CN113373063A - 一株米曲霉za175及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株米曲霉Z175及其应用，该菌株具有大豆蛋白和糖类溶出率高、原料利用率高和综合酶活力高等优点，遗传性质稳定，应用于酱油/酱生产的过程中，无需另外对制曲及发酵工艺过程进行调控设置，即可使米曲霉ZA175产生较高的α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶和α‑葡萄糖醛酸酶活力，对原料利用率高、能耗低；发酵过程中不用再额外添加各种用途的物料，就可以获得风味鲜甜突出、滋味醇厚、酱香浓郁、留口持久的酱油/酱，可以轻松实现工业化生产零添加纯酿酱油/酱；后期也无需通过调配其他添加剂来制造成品，工艺步骤简单、节约了生产成本；采用本发明米曲霉菌株进行酱油/酱的制曲和发酵，能够显著提高酱油/酱的风味、色泽和抗氧化能力，改善产品品质。
Description
技术领域
本发明属于酿造微生物技术领域，具体涉及一株米曲霉，及其在酱油酿造中的应用。
背景技术
酱油，是以大豆、小麦粉等为主要原料，由微生物和酶共同作用发酵而来。米曲霉是酱油发酵的主要菌种，细胞内酶系丰富，能够降解植物蛋白和多糖，生产酱油。一般情况下，米曲霉中酶系越丰富，原料利用率就越高，酱油生产中产生的沉淀就越少，成品风味越丰富。
在酱油发酵过程中，米曲霉3.042具有能够分泌高活性的水解酶、生长快速等优良特性，因而成为国内酱油酿造行业最主要的工业菌种。米曲霉3.042通过其分泌的多种酶系，将发酵原料中的大豆蛋白分解为多肽，将直链、支链淀粉降解为各种低分子糖类(例如糊精)被酱油中的其他微生物所利用，从而产生作为调味品更多丰富的风味物质。然而，米曲霉3.042主要产生中性蛋白酶、淀粉酶，而其他种类酶活性较低，对纤维素的利用率比较低，影响着酱油色泽及风味物质的产生。
大豆作为酱油发酵的主要原料，其特点在于不似小麦等以淀粉为主要成分，大豆几乎不含淀粉，而是由相当复杂的寡糖类及多糖类所构成，其构成大豆植物细胞壁的结构性多糖，占比约高达20％～40％。由于许多多糖类物质要么是不溶的，要么与不溶基质紧密结合，因此发酵过程中这些难溶性多糖常常易导致沉淀产生，进而导致发酵体系中还原糖种类及含量不足，造成产品红色指数偏低，氨基酸含量及风味不足等。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶催化含阿拉伯糖的聚合物中以α-(1,2)，α-(1,3)或α-(1,5)-连接的阿拉伯呋喃糖基的水解，该酶的主要功能是协同其他水解酶水解半纤维素等大分子物质。然而对于复杂的酱油发酵体系来说，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶常常表现出较低的活性，有报道称α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶与其他酶之间的协同作用十分重要，α-葡萄糖醛酸酶木聚糖降解酶系中非常重要的一员，可降解木聚糖等半纤维素侧枝上的葡萄糖醛酸残基，与其他半纤维素酶在降解半纤维素过程中发挥协同作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶与其他具有协同效应的酶系例如α-葡萄糖醛酸酶在制曲过程中促进植物纤维素、半纤维素得以较好分解，由此产生的可溶性还原糖为酱醅(醪)发酵过程中的美拉德反应提供充足的羰基化合物来源，发酵反应产物赋予酱油产品独特的风味和色泽，并且拥有一定的抗氧化活性。
有公开报道称酱曲来源的Aspergillus niger HL15产生的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、木聚糖酶、木糖酶能够在质量分数为15％NaCl溶液下高效协同降解半纤维素,释放出多糖中的阿拉伯糖、木糖。然而，由于采用该菌株发酵所得酱醪木糖浓度较高，色率随着发酵时间的变化梯度较大，酱油发酵和灭菌过程中易产生黑色素，酱油产品氨氮和全氮的生成率较低，导致酱油味道鲜美度进一步降低。
目前主要通过在酱油发酵体系中外源添加组合酶制剂或者改进生产工艺，从而达到同时提升酱油产品色泽、风味品质的目的，一方面增加了酱油酿造工艺质控难度，另一方面增加了酱油生产成本。相比之下，采用优良菌种进行酱油酿造是提升酱油品质较为经济和易进行规模化生产推广的途径，因此，寻找新的能够解决上述问题的发酵米曲霉菌株是十分必要的。
发明内容
鉴于以上背景技术，本发明的目的之一在于提供一株半纤维素糖化能力增强的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175，通过该米曲霉菌株制得的酱油成曲具有较高的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶活性，高效降解大豆、小麦等原料中的半纤维素，提高了原料的利用率。应用该菌株酿造酱油等调味品，不仅能够提高氨基氮、全氮含量，提升酱油鲜美及香甜口感。而且所制备的酱油色泽红润，呈红/棕褐色，同步提升了酱油的色泽。本发明的目的还在于公开上述米曲霉ZA175菌株在浓厚酱油酿造中的应用。
为了实现本发明的目的，本发明的发明人通过大量的实验，最终获得了如下实验方案：
本发明的发明人尝试以目前普遍使用的生产菌株沪酿3.042为出发菌株，通过诱变选育获得能够提高成曲α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶活力的米曲霉菌株，具体地，本发明所采用的诱变选育方法包括如下步骤：
1、以沪酿3.042为出发菌株，采用常压室温等离子体(Atmospheric RoomTemperature Plasma，简称ARTP)诱变方法对出发菌株进行诱变获得诱变菌落，采用半纤维素双层平板培养基对突变菌落进行筛选，即在半纤维素双层平板培养基上挑选透明圈清晰、孢子丰富且菌丝生长旺盛的诱变菌株进行初步筛选。
其中，半纤维素双层平板培养基的配方为：下层为2％琼脂，上层为10mL筛选培养基，其中包含0.5g/L葡萄糖，2.0g/L KH2PO4，2.0g/L NH4NO3，0.2g/LMgSO4·7H2O，5g/L酵母膏，20g/L半纤维素，20g/L琼脂，pH 6.0，加水至1L。
2、初筛方法为保藏菌株由PDA斜面活化后转接三角瓶培养，观察诱变米曲霉菌株的生长情况。挑选透明圈较大并且孢子数较多的菌落突诱变菌株，采用常规方法检测其蛋白酶、淀粉酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶活力，优选蛋白酶、淀粉酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶活力高的菌株进行复筛。
3、复筛方法为按照常规酱油生产方法进行小规模制曲，检测制曲成曲蛋白酶、淀粉酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶，优选综合酶活力高的菌株进行生产试用。
4、生产使用为按照常规酱油生产方法进行酱油生产，检测制曲成曲指标和发酵酱油质量。
通过上述方法，获得了本发明的诱变菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175。
作为本发明的一个方面，本发明提供一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175，其于2021年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC.No：61642，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
本发明的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175的菌落形态特征如下：菌落直径达1cm～2cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，请参见图2。
作为本发明的另一方面，本发明还提供了上述米曲霉ZA175在制曲中的用途，在某些实施方案中，所述制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。
作为本发明的另一方面，本发明还提供了上述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175在制备酱油或/和酱中的用途。
作为本发明的另一方面，本发明还提供一种酱油或/和酱的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将上述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175接种至制曲培养基，培养；
(2)将步骤(1)制备的成曲与氯化钠溶液混合，发酵。
在某些实施方案中，所述制曲培养基包含豆类原料或/和淀粉质类原料。
在某些实施方案中，发酵的方式为高盐稀态发酵。
在某些实施方案中，培养的温度为28℃-35℃，培养的时长为25h-45h。
在某些实施方案中，发酵的时长为85d-95d。
作为本发明的另一方面，本发明还提供一种酱油或/和酱，其采用如上述的制备方法制备。
作为本发明的另一方面，本发明还提供了上述米曲霉ZA174用于提高成曲α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶活力的用途。
在某些实施方案中，所述成曲酶还具备高活力淀粉酶、蛋白酶。
在某些实施方案中，与出发菌株沪酿3.042相比，本发明提供的米曲霉ZA174的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力增长率不小于20％，优选不小于22％，更优选不小于24％，特别优选不小于26％，最优选不小于30％。
在某些实施方案中，与出发菌株沪酿3.042相比，本发明提供的米曲霉ZA174的α-葡萄糖醛酸酶活力增长率不小于5％，优选不小于8％，更优选不小于11％，特别优选不小于14％，最优选不小于16％。
本发明的有益效果为：
(1)本发明提供一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175，该菌株通过对出发菌株沪酿3.042进行ARTP诱变、筛选获得目标菌株，该目标菌株较好的保留了出发菌株沪酿3.042蛋白酶、淀粉酶活力高的特点，同时α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活、α-葡萄糖醛酸酶活较出发菌株得以较显著的提升，分别提升了31％、17％，具有综合酶活活力高的优点。
(2)本发明提供的米曲霉ZA175菌株遗传性质稳定，应用该菌株酿造酱油、酱等调味产品，对酱醪原料中纤维素、半纤维素物质实现有效分解，提高酱醪中L-阿拉伯糖还原糖含量，从而不用额外添加其他物料(例如酶制剂)，即可获得风味鲜甜突出、滋味醇厚、酱香浓郁、留口持久的浓厚酱油和/酱。后期也无需通过调配其他添加剂来制造成品，工艺步骤简单、节约了生产成本。
(3)采用本发明米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175菌株进行酱油和/或酱发酵，对原料利用率高，所酿造的酱油原油更加澄清，降低了原油过滤成本，可通过现有的生产工艺进行生产，不涉及生产工艺调整和设备的更换，投产成本低，易于工业化推广。酿造酱油原油氨基氮、全氮含量高，显著提升了酱油鲜美及香甜口感。而且所制备的酱油色泽红润，呈红/棕褐色，同步提升了酱油的色泽，改善了浓厚酱油产品品质。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175的获得及应用流程图；
图2为米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175在PDA培养基上的菌落形态图；
图3为采用米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175发酵所得酱油的感官鉴评结果图。
本发明提供的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175，已于2021年5月8日保藏于广东微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61642；该菌株于2021年5月8日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2021年5月8日检测为存活菌株。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
酱油色素主要有三种产生途径，一是由糖和氨基酸发生的非氧化褐变反应，二是糖和氨基酸在自然环境下的氧化褐变反应，三是糖类在高温下脱水所产生的焦糖色。以上三种途径均与糖类物质密不可分。而目前对于色素高的酱油，氨氮和全氮的生成率较低。纤维素是构成植物细胞壁的主要成分之一，主要包括了聚木糖类、聚葡萄甘露糖类和聚半乳糖葡萄甘露糖类。酱醪中的五碳糖含量是决定酱油色率的关键因素。本发明人意外发现，在酱油的发酵过程中，L-阿拉伯糖和氨基酸发生褐变反应，随着发酵时间的延长，酱油色率增高。而酱油口感的厚重、绵长随着发酵时间延长逐渐获得，目前通常采用降低大豆比重增加小麦含量的方法，但是这种工艺生产出的酱油氨氮含量不高，酱油味道鲜美度降低，色率值低。在不改变原料配比的情况下，提供合适的还原糖参与酱醪发酵，让色率随着发酵时间变化的同时不影响氨氮、全氮的生成率，这是生产高色率、高氨氮酱油的一条可行途径。
目前通常通过高性能的半纤维素降解酶对半纤维素进行酶解获得还原性单糖。根据作用位点和方式的不同，半纤维素酶可被分为解聚型和脱支型2大类。解聚酶是水解半纤维素主链上连接键的一类半纤维素酶；脱支酶也被称作辅助酶，多用于多糖侧链。而L-阿拉伯糖残基和葡萄糖醛酸基在半纤维素中大量存在，L-阿拉伯糖残基和葡萄糖醛酸基单体或低聚体侧枝以α-1,3或α-1,2键连在木糖的主链上。侧枝的存在限制了解聚酶的作用，而α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶能降解侧枝，与解聚酶在降解半纤维素时存在着协同作用。因此，获得能够产适用于酱油酿造的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶的米曲霉具有重要意义。
本发明利用新型ARTP诱变育种方法诱变米曲霉菌株，并获得高产α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶的米曲霉突变株，提高米曲霉对半纤维素的糖化能力，产生L-阿拉伯糖和葡萄糖醛酸，减少酱油沉淀量，增加酱油甜度，强化酿造酱油过程中发生的美拉德反应，提高酱油品质。
本发明的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175，是发明人从佛山市海天(高明)调味食品有限公司发酵酱醪中，经过多次诱变、筛选和分离纯化培养获得。具体地，本发明所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175菌株的诱变选育方法如下(参见图1)：
1、以沪酿3.042为出发菌株，采用常压室温等离子体(Atmospheric RoomTemperature Plasma，简称ARTP)诱变方法对出发菌株进行诱变获得突变菌落，采用半纤维素双层平板培养基对突变菌落进行筛选，即在半纤维素双层平板培养基上挑选透明圈清晰、孢子丰富且菌丝生长旺盛的诱变菌株进行初步筛选。其中，半纤维素双层平板培养基的配方为：下层为2％琼脂，上层为10mL筛选培养基，其中包含0.5g/L葡萄糖，2.0g/L KH2PO4，2.0g/L NH4NO3，0.2g/LMgSO4·7H2O，5g/L酵母膏，20g/L半纤维素，20g/L琼脂，pH 6.0。
2、初筛方法为保藏菌株由PDA斜面活化后转接三角瓶培养，观察诱变米曲霉菌株的生长情况。挑选透明圈较大并且孢子数较多的突变菌株，采用常规方法检测其蛋白酶、淀粉酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶活力，优选蛋白酶、淀粉酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶活力高的菌株进行复筛；
3、复筛方法为按照常规酱油生产方法进行小规模制曲，检测制曲成曲蛋白酶、淀粉酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶，优选综合酶活力高的菌株进行生产试用。
4、生产使用为按照常规酱油生产方法进行酱油生产，检测制曲成曲指标和发酵酱油质量。
本发明通过上述诱变选育方法提供的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175，已于2021年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏编号为GDMCC No:61642。
本发明还提供一种米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175在制曲中的用途。制曲所得的成曲可以用于制备酱油，也可以用于制备酱。
本发明还提供一种米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175在制备酱油或/和酱中的用途。
本发明还提供一种酱油或/和酱的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175接种至制曲培养基，培养；
(2)将步骤(1)制备的成曲与氯化钠溶液混合，发酵。
在其中一个示例中，所述制曲培养基包含豆类原料或/和小麦类原料。本发明所述的豆类原料主要是指来源于豆科作物的原料，例如豆粕，可以是经脱脂处理的豆类，也可以是未经脱脂处理的豆类，豆类包括但不限于黄豆和黑豆。本发明所述的小麦类原料可以为小麦淀粉，也可以是麸皮。优选地，本发明所述的制曲培养基包含大豆、麸皮和面粉。
在制备成曲过程中，培养可以采用适合米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175的任意条件，例如培养的条件包括：温度为28℃-35℃，相对湿度保持在75％以上，培养时长为25h-45h。例如温度为28℃、32℃、33℃、34℃、35℃或者任意两值之间的温度值，相对湿度保持在75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或者任意两值之间的湿度值，培养时长为25h、30h、40h、44h或者任意两值之间的时长。米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175可以以合适的接种量接种至所述制曲培养基中，例如将常规培养在三角瓶中的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175种子液按3％-5％的接种量接种至所述制曲培养基中，例如接种量为3％、4％、5％或者任意两值之间的接种量值。本发明所述的“接种量”是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。
本发明所述酱油，例如为老抽、生抽等，本发明所述的酱，例如为调味酱、黄豆酱等。
本发明所述的发酵方式可以采用高盐稀态发酵。发酵的时长可以是适合米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175的任意发酵时长，优选为85d-95d，例如85d、90d、95d或者任意两值之间的发酵时长值。
本发明还提供一种酱油或/和酱，其采用如上所述的制备方法制备。
本发明还提供如上述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175在提高成曲α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶活力中的用途。
下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
下述实施例中，所述的盐，为食盐。例如盐水指食盐水溶液。
实施例1：米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175的获得
1、菌株诱变
将培养成熟的出发菌株沪酿3.042的孢子制成孢子悬液，孢子悬液的制备方法如下：
将活化好的沪酿3.042菌株接种于PDA液体培养基中，培养温度28℃，培养18h～24h至对数期，然后将对数期的菌株悬液用0.8％生理盐水调其浓度，通过光学显微镜进行计数，将菌浓度调至1×106cfu/mL～1×108cfu/mL。本实施例采用的沪酿3.042孢子悬液浓度为2×106cfu/mL。
取上述孢子悬浮液95μL，并加入50％甘油5μL混合均匀。对孢子悬液进行ARTP诱变。ARTP诱变条件为：采用氦气为工作气体，使载片与等离子体发生器射流出口间距约为2mm，功率为120W，气流量10L/min，诱变时间为140s。
2、诱变菌株的初筛
将上述诱变后的孢子悬液均匀涂布至半纤维素双层平板培养基上，28℃培养4天。培养过程中观察菌体生长、产孢情况和水解圈等。挑选透明圈清晰、孢子丰富且菌丝生长旺盛的突变菌株77株。将上述诱变菌株转接至PDA斜面培养基上，30℃培养成熟后置于4℃冰箱保藏备用。
将上述挑选出的77株诱变菌株活化后均匀涂布在半纤维素双层平板培养基上，28℃培养4天。培养过程中观察平板上透明圈形成快慢、大小，并记录菌落生长直径和透明圈直径。透明圈直径与菌落直径的比值大小用以表征诱变菌株分解半纤维素能力的大小，比值较大者即为分解半纤维素能力较强的菌株，从而筛选出与出发菌株相比菌落生长良好，分解半纤维素性能较好的菌落。该过程观察并记录到菌落生长速度快、圈径比值大的诱变菌株6株，编号分别为HZ03、HZ06、HZ32、HZ58、HZ63和HZ64，圈径比结果如表1。
将上述6株诱变菌株转接至PDA培养基斜面，30℃培养箱培养至成熟后置于4℃冰箱保藏备用。
半纤维素双层平板培养基制备方法如下：
ⅰ)在直径为9cm的平皿中倒入2％琼脂10mL；
ⅱ)筛选培养基的配制：上层为10mL筛选培养基，具体配方为：0.5g/L葡萄糖，2.0g/L KH2PO4，2.0g/L NH4NO3，0.2g/L MgSO4·7H2O，5g/L酵母膏，20g/L半纤维素，20g/L琼脂，pH 6.0，加水至1L；
ⅲ)待ⅰ)中琼脂层凝固后，在琼脂层表面倒入10mL筛选培养基。
表1、初筛米曲霉菌株圈径比结果
3、诱变菌株的复筛
将上述诱变获得的6株目标菌种活化转接于试管斜面培养基上，培养4d。然后取成熟斜面孢子分别接种于三角瓶培养基中进行扩培。其中，
试管斜面培养基为PDA培养基。
三角瓶培养基是由麸皮、大豆、面粉、水制备而成。
三角瓶的工艺控制采用常规方法，具体步骤如下：将大豆清洗除杂、浸泡8h，然后121℃灭菌20min，冷却后加入麸皮和面粉，大豆、麸皮和面粉质量比为1:4:1，恒温培养箱中培养，0h→16h温度为32℃，湿度为95％，16h进行第一次翻曲，16h→36h，温度调为28℃，湿度为95％，22h进行第二次翻曲；36h→44h，每隔2h湿度降低5％，使44h出曲时湿度降低至75％，培养44h得到成曲。
对于上述菌株制备成曲样品进行检测，挑选α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶酶活(采用常规检测方法)较高的诱变菌株进行酱油发酵：
孢子数测定方法：参照SB/T 10315-1999。
中性蛋白酶活力的测定：参照国标SB/T 10317-1999《蛋白酶活力测定》，采用福林法测定中性条件下pH7.2的蛋白酶活力。
α-淀粉酶活力的检测方法：参照轻工业标准QB/T 1803-1993《工业酶制剂通用试验方法》。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶酶活检测方法：将发酵液稀释1000倍后，取25μL样品于96孔板中，依次加入25μL 4mmol/L pNPAF溶液，50μL 0.1mol/L pH5.5醋酸钠缓冲液，将反应体系置于50℃的水浴锅中反应15min，反应结束后迅速加入100μL 1mol/LNa2CO3终止反应；将酶液在沸水浴中灭活10min做空白对照；将终止反应的反应体系静置15min后，用酶标仪测410nm下的吸光值，根据对硝基苯酚制作的标准曲线，计算出样品中对硝基苯酚的含量。
酶活的定义：每分钟产生1μmol/L的对硝基苯酚所需的酶量为1个酶单位。以Bradford测定样品蛋白质的浓度，从而测定酶的比活。
α-葡萄糖醛酸酶活检测：酶活性测定是利用酶水解反应产生的4-O-MeGlcA与砷钼酸钠的显色反应进行比色，具体方法是以MeGlcAX2为底物,添加适当稀释酶在适当条件下保温，然后添加铜试剂终止反应。其混合物在沸水浴中加热10min后,在冰水浴中冷却,然后添加砷钼酸钠试剂呈蓝色,在620nm下用分光光度计测其吸收峰值。α-葡萄糖醛酸酶活性单位定义为每分钟催化产生1μmol产物的酶量。以α-葡萄糖醛酸作标准曲线。
检测结果见表2。
表2、不同米曲霉菌株制备成曲的质量分析结果
备注：以出发菌株各项指标为1.00，其他诱变菌株换算成相应比值。
3、诱变菌株的发酵小试
优选生长正常和综合酶活力高的菌株HZ06、HZ32和HZ63进行发酵小试。将上述复筛选出的3株菌HZ06、HZ32和HZ63依次转接斜面活化后，进行三角瓶扩大培养，然后继续进行制曲和发酵小试，包括如下步骤：大豆经过清洗除杂、浸泡和121℃灭菌20min，冷却后加入麸皮和面粉，大豆、麸皮和面粉质量比为1:4:1，恒温培养箱中培养，0h→16h温度为32℃，湿度为95％，16h进行第一次翻曲，16h→36h，温度调为28℃，湿度为95％，22h进行第二次翻曲；36h→44h，每隔2h湿度降低5％，使44h出曲时湿度降低至75％，培养44h得到成曲，然后加入2.2倍体积的盐水，入发酵罐发酵，30℃发酵90d。
检测制曲成曲孢子数、中性蛋白酶、淀粉酶、阿拉伯糖苷酶活力的酶活和α-葡萄糖醛酸酶活力，检测结果见表3。
检测发酵原油沉淀量、还原糖、氨氮、全氮、红色指数和总抗氧化能力，检测结果见表4。
表3、不同菌株制曲质量分析结果
备注：以出发菌株各项指标为1.00，其他诱变菌株换算成相应比值。
表4、不同菌株发酵原油质量分析结果
| 菌株 | 还原糖 | 沉淀量 | 氨氮 | 全氮 | 红色指数 | 总抗氧化能力 |
| 出发菌株 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| HZ06 | 1.12 | 0.89 | 1.07 | 1.09 | 1.04 | 1.51 |
| HZ32 | 1.01 | 1.03 | 0.99 | 0.99 | 1.03 | 1.22 |
| HZ63 | 0.99 | 0.98 | 1.01 | 1.02 | 1.03 | 1.13 |
备注：以出发菌株各项指标为1.00，其他诱变菌株换算成相应比值。
从上表3和4的结果可以看出，与沪酿3.042相比，HZ06菌株中性蛋白酶活力、淀粉酶活力、α-L-阿拉伯糖苷酶活力和α-葡萄糖醛酸酶活力具有显著的优势，采用HZ06菌株发酵获得酱油原油，沉淀量显著降低，还原糖、红色指数、总抗氧化能力指标得到显著的提升。因此，选育获得的HZ06菌株具有明显的优势。
本实施例选育获得的米曲霉HZ06已经由本发明的发明人于2021年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，命名为米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175，保藏编号为GDMCC No:61642，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
本实施例筛选到的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175的菌落特征如下：菌落直径达3cm～4cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，请参见图2。
实施例2：米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175菌株遗传稳定性检测
诱变获得选育菌株产酶活的传代稳定性是关系到菌种质量的重要考察指标。将选育获得的诱变菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175在豆汁培养基斜面上进行连续传代10代，观察各代菌株的生长情况，并将第1代、第5代和第10代斜面菌种按照实施例1所述方法逐级扩大制备成三角瓶曲和制曲，判断其遗传稳定性，若十代测定孢子数、中性蛋白酶活力、淀粉酶活力、α-L-阿拉伯糖苷酶活力和α-葡萄糖醛酸酶活力误差在10％误差范围内，则表明菌株遗传稳定性良好。具体数据见表5。
表5、米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175菌株传代稳定性的制曲检测结果
备注：以出发菌株各项指标为1.00，其他诱变菌株换算成相应比值。
如表5的结果所示，从制曲成曲孢子数、中性蛋白酶、淀粉酶、α-L-阿拉伯糖苷酶活检测结果来看，米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175菌株的遗传稳定性好。
实施例3：米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175在酱油发酵中的效果
将选育获得的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175菌株与出发菌株同步展开酱油生产使用，同时设计外源添加α-L-阿拉伯糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶实验进行阳性对照，实验方案设计如下：
(1)分别将米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175与出发菌株的成曲加入2.2倍体积的盐水进行高盐稀态发酵，发酵温度及发酵周期管理按照常规方法进行：将大豆清洗除杂、浸泡8h，然后121℃灭菌20min，冷却后加入麸皮和面粉，大豆、麸皮和面粉质量比为1:4:1，恒温培养箱中培养，0h→16h温度为32℃，湿度为95％，16h进行第一次翻曲；16h→36h，温度调为28℃，湿度为95％，22h进行第二次翻曲；36h→44h，每隔2h湿度降低5％，使44h出曲时湿度降低至75％，培养44h得到成曲，然后加入2.2倍体积的盐水，入发酵罐发酵，30℃发酵90d，发酵结束压榨后所得的酱油进行沉淀量、还原糖、红色指数和总抗氧化能力的检测，检测结果见表6。
(2)阳性对照：将大豆清洗除杂、浸泡8h，然后121℃灭菌20min，冷却后加入麸皮和面粉，大豆、麸皮和面粉质量比为1:4:1，米曲霉3.024接种量为4％，恒温培养箱中培养，0h-16h温度为32℃，湿度为95％，16h进行第一次翻曲，16h-36h，温度调为28℃，湿度为95％，22h进行第二次翻曲；36h-44h，每隔2h湿度降低5％，使44h出曲时湿度降低至75％，培养44h得到成曲，然后加入2.2倍体积的盐水和外源酶添加至发酵罐发酵，外源酶添加方式分为以下三组：1)外源酶组A：添加0.05％外源α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶；2)外源酶组B：添加0.05％外源α-葡萄糖醛酸酶；3)外源酶组C：同时添加0.05％外源α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和0.05％外源α-葡萄糖醛酸酶，30℃发酵90d，发酵结束压榨后所得的酱油进行沉淀量、还原糖、氨氮、全氮、红色指数和总抗氧化能力的检测，检测结果见表6。
沉淀量测定：采用静置法，将样品室温静置10天，虹吸法抽去上清液，留下最后约20mL酱油和沉淀摇匀后离心收集沉淀，离心参数4500r/min，30min，然后将沉淀置于60℃烘箱中烘干2h后称重。
还原糖：参照食品安全国家标准食品中还原糖的测定(GB 5009.7-2016)
氨氮：氨基酸态氮的测定采用电位滴定仪。
全氮：参照GB/T 5009.5-2003。
红色指数测定方法：参考郑海燕(郑海燕.酱油中红色指数的测定方法，中国调味品，1999(1)：27-29.)方法，将过滤后酱油样品稀释10倍，分别在波长510nm和610nm下测得光密度值D1和D2，红色指数r由10×lg(D1/D2)表示。
总抗氧化测定方法：采用ABTS法，取2mmol/L ABTS溶液50mL与70mmol/LK2S2O8水溶液混合均匀，室温避光放置12h～16h，得ABTS+储备液。用磷酸盐缓冲溶液(10mmol/L，pH7.4)将ABTS+储备液稀释，使其A734＝0.700±0.020；取0.2mL样品稀释液与3.8mLABTS+工作液混合均匀反应4min后检测其A734，ABTS+自由基清除能力与A734呈反比；以Trolox为阳性对照，并绘制标准曲线，样品的抗氧化能力用Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity(TEAC)来表示。
表6、米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175发酵酱油质量分析
| 菌株 | 还原糖 | 沉淀量 | 全氮 | 氨氮 | 红色指数 | 总抗氧化能力 |
| 出发菌株 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 外源酶组A | 1.05 | 0.89 | 1.04 | 1.06 | 1.03 | 1.02 |
| 外源酶组B | 1.03 | 0.95 | 1.01 | 1.03 | 1.00 | 1.01 |
| 外源酶组C | 1.18 | 0.78 | 1.04 | 1.09 | 1.15 | 1.44 |
| ZA175 | 1.09 | 0.86 | 1.12 | 1.14 | 1.06 | 1.47 |
备注：以出发菌株值为1.00，其他诱变菌株换算成相应比值。
本实施例还召集20名有丰富经验的鉴评人员进行感官鉴评。感官鉴评的评价指标包括体态、色泽、香气、鲜味、甜味、苦涩味、咸味、酸味和综合口感，分值为0～5分，分数越高，该项指标越好。感官鉴评结果总结于表7和图3中。
表7、米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175发酵酱油感官鉴评结果
| 菌株 | 体态 | 色泽 | 香气 | 鲜味 | 甜味 | 苦涩味 | 咸味 | 酸味 |
| 出发菌株 | 4.5 | 4.3 | 4.4 | 4.6 | 4.4 | 4.5 | 4.3 | 4.5 |
| 外源酶组A | 4.6 | 4.3 | 4.3 | 4.5 | 4.3 | 4.5 | 4.2 | 4.3 |
| 外源酶组B | 4.5 | 4.6 | 4.3 | 4.7 | 4.7 | 4.4 | 4.2 | 4.3 |
| 外源酶组C | 4.7 | 4.8 | 4.5 | 4.7 | 4.9 | 4.1 | 4.1 | 4.2 |
| ZA175 | 4.8 | 4.8 | 4.8 | 4.7 | 4.9 | 4.0 | 4.1 | 4.1 |
备注：表中数据为20名鉴评人员鉴评结果的平均值。
从表6的结果可以看到，与出发菌株沪酿3.042相比，选育得到的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175菌株在减少沉淀量、还原糖、全氮、氨氮、色泽和抗氧化能力方面具有优势，由于选育获得的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175菌株综合酶系更高，沉淀量更少，原料利用更充分，酱油中沉淀量减少14％，还原糖、红色指数和总抗氧化能力含量分别提高了9％、6％和47％。
从表7和图3的感官鉴评结果显示，选育得到的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175菌株制备的原油，在体态、色泽和香气方面明显好于出发菌株，同时感官咸味、苦涩味较对照菌株感官体验更好，综合口感也更具有优势。综上，本发明基于ARTP诱变技术获得米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175，该菌株具有减少酱油沉淀量、原料利用率高和综合酶活力高等优点，遗传性质稳定，应用于酱油生产，无需另外对制曲及发酵工艺过程进行调控设置，即可使米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175产生较高的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶活力，原料利用率高，能耗低，发酵过程不用再额外添加各种用途的酶制剂，就可以减少酱油沉淀量、获得风味鲜甜突出、滋味醇厚、酱香浓郁、留口持久的发酵原油，也无需通过后期调配其他添加剂来制造成品，工艺步骤简单、节约了生产成本；采用本发明米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175菌株进行制曲并制备酱油和/或酱，能够显著提高酱油/酱的风味、色泽和抗氧化能力，改善产品品质。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175，其于2021年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC.No：61642，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
2.权利要求1所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175在制曲中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。
4.权利要求1所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175在制备酱油或/和酱中的用途。
5.一种酱油或/和酱的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175接种至制曲培养基，培养；
(2)将步骤(1)制备的成曲与氯化钠溶液混合，发酵。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制曲培养基包含豆类原料或/和淀粉质类原料。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，发酵的方式为高盐稀态发酵。
8.根据权利要求5至7任一项所述的制备方法，其特征在于，培养的温度为28℃-35℃，培养的时长为25h-45h；或/和，发酵的时长为85d-95d。
9.一种酱油或/和酱，其特征在于，其采用如权利要求5至8任一项所述的制备方法制备。
10.权利要求1所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA175在提高成曲α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶活力中的用途。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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