CN110093293A - 一株产聚唾液酸的大肠杆菌及其应用 - Google Patents

一株产聚唾液酸的大肠杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产聚唾液酸的大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)，菌株号K235‑GX124，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2018878，保藏日期为2018年12月10日。本发明还公开了上述高产聚唾液酸的菌株的筛选方法和发酵工艺，属于生物工程技术领域。本发明建立了一种高效制备聚唾液酸的发酵工艺，发酵过程中当聚唾液酸浓度达到一定程度，离心回收菌体，通过陶瓷膜截留聚唾液酸实现产物分离，滤液与菌体混匀继续发酵，经7个批次连续发酵，唾液酸总产量达48.1g/L。本发酵技术不借助任何络合剂或通透剂，通过陶瓷膜截留聚唾液酸，降低产物抑制，大幅度提升了聚唾液酸产量。

Description

一株产聚唾液酸的大肠杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一种聚唾液酸高产菌株的获得方法以及聚唾液酸的发酵工艺。
背景技术
唾液酸(SA)，学名叫作“N-乙酰基神经氨酸”，是一种天然存在的碳水化合物。它最初由颌下腺粘蛋白中分离而出，也因此而得名。唾液酸通常以低聚糖、糖脂或者糖蛋白的形式存在。在人体中，脑部的唾液酸含量最高，其唾液酸含量是肝、肺等内脏器官的15倍。在医学领域中，称做神经节苷脂，它在大脑和神经系统的产生和发育中发挥非常重要的作用。同时，动物实验研究表明，动物学习能力底下与神经节苷脂含量水平正相关，补充营养可以提高神经节苷脂水平。特别是对于出生体重较低的婴儿，充足的唾液酸补给对婴儿的大脑正常发育至关重要。而母乳是婴儿获取唾液酸的主要食物来源。而女人分娩后体内的唾液酸含量水平逐渐下降，为维持体内唾液酸水平，孕妇乃至孕后需额外摄取足量的唾液酸。另外，唾液酸的含量还与DHA的含量有着明显的相关性，这表明它极有可能与婴儿的脑结构和脑功能发育有关，可能两者都对早期脑发育有益。
聚唾液酸以荚膜的形式存在于少数几种细菌细胞的表面。在固体发酵过程中,聚唾液酸通常以夹膜的形式附于细胞表面；在液体发酵过程中,由于搅拌等作用聚唾液酸通常以粘液的形式脱落到发酵液中。将聚唾液酸进行酸水解或酶水解后,分离纯化可得到唾液酸,这是工业化发酵生产唾液酸的基础。
现阶段的聚唾液酸生产菌株主要是大肠杆菌，野生型大肠杆菌聚唾液酸的产量一般都不高且发酵水平不稳定,极易发生负向的自发突变。通过诱变筛选，往往可以得到稳定高产的生产菌株。
日前，聚唾液酸在医药、食品添加剂和化妆品领域受到热捧，市场前景广阔。目前，工业化方法发酵生产普遍产量低下，在5-6g/L左右，其中武汉中科光谷通过在发酵液中添加对聚唾液酸具有吸附、络合或耦合能力的分离剂，使得唾液酸的产量达到30g/L以上，但由于使用的分离剂具有一定的毒性，一定程度上限制了其应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株经高产聚唾液酸的大肠杆菌，以解决现有技术中聚唾液酸产量低、发酵水平不稳定的问题。
本发明还要解决的技术问题是提供上述大肠杆菌在发酵生产聚唾液酸或唾液酸方面的应用。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一株产聚唾液酸的大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌Escherichia coli)，菌株号K235-GX124，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2018878，保藏日期为2018年12月10日。
本发明的大肠杆菌Escherichia coli K235-GX124的筛选方法，将大肠杆菌出发菌株K235(购于中国典型培养物保藏中心(CCTCC))经等离子体诱变后，利用初筛得到能够产聚唾液酸的菌株，再经过复筛得到高产聚唾液酸的菌株。
其具体步骤如下：
(1)制作种子液：将活化好的大肠杆菌菌种接种LB培养基上，培养温度37℃，当培养4-6小时是对数期，本试验采用对数期培养5小时的大肠杆菌，将对数期的大肠杆菌用0.8％生理盐水调其浓度，通过梯度稀释稀释104-105倍；
(2)初筛：采用氦气为工作气体，使载片与等离子体发生器射流出口间距约为2mm，功率为60～140w，气流量10～30SLM，对15uL种子悬液进行诱变，处理完毕后，梯度稀释种子悬液为，取200uL各稀释倍数种子悬浮液涂布选择培养皿，培养皿采用溴百里酚蓝显色培养基，37℃培养16～24h后，挑选黄色变色圈比较大的菌落，完成初筛过程，然后将变色圈较大的菌落制作成种子悬液；
(3)复筛：在96孔板中加入一定比例发酵培养基，按照一定比例加入以上种子悬液，于37℃恒温生化培养箱摇床培养48h后，间苯二酚法检测唾液酸含量，吸光度大的菌种选为目标菌种，完成复筛；
(4)摇瓶发酵筛选
将上述挑选得到的菌株和出发菌株K235按1％接种量转接200mL发酵培养基中，于37℃、200rpm摇床中摇瓶发酵72h，间苯二酚法检测唾液酸含量，吸光度大的菌种选为目标菌种，完成筛选。
在上述筛选方法中：步骤(2)中，所述的固体培养基为LB培养基，溴百里酚蓝的使用量为1％～5％。
在上述筛选方法中：步骤(3)中，所述的发酵培养基为：山梨醇浓度为10～30g/L、酵母粉浓度为5～20g/L、MgSO4浓度为0.1～1.0g/L、K2HPO4浓度为1.0～3.0g/L、KH2PO4浓度为1.0～3.0g/L。
上述产聚唾液酸的大肠杆菌在制备聚唾液酸中的应用在本发明的保护范围之内。
上述产聚唾液酸的大肠杆菌在制备唾液酸中的应用在本发明的保护范围之内。
利用大肠杆菌K235-GX124发酵产聚唾液酸的方法，包括如下步骤：
(1)将大肠杆菌K235-GX124接种至发酵培养基中，利用氨水调节pH为6.3～6.5，发酵培养；
(2)以10～30mL/h/L速率进行补料发酵；
(3)离心发酵液，上清液利用陶瓷膜进行过滤，收集上清液中的聚唾液酸；
(4)步骤(3)离心得到的菌体和过滤得到的滤液回流至发酵罐，继续进行发酵；
(5)每12～20h对发酵液进行陶瓷膜过滤分离，连续发酵5～15批次。
步骤(1)中，所述的发酵培养基包括如下组分：
山梨醇10～30g/L、酵母粉5～20g/L、MgSO4 0.1～1g/L、K2HPO4 1～3g/L、KH2PO41～3g/L，溶剂为水；优选山梨醇20g/L、酵母粉10g/L、MgSO4 0.5g/L、K2HPO4 2g/L、KH2PO42g/L。
步骤(1)中，所述的发酵培养，其培养条件如下：
转速200～800rpm，优选600rpm；通风量2～10L/min，优选8L/min；发酵温度33～40℃，优选37℃；培养时间为12～20h，优选14h。
步骤(2)中，所述的补料发酵，其补料培养基为山梨醇250～350g/L，优选300g/L。
步骤(2)中，所述的补料发酵，其发酵条件为：利用氨水调节pH为6.3-6.5，以10～30mL/h/L速率进行补料发酵，继续发酵12～20h。
步骤(3)中，所述的陶瓷膜为久吾高科公司50～200nm孔径的陶瓷膜。
有益效果：
本发明以一株产聚唾液酸的大肠杆菌K235-GX124为生产菌株，建立了一种将聚唾液酸发酵、菌液分离、产物分离串联的发酵方法。该发酵工艺不仅具有传统连续式发酵高效的特点，更重要的是避免了聚唾液酸积累的抑制作用，实现了聚唾液酸的高效分泌表达，为聚唾液酸工业化发酵提供新的途径。
附图说明
图1为大肠杆菌的等离子体诱变存活率曲线。
图2为本发明实施案例3中的唾液酸发酵结果曲线图。
图3为本发明实施案例4中的唾液酸发酵结果曲线图。
具体实施方式
实施例1：
本实施例说明将大肠杆菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法。
大肠杆菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法如下：
将大肠杆菌原始菌株活化培养，培养温度33～37℃，500ml三角瓶装液量为100mL，培养时间12～18h，得到生长旺盛的菌液；取新鲜培养的细胞稀释至细胞浓度OD600＝1～1.5，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，以100W作为射频功率，以10SLM作为气体流量，以10～100s作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变，诱变后，将载体上的菌膜洗脱下来，计算存活率。实验结果如附图1所示；由图1可知，35s是最佳的诱变辐照时间。
实施例2：
本实施例说明筛选出高产聚唾液酸的大肠杆菌的方法。
其中，所使用的培养基配方如下所示：
(1)种子培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15～20g/L，pH＝7.0。
(2)初筛显色培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15～20g/L，溴百里酚蓝3％，pH＝7.0。
(3)发酵培养基：山梨醇30g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，硫酸镁0.9g/L，pH7.0。
筛选步骤：
(1)等离子诱变初筛选：
将诱变后的载片置于装有1～2ml生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌株洗脱，稀释成不同浓度涂布于初筛显色培养基平板上，培养16～24h，培养温度37℃，挑选出具有颜色变化区的菌落，种子培养基培养，保存。
(2)96孔平板发酵复筛选：
在96孔板中加入一定比例发酵培养基，按照一定比例加入以上种子悬液，于37℃恒温生化培养箱摇床培养48h后，间苯二酚法检测唾液酸含量，吸光度大的菌种选为目标菌种，完成复筛。
(3)摇瓶发酵筛选：
将上述挑选得到的菌株和出发菌株K235按1％接种量转接200mL发酵培养基中，于37℃、200rpm摇床中摇瓶发酵48h，间苯二酚法测定筛选菌株和出发菌株K235的唾液酸含量如表1所示：
表1摇瓶发酵筛选结果
经过三轮筛选获得的6株突变株唾液酸明显高于出发菌株，最终筛选出摇瓶发酵唾液酸产量最高的突变菌株GX124，将该菌株命名为K235-GX124，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2018878，保藏日期为2018年12月10日。
实施例3：
本实施例提供的单批次唾液酸发酵方法。
菌株：大肠杆菌(Escherichia coli)K235-GX124。
发酵培养基(g/L)：山梨醇10，酵母粉10，蛋白胨10，磷酸氢二钾2.5，磷酸二氢钾2.5，硫酸镁0.9，pH6.4。
利用5L发酵培养基，在10L迪比尔机械搅拌罐上采用pH反馈控制法进行发酵，接种量2％，灭菌前加入消泡剂以控制发酵过程中的泡沫，发酵转速200～800rpm，通风量2～10L/min，发酵温度37℃。17％氨水调节pH。菌体生长阶段的pH自然下降到6.4，然后用氨水把pH控制在6.4，直至发酵结束。
自发酵5～8小时开始以10～30mL/h/L速率开始补料，过程依据pH反馈进行适当调整。
发酵初始山梨醇浓度为10g/L，发酵液培养72h下罐，利用间苯二酚法测定，最终唾液酸的产量为16.1g/L。
实施例4：
本实施例提供的多批次唾液酸发酵方法。
菌株：大肠杆菌(Escherichia coli)K235-GX124.
发酵培养基(g/L)：山梨醇10，酵母粉10，蛋白胨10，磷酸氢二钾2.5，磷酸二氢钾2.5，硫酸镁0.9，pH6.4。
利用5L发酵培养基，在10L迪比尔机械搅拌罐上采用pH反馈控制法进行发酵，接种量2％，灭菌前加入消泡剂以控制发酵过程中的泡沫，发酵转速200-800rpm，通风量2-10L/min，发酵温度37℃。17％氨水调节pH。菌体生长阶段的pH自然下降到6.4，然后用氨水把pH控制在6.4，直至发酵结束。
自发酵5～8小时开始，以10～30mL/h/L速率开始补料，过程依据pH反馈进行适当调整。
发酵30h，唾液酸的产量达9.6g/L，利用管式离心机进行离心，上清液经过陶瓷膜进行过滤，产物聚唾液酸被截留，滤液和菌体回流发酵罐，继续进行发酵；然后，毎12-20h对聚唾液酸进行陶瓷膜分离，实现多批次的连续发酵生产聚唾液酸；经130h的连续发酵，利用间苯二酚法测定，唾液酸的总产量达48.1g/L(不同批次唾液酸的产量分别为：9.6g/L，8.2g/L，8.5g/L，7.6g/L，5.8g/L，4.6g/L，3.8g/L)。

Claims (9)

1.一株产聚唾液酸的大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌，菌株号K235-GX124，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2018878，保藏日期为2018年12月10日。
2.权利要求1所述产聚唾液酸的大肠杆菌在制备聚唾液酸中的应用。
3.权利要求1所述产聚唾液酸的大肠杆菌在制备唾液酸中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将大肠杆菌K235-GX124接种至发酵培养基中，利用氨水调节pH为6.3～6.5，发酵培养；
(2)以10～30mL/h/L速率进行补料发酵；
(3)离心发酵液，上清液利用陶瓷膜进行过滤，收集上清液中的聚唾液酸；
(4)步骤(3)离心得到的菌体和过滤得到的滤液回流至发酵罐，继续进行发酵；
(5)每12～20h对发酵液进行陶瓷膜过滤分离，连续发酵5～15批次。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述的发酵培养基包括如下组分：
山梨醇10～30g/L、酵母粉5～20g/L、MgSO4 0.1～1g/L、K2HPO4 1～3g/L、KH2PO41～3g/L，溶剂为水。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述的发酵培养，其培养条件如下：
转速200～800rpm，通风量2～10L/min，发酵温度33～40℃，培养时间为5～8h。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述的补料发酵，其补料培养基为山梨醇250～350g/L。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述的补料发酵，其发酵条件为：利用氨水调节pH为6.3-6.5，以10～30mL/h/L速率进行补料发酵，继续发酵12～20h。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述的陶瓷膜为50-300nm孔径的陶瓷膜。
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