Der verwendete starke anionische lonenaustauscher Lewatit S 2568 (Lanxess) lag in Chlorid(Cl-)-Form vor. Die erhaltene Lösung wurde erneut auf pH 7 neutralisiert. Die so erhaltene Lösung wurde dann unter Verwendung einer Alfa-Laval NF99HF-Nanofiltrationsmembran und sechs Volumina an sterilem entionisiertem Wasser diafiltriert. Die Lösung wurde unter Verwendung der Nanofiltrationsmembran weiter konzentriert, wobei eine 2'-Fucosyllactoselösung von 200 g/l und einer Leitfähigkeit von 7 mS/cm erhalten wurde.
[0058] Die konzentrierte 2'-Fucosyllactose-Lösung wurde dann mit Aktivkohle behandelt, um farbgebendes Material wie Maillard-Reaktionsprodukte und Aldol-Reaktionsprodukte zu entfernen. Als Aktivkohle wurden 20 g Norit GAC EN pro | konzentrierte 2'-Fucosyllactose-Lösung verwendet, was eine deutlich entfärbte Lösung ergab.
[0059] Die so erhaltene konzentrierte 2'-Fucosyllactose-Lösung wurde dann unter Verwendung eines PC-Cell BED 1-3-Elektrodialysegeräts (PC-Cell, Heusweiler, Deutschland), das mit einem PC-Cell E200- Membranstapel ausgestattet war, auf 0,3 mS/cm elektrodialysiert. Der Stapel enthielt die folgenden Membranen: Kationenaustauschermembran CEM: PC SK, und Anionenaustauschermembran AEM:PcAcid60 mit einer Größenausschlussgrenze von 60 Da. Eine 0,025 M Sulfaminsäure (Amidosulfonsäure)-Lösung wurde als Elektrolyt in dem ED-Verfahren verwendet.
[0060] Dann wurde die erhaltene Lösung unter Vakuum bei 40°C konzentriert, um eine 45%-ige 2'-Fucosyllactose-Lösung zu erhalten. Die konzentrierte Lösung wurde dann erneut mit lonenaustauschern Lewatit S 6368 A (Lanxess) in Na*-Form (Bettvolumen des verwendeten lonenaustauschers betrug 10 I) und nach Neutralisation mit dem anionischen lonenaustauscher Lewatit S 2568 (Lanxess) in CI7-Form (Bettvolumen des verwendeten lonenaustauschers betrug 10 |) behandelt.
[0061] Die erhaltene 2'-Fucosyllactoselösung wurde dann mit Aktivkohle (Norit DX1 Ultra) behandelt. Für 11 einer 45%-igen 2'- Fucosyllactoselösung wurden 30 g Aktivkohle eingesetzt.
[0062] Die Lösung wurde dann erneut einer Elektrodialyse unterzogen, bis eine Leitfähigkeit von weniger als 0,3 mSi/cm erhalten wurde.
[0063] Anschließend wurde die Lösung einer Sterilfiltration unterworfen, indem die Lösung durch ein 3 kDa-Filter (Pall Microza Ultrafiltrations-Hohlfasermodul SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich) geleitet wurde.
[0064] Ein Teil der erhaltenen 2'-Fucosyllactose-Lösung wurde dann zur Analyse sprühgetrocknet.
[0065] [Für die Aufzeichnung von NMR-Spektren wurde das sprühgetrocknete Produkt in Hexadeuterodimethylsulfoxid (DMSO-d6) gelöst. Für die Protonen- und 'SC-Analyse wurden die folgenden charakteristischen chemischen Verschiebungen beobachtet:
1H NMR (500 MHz, DMSO-de) 5 6, 63 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 6,28 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 5,21 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,19 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,01 (d, J = 2,2, 2H), 4,92 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 4,89 (dd, J = 4,6, 1,3 Hz, 2H), 4,78 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 4,74 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 4,63 (m, 6H), 4,53 (t, d, J = 5,5, 1H), 4,46 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,44 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 4,38 - 4,26 (m, 5H), 4,23 (d, J = 0,9, 1H), 4,05 (d, J = 0,9, 1H), 4,00 (quin, J = 3,3, 1H), 3,68 - 3,60 (m, 7H), 3,59 - 3,50 (m, 13H), 3,50 - 3,37 (m, 6H), 3,24 (dt, J = 8,8, 2,2 Hz, 1H), 3,14 (m, 2H), 2,96 (td, J = 8,4, 4,7 Hz, 1H), 1,04 (d, J= 6,1 Hz, 3H), 1,03 (d, J = 6,1 Hz, 3H). "°C NMR (126 MHz, DMSO-d6) 5 100,99, 100,85, 100,35, 100,25, 96,59, 92,02, 78,13, 77,78, 77,16, 77,01, 75,27 75,05, 74,67, 73,70, 72,33, 71,62, 71,56, 70,91, 69,90, 69,64, 68,75, 68,16, 66,33, 60,17, 59,82, 59,67, 16,37, 16,36.
[0066] Es wurde festgestellt, dass die chemischen Verschiebungen mit der 2'-FucosyllactoseStruktur konsistent sind.
[0067] Unter Verwendung dieses Protokolls konnte ein 45%-iges 2'-Fucosyllactose-Konzentrat mit einer Reinheit von 94,5% erhalten werden (bestimmt durch HPLC-Analyse). Hauptkontaminanten waren 3'- Fucosyllactose (1,8%), Difucosyllactose (2,9%) und Lactose (0,3%).
[0068] Die Ausbeute der Reinigung betrug ungefähr 70%.
[0069] Bedeutenderweise konnte kein rekombinantes Material in 10 g Gefriermaterial unter Verwendung von 50 Zyklen qPCR bestimmt werden konnte. Die Proteinmenge des erhaltenen Materials wurde unter Verwendung eines Nano-Bradford-Assays (Roth, Karlsruhe, Deutschland) als < 50 ug/g gefriergetrocknetes Material bestimmt. Die Asche-Gesamtmenge wurde mit 0,19% bestimmt. Die Konzentration an Schwermetallen (Arsen-Cadmium, Blei und Quecksilber) lag unter 0,1 ug/g Material. Die Endotoxinwerte wurden zu < 0,005 EU/ml 2'-Fucosyllactosekonzentrat bestimmt.
BEISPIEL 2: Reinigung von 2'-Fucosyllactose aus der Fermentation unter Verwendung eines rekombinanten mikrobiellen Produktionsstamms |I.
[0070] Eine 1-m*°-Mikrobenfermentation, die 2'-Fucosyllactose bei einer Konzentration von 47 g/l enthielt, wurde durch ein Querstromfilter mit einem Cutoff von 100 kDa (Microdyn Nadir) filtriert, um ein zellfreies Fermentationsmedium zu erhalten.
[0071] Als Fermentationsmedium wurde das folgende Medium eingesetzt: Hauptmediumbestandteile: Glycerol 30 g/l, NH«H2PO«4 7 g/l, KzHPO-« 7 g/l, Citrat 0,3 g/l, KOH 2 g/l, MgSO4:7H2O 2 g/l; Spurenelemente: CaCl»6H2;O 20 mg/l, Nitrilotriessigsäure 101 mg/l, Ammoniumeisen (Ill)citrat 56 mg/l, MnCl2-4H2;O 9,8 mg/l, CoCl2:6H2O 1,6 mg/l, CuCl2:2H2;0 1 mg/l, H3BOs 1,6 mg/l, ZnSO4:7H20 9 mg/l, Naz2MoO4:2H2O 1,2 mg/l, NazSeOs 1,2 mg/l; Zufuhrsubstanzen: Glycerol und Lactose.
[0072] Das zellfreie Fermentationsmedium wurde dann über einen kationischen lonenaustauscher (Lewatit S 6368 A (Lanxess) in H*-Form (Volumen des lonenaustauscherbetts betrug 100 I) geleitet, um positiv geladene Kontaminanten zu entfernen. Die erhaltene Lösung wurde dann durch Zugabe einer 2 M Natriumhydroxidlösung auf pH 7 eingestellt. Die Lösung wurde dann unverzüglich über eine anionische lonenaustauschersäule (eingesetztes Volumen des lonenaustauscherbetts betrug 100 I) geleitet, die den starken anionischen lonenaustauscher Lewatit S 2568 (Lanxess) in Chlorid (CI)-Form enthielt. Die erhaltene Lösung wurde erneut auf pH 7 neutralisiert.
[0073] Die so erhaltene Lösung wurde dann diafitriert (unter Verwendung von 10 Volumina sterilem entionisiertem Wasser) und unter Verwendung einer Nanofiltrationsmembran (Alfa-Laval NF99HF) konzentriert, um eine 2'-Fucosyllactoselösung von 200 g/l und einer Leitfähigkeit von ca. 7 mSi/cm zu erhalten.
[0074] Die konzentrierte 2'-Fucosyllactose-Lösung wurde dann mit Aktivkohle unter Verwendung von 20 g Norit GAC EN pro | konzentrierter 2'-Fucosyllactose-Lösung behandelt. Zu der filtrierten 2'-Fucosyllactose-Lösung wurden 40 g/l Norit DX1 Ultra-Aktivkohle gegeben. Die Lösung wurde dann ungefähr 18 Stunden lang bei 4°C der Aktivkohle ausgesetzt. Nach 18h wurde die Aktivkohle aus der 2'-Fucosyllactoselösung durch Filtration entfernt.
[0075] Die Lösung wurde dann unter Verwendung eines PC-Cell BED 1-3- Elektrodialysegeräts (PC-Cell, Heusweiler, Deutschland), das mit einem PC-Cell E200-Membranstapel ausgestattet war, auf eine Leitfähigkeit von <0,3 mS/cm elektrodialysiert. Der Stapel enthielt die folgenden Membranen: Kationenaustauschermembran CEM: PC SK und Anionenaustauschermembran AEM: PcAcid60 mit einer Größenausschlussgrenze von 60 Da. Eine 0,025 M Sulfaminsäure (Amidosulfonsäure) -Lösung wurde als Elektrolyt im ED-Verfahren verwendet.
[0076] Die erhaltene Lösung wurde dann aufkonzentriert, um eine 40%-ige 2'-Fucosyllactoselösung zu erhalten. Die erhaltene 2'-Fucosyllactose-Lösung wurde dann über eine Lewatit S 2568 (Lanxess) Cl'-Form (Bettvolumen 10 1) geleitet und mit Aktivkohle (Norit DX1 Ultra) bei 8°C für 18 Stunden behandelt. Die Lösung wurde dann einer Sterilfiltration durch Hindurchleiten der Lösung durch einen 3-kDa-Filter (Pall Microza Ultrafiltrations-Hohlfasermodul SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich) unterzogen und unter Verwendung eines NUBILOSA LTC-GMP-Sprühtrockners (NUBILOSA, Konstanz, Deutschland) sprühgetrocknet.
[0077] Unter Verwendung dieses Protokolls konnte 2'-Fucosyllactose mit einer Reinheit von 94% erhalten werden (bestimmt durch HPLC- Analyse). Haupt-Kontaminanten waren 3'-Fucosyllactose (1,8%), Difucosyllactose (3,2%) und Lactose (0,2%). Die Ausbeute der Reinigung betrug ungefähr 70 %.
[0078] Die Erfindung kann durch die folgenden Aspekte charakterisiert werden:
[0079] 1. Verfahren zur chargenweisen oder kontinuierlichen Reinigung von neutralen humanen Milch-Oligosacchariden (HMOs) aus einer durch mikrobielle Fermentation erhaltenen Fermentationsbrühe, wobei die Fermentationsbrühe ein neutrales HMO, Biomasse, Mediumbestandteile und Kontaminanten umfasst, wobei die Reinheit des neutralen HMO in der Fermentationsbrühe <80 % ist,
dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentationsbrühe folgenden Reinigungsschritten unterzogen wird:
ij) Abtrennung von Biomasse aus der Fermentationsbrühe,
il) Behandlung mit kationischem lonenaustauscher zur Entfernung von positiv geladenem Material,
il) Behandlung mit anionischem lonenaustauscher zur Entfernung von negativ geladenem Material,
iv) Nanofiltrationsschritt und/oder Elektrodialyseschritt,
wobei eine gereinigte Lösung bereitgestellt wird, die das neutrale HMO in einer Reinheit von = 80 % umfasst.
[0080] 2. Verfahren nach Aspekt 1, dadurch gekennzeichnet, dass das neutrale HMO aus einer Fermentationsbrühe gereinigt wird, die durch mikrobielle Fermentation unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus, vorzugsweise Bakterien oder Hefe, stärker bevorzugt eines rekombinanten Mikroorganismus, der in einem chemisch definierten Medium herangezüchtet wird, erhalten wurde, wobei die in Schritt I) abgetrennte Biomasse gegebenenfalls in die mikrobielle Fermentation zurückgeführt (rezykliert) wird.
[0081] 3. Verfahren nach einem der Aspekte 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinheit des neutralen HMO in der Fermentationsbrühe <70 %, <60 %, <50 %, <40 %, <30 %, =20 %,
<10 % oder =5 % beträgt und/oder die gereinigte Lösung das neutrale HMO bei einer Reinheit von 285 %, vorzugsweise von 2z90 % enthält.
[0082] 4. Verfahren nach einem der Aspekte 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausbeute an neutralem HMO >75 % beträgt und/oder die gereinigte Lösung frei von DNA, Proteinen und/oder rekombinantem genetischem Material ist.
[0083] 5. Verfahren nach einem der Aspekte 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das neutrale HMO ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2'-Fucosyllactose, 3-Fucosyllactose, 2',3Difucosyllactose, Lacto-N-triose Il, Lacto-N-tetraose, Lacto-N-neotetraose, Lacto-N- fucopentaose |, Lacto-N-neofucopentaose, Lacto-N-fucopentaose Il, Lacto-N-fucopentaose Ill, Lacto-Nfucopentaose V, Lacto-N- neofucopentaose V, Lacto-N-difucohexaose I, Lacto-N-difucohexaose Il, 6'-Galactosyllactose, 3'-Galactosyllactose, Lacto-N-hexaose und Lacto-N-neohexaose.
[0084] 6. Verfahren nach einem der Aspekte 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung von Biomasse aus der Fermentationsbrühe erreicht wird durch
a) Ultrafiltration, bevorzugt durch Abtrennung von Biomasse und Materialien > 500 kDa, stärker bevorzugt > 150 kDa; und/oder
b) Filtration durch einen Querstromfilter, vorzugsweise mit einem Cutoff <= 100 kDa, bevorzugter mit einem Cutoff <= 10 kDa, noch bevorzugter einem Cutoff = 5 kDa;
wobei Schritt a) vorzugsweise vor Schritt b) durchgeführt wird.
[0085] 7. Verfahren nach einem der Aspekte 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der Reinigungsschritte ii) bis iv) während des Verfahrens mindestens einmal wiederholt wird.
[0086] 8. Verfahren nach einem der Aspekte 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentationsbrühe nach mindestens einem der Reinigungsschritte i) bis iv) mindestens einmal einer Aktivkohlebehandlung zur Adsorption von farbgebendem Material und größeren Oligosacchariden an Aktivkohle unterzogen wird.
[0087] 9. Verfahren nach einem der Aspekte 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass
a) nach mindestens einem der Reinigungsschritte i) bis iv); oder
b) nach mindestens einer Aktivkohlebehandlung zur Adsorption von farbgebendem Material und größeren Oligosacchariden an Aktivkohle; oder
cC) vor einem Konzentrationsschritt, der nach mindestens einem der Reinigungsschritte i) bis iv) durchgeführt wird;
die Lösung, die das neutrale humane Milch-Oligosaccharid enthält, diafiltriert und/oder konzentriert wird, vorzugsweise mit einer Nanofiltrationsmembran, stärker bevorzugt mit einer Nanofiltrationsmembran mit einer Größenausschlussgrenze von <20 A, wobei am meisten bevorzugt die Lösung diafiltriert wird, bis eine Leitfähigkeit von <= 15 mS/cm, vorzugsweise = 10 mS/cm, stärker bevorzugt = 5 mS/cm, erreicht wird.
[0088] 10. Verfahren nach einem der Aspekte 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Schritt vor Schritt i) eine Glucosidasebehandlung, vorzugsweise eine ßB-Glucosidasebehandlung, mit der Fermentationsbrühe durchgeführt wird, wobei die Behandlung vorzugsweise durchgeführt wird durch
a) Zugabe eines Mikroorganismenstamms, der zum Exprimieren eines oder mehrerer Glycosidaseenzyme(s) in der Lage ist, die zum Abbau unerwünschter Zwischenprodukte, Substrate und/oder Oligosaccharid-Nebenprodukte geeignet sind; und/oder
b) Verwenden eines Fermentationsstamms, der ein oder mehrere Glycosidaseenzym(e) exprimiert, vorzugsweise durch Zugabe eines Induktors zu der Fermentationsbrühe und/oder durch Verschieben der Temperatur der Fermentationsbrühe; und/oder
c) Zugabe einer oder mehrerer Glycosidase(n), vorzugsweise mindestens einer ß-Glucosidase, zu der Fermentationsbrühe als rohes Enzym oder als gereinigtes Enzym.
[0089] 11. Verfahren nach einem der Aspekte 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Fer
mentationsbrühe nach mindestens einem der Reinigungsschritte i) bis iv), vorzugsweise nach dem Reinigungsschritt iv) unter Verwendung von Vakuumverdampfung oder Umkehrosmose oder Nanofiltration konzentriert wird
a) auf eine Konzentration von = 100 g/l, vorzugsweise = 200 g/l, stärker bevorzugt = 300 g/l; und/oder
b) bei einer Temperatur von < 80°C, bevorzugt < 50°C, stärker bevorzugt 20°C bis 50°C, noch bevorzugter 30°C bis 45°C während der Vakuumverdampfung oder Umkehrosmose; und/oder
c) bei einer Temperatur von < 80°C, bevorzugt < 50°C, stärker bevorzugt 20°C bis 50°C.
[0090] 12. Verfahren nach einem der Aspekte 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die gereinigte Lösung sterilfiltriert und/oder einer Endotoxinentfernung unterzogen wird, vorzugsweise durch Filtration der gereinigten Lösung durch einen 3-kDa-Filter.
[0091] 13. Verfahren nach einem der Aspekte 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die gereinigte Lösung auf eine Konzentration von > 1,5 M konzentriert und auf eine Temperatur < 25 °, bevorzugter < 8°C abgekühlt wird, um kristallines Material des neutralen HMO zu erhalten.
[0092] 14. Verfahren nach einem der Aspekte 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die gereinigte Lösung sprühgetrocknet wird, insbesondere sprühgetrocknet bei einer Konzentration des neutralen HMO von 20-60 (w/v), vorzugsweise 30-50 (w/v), stärker bevorzugt 35-45 (w/v), einer Düsentemperatur von 110-150°C, vorzugsweise 120- 140°C, stärker bevorzugt 125-135°C und/oder einer Auslasstemperatur von 60-80°C, vorzugsweise 65-70°C.
[0093] 15. Neutrales humanes Milch-Oligosaccharid (HMO), herstellbar mit dem Verfahren gemäß einem der Aspekte 1 bis 14, wobei das neutrale HMO vorzugsweise sprühgetrocknet oder kristallisiert ist.
[0094] 16. HMO nach Aspekt 15, dadurch gekennzeichnet, dass das neutrale HMO ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2'-Fucosyllactose, 3-Fucosyllactose, 2',3-Difucosyllactose, Lacto-N-triose Il, Lacto- N-tetraose, Lacto-N-neotetraose, Lacto-N-fucopentaose |, Lacto-N-neofucopentaose, Lacto-N-fucopentaose Il, Lacto-N-fucopentaose Ill, Lacto-N-fucopentaose V, Lacto-N-neofucopentaose V, Lacto-N-difucohexaose I, Lacto-N-difucohexaose Il, 6'-Galactosyllactose, 3'-Galactosyllactose, Lacto-N-hexaose und Lacto-N-neohexaose.
[0095] 17. HMO nach einem der Aspekte 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass das HMO
a) eine Leitfähigkeit von weniger als 1 mSi/cm bei einer 300-g/l-Lösung besitzt;
b) frei von rekombinantem DNA-Material, gegebenenfalls frei von jeglicher DNA, ist; und/oder
c) frei von Proteinen, die von dem rekombinanten Mikroorganismus stammen, gegebenenfalls frei von jeglichen Proteinen, ist.
[0096] 18. HMO nach einem der Aspekte 15 bis 17 zur Verwendung in der Medizin, vorzugsweise zur Verwendung in der Prophylaxe oder Therapie einer Magen-Darm-Störung.
[0097] 19. Verwendung eines HMO nach einem der Aspekte 15 bis 18 als Zusatzstoff in Lebensmitteln, vorzugsweise als Zusatzstoff in Nahrung für Menschen und/oder Haustiernahrung, stärker bevorzugt als Zusatzstoff in menschlicher Babynahrung.

Claims (9)

  1. Ansprüche 1. Sprühgetrocknetes oder kristallisiertes Produkt, enthaltend
    ein gewünschtes neutrales humanes Milch-Oligosaccharid (HMO) und eine oder mehrere Verunreinigungen,
    wobei das gewünschte HMO ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2'-Fucosyllactose, 3-Fucosyllactose, 2',3-Difucosyllactose, Lacto-N- triose Il, Lacto-N-tetraose, Lacto-Nneotetraose, Lacto-N-fucopentaose I, Lacto-N-neofucopentaose, Lacto-N-fucopentaose II, Lacto-N-fucopentaose Ill, Lacto-N-fucopentaose V, Lacto-N-neofucopentaose V, Lacto-Ndifucohexaose |, Lacto-N-difucohexaose Il, 6'-Galactosyllactose, 3'-Galactosyllactose, Lacto-N-hexaose und Lacto-N- neohexaose,
    wobei die Reinheit des gewünschten HMO größer oder gleich 80 Prozent ist und
    wobei ein oder mehrere andere Oligosaccharide als das gewünschte neutrale HMO als Verunreinigungen vorhanden sind, und
    wobei das HMO-Produkt frei von rekombinantem DNA-Material ist.
  2. 2. Produkt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem HMO um 2'Fucosyllactose handelt.
  3. 3. Produkt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung frei von jeglicher DNA ist.
  4. 4. Produkt nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass das HMO-Produkt frei von Proteinen ist.
  5. 5. Produkt nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass das HMO-Produkt eine Leitfähigkeit von weniger als 1 mSi/cm bei einer 300-g/l-Lösung besitzt.
  6. 6. Produkt nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verunreinigungen Lactose umfassen.
  7. 7. Produkt nach einem der Ansprüche 2-6, dadurch gekennzeichnet, dass die Verunreinigungen 3'-Fucosyllactose, Difucosyllactose und/oder Lactose umfassen.
  8. 8. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung in der Medizin, vorzugsweise zur Verwendung in der Prophylaxe oder Therapie einer Magen-Darm-Störung.
  9. 9. Verwendung eines Produktes nach einem der Ansprüche 1 bis 7 als Zusatzstoff in Lebensmitteln, vorzugsweise als Zusatzstoff in Nahrung für Menschen und/oder Haustiernahrung, stärker bevorzugt als Zusatzstoff in menschlicher Babynahrung.
    Hierzu 3 Blatt Zeichnungen
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