CN102154163A - 一种3′-唾液酸乳糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种3′-唾液酸乳糖的制备方法，属生物工程技术领域。本发明以大肠杆菌CCTCC NO：M208088为出发菌种，在发酵罐中添加发酵培养基，发酵2-6小时后添加补料培养基，发酵中后期流加乳糖；将所得发酵液离心得上清液1和菌体，将离心后菌体加水稀释并加热裂解，再次离心得上清液2，然后将所得上清液1和上清液2合并，通过离子交换树脂吸附和脱吸、真空干燥得到产品3′-唾液酸乳糖。本发明通过大肠杆菌CCTCC NO：M208088菌株大量制备3′-唾液酸乳糖，该产品可改变传统婴儿奶粉中外源添加物质中唾液酸寡糖成份偏少的现状，为婴儿奶粉添加更为有效的唾液酸类营养因子提供保障。
Description
技术领域
本发明涉及一种唾液酸乳糖的制备方法，具体涉及一种3’-唾液酸乳糖的制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
随着现代生命科学技术的迅猛发展，糖生物学逐渐成为生命科学领域的一个新的热点。在众多糖类物质中，唾液酸糖质原料成为最受关注的板块之一。唾液酸一般位于机体内糖链部分的末端，这一位置通常是发生生理学反应的敏感端和生命信息传递的第一接触位点，具有举足轻重的地位。现阶段研究已经发现唾液酸与机体内众多的生理和病理发生有极大的关联性，由此生命科学衍生出了以揭示唾液酸类物质的生物学功能为目标的新的研究领域“唾液酸生物学”（sialobiology）。
生物体内的唾液酸大都不是以游离状态存在的，多数情况下唾液酸与其他糖类、多肽或者酯类连接在一起形成复合物，进而发挥生理功能，如唾液酸化乳糖(Sialylactose)、唾液酸化神经节苷酯（GM1）等。人乳中含有80多种寡糖，其中含有唾液酸的寡糖大概有40种，包括3′-唾液酸乳糖、6′-唾液酸乳糖、唾液酸乳-N-四糖等，而牛乳中含唾液酸寡糖含量较少，且没有3′-唾液酸乳糖。这些唾液酸寡糖除了提供给婴儿营养物质外，还具有抗感染、促进大脑发育和增强婴儿免疫力等功效，而且研究证明3′-唾液酸乳糖在抗病毒和感染方面的作用比6′-唾液酸乳糖强。
关于唾液酸单体在人体内的功能与作用存在很大争议。研究表明，唾液酸单体进入机体后降解成丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺，并进一步被机体当作能源物质吸收。因此唾液酸单体无法直接参与机体内大分子乳神经粘附分子、糖蛋白、糖脂等的合成。在另外一项对比人乳喂养与牛乳喂养的婴儿发育比较研究中发现，人乳喂养婴儿的大脑的发育较好。此外，还有研究表明，唾液酸乳糖能够提供婴儿对细菌和病毒的抵抗能力。
由于人乳唾液酸比牛乳唾液酸含量高，这激起了奶粉生产厂家对开发模拟人乳的产品研发。目前，众多厂商纷纷在自己生产的婴儿奶粉中主要添加富含唾液酸寡糖的乳清粉、乳清提取物或蛋黄提取物。但是，这些外源添加物质中唾液酸寡糖成份及含量与人乳相差较大，还无法满足模拟人乳的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种唾液酸乳糖的制备方法，为婴儿奶粉添加更为有效的唾液酸类营养因子提供保障。
本发明的技术方案：一种产3′-唾液酸乳糖的菌株，分类命名为大肠杆菌（Escherichia coli）K235 WXJYL-11，已经在中国典型培养物保藏中心进行专利保藏，保藏编号CCTCC NO：M208088。
用所述菌株发酵制备3′-唾液酸乳糖的方法，工艺为：
（1）高密度培养：以大肠杆菌CCTCC NO：M208088为菌种，在发酵罐中添加发酵培养基，接种量为4%，整个发酵过程维持温度30-37℃，通气量1-1.5 vvm，搅拌转速为600-800 r/min；在发酵过程中流加氨水控制pH为6-7，发酵周期为32-48小时；发酵2-6小时后开始添加补料培养基，直至发酵结束前半小时停止添加，添加补料培养基的体积数与发酵培养基的体积数相当，以均速加入发酵体系内。
发酵培养基成分g/L：山梨醇 30，乳糖20，硫酸铵2.5，三水合磷酸氢二钾 2.5，MgSO4 0.9，胰蛋白胨 1.5。
补料培养基成分g/L：山梨醇 400，硫酸铵 50。
（2）流加乳糖：配置10-20g/L的乳糖溶液；在发酵16-20小时后，以发酵体系计0.5-5 g/L的恒定速率向发酵罐中流加乳糖溶液直至发酵结束前5-10小时停止流加。
（3）离心除菌：发酵结束后，取步骤（2）所得发酵液80℃加热处理30分钟，然后以6000 rpm离心10分钟除去菌体，得到含有唾液酸乳糖的上清液1和菌泥。
（4）菌体加热裂解：将步骤（3）所得菌泥加水稀释3～5倍，沸水浴加热45-60分钟，然后以10000rpm离心10分钟除去细胞碎片，得到含有唾液酸乳糖的上清液2。
（5）离子交换树脂吸附和脱吸：将步骤（3）所得上清液1和步骤（4）所得上清液2合并，加热至80-90℃，恒温加热15分钟；用截留分子量1000Da的膜进行超滤，收集滤出液；用截留分子量500Da超滤膜处理滤出液，收集处理后的截留液；将截留液通入阳离子交换树脂柱，用水洗脱，把培养基中的乳糖和产物3′-唾液酸乳糖分开，收集富含3′-唾液酸乳糖的洗脱液。
（6）真空干燥：将步骤（5）所得洗脱液进行真空浓缩，然后再进行喷雾干燥，即获得产品3′-唾液酸乳糖。
步骤（5）所述阳离子交换树脂为Diaion UBK 530，即酸磺化聚苯乙烯-二乙烯基苯Na型或K型树脂。
所述3′-唾液酸乳糖结构如下所示：
本发明的有益效果：本发明提供一种唾液酸乳糖的制备方法，这种方法可通过大肠杆菌CCTCC M208088菌株大量制备唾液酸乳糖。可改变传统婴儿奶粉中外源添加物质中唾液酸寡糖成份偏少的现状，为婴儿奶粉添加更为有效的唾液酸类营养因子提供保障。
生物材料样品保藏：大肠杆菌K235 WXJYL-11（Escherichia coli K235 WXJYL-11），已经在中国典型培养物保藏中心进行专利保藏，保藏编号CCTCC NO：M208088，保藏日期2008年6月16日。该菌株并在国际期刊Biochemical Engineering Journal, 2010, 53: 97-103 公开。根据专利审查的有关规定，申请人保证该菌株从申请日起20年向公众开放。
具体实施方式
本发明在以下的实施例进一步说明。这些实施例只是为了说明目的，而不是用来限制本发明的范围。
实施例1 发酵
（1）高密度培养：以大肠杆菌CCTCC NO：M208088为菌种，在30L的发酵罐中添加发酵培养基18L，接种量为4%，整个发酵过程维持温度30-37℃，通气量1-1.5 vvm，搅拌转速为600-800 r/min；在发酵过程中流加氨水控制pH为6-7，发酵周期为32-48小时；发酵2-6小时后开始添加补料培养基，直至发酵结束前半小时停止添加，添加补料培养基的体积数与发酵培养基的体积数相当，以均速加入发酵体系内。
发酵培养基成分g/L：山梨醇 30，乳糖20，硫酸铵2.5，三水合磷酸氢二钾 2.5，MgSO4 0.9，胰蛋白胨 1.5。
补料培养基成分g/L：山梨醇 400，硫酸铵 50。
（2）流加乳糖：配置10-20g/L的乳糖溶液；在发酵16-20小时后，以发酵体系计0.5-5g/L的恒定速率向发酵罐中流加乳糖溶液直至发酵结束前5-10小时停止流加。
实施例2唾液酸乳糖的收集
（1）离心除菌：发酵结束后，取实施例1所得发酵液80℃加热处理30分钟，然后以6000 rpm离心10分钟除去菌体，得到含有唾液酸乳糖的上清液1和菌泥。
（2）菌体加热裂解：将步骤（1）所得菌泥加水稀释3～5倍，沸水浴加热45分钟，然后以10000rpm离心10分钟除去细胞碎片，得到含有唾液酸乳糖的上清液2；
（3）离子交换树脂吸附和脱吸：将步骤（1）所得上清液1和步骤（2）所得上清液2合并，加热至80-90℃，恒温加热15分钟；用截留分子量1000Da的膜进行超滤，收集滤出液；用截留分子量500Da超滤膜处理滤出液，收集处理后的截留液；将截留液通入阳离子交换树脂柱，用水洗脱，把培养基中的乳糖和产物3′-唾液酸乳糖分开，收集富含3′-唾液酸乳糖的洗脱液。
（4）真空干燥：将步骤（3）所得洗脱液进行真空浓缩，然后再进行喷雾干燥，即可获得产品3′-唾液酸乳糖。
Claims (3)
1.一种产3′-唾液酸乳糖的菌株，分类命名为大肠杆菌（Escherichia coli）K235 WXJYL-11，已经在中国典型培养物保藏中心进行专利保藏，保藏编号CCTCC NO：M208088。
2.用权利要求1所述菌株发酵制备3′-唾液酸乳糖的方法，其特征在于工艺为：
（1）高密度培养：以大肠杆菌CCTCC NO：M208088为出发菌种，在发酵罐中添加发酵培养基，接种量为4%，整个发酵过程维持温度30-37℃，通气量1-1.5 vvm，搅拌转速为600-800 r/min；在发酵过程中流加碱液氨水控制pH为6-7，发酵周期为32-48小时；发酵2-6小时后开始添加补料培养基，直至发酵结束前半小时停止添加，添加补料培养基的体积数与发酵培养基的体积数相当，以均速加入发酵体系内；
发酵培养基成分g/L：山梨醇 30，乳糖20，硫酸铵2.5，三水合磷酸氢二钾 2.5，MgSO4 0.9，胰蛋白胨 1.5；
补料培养基成分g/L：山梨醇 400，硫酸铵 50；
（2）流加乳糖：配置10-20g/L的乳糖溶液；在发酵16-20小时后，以发酵体系计0.5-5 g/L的恒定速率向发酵罐中流加乳糖溶液直至发酵结束前5-10小时停止流加；
（3）离心除菌：发酵结束后，取步骤（2）所得发酵液80℃加热处理30分钟，然后以6000 rpm离心10分钟除去菌体，得到含有唾液酸乳糖的上清液1和菌泥；
（4）菌体加热裂解：将步骤（3）所得菌泥加水稀释3～5倍，沸水浴加热45-60分钟，然后以10000rpm离心10分钟除去细胞碎片，得到含有唾液酸乳糖的上清液2；
（5）离子交换树脂吸附和脱吸：将步骤（3）所得上清液1和步骤（4）所得上清液2合并，加热至80-90℃，恒温加热15分钟；用截留分子量1000Da的膜进行超滤，收集滤出液；用截留分子量500Da超滤膜处理滤出液，收集处理后的截留液；将截留液通入阳离子交换树脂柱，用水洗脱，把培养基中的乳糖和产物3′-唾液酸乳糖分开，收集富含3′-唾液酸乳糖的洗脱液；
（6）真空干燥：将步骤（5）所得洗脱液进行真空浓缩，然后再进行喷雾干燥，即获得产品3′-唾液酸乳糖。
3.根据权利要求1所述3′-唾液酸乳糖的制备方法，其特征在于步骤（5）所述阳离子交换树脂为Diaion UBK 530，即酸磺化聚苯乙烯-二乙烯基苯Na型或K型树脂。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110817 |