CN110511877A - 一种低半纤维素酶活米曲霉及其在高氨氮浅色酱油酿造中的应用 - Google Patents

一种低半纤维素酶活米曲霉及其在高氨氮浅色酱油酿造中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低半纤维素酶活米曲霉，通过以下工艺制得：以米曲霉As 3.042为出发菌株进行ARTP诱变，ARTP诱变条件为，10μL米曲霉菌悬液放到ARTP诱变仪器固定位置，气流量9.5～10SLM，诱变处理时间为155～165s，获得突变体，所述米曲霉突变株X44于2019年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.18104。该米曲霉霉突变株半纤维素酶活低，中性蛋白酶和酸性蛋白酶酶活高，将其应用于酱油酿造，能够得到高氨氮的浅色酱油，本发明还公开上述低半纤维素酶活米曲霉在高氨氮浅色酱油酿造中的应用。

Description

一种低半纤维素酶活米曲霉及其在高氨氮浅色酱油酿造中的 应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵工业领域，具体涉及一种低半纤维素酶活米曲霉及其在高氨氮浅色酱油酿造中的应用。
背景技术
酱油色素主要有三种产生途径，一是由糖和氨基酸发生的非氧化褐变反应，二是糖和氨基酸在自然环境下的氧化褐变反应，三是糖类在高温下脱水所产生的焦糖色。以上三种途径均与糖类物质密不可分。因此，糖和氨基酸是形成酱油色素的主要原料。而对于色素高的酱油，氨氮和全氮的生成率较低，且烹饪口感不如浅色酱油，同时，基于消费者对于健康饮食理念的追求，大众对浅色酱油的接受度日益增加。
半纤维素是构成植物细胞壁的主要成分之一，主要包括了聚木糖类、聚葡萄甘露糖类和聚半乳糖葡萄甘露糖类。酱醪中的五碳糖含量是决定酱油色率的关键因素。在酱油的发酵过程中，五碳糖和氨基酸发生褐变反应，形成棕褐色，再经高温会逐渐转变为黑褐色，随着发酵时间的延长，酱油色率增高。而酱油口感的厚重、绵长需要足够的发酵时间才能获得，这与消费者对浅色酱油的追求理念相违背。传统的，为了获得浅色酱油，采用降低大豆比重增加小麦含量的方法，但是这种工艺生产出的酱油氨氮含量不高，酱油味道鲜美度降低。在不改变原料配比的情况下，降低酱醪中木糖浓度，让色率随着发酵时间变化较小，这是生产低色率高氨氮酱油的一条可行途径。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明公开一种低半纤维素酶活米曲霉，该米曲霉半纤维素酶活低，中性蛋白酶和酸性蛋白酶酶活高，将其应用于酱油酿造，能够得到高氨氮的浅色酱油，本发明还公开上述低半纤维素酶活米曲霉在高氨氮浅色酱油酿造中的应用。
本发明通过下述技术方案实现：
一种低半纤维素酶活米曲霉，通过以下工艺制得：
以米曲霉As 3.042为出发菌株进行ARTP诱变，ARTP诱变条件为，10μL米曲霉菌悬液放到ARTP诱变仪器固定位置，气流量9.5～10SLM，诱变处理时间为155～165s，获得突 变体，在突变体中选育出一株低半纤维素酶活的米曲霉突变株X44，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2019年6月28日，保藏名称为X44，其保藏编 号为：CGMCC No.18104。
米曲霉突变株X44的分类命名为：米曲霉Aspergillus oryzae，保藏地址为：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号。
一种低半纤维素酶活米曲霉在高氨氮浅色酱油酿造中的应用。
一种高氨氮浅色酱油的酿造工艺，包括以下步骤：
(1)菌种培养：将权利要求1所述的一种低半纤维素酶活米曲霉制备成菌种；
(2)制曲：将小麦粉、豆粕、水按比例混合后灭菌、冷却，以0.6％的接种量将步骤(1) 的菌种接入物料中，培养制得成曲；
(3)发酵、灭菌，得到成品酱油。
其中，步骤(1)中，菌种的具体制备工艺为：突变菌株X44进行分离、复壮、优选，再经多级种子扩大培养，制成菌种。
进一步的，步骤(2)中，灭菌温度为121℃，灭菌20min，冷却至40℃以下，接入菌种后，控制温度为30℃、湿度为95％条件下培养40～60h，制得成曲。
进一步的，步骤(2)中，制曲各原料重量配比为：小麦粉：豆粕：水＝(2～7)：(3～8)： (6～8),制曲过程中加入金属螯合剂柠檬酸或酒石酸，抑制色素生成，加入量为0.001～ 0.01％。
进一步的，步骤(3)中，所述发酵工艺为：
②盐水配制：按1:1.8～2.5比例在成曲中加入盐浓度为22～23％的盐水；
②发酵控制：将拌好盐水的成曲打入发酵池，条件控制为前期低温、中期高温、后期低温发酵，发酵时间8-12个月，制得酱油。
前期低温为12℃，发酵1个月，中期高温为28℃，发酵2～5个月，后期低温为12℃，发酵5～6个月。
进一步的，步骤(3)中，灭菌工艺为：采用高温瞬时灭菌，145℃～150℃灭菌8～15s。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明一种低半纤维素酶活米曲霉，通过常温等压等离子体诱变技术，诱变筛选出米曲霉突变株X44，其半纤维素酶活为534U/g，较出发菌株降低85.34％，且其中性蛋白酶和酸性蛋白酶较出发菌株提高，分别达到3749U/g、478U/g，应用于酱油酿造工艺，可以有效分解酱醪中蛋白质，且产生木糖较少，有效抑制了酱油发酵和灭菌过程中黑色素的产生，从而在高氨氮情况下制得浅色酱油；
2、本发明一种高氨氮浅色酱油的酿造工艺，以米曲霉突变株X44为菌种，在高大豆占比情况下，可将酱油色率降至2000以下，且氨氮含量高于0.8g/100mL，得到高氨氮浅色酱油。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
低半纤维素酶活的米曲霉X44菌株的筛选：以初筛的产半纤维素酶的米曲霉As3.042为出发菌株，以常温等压等离子体(ARTP)进行诱变选育，将10μL米曲霉菌悬液放到ARTP 诱变仪器固定位置后，在气流量为10SLM，诱变处理时间设为165s，获得突变体，将诱变后的菌液稀释后均匀涂布于含有木聚糖的黄豆培养基(木聚糖浓度10g/L)上，30℃条件下培养48h后挑出突变菌株。
将小麦粉、豆粕、水以重量计按3:7:7的比例混合，121℃条件下灭菌20min，冷却至40℃以下。将上述筛选菌株按照0.6％的比例接入物料中，控制温度为30℃及湿度为95％条件下培养48h，测定成曲中半纤维素酶活性，与出发菌株做对照，得到一株低半纤维素酶活的突变菌株X44，结果见表1。
表1.突变菌株X44与出发菌株半纤维素酶活性比较
实施例2
米曲霉As 3.042及诱变菌株X44发酵成品酱油色率测定：将小麦粉、豆粕、水以重量计按3:7:7混合均匀，121℃条件下灭菌20min，冷却至40℃以下。分别以米曲霉As 3.042、诱变菌株X44为实验菌株，以0.6％的接种量接入物料中，在温度30℃及湿度95％条件下培养2-3d，制得成曲。
按重量计1:1.8～2.5的比例在成曲中加入浓度为22％的盐水，将拌好盐水的成曲打入发酵池，控制发酵温度为前期低温(12℃发酵1个月)、中期高温(28℃发酵5个月)、后期低温(12℃发酵6个月)，制得成品酱油。相关参数见表2。
表2 As 3.042发酵成品酱油相关指数
实施例3
制曲过程中增加小麦配比发酵酱油实验：将小麦粉、豆粕、水以重量计分别以5:5:7(配方1)、7:3:7(配方2)、9:1:7(配方3)的比例混合均匀，在121℃条件下灭菌20min，冷却至40℃以下。以X44为实验菌株，以0.6％的接种量接入物料中，在温度为30℃及湿度为95％条件下培养2-3d，制得成曲。
按重量计1:1.8～2.5比例在成曲中加入浓度为22％的盐水，将拌好盐水的成曲打入发酵池，控制发酵温度为前期低温(12℃发酵1个月)、中期高温(28℃发酵5个月)、后期低温 (12℃发酵6个月)，制得成品酱油。相关参数见表3。
表3改变原料配比发酵成品酱油相关指数
实施例4
成曲中添加金属螯合剂柠檬酸发酵实验：将小麦粉、豆粕、水以重量计按3:7:7的比例混合均匀，并添加不同浓度的柠檬酸，121℃条件下灭菌20min，冷却至40℃以下。以X44为实验菌株，以0.6％的接种量接入物料中，在温度为30℃及湿度为95％条件下培养 2-3d，制得成曲。
按重量计1:1.8～2.5比例在成曲中加入浓度为22％的盐水，将拌好盐水的成曲打入发酵池，控制发酵温度为前期低温(12℃发酵1个月)、中期高温(28℃发酵5个月)、后期低温 (12℃发酵6个月)，制得成品酱油。相关参数见表4。
表4不同柠檬酸浓度下发酵成品酱油相关指数
实施例5
成曲中添加金属螯合剂酒石酸发酵实验：将小麦粉、豆粕、水以重量计按照3:7:7的比例混合均匀，并添加不同浓度的酒石酸，121℃条件下灭菌20min，冷却至40℃以下。以X44 为实验菌株，以0.6％的接种量接入物料中，在温度为30℃及湿度为95％条件下培养2-3d，制得成曲。
按重量计1:1.8～2.5比例在成曲中加入浓度为22％的盐水，将拌好盐水的成曲打入发酵池，控制发酵温度为前期低温(12℃发酵1个月)、中期高温(28℃发酵5个月)、后期低温 (12℃发酵6个月)，制得成品酱油。相关参数见表5。
表5不同酒石酸浓度下发酵成品酱油相关指数
实施例6
恒温发酵实验：将小麦粉、豆粕、水以重量计按照3:7：7的比例混合均匀，121℃条件下灭菌20min，冷却至40℃以下。以X44为实验菌株，以0.6％的接种量接入物料中，在温度为30℃及湿度为95％条件下培养2-3d，制得成曲。
按重量计1:1.8～2.5比例在成曲中加入浓度为22％的盐水，将拌好盐水的成曲打入发酵池，控制发酵温度为30-35℃，发酵12个月。制得成品酱油，相关参数如表6。
表6恒温发酵酱油相关指数
根据各实施例中，发酵成品酱油的色率、红色指数以及氨氮三个指标的检测结果，选取每个实施例中最优配比以及具代表性的两个市售酱油样品，具体见表7。
表7各实施例及市售代表酱油相关指数
根据表7，选用本发明中诱变菌株X44发酵制曲，在曲中加入0.005％的金属螯合剂柠檬酸，采用前期低温(发酵1个月12℃)中期高温(发酵2-5个月28℃)后期低温(发酵5～6个月12℃)发酵方式，获得的浅色酱油质量最好。市售的浅色酱油中，其氨氮含量远低于本发明；市售的高氨氮酱油中，色率远高于本发明。
综上：
通过实施例1可知，本发明筛选的米曲霉X44菌株，制得成曲中木糖含量及其半纤维素酶活性明显低于出发菌株。
通过实施例2可知，经ARTP诱变得到的X44菌株，经制曲发酵，得到的酱油色率低于出发菌株制曲发酵所得酱油色率且氨氮高于出发菌株制曲发酵所得成品酱油。
通过实施例3与实施例2的试验结果对比，酱油制曲过程中，降低大豆比例增加小麦使用量，经发酵得到的成品酱油虽然色率变低，但氨氮含量也明显降低。
通过实施例4与实施例2的试验结果对比，制曲过程中加入0.005％的柠檬酸，制得的成品酱油色率降低且氨氮含量未明显下降。
通过实施例5与实施例2的试验结果对比，制曲过程中加入0.003％的酒石酸，制得的成品酱油色率降低且氨氮略有下降。
通过实施例4与实施例5的试验结果对比，制曲过程中加入0.005％的柠檬酸发酵所得成品酱油与制曲过程中加入0.003％的酒石酸发酵所得成品酱油相比，加入柠檬酸发酵的成品酱油色率更低且氨氮含量更高。
通过实施例6与实施例2的试验结果对比，前期低温(发酵1个月12℃)中期高温(发酵2-5个月28℃)后期低温(发酵5～6个月12℃)工艺生产的酱油色率低于恒温发酵(30-35℃) 酱油且氨氮含量高于恒温发酵酱油(30-35℃)。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种低半纤维素酶活米曲霉，其特征在于，通过以下工艺制得：
以米曲霉As 3.042为出发菌株进行ARTP诱变，ARTP诱变条件为，10μL米曲霉菌悬液放到ARTP诱变仪器固定位置，气流量9.5～10SLM，诱变处理时间为155～165s，获得突变体，在突变体中选育出一株低半纤维素酶活的米曲霉突变株X44，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2019年6月28日，保藏名称为X44，其保藏编号为：CGMCCNo.18104。
2.如权利要求1所述的一种低半纤维素酶活米曲霉在高氨氮浅色酱油酿造中的应用。
3.一种高氨氮浅色酱油的酿造工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种培养：将权利要求1所述的一种低半纤维素酶活米曲霉制备成菌种；
(2)制曲：将小麦粉、豆粕、水按比例混合后灭菌、冷却，以0.6％的接种量将步骤(1)的菌种接入物料中，培养制得成曲；
(3)发酵、灭菌，得到成品酱油。
4.根据权利要求3所述的一种高氨氮浅色酱油的酿造工艺，其特征在于，步骤(1)中，菌种的具体制备工艺为：突变菌株X44进行分离、复壮、优选，再经多级种子扩大培养，制成菌种。
5.根据权利要求3所述的一种高氨氮浅色酱油的酿造工艺，其特征在于，步骤(2)中，灭菌温度为121℃，灭菌20min，冷却至40℃以下，接入菌种后，控制温度为30℃、湿度为95％条件下培养40～60h，制得成曲。
6.根据权利要求3所述的一种高氨氮浅色酱油的酿造工艺，其特征在于，步骤(2)中，制曲各原料重量配比为：小麦粉：豆粕：水＝(2～7)：(3～8)：(6～8),制曲过程中加入金属螯合剂柠檬酸或酒石酸，抑制色素生成，加入量为0.001～0.01％。
7.根据权利要求3所述的一种高氨氮浅色酱油的酿造工艺，其特征在于，步骤(3)中，。所述发酵工艺为：
①盐水配制：按1:1.8～2.5比例在成曲中加入盐浓度为22～23％的盐水；
②发酵控制：将拌好盐水的成曲打入发酵池，条件控制为前期低温、中期高温、后期低温发酵，发酵时间8-12个月，制得酱油。
8.根据权利要求3所述的一种高氨氮浅色酱油的酿造工艺，其特征在于，步骤(3)中，灭菌工艺为：采用高温瞬时灭菌，145℃～150℃灭菌8～15s。
9.根据权利要求7所述的一种高氨氮浅色酱油的酿造工艺，其特征在于，前期低温为12℃，发酵1个月，中期高温为28℃，发酵2～5个月，后期低温为12℃，发酵5～6个月。
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