CN103756945A - 枯草芽孢杆菌菌株xp、菌酶联合制剂及其在降解烟草制品中淀粉类化合物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株xp，其分类命名为Bacillussubtilis，该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No：M2011452。本发明还公开了一种利用所述菌株xp制成的菌酶联合制剂及其在降解烟草制品中淀粉类化合物方面的应用。

Description

枯草芽孢杆菌菌株xp、菌酶联合制剂及其在降解烟草制品中淀粉类化合物方面的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌菌株xp、由该枯草芽孢杆菌xp与淀粉酶、纤维素酶和糖化酶混合制成的菌酶联合制剂、以及该菌酶联合制剂在降解烟草制品中淀粉类化合物方面的应用。 

背景技术

烟叶发酵又称为烟叶醇化，其实质是在一定温度和湿度条件下，促使烟叶理化特性发生深刻变化的过程，是卷烟工业提高产品质量的一种初加工方法，也是卷烟加工中极为重要的一个环节。未经发酵处理的原烟和新烟不仅色泽不能令人满意，而且常具有生青气和地方性杂气，吸味粗糙，刺激性大，尤其是低次烟还有苦、辣、涩等缺点。经过发酵处理可以不同程度地克服新烟和低次烟的不良品质因素，减少或消除新烟带有的青色，使叶色转深，减少青杂气和土杂气，使香气显露，烟味醇和，减少刺激性和异味，使吸味和顺，增加烟叶的弹性，增强烟叶的燃烧性并降低其吸湿能力。烟草醇化或者发酵方法一般分为人工醇化和自然醇化。人工醇化速度快，但醇化效果差；自然醇化是将烟叶按一定要求堆放在储备库内，在一定湿度（有时还需控制温度）条件下进行的醇化，醇化时间为1－3年。自然醇化虽然效果较好，但也存在一些不足，如：1）因烟叶富含营养物质以及长期与外部环境密切接触，烟叶很容易生虫。2）在春夏秋冬四季变化过程中，因为温度、湿度变化大，烟叶很容易产生霉变。3）因烟叶长期与过量空气接触，烟叶颜色很容易变褐、变深，所以自然醇化时间不能过长，一般不能超过三年。 

19世纪80年代小什列晋格提出了微生物作用假说，认为烟叶发酵最初作用的是微生物，后续过程才是在无机催化剂作用下进行的。由于微生物种类繁多、繁殖速度快、代谢能力强及微生物酶的种类多，所以能高效率催化各种类型的生物化学反应。在发酵开始阶段，细菌数目大量增加，当烟堆温度升高，氧气缺少时，细菌数目逐渐减少。进一步研究还发现，在正常发酵条件下，细菌增加，真菌减少，如果发酵条件控制不当，温、湿度过高或缺氧，导致厌氧微生物数量增加，发酵后烟叶将产生异味。未发酵或人工发酵的烤烟叶面存在大量微生物群落，烟叶发酵过程中微生物的种类和数量总体呈下降趋势，说明烟叶表面的微生物在烟叶发酵中起着重要的作用，从而影响烟叶的香气和品质。 

无论是自然发酵还是人工发酵，整个烟叶发酵过程中，微生物的作用是不可忽略的。微生物对烟叶发酵品质的提高主要通过微生物自身在生长代谢过程中以烟叶中的有机成分作为基质，把糖类分解为醇类、酯类及其它芳香物质，使烟叶的香味物质得以充分表现，把蛋白质降解为氨基酸等小分子物质，把淀粉降解为水溶性糖，把果胶、木质素、纤维素、酚类等降解为低分子量物质。在此基础上，再经过烟草美拉德反应，使烟叶色泽、吸味和香气得到充分改善。 

烟草发酵酶制剂是专门用于改善烟气品质与特性的烟草添加剂，在叶组配方达到充足的烟气浓度和强度后，使用该产品能够改善烟气气溶胶性质，使烟气粒相变细，从而达到烟气细腻、圆润的效果。随着市售酶制剂种类的日益增多，产品质量也参差不齐，市场上时有低劣酶制剂出现，因此酶制剂的活力测定就起到了非常重要的作用。其中常用的测定淀粉酶活力的方法有四类，一是测定底物淀粉的消耗量，有粘度法、浊度法和淀粉-碘显色法等；二为生糖法，测定产物葡萄糖的生成量；三为色原底物分解法，四是酶偶联法。其中淀粉-碘显色法测淀粉酶活力操作简便迅速、实用。其原理是淀粉经α-淀粉酶催化水解，生成产物为葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物淀粉浓度已知且过量的条件下，反应后加入碘液与未被催化水解的淀粉结合成蓝色复合物。其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较成比例，从而计算出淀粉量，推算淀粉酶活力。 

烟草经发酵剂处理后，需要进行淀粉及蛋白含量测定，以初步确定发酵液是否对烟草的醇化产生了作用。常用的淀粉含量测定方法有碘显色法、费林试剂法、苯酚法和高氯酸提取法。其中碘显色法采用对烟草粉末直接煮沸然后测定其滤液，方法比较简单，但由于单纯的加热会破坏烟叶细胞壁使淀粉外露的效果不理想，从而测定的值比较小且误差较大。费林试剂法、苯酚法是间接测定淀粉生产产物还原性糖类的含量，由于耗时、耗试剂且误差大不予采取。高氯酸提取法以其能大量提取淀粉而被选做首选方法。 

因此，研究和改进新的烟叶发酵技术，对卷烟企业提高卷烟品质、节约生产成本、提高经济效益具有广泛而现实的意义。 

发明内容

本发明目的在于提供一种枯草芽孢杆菌xp，及由该枯草芽孢杆菌xp与淀粉酶、纤维素酶和糖化酶混合制成的菌酶联合制剂。 

本发明还提供了上述菌酶联合制剂在降解烟草制品中淀粉类化合物方面的应用，即该菌酶联合制剂可以加速烟叶的发酵。 

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

一株枯草芽孢杆菌xp，其分类命名为Bacillus subtilis. xp，该菌株xp在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No：M 2011452，保藏日期：2011年12月9日，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号（武汉大学）。

一种利用上述枯草芽孢杆菌xp制成的菌酶联合制剂，其由下述步骤制得： 

1）斜面培养：将枯草芽孢杆菌xp用LB液体培养基进行悬浮，然后用接种环挑取菌液于20－40℃斜面培养2－14h；

2）种子培养：将步骤1）培养获得的菌，在无菌条件下用接种环挑取单菌落接种于LB液体培养基于30－38℃摇床培养至OD₆₀₀值为1.0－5.0，获得种子液；

3）将种子液与淀粉酶、纤维素酶和糖化酶按体积比1:1:1:1混匀后即得。

具体的，所述淀粉酶、纤维素酶和糖化酶的酶活浓度分别为6－9 U/ml、700－900 U/ml和50－150 U/ml。 

所述利用枯草芽孢杆菌xp制成的菌酶联合制剂在降解烟草制品中淀粉类化合物方面的应用。 

所述的菌酶联合制剂在降解烟草制品中淀粉类化合物方面的应用，具体为：将该菌酶联合制剂在温度28－32℃、湿度55－65%条件下均匀喷洒于烟草制品上。 

本发明中，所述的烟草制品可以为新鲜采摘或经烘烤、晾晒、发酵的不同品种、产地的全株烟草（Nicotiana tabacum），或者以烟草为原料经切制、研磨、提取或再造制成的烟丝、烟末、烟块、烟片或烟膏等。 

其中，所述烟草制品优选为烤烟叶片。 

本发明所用菌株xp经16srDNA鉴定为高产淀粉酶的枯草芽孢杆菌。选用的淀粉酶、纤维素酶和糖化酶为普通市售产品。菌和酶的作用是共同将烟草细胞壁物质初步部分降解，使酶与烟草细胞内物质充分接触，达到将影响烟草吸食品质的淀粉类物质转化为糖、醇及其他小分子物质的目的，以短时间、高效率和低成本提高烟草吸食品质。 

和现有技术相比，本发明的有益效果：经过菌酶联合制剂处理过的烟草，评吸得分总分增加了1.17分，使烟草提高了一个等级。使得在30天内烟叶淀粉降解水平达到原本醇化1－2年的效果，显著加快了烟叶的发酵。 

附图说明  

图1 为基于微生物菌株xp 16S rRNA基因序列构建的系统发育树；

图2 为本发明菌酶联合制剂喷洒培养时间对烟叶醇化淀粉含量的影响。

具体实施方式

（一）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株xp的筛选：

由于烟草中的淀粉70%为支链淀粉，本申请以可溶性支链淀粉为底物，制作成琼脂平板。在30℃、24hr的条件下使用烟田土壤水溶液进行涂板培养，平板培养物经过4℃的低温处理24－72hr后，菌落周围的培养基颜色变深，透明，在淀粉琼脂培养基的白色背景中，能直接分离不受杂菌污染的菌株。根据淀粉酶的活力和透明圈直径的关系测定不同菌株产生的淀粉酶的活力。在pH值4.0－6.0的琼脂平板上进行筛选培养，即可得到耐酸性菌株xp。

（二）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株xp的鉴定：

筛选得到的菌株xp为革兰氏阳性菌，该菌为棒杆状，长有芽孢，外有荚膜，长约1.2 μm，宽约0.4μm。委托中国典型培养物保藏中心对其进行生理生化特性鉴定，结果见表1和表2，其16S rRNA基因序列比对结果见表3，构建的系统发育树数据见附图1。

表3 基于微生物菌株xp 16S rRNA基因序列的比对结果 

根据上述生理生化特性、16S rRNA基因序列比对结果及构建的系统发育树，鉴定该菌株

xp属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，菌株xp在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No：M 2011452。

（三）以下以烤烟叶片为例，说明菌酶联合制剂在降解烟草制品中淀粉类化合物方面的应用

下述实施例如无特殊说明，所用的LB液体培养基配方为：每1000 ml去离子水中含有：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，用NaOH溶液调pH为7.0。斜面培养选用LB固体培养基，配方为：每1000 ml去离子水中含有：琼脂粉15g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，用NaOH溶液调pH为7.0。培养基在使用前于121℃灭菌15min。

所用淀粉酶、纤维素酶和糖化酶购自上海楷洋生物技术有限公司，其酶活浓度分别为4000 U/g、400 U/mg和100 U/mg。 

实施例1

制备本发明微生物-酶制剂及测定酶活力方法

1、制备微生物制剂

1）斜面培养：将菌株xp用0.5ml LB液体培养基进行悬浮，然后用接种环挑取菌液于37℃斜面培养14h；

2）种子培养：将步骤1）培养获得的菌，在无菌条件下用接种环挑取单菌落接种于装有100ml LB液体培养基的300 ml三角瓶中，于37℃摇床培养至OD₆₀₀值为5.0（约10 h，转速200 rpm），获得种子液。收集种子液，装入250 ml菌液收集瓶中，4℃下离心，所用离心条件为8000 rpm，20 min。取上清液进行酶活力测定。酶活力测定方法为淀粉-碘显色法。

淀粉-碘显色法的酶活定义：1 ml酶液于60℃、pH7.0的条件下，在60 min液化可溶性淀粉的克数，计为1个酶活力单位（mg/ml）。计算公式为 (60/T×A×B×N)÷D；其中60为酶活定义中的反应时间；T为反应时间（min）；A为可溶性淀粉的毫升数；B为可溶性淀粉浓度；N为酶液稀释倍数；D为测定时所用酶液量（ml）。 

上述上清液的酶活力为：153.25 mg/ml。 

3）制备酶制剂 

所用淀粉酶、纤维素酶、糖化酶的适宜pH分别为5.0－8.0、4.0－5.5和4.0－4.5。测试烟叶的浸提液pH为5.4，基本在三种酶液的适宜pH内，说明这三种酶在烟叶表面喷施后适宜发酵。

用去离子水分别配制成不同浓度的淀粉酶溶液、纤维素酶溶液和糖化酶溶液，进行酶活力测定并确定在不同酶浓度条件下作用于标准品的最佳作用浓度。 

淀粉酶活力测定方法为淀粉-碘显色法；纤维素酶活力测定方法为滤纸酶活（FPA）测定法，糖化酶（或葡萄糖淀粉酶）活力测定方法为分光光度计法。 

    淀粉酶活力测定：①取0.2 g淀粉酶溶于50 ml水中，定容到100 ml； 

②取上述酶液0.2 ml加入1 ml 0.4 g/ml的淀粉溶液，40℃准确反应10 min，测定淀粉酶活为107.41 mg/ml。定义淀粉酶的酶活为每分钟反应体系在660 nm波长下变化0.001OD₆₆₀值为1个酶活力单位1 U；

③测定2－40U/ml的淀粉酶液作用于1 ml 0.4 mg/ml的底物淀粉溶液时对淀粉的降解率，确定对淀粉标准品的最佳作用浓度。其测定结果见表4。

纤维素酶活力测定法中的酶活定义：在指定反应条件下，每分钟催化纤维素水解成1 μmol葡萄糖的酶量。其计算公式为：酶活力(U/mL)=葡萄糖/（60×Ew）， 其中：60为保温时间(酶与底物作用时间，min)；Ew为粗酶液的体积(mL)。 

纤维素酶活力测试：配制浓度0－800 U/ml的纤维素酶溶液；取0.1 M醋酸缓冲液（pH 4.6）1ml于试管中，加入1 ml纤维素酶溶液，预热到50℃，加入一条新华滤纸条（1×6 cm），50℃保温1 h，取出，沸水浴灭活5 min，冷却至室温，3 ml DNS（稀释3倍）显色，测OD_520nm吸光值。其测定结果见表5。 

糖化酶活力测定法中的酶活定义：在指定反应条件下，1 ml液体酶1 h分解可溶性淀粉的毫克数，计为1个酶活力单位。 

糖化酶活力测试：配制0－200 U/ml的糖化酶溶液；取1 ml糖化酶溶液加入到1 ml底物淀粉溶液（0.4 mg/ml）中，40℃反应30 min，加入1 ml碘化钾-碘溶液，测定OD_600 nm吸光值。其测定结果见表6。 

由上述表1至3的结果可看出，淀粉酶的最佳作用量为8 U/ml，纤维素酶的最佳作用量为800 U/ml，糖化酶的最佳作用量为100 U/ml。 

实施例2

一种利用枯草芽孢杆菌菌株xp制成的菌酶联合制剂，其由下述步骤制得：

1）斜面培养：将菌株xp用LB液体培养基进行悬浮，然后用接种环挑取菌液于37℃斜面培养14h；

2）种子培养：将步骤1）培养获得的菌，在无菌条件下用接种环挑取单菌落接种于LB液体培养基于37℃摇床培养至OD₆₀₀值为5.0（约10 h），获得种子液；

3）将种子液与淀粉酶、纤维素酶和糖化酶按体积比1:1:1:1混匀后即得。所述淀粉酶、纤维素酶和糖化酶的酶活浓度分别为8 U/ml、800 U/ml和100 U/ml。

烟叶试验：于温度30℃、湿度60%条件下将100ml上述菌酶联合制剂均匀喷洒于500g烤烟叶片表面，在不同时间取样，检测烤烟叶片中淀粉的含量。烤烟叶片中淀粉含量的测定采用高氯酸-碘显色法进行。对照组自然放置，未作处理。试验所用烟叶选自河南郏县2009年烟叶。 

试验结果：菌酶联合制剂喷洒培养时间对烟叶醇化淀粉含量的影响数据见图2，图2中可以看出喷洒培养30天中菌酶联合制剂对淀粉的降解情况，OD_575nm处淀粉的吸收峰随时间逐渐减小。喷洒培养30天后的烟叶吸食口感数据见表7。由表7可以看出，对照组：总分40.96；试验组：总分42.13。评吸结论：对照组：杂气较大，香气质、量一般；试验组：稍有杂气，余味较好，甜度增加，浓度、劲头有所增加，烟气柔细度较好，香气质、量有所提高；使烟草提高了一个等级。 

Claims (7)

1.一株枯草芽孢杆菌xp，其分类命名为Bacillus subtilis. xp，该菌株xp在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No：M 2011452。

2.利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌xp制成的菌酶联合制剂，其特征在于，由下述步骤制得：

1）斜面培养：将枯草芽孢杆菌xp用LB液体培养基进行悬浮，然后用接种环挑取菌液于20－40℃斜面培养2－14h；

2）种子培养：将步骤1）培养获得的菌，在无菌条件下用接种环挑取单菌落接种于LB液体培养基于30－38℃摇床培养至OD₆₀₀值为1.0－5.0，获得种子液；

3）将种子液与淀粉酶、纤维素酶和糖化酶按体积比1:1:1:1混匀后即得。

3.如权利要求2所述利用枯草芽孢杆菌xp制成的菌酶联合制剂，其特征在于，所述淀粉酶、纤维素酶和糖化酶的酶活浓度分别为6－9 U/ml、700－900 U/ml和50－150 U/ml。

4.权利要求2所述的菌酶联合制剂在降解烟草制品中淀粉类化合物方面的应用。

5.如权利要求4所述的菌酶联合制剂在降解烟草制品中淀粉类化合物方面的应用，其特征在于，将该菌酶联合制剂在温度28－32℃、湿度55－65%条件下均匀喷洒于烟草制品上。

6.如权利要求5所述的菌酶联合制剂在降解烟草制品中淀粉类化合物方面的应用，其特征在于，所述烟草制品为新鲜采摘或经烘烤、晾晒、发酵的全株烟草，或者以烟草为原料经切制、研磨、提取或再造制成的烟丝、烟末、烟块、烟片或烟膏。

7.如权利要求6所述的菌酶联合制剂在降解烟草制品中淀粉类化合物方面的应用，其特征在于，所述烟草制品为烤烟叶片。

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