CN111218442A - 具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法 - Google Patents

具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法，将诱变后的米曲霉菌悬液用无菌膜过滤，获得单核体米曲霉菌种；获得的单核体米曲霉菌种用于进一步选育，之中得到具有遗传稳定性的单核米曲霉突变株。经本发明提供的方法处理后的米曲霉菌株，具有良好的遗传稳定性，可显著提高米曲霉突变株的应用价值。

Description

具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法。
背景技术
酱油，以大豆和小麦为主要原料经米曲霉、酵母等多种微生物混合发酵而来。米曲霉中丰富的酶系活性的高低直接影响酱油的原料利用率和产品品质。米曲霉是产复合酶的菌种，除蛋白酶外，还能产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶、果胶酶等。米曲霉不产生黄曲霉毒素，是我国传统酿造食品酱和酱油的主要生产菌种。
为获取品质优良的米曲霉菌株，提高生产效率，常利用不同手段对米曲霉菌株进行改造。但是，研究表明，米曲霉的多核属性，会导致通过诱变育种技术获取的米曲霉突变株经传代后发酵性能差异巨大，即为诱变株遗传性状的不稳定性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：米曲霉菌株诱变株遗传性状不稳定，本发明提供了解决上述问题的具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法，经此方法处理后的米曲霉菌株，具有良好的遗传稳定性，可显著提高米曲霉突变株的应用价值。
本发明通过下述技术方案实现：
一种具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法，将诱变后的米曲霉菌悬液用无菌膜过滤，获得单核体米曲霉菌种；获得的单核体米曲霉菌种用于进一步选育，之中得到具有遗传稳定性的单核米曲霉突变株。
进一步地，所述无菌膜的筛孔大小为0.2μm或0.45μm。
进一步地，所述米曲霉采用米曲霉As 3.042。
进一步地，采用的诱变方法包括ARTP诱变法。
进一步地，采用ARTP诱变法处理的方法包括以下步骤：将米曲霉菌悬液置于ARTP诱变仪器固定位置，设定功率120w，气流量10SLM～10.5SLM，诱变处理时间为155s～165s，获得突变体米曲霉菌悬液。
进一步地，在诱变之前进行菌株活化：将米曲霉接种于黄豆汁培养基进行培养活化；所述黄豆汁培养基，包括以下成分：磷酸氢二钾0.10％～0.15％，硫酸镁0.045％～0.055％，可溶性淀粉1.8％～2.0％，硫酸铵0.045％～0.055％，琼脂1.5％～1.7％，溶于黄豆汁定容至100ml；pH调至6.8。
进一步地，还包括富集筛选处理过程：无菌膜过滤获得的含单核体米曲霉菌种滤液转入筛选培养基Ⅰ中培养；所述筛选培养基I，包括以下成分：葡萄糖1.8％～2.0％，酵母浸粉0.95％～1.05％，硫酸镁0.045％～0.055％，磷酸二氢钾0.095％～0.105％，蛋白胨0.95％～1.05％，氯化钙0.0095％～0.0105％，硫酸铵0.45％～0.55％，溶于蒸馏水定容至100ml；pH调至6.5。
进一步地，选取筛选培养基I中生长最优的菌种移至筛选培养基II培养；
所述筛选培养基II为固态双层培养基：
下层培养基为：15‰～17‰琼脂，溶于蒸馏水中定容至1000ml。
上层培养基包括A、B两部分：A为3.98g～4.02g干酪素溶于100mL0.1mol/LNaOH，加入1.068g～1.072g磷酸钠和0.358g～0.362g磷酸二氢钾，20g琼脂，880mL蒸馏水，pH调至7.2；B为3.98g～4.02g氯化钡，20mL蒸馏水；A、B两部分在121℃条件下灭菌20min后混合获得上层培养基。
进一步地，选取筛选培养基I中生长最优的菌种的方法采用MMC培养：将筛选培养基I的培养液转入全自动高通量微生物液滴培养仪进样瓶，选择“生长曲线”功能，液滴数量为180个～200个，检测波长为600nm，选取生长情况最优的液滴于筛选培养基II培养，选育出符合目的具有遗传稳定性的单核米曲霉突变株。
本发明具有如下的优点和有益效果：
常压室温等离子体诱变(ARTP)具有设备简单、成本低、操作便捷、突变谱广、突变率高等特点。高通量微生物液滴培养仪(MicrobialMicrodropletCulture system,MMC)是基于液滴微流控技术开发的微型化、自动化、智能化高通量微生物培养仪器，可通过液滴培养的方式迅速筛选目标菌株。因此，通过ARTP技术改造米曲霉菌株，突变株的菌悬液用0.2μm或0.45μm无菌膜过滤，得到突变株的单核体，确保米曲霉突变株的遗传稳定性，再通过MMC技术高效筛选，以此迅速获取符合目的的具有遗传稳定性的单核米曲霉突变株，这是增加料利用率、提高酱油品质的一条可行途径。
1、本发明一种使米曲霉菌株经ARTP诱变后仍具有遗传稳定性的方法，使突变株在连续传代后，发酵性能等同于初始突变株，保持了良好的遗传稳定性。
2、本发明一种通过常温等压等离子体诱变技术(ARTP)改造米曲霉菌株发酵性能、且通过无菌滤膜筛选单核菌株，这种诱变及筛选单核菌株方式，成本低、操作简单且效果显著。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例提供了一种具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法，具体如下所示：
步骤1，菌株活化：米曲霉As 3.042接种于黄豆汁培养基，30℃条件下培养3d；
黄豆汁培养基成分为：磷酸氢二钾0.10％，硫酸镁0.05％，可溶性淀粉2％，硫酸铵0.05％，琼脂1.5％，溶于黄豆汁定容至100ml，pH调至6.8。
步骤2，菌悬液的制备：用15mL生理盐水将菌体从培养基上洗脱，4层纱布过滤于100mL盛有玻璃珠的锥形瓶中，八层纱布封口，120rpm震荡60min；
步骤3，ARTP诱变：取1mL处理后的米曲霉菌悬液放到ARTP(常温等压等离子体)诱变仪器固定位置，设定功率120w，气流量10SLM，诱变处理时间为165s，获得米曲霉突变体菌悬液；
步骤4，单核体的获取：将诱变后的菌悬液用0.45μm无菌膜过滤，获得单核体米曲霉菌株；
步骤5，单核体的富集：将无菌膜过滤滤液转入4mL筛选培养基I中培养48h；
所述筛选培养基I，包括以下成分：葡萄糖2％，酵母浸粉1％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，蛋白胨1％，氯化钙0.01％，硫酸铵0.5％，溶于蒸馏水定容至100ml，pH调至6.5。
步骤6，MMC培养：取筛选培养基I的培养液转入全自动高通量微生物液滴培养仪(Microbial MicrodropletCulture system,MMC)进样瓶，选择“生长曲线”功能，液滴数量为200个，检测波长为600nm。选取生长情况最优的液滴于筛选培养基Ⅱ培养，选育出符合目的的具有遗传稳定性的单核米曲霉突变株。
所述筛选培养基II为固态双层培养基：下层培养基为15‰的琼脂溶于蒸馏水中定容至1000ml；上层培养基包括A、B两部分：A为4g干酪素溶于100mL 0.1mol/LNaOH，加入1.07g磷酸钠和0.36磷酸二氢钾，20g琼脂，880mL蒸馏水，pH调至7.2；B为4g氯化钡，20mL蒸馏水；A、B两部分在121℃条件下灭菌20min后混合获得上层培养基。
性能检验：
按质量比将小麦粉、豆粕、水按以3:7:7的比例混合，121℃条件下灭菌20min，冷却至40℃以下。将上述筛选菌株按照0.6％的接种量接入物料中，控制温度为30℃及湿度为95％条件下培养48h，测定成曲中相关酶活，与出发菌株做对照，分别得到低半纤维素酶活、高纤维素酶活、高中性蛋白酶酶活、高酸性蛋白酶酶活、高果胶酶酶活的突变株，结果见表1：(“本发明1、本发明2、本发明3、本发明4、本发明5”是挑选的实施例1过膜处理后的五个不同的突变菌株)。
表1突变菌株与出发菌株相关酶活对比
Figure BDA0002417709320000041
实施例2
本实施例提供了一种具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法，方案概括如下所示，与实施例1的区别在于，没有步骤4所述的无菌膜过滤步骤：
以初筛的米曲霉As 3.042为出发菌株，活化后制备为菌悬液，以常温等压等离子体(ARTP)进行诱变选育，将米曲霉菌悬液放到ARTP诱变仪器固定位置后，在气流量为10SLM，诱变处理时间设为165s，获得突变体，突变体菌悬液转入4mL筛选培养基Ⅰ中培养48h，培养液转入全自动高通量微生物液滴培养仪(MicrobialMicrodropletCulturesystem,MMC)进样瓶，选择“生长曲线”功能，液滴数量为200个，检测波长为600nm。选取生长情况最优的液滴于筛选培养基Ⅱ培养，选育符合目的的米曲霉突变株。
将小麦粉、豆粕、水按以3:7:7的比例混合，121℃条件下灭菌20min，冷却至40℃以下。将上述筛选菌株按照0.6％的比例接入物料中，控制温度为30℃及湿度为95％条件下培养48h，测定成曲中相关酶活，得到复合目的的突变株，结果见表2(“未过膜突变株1、未过膜突变株、未过膜突变株3”是挑选的未过膜处理的三个不同突变株)。
表2未过膜突变株发酵制曲酶活检测
Figure BDA0002417709320000042
实施例3
将实施例1获得的具有遗传稳定性的单核米曲霉突变株，连续传代后初始突变株和第五十代突变株发酵制曲后相关酶活稳定性验证：
将突变株接种于黄豆培养基斜面，30℃条件下培养72h，连续传递五十代。
按质量比将小麦粉、豆粕、水按以3:7:7的比例混合，121℃条件下灭菌20min，冷却至40℃以下。将突变株第五十代菌株按照0.6％的比例接入物料中，控制温度为30℃及湿度为95％条件下培养48h，测定成曲中相关酶活，结果见表3。
表3过膜突变株和未过膜突变株第五十代菌株相关酶活检测
Figure BDA0002417709320000051
综上所述：
通过实施例1可知，经ARTP诱变后过膜，再经高通量微生物液滴培养后选育的突变株，经发酵制曲，分别可筛选得到半纤维素酶活低于出发菌株及纤维素酶活、中性蛋白酶酶活、酸性蛋白酶酶活、果胶酶酶活高于出发菌株的突变株。
过实施例2可知，经ARTP诱变后直接通过高通量微生物液滴培养选育的突变株，经发酵制曲，可筛选得到发酵性能较好的突变株。
通过实施例3与实施例1的试验结果对比，经ARTP诱变后过膜，再经高通量微生物液滴培养后选育的突变株，经连续传代后，发酵性能未退化，突变株具有较强的遗传稳定性。
通过实施例3与实施例2的试验结果对比，经ARTP诱变后菌悬液直接经高通量微生物液滴培养后选育的突变株，经连续传代后，发酵性能不稳定，突变株不具有遗传稳定性。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法，其特征在于，将诱变后的米曲霉菌悬液用无菌膜过滤，获得单核体米曲霉菌种；获得的单核体米曲霉菌种用于进一步选育，之中得到具有遗传稳定性的单核米曲霉突变株。
2.根据权利要求1所述的具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法，其特征在于，所述无菌膜的筛孔大小为0.2μm或0.45μm。
3.根据权利要求1所述的具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法，其特征在于，所述米曲霉采用米曲霉As 3.042。
4.根据权利要求1所述的具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法，其特征在于，采用的诱变方法包括ARTP诱变法。
5.根据权利要求4所述的具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法，其特征在于，采用ARTP诱变法处理的方法包括以下步骤：将米曲霉菌悬液置于ARTP诱变仪器固定位置，设定功率120w，气流量10SLM～10.5SLM，诱变处理时间为155s～165s，获得突变体米曲霉菌悬液。
6.根据权利要求1至5任一项所述的具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法，其特征在于，在诱变之前进行菌株活化：将米曲霉接种于黄豆汁培养基进行培养活化；
所述黄豆汁培养基，包括以下成分：磷酸氢二钾0.10％～0.15％，硫酸镁0.045％～0.055％，可溶性淀粉1.8％～2.0％，硫酸铵0.045％～0.055％，琼脂1.5％～1.7％，溶于黄豆汁定容至100ml，pH调至6.8。
7.根据权利要求1至5任一项所述的具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法，其特征在于，还包括富集筛选处理过程：无菌膜过滤获得的含单核体米曲霉菌种滤液转入筛选培养基Ⅰ中培养；
所述筛选培养基I，包括以下成分：葡萄糖1.8％～2.0％，酵母浸粉0.95％～1.05％，硫酸镁0.045％～0.055％，磷酸二氢钾0.095％～0.105％，蛋白胨0.95％～1.05％，氯化钙0.0095％～0.0105％，硫酸铵0.45％～0.55％，溶于蒸馏水定容至100ml，PH调至6.5。
8.根据权利要求7所述的具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法，其特征在于，选取筛选培养基I中生长最优的菌种移至筛选培养基II培养；
所述筛选培养基II为固态双层培养基：
下层培养基为：15‰～17‰琼脂，溶于蒸馏水中定容至1000ml。
上层培养基包括A、B两部分：A为3.98g～4.02g干酪素溶于100mL0.1mol/LNaOH，加入1.068g～1.072g磷酸钠和0.358g～0.362g磷酸二氢钾，20g琼脂，880mL蒸馏水，pH调至7.2；B为3.98g～4.02g氯化钡，20mL蒸馏水；A、B两部分在121℃条件下灭菌20min后混合获得上层培养基。
9.根据权利要求8所述的具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法，其特征在于，选取筛选培养基I中生长最优的菌种的方法采用MMC培养：将筛选培养基I的培养液转入全自动高通量微生物液滴培养仪进样瓶，选择“生长曲线”功能，液滴数量为180个～200个，检测波长为600nm，选取生长情况最优的液滴于筛选培养基II培养，选育出符合目的具有遗传稳定性的单核米曲霉突变株。
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