CN101824391A - 一种短小芽孢杆菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种短小芽孢杆菌及其应用，属微生物技术领域。本发明的生产菌株分类命名为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus Van35；保藏编号为CGMCC No.3411。喷施该菌株制剂可以使烟叶可溶性总糖、还原糖含量增加，使蛋白质、总氮、烟碱含量下降。因而糖氮比、糖碱比和氮碱比的比值趋于上升，使化学品质更为协调，烟叶评吸品质得到提升。
Description
技术领域
本发明属应用微生物技术领域，更具体说，本发明涉及一种短小芽孢杆菌。同时，还涉及所述的短小芽孢杆菌在烟草生产中的新用途。
背景技术
烟草是我国财政的重要支柱之一。国家烟草专卖局在“十一五”中国卷烟科技发展纲要第7条明确指出，要“攻克影响烟叶香气质、香气量的关键技术”，缩小与国外烟叶质量差距，以提高国内外市场竞力。
烟叶发酵是烟草加工过程中的主要工艺环节。改进烟叶发酵技术，增进烟叶的香吃味质量，已成为卷烟工业提高加工工艺技术水平的重要手段。由于当年新购烟叶品质都存在不同程度的缺陷，不宜直接用于卷烟生产，必须经2-3年的醇化处理才可用于生产。在醇化发酵过程中，烟叶主要化学成分会发生相应的变化，青杂气和刺激性逐渐降低，香气显露，吃味醇和，色泽均匀并加深，故而烟叶醇化在卷烟工业中对烟叶质量的改变起着非常重要的作用。
研究表明，在烤烟醇化中期和醇化完成时，烟叶中均存在一定数量的微生物，其中以细菌为主，烟叶表面的微生物数量和种类与醇化条件和醇化效果有密切关系。总之，微生物不仅可以通过自身的生命活动作用于烟叶的醇化过程，而且还通过其代谢产生的生物酶参与烟叶的生理生化反应，促进烟叶中大分子生物化合物的转化。
国内近期的研究表明通过微生物发酵能够大大缩短烟叶醇化的时间，具有明显消除烟叶的青杂气，减轻刺激性的作用，对烟叶香气质量的改善也有一定的帮助。目前，关于添加微生物提高烟叶品质的研究已有报导。但经文献检索，尚未发现与本发明内容相同的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的短小芽孢杆菌。
本发明进一步的目的是提供一种所述的短小芽孢杆菌在烟草生产中的应用，即提供一种能有效提高烤烟品质的方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
A.本发明从烤烟叶面上分离了一株优势微生物Van35作为试验菌种，对其进行了16S rRNA分析，鉴定结果表明该细菌属于短小芽孢杆菌，其分类命名为Bacillus pumilus Van35。保藏号为CGMCC No.3411。
短小芽孢杆菌Van35(B.pumilus Van35)菌株的形态学和生理生化性质特征为：菌体呈杆状，革兰氏阳性，芽孢椭圆形中生或端生，不膨大，芽孢比菌体小存在于菌体中。菌落呈圆形，扁平无凸起，乳白色，有光泽，边缘不整齐。常规生理生化实验表明：Van35是好氧菌，过氧化氢酶实验，VP实验，产H2S实验，明胶液化实验和卵磷脂酶实验呈阳性；水解淀粉实验，产NH3实验，甲基红实验，吲哚实验，水解脂肪实验和硝酸盐还原实验呈阴性。
短小芽孢杆菌Van35的分子鉴定特征为：利用通用引物20F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1500R(5’-GGTTACCTTGTTACGA CT-3’)，以短小芽孢杆菌Van35的基因组DNA作为模板扩增得到1500bp左右的PCR产物，回收测序、校正之后得到的Van35菌株的部分16S rRNA基因序列1510bp，该序列已经递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列索引号为：GU290547。
本发明的短小芽孢杆菌制剂按常规方法制备，即将短小芽孢杆菌Van35(B.pumilus Van35)扩大发酵培养后制成菌制剂。
B.本发明提供了一种所述短小芽孢杆菌在烟草生产中的应用，即提供一种利用短小芽孢杆菌提高烤烟品质的方法。其具体作法如下：
利用短小芽孢杆菌Vasn35，制备液体培养液。1000mL培养液离心，用无菌水洗涤沉淀，最后用20mL无菌水振荡均匀，使用时稀释10倍即为菌剂。称取预先平衡水分至13％的烟丝200g，喷施Van35(B.pumilusVan35)菌剂40mL，对照组喷施等量无菌水。将处理后的烟叶样品放入22℃，60％的恒温恒湿箱内发酵20天。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
1.试验数据表明，短小芽孢杆菌能有效提高烤烟品质。本发明成功地将生物技术引入烟草生产中，是烟草生产技术的一个重要突破；
2.通过改善烟叶品质，大大提高烟叶可用性。加速烟叶发酵，提高烟叶等级质量。使烟叶可溶性总糖、还原糖含量增加；而蛋白质、总氮、烟碱含量下降。因而糖氮比、糖碱比和氮碱比的比值趋于上升，使化学品质更为协调，烟叶评吸品质得到明显提升。
3.工艺简单，操作容易，成本低，适于推广应用，对促进卷烟工业健康发展具有积极意义。
保藏生物材料的说明
本发明的菌株，已于2009年11月5日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCG)；该中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株分类命名为Bacillus pumilus Van35；保藏号为CGMCC No.3411。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数据，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
(一)试验烟叶样品的采集
本研究所用的烟叶样品均采自红云烟草(集团)有限公司原料部烟叶醇化车间，烟叶的具体信息见表1。
表1.供试烟叶样品
(二)短小芽孢杆菌Van35(B.pumilus Van35)的培养方法。
1)试管斜面培养
采用Luria-Bertani(LB)培养基，配方为(克/升，g/v)：10克蛋白胨，10克氯化钠，5克酵母提取物，20克琼脂，蒸馏水定容到1000毫升。121℃灭菌25分钟，摆成斜面。接种B.pumilus Van35，37℃培养12小时，获得试管种。
2)菌剂的制备
A.种子培养(LB培养基)，配方为：10克蛋白胨，10克氯化钠，5克酵母提取物，蒸馏水定容到1000毫升。121℃灭菌25分钟。接种B.pumilus Van35，37℃培养12小时，获得液体菌种。
B.将液体菌种按5％(液体菌种体积百分比，v/v)接种量转接到1L的LB液体培养基中，37℃，150r/min振荡培养12h。培养液以3500r/min离心10min，用无菌水洗涤沉淀、离心，最后用20mL无菌水振荡均匀，使用时稀释10倍即为菌剂。
(三)烟叶发酵
称取预先平衡水分至13％的云南石宜K326B2F和C3F烟丝各200g，喷施Van35(B.pumilus Van35)菌剂40mL，对照组喷施等量无菌水。本实验处理四种烟叶，设三次重复。然后将处理后的烟叶样品放入22℃，60％的恒温恒湿箱内发酵20天，取样品测其主要化学成分。
(四)烟叶水分和主要化学成分分析
烟叶水分和主要化学成分分析根据烟草行业制定的标准进行检测。
具体如下：
水份检测：《YC/T31-1996烟草及烟草制品试样的制备和水份测定烘箱法》；
还原糖和水溶性总糖：《YC/T159-2002烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法》
烟碱：《YC/T160-2002烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动法》
总氮：《YC/T161-2002烟草及烟草制品总氮的测定连续流动法》
钾：《YC/T217-2007烟草及烟草制品钾的测定连续流动法》
蛋白质：《YC/T166-2003烟草及烟草制品总蛋白质含量的测定》
纤维素：根据张槐苓等《烟草分析与检验》中的方法进行测定
(五)烟叶样品化学成分测定结果
烟叶的化学成分检测结果如下(表2和表3)。从单一化合物看，经菌剂处理的各类烟叶内的化学成分比值发生了显著变化。总糖含量比对照增加14.42％-25.71％；总还原糖含量比对照增加21.42％-38.57％；纤维素含量比对照降低7.22％-11.79％；总氮含量比对照降低2.11％-2.56％；蛋白质含量降低0.95％-1.37％；烟碱含量与对照相比降低2.99％-4.02％；钾的含量比对照增加3.93％-6.39％。
由表4结果表明，从化合物比例关系看，喷施菌剂对糖氮比、糖碱比、氮碱比均有促进升高的作用。
以上的试验数据说明，经菌剂处理的各类烟丝各项指标均优于对照，烟丝内各成分趋于平衡。有利于改善烟叶内在品质，提高烟叶香气。
表2.菌剂对烟叶主要化学成分含量的影响
表3.菌剂对烟叶主要化学成分含量的影响
表4.菌剂对烟叶的糖/氮、糖/烟碱、氮/烟碱比值的影响
(六)处理烟叶样品的感官评吸
将处理组和对照组的烟丝制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％，温度22℃条件下平衡24h后，由卷烟专业评吸专家组成的评吸小组进行评吸。
经专家评吸认为：利用短小芽孢杆菌Van35(B.pumilus Van35)处理后的云南石宜K326B2F和C3F烟叶样品，具有明显提调烟香、细腻醇和烟气、降低刺激、掩盖杂气和改善卷烟吸味的良好效果，结果见表5。
表5.菌剂对感官评吸的影响
实施例2
(一)短小芽孢杆菌Van35菌剂制备：短小芽孢杆菌Van35的液体和固体培养，菌剂的制备方法同实施例1.
(二)烟叶发酵和烟叶主要化学成分分析
称取预先平衡水分至13％的保山红大B2F和C3F烟丝各200g，喷施Van35(B.pumilus Van35)菌剂40mL，对照组喷施等量无菌水。本实验处理四种烟叶，设三次重复。然后将处理后的烟叶样品放入22℃，60％的恒温恒湿箱内发酵20天，取样品测其主要化学成分，测得数据取平均值进行分析。
烟叶的化学成分检测结果如下(表6和表7)。从单一化合物看，经菌剂处理的各类烟叶内的化学成分比值发生了显著变化。总糖含量比对照增加12.1％-23.4％；总还原糖含量比对照增加25.25％-30.76％；纤维素含量比对照降低7.9％-8.28％；总氮含量比对照降低3.25％-6.04％；蛋白质含量降低1.35％-3.01％；烟碱含量与对照相比降低3.79％-4.38％；钾的含量比对照增加3.61％-6.78％。
由表8结果表明，从化合物比例关系看，喷施菌剂对糖氮比、糖碱比、氮碱比均有促进升高的作用。
以上的试验数据说明，经菌剂处理的各类烟丝各项指标均优于对照，烟丝内各成分趋于平衡。有利于改善烟叶内在品质，提高烟叶香气。
表6.菌剂对烟叶主要化学成分含量的影响
表7.菌剂对烟叶主要化学成分含量的影响
表8.菌剂对烟叶的糖/氮、糖/烟碱、氮/烟碱比值的影响
(三)处理烟叶样品的感官评吸
将处理组和对照组的烟丝制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％，温度22℃条件下平衡24h后，由卷烟专业评吸专家组成的评吸小组进行评吸。
经专家评吸认为：利用短小芽孢杆菌Van35(B.pumilus Van35)处理后的保山红大B2F和C3F烟叶样品，具有明显提调烟香、细腻醇和烟气、降低刺激、掩盖杂气和改善卷烟吸味的良好效果，结果见表9。
表9.菌剂对感官评吸的影响
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种短小芽孢杆菌，其特征在于：该菌株的分类命名为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus Van35，保藏编号为CGMCC No.3411。
2.一种用权利要求1所述的短小芽孢杆菌提高烤烟品质的方法，其具体做法如下：
利用短小芽孢杆菌Vasn35，制备液体培养液；1000mL培养液离心，用无菌水洗涤沉淀，最后用20mL无菌水振荡均匀，使用时稀释10倍即为菌剂；称取预先平衡水分至13％的烟丝200g，喷施Van35菌剂40mL，将处理后的烟叶样品放入22℃，60％的恒温恒湿箱内发酵20天。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |