CN106676035A - 枯草芽孢杆菌在降解烟草制品中果胶方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于烟草制备技术领域，具体一种枯草芽孢杆菌xp菌株在降解烟草制品中果胶方面的应用。所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌xp菌株，该菌株现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2011452；该菌株用于降低烟草制品中果胶含量；应用时，将枯草芽孢杆菌xp菌株制备成菌剂，按烟草制品1.0%的质量比例均匀喷洒于烟草制品表面，然后30~37℃、55~65%湿度条件下，贮藏醇化30~40d。本发明通过特定枯草芽孢杆菌菌株的选择，证明其可有效降低烟草制品中果胶含量，提升烟草等级，在确保醇化效果同时进而加快烟叶醇化进程。

Description

枯草芽孢杆菌在降解烟草制品中果胶方面的应用
技术领域
本发明属于烟草制备技术领域，具体一种枯草芽孢杆菌xp菌株在降解烟草制品中果胶方面的应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌是芽胞杆菌属的一种，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。其菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚，在遗传学研究中应用广泛。此外，枯草芽孢杆菌菌体自身可合成α-淀粉酶、中性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在降解复杂大分子化合物方面具有良好的应用前景，因此近年来枯草芽孢杆菌逐渐成为被关注和研究的热点。
烟叶发酵又称为烟叶醇化，其实质是在一定温度和湿度条件下，促使烟叶理化特性发生深刻变化的过程，即将不利于烟叶品质的大分子物质组分（包括蛋白质、淀粉、果胶等）降解转化成有利于提升烟叶品质的小分子组分（还原糖、氨基酸等），进而达到克服新烟不良品质，改良和提高烟叶内在质量与外观质量的目的。
烟叶醇化是卷烟工业提高产品质量的一种初加工方法，也是卷烟加工中极为重要的一个环节。烟草醇化或者发酵方法一般分为人工醇化和自然醇化两种。人工醇化速度快，周期短，但醇化效果差；自然醇化是将烟叶按一定要求堆放在储备仓库内，在自然条件下进行的醇化，时间一般为1~3年。自然醇化虽然效果较好，但也存在一些不足，如：1）醇化过程中，烟叶容易滋生虫害；2）由于温度、湿度的变化，烟叶容易产生霉变；3）醇化周期较长，易造成库存烟叶的积压与大量资金的占用。
果胶是烟叶中的重要化学成分，以α-1，4糖苷键聚合形成的聚半乳糖醛酸为基础，和纤维素一起构成了烟叶细胞壁的基本结构。在卷烟燃吸过程中，烟叶中的果胶会造成烟叶燃烧不完全，并产生甲醇，甲醇进一步氧化成甲醛、甲酸等，是烟气刺激性产生的主要因素，同时也对烟草安全性产生不利影响。因此，降低烟草中果胶含量对提高烟草品质具有重要的意义。
在烟叶自然醇化过程中，烟叶中的果胶降解缓慢，因而也就为烟支的抽吸安全造成了潜在影响。针对这一缺陷，开发利用外源微生物制剂或者酶制剂，从而加速降解烟叶中的果胶等大分子物质，进而加快烟叶醇化进程，缩短烟叶醇化周期，这对卷烟企业提高卷烟品质、节约生产成本、提高经济效益具有广泛而现实的意义。
发明内容
通过特定的枯草芽孢杆菌xp菌株的选择，本发明目的在于提供枯草芽孢杆菌xp菌株在降解烟草制品中果胶方面的新应用，从而获得较为稳定降低烟草中果胶含量的技术效果，进而加快烟叶的醇化进程，缩短醇化周期。
本申请所采取的技术方案详述如下。
枯草芽孢杆菌在降解烟草制品中果胶方面的应用，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌xp菌株，其分类命名为Bacillus subtilis. xp，该菌株现保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏地址为：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16 号（武汉大学），保藏日期为：2011年12 月9 日，保藏编号为CCTCC No ：M 2011452。
所述枯草芽孢杆菌在降解烟草制品中果胶方面的应用，其用于降解烟草制品中果胶时，首先制备成菌剂，然后以烟草制品0.8~2.0%的质量比例（优选1.0%）均匀喷洒于烟草制品表面，最后在30~37℃、55~65%湿度条件下，贮藏醇化30~40d；
所述菌剂，具体为采用LB液体培养基制备的OD600=1.0~5.0的悬浮培养液；
所述烟草制品，具体可为新鲜采摘的或经烘烤、晾晒、发酵后的不同品种、不同产地的全株烟草或部分组织器官，更进一步而言，具体例如为烤烟叶片。
总体而言，本发明通过特定枯草芽孢杆菌菌株的选择，在将其扩增制备成菌剂后，应用于烟草制品时，可有效降低烟草制品中果胶含量，改善烟叶质量，提高其评吸效果，提升烟草等级，在确保醇化效果同时进而加快烟叶醇化进程。由于本发明可在短时间内，以较低成本和较高效率较好改善烟草的吸食品质，加上其操作流程较为简便，因而使得本申请在卷烟制备领域表现出较好的应用价值和应用前景。
附图说明
图1为本发明菌液制剂喷洒后作用时间对烟叶醇化中果胶降解率的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分实验背景情况简要介绍如下。
实验材料：
供试烟叶：2015年河南许昌C3F，由河南中烟工业有限责任公司提供；
下述实施例中所采用的枯草芽孢杆菌xp菌株，其分类命名为Bacillus subtilis. xp，该菌株现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No ：M 2011452；由于该菌株为申请人自行筛选获得，且已在其他专利中有所公开，因而属于可公开获得的微生物资源，本申请属于该菌株的新用途专利申请；
实验试剂：
LB液体培养基，常规配制并灭菌（121℃保温15 min）即可，具体配方为：每1000 mL 去离子水中含有：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCL 10 g，用NaOH 溶液调pH=7.0；
主要实验设备：
UV-2550紫外分光光度计，为Shimadzu公司产品。
实施例
为将枯草芽孢杆菌xp菌株用于降解烟草制品中果胶，首先需将该菌株进行适当扩增培养，制备成含有一定数量的活性菌剂才能加以应用，菌剂的具体制备方法如下所述。
（1）菌种活化，利用接种环挑取斜面培养基（配方同LB液体培养基，仅另外添加15g/L琼脂粉）上菌种，置于LB液体培养基中悬浮培养，30℃培养12h进行菌种活化；
（2）菌种扩增，将步骤（1）中菌种活化后菌液转接至LB液体培养液中，35℃摇床培养至OD600=3.5左右，悬浮均匀后即可作为降解烟草制品用菌剂。
将上述菌剂具体用于降解烟草制品中果胶时，按烟草制品1.0%的质量比例均匀喷洒于烟草制品表面，然后在35℃、55~65%湿度条件下贮藏醇化30~40d左右即可。
为确定具体降解果胶效果，具体以片状（3cm×3cm）烟叶（去除烟梗的烟叶）作为烟草制品进行了醇化处理，同时设置空白对照组（CK）（按烟草1.0%的质量比例喷施蒸馏水），喷施后贮藏35d后，对烟叶中果胶降解率进行测定并进行感官质量评价。
果胶降解率测定
果胶含量采用咔唑硫酸分光光度法进行测定，具体测定步骤如下：
（1）准确称取分析纯半乳糖醛酸（G.A.）0.0500 g，用蒸馏水溶解后定容于50 mL容量瓶中(浓度1000 mg/L)；
（2）于6个50mL容最瓶中分别吸取此液0、1、2、3、4、5 mL，稀释至刻度(浓度0一100 mg/L)；
（3）分别吸取不同浓度的标准稀释液1mL于6支试管(20 mm ×150 mm)中，然后各加入浓硫酸6 mL，用自来水边加边冷却至室温；
（4）然后各加入0.30 mL 0.15%(1.500 g/L)咔唑无水乙醇溶液，摇匀；
（5）在室温下暗处放置1.5 h，在540 nm波长下用1 cm比色皿，以试剂空白作参比，测定吸光度(A)，绘制A一C标准曲线；
（6）准确称取0.035 g果胶粉于50mL烧杯中，加入10 mL 0.5mol/L硫酸、15 mL水，搅匀，在75℃水溶中水解15 min，冷却至室温后定容于50 mL容量瓶中；
（7）准确移取5.0 mL该液于另一50 mL容量瓶，稀释至刻度，同步骤（5）中吸光度测定；
（8）计算G.A.%=[C×50/(5×50)]÷[W×106] ×100%，
式中: C为从标准曲线查得的所测果胶液中G.A.的浓度(mg/L)，W为果胶粉质量(g)；
根据不同果实果胶中G.A.的含量不同，可换算出相应烟叶中果胶的含量；
（9）检测得到各样品果胶含量后，与初始对照组烟叶果胶含量比对，换算相应的果胶降解率。
测定结果如图1所示。
从图1可以看出，随着处理时间增加，空白对照组中烟叶样品的果胶含量并无明显变化；而经菌剂处理后，处理组中烟叶样品的果胶含量发生明显变化，并且随着处理时间延长，果胶降解率持续增高，当贮藏醇化处理30天时，烟叶中果胶降解率可达最高值（17%），之后趋于稳定。
烟草制品感官质量评价
在不同贮藏醇化时间段内，取适量烟叶切丝，常规制备卷烟样品，恒温恒湿平衡后，由专业评委对烟支的香气质（A）、香气量（B）、浓度（C）、柔细度（D）、余味（E）、杂气（F）、刺激性（G）等指标进行评定，每项指标均按9分制打分，感官评吸总分（T）=（A+B）× 2.3 + C ×1.5 + D + E + F + G。
具体评价结果如下表所示：
CK为喷洒等量蒸馏水的对照烟叶（需要说明的是，贮藏35天后的评吸结果与此数据大致相同，故此省略）。
对上表数据分析可以看出，与样品初始状态相比，经菌剂处理后，随着贮藏醇化时间延长，烟草制品的感官质量可以得到持续性的改善。在处理30天时评吸总分达到最高值，总分相比对照增加了1.66分，结合上述烟叶果胶降解率结果，可确定菌液制剂的最佳处理时间为30天，此时可使烟叶果胶降解17%，评吸总分相比对照提高1.66分，使烟叶整体提高了一个等级，显著加快了烟叶的醇化进程，因而本发明在改善烟叶醇化质量，缩短醇化周期方面具有良好的应用前景。

Claims (3)

1.枯草芽孢杆菌在降解烟草制品中果胶方面的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌xp菌株，其分类命名为Bacillus subtilis. xp，该菌株现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No ：M 2011452；该菌株用于降低烟草制品中果胶含量；所述烟草制品为新鲜采摘的或经烘烤、晾晒、发酵后的不同品种、不同产地的全株烟草或其中部分组织器官。
2.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌在降解烟草制品中果胶方面的应用，其特征在于，将枯草芽孢杆菌xp菌株制备成菌剂，按烟草制品1.0%的质量比例均匀喷洒于烟草制品表面，然后30~37℃、55~65%湿度条件下，贮藏醇化30~40d；
所述菌剂，具体为采用LB液体培养基制备的OD600=1.0~5.0的悬浮培养液。
3.如权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌在降解烟草制品中果胶方面的应用，其特征在于，所述烟草制品为烤烟叶片。
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